2027年高考生物一轮复习 突破练习含答案 070-能力提升课7 PCR技术中引物的选择、限制酶的选择和PCR过程中方向的判断（教用）

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1．（2025·辽宁大连期末）若要通过PCR检测受体细胞中是否含有插入的XplA和XplB基因，应选择的最佳引物组合是（ ）
A. 引物1+引物3B. 引物1+引物4
C. 引物2+引物3D. 引物2+引物4
【答案】A
【解析】由图甲可知，启动子在左侧，转录方向从左向右，而RNA合成方向为5′→3′，因此图甲中的模板链是下侧这一条链，图乙中XplB基因需转180∘ 后与XplA基因连接才能在图甲所示的T−DNA中正确转录，此时引物1在左下角，引物3在右上角，引物1和引物3的组合可以用于检测是否正确插入两个基因，A正确。
2．（2025·山东菏泽质检）土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为（ ）
A. 5′−CTTGGATGAT−3′和5′−TCTGTTGAAT−3′
B. 5′−CTTGGATGAT−3′和5′−TAAGTTGTCT−3′
C. 5′−ATTCAACAGA−3′和5′−ATCATCCAAG−3′
D. 5′−ATTCAACAGA−3′和5′−GAACCTACTA−3′
【答案】A
【解析】图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′−CTTGGATGAT−3′（上面链的引物）和5′−TCTGTTGAAT−3′（下面链的引物）作为引物，A符合题意。
3．（2025·广东揭阳月考）利用PCR获得目的基因后,用限制酶EcRⅠ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如图所示。下列有关引物的分析正确的是（ ）
A. 通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3
B. 检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物1和引物4进行PCR
C. 若设计的引物与模板不完全配对,为了引物能与模板链结合可适当提高PCR复性的温度
D. DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
【答案】A
【解析】引物结合在模板链的3′端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3,A正确;引物结合在模板链的3′端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2和引物4进行PCR,B错误;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低PCR复性的温度,以便引物与模板链结合,C错误;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3′端连接脱氧核苷酸,D错误。
4．（2025·吉林长春质检）图甲有三种限制酶及在目的基因上的切割位点，图乙有三种限制酶的切割位点和标记基因。下列关于限制酶的选择和基因表达载体构建的叙述错误的是（ ）
A. 可以选择SmaⅠ限制酶来构建的基因表达载体
B. 可以选择PstⅠ限制酶来构建基因表达载体
C. 选用限制酶PstⅠ和EcRⅠ来构建基因表达载体可以防止质粒自身环化
D. 选用一种限制酶或两种限制酶均可构建基因表达载体
【答案】A
【解析】由题图可知：选择SmaⅠ限制酶会破坏目的基因和质粒上的标记基因，A错误；目的基因两侧和质粒上都有PstⅠ限制酶切割位点，所以可以选择PstⅠ限制酶来构建基因表达载体，B正确；选用限制酶PstⅠ和EcRⅠ切断目的基因和质粒，能防止质粒自身环化和避免目的基因和质粒的反向连接，因而成功率更高，C正确；结合B、C项的分析可知，用一种限制酶或两种限制酶断开目的基因和质粒均可构建基因表达载体，D正确。
5．（2025·河南郑州质检）如图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcRⅠ：—G↓AATTC—；BamHⅠ：—G↓GATCC—；BclⅠ：—T↓GATCA—；Sau3AⅠ：—↓GATC—；SmaⅠ：—CCC↓GGG—。注：Tetr表示四环素抗性基因；Ampr表示氨苄青霉素抗性基因。下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A. 若单独使用SmaⅠ，则目的基因表达的产物可能不相同
B. 若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C. 若选择BamHⅠ和SmaⅠ，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D. 若用EcRⅠ和BclⅠ切割质粒，则可用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
【答案】C
【解析】用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段后，目的基因可能会反向连接到质粒上，A正确；若单独使用SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长，B正确；若选择BamHⅠ和SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，重组质粒上含有正常的四环素抗性基因，能在四环素培养基中生长的受体菌有可能获得了重组质粒，也有可能获得的是普通质粒，C错误；含目的基因的DNA片段上没有BclⅠ的识别序列，不能使用BclⅠ切割含目的基因的DNA片段，但Sau3AⅠ切割DNA后产生的黏性末端与BclⅠ相同，故若用EcRⅠ和BclⅠ切割质粒，则需用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段，D正确。
6．（2026·山东日照段考）通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述正确的是（ ）
A. 两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入
B. 在PCR体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、TaqDNA聚合酶等
C. 第2轮PCR,引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
D. 在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8
【答案】A
【解析】引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入运载体，A正确；在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq酶等，但不需要加入解旋酶、核糖核苷酸和ATP，B错误；在第3轮PCR中，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因，C错误；在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D错误。
7．（2025· 黑吉辽蒙卷·25）（14分）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
（1） 可从_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入_ _ _ _ _ _ _ _ 和_ _ _ _ _ _ _ _ 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
图1
（2） 进一步筛选构建的质粒，以1∼4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 的污染。初步判断实验组_ _ _ _ （从“1∼4”中选填）的质粒中成功插入了基因N,理由是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。
图2
（3） 为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有_ _ _ _ _ _ 。
（4） 进一步检测转基因酵母菌发酵得到的_ _ _ _ _ _ _ _ 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【答案】（1） 序列数据库（如GenBank）；XℎⅠ；XbaⅠ；DNA连接酶
（2） 外源DNA；1；引物1和引物2只能特异性扩增出基因N；pYL大小为7.2kb，重组质粒大小约为9.5kb，可推断基因N约有2.3kb(2300个碱基对)，只有实验组1的电泳条带符合要求
（3） GCC
（4） 香树脂醇
【解析】
（1） GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息。故可从序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物，PCR扩增基因N。基因N应插入pYL的启动子和终止子之间，由图1可知，用于切割pYL的限制酶应为SpeⅠ和XℎⅠ，但若用SpeⅠ切割基因N会使该基因的结构被破坏，因此可用同尾酶XbaⅠ代替SpeⅠ切割基因N。为保证基因N与质粒pYL正确连接，需确定基因的上下游。
基因上游与质粒的启动子相连，故引物2的5′端需添加XbaⅠ识别序列；基因下游与质粒的终止子相连，故引物1的5′端需添加XℎⅠ识别序列。
（2） 由（1）中重组质粒(约9.5kb)和图1 pYL（7.2 kb）数据可知，基因N约为2.3kb(2300个碱基对)。引物1和引物2可扩增基因N，由图2结果可初步判断实验组1的质粒成功插入了基因N。在第5组的PCR中，使用无菌水代替实验组模板DNA的目的是检验PCR中是否有外源DNA污染。
（3） 由题意可知，引物a可使模板中第240位脯氨酸的碱基序列替换为丙氨酸的碱基序列(GCA)，另一引物（引物b、c、d中的一条）可使第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为丙氨酸的碱基序列，因引物a和另一引物的配对模板相同，所以两条引物具有相同的部分序列。相关分析如图。
结合基因表达相关知识可知，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。
（4） 在（3）操作的基础上进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量，进行比较可选出最优香树脂醇合酶基因的改造方案。