【备考2026】高考生物一轮复习资源：第10单元 第54课时 基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)（课件）

这是一份【备考2026】高考生物一轮复习资源：第10单元 第54课时 基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)（课件），共113页。PPT课件主要包含了基因工程的基本工具，基因工程的概念，DNA分子，转基因，遗传特性，生物类型，基因重组，基因工程的理论基础，体之间转移，限制酶等内容，欢迎下载使用。
1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.DNA的粗提取与鉴定。4.阐明基因工程的基本操作程序。
考点一　基因工程的基本工具
考点二　基因工程的基本操作程序
源自选择性必修3 P68“科技探索之路”肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了____________________________ ；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的 有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种 、 和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件； 技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
DNA 可以在同种生物的不同个
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
3.DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理
①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
(1)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(2024·贵州，13D)(　　)(2)羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料(2020·海南，10A)(　　)
提示　羊属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核，不可作为提取DNA的材料。
(3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物(　　)
提示　向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞吸水涨破，DNA溶于蒸馏水，观察不到白色丝状物。
(4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行(2022·湖北，4A)(　　)
提示　动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行。
分析限制酶的作用和选择将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶
EcRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：
(1)限制酶EcRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是__________________________和_____________________。
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，
实验人员使用限制酶EcRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具1.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cli DNA连接酶连接
2.(2024·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
与DNA有关的几种酶的比较
考向二　DNA的粗提取与鉴定3.(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白 质杂质
4.(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是A.整个提取过程中可以不使用离心机B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用 和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取①人工合成目的基因。②PCR 和扩增目的基因a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据 的原理，在体外提供参与DNA复制的各种 与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行 的技术。b.PCR反应的条件：一定的 、DNA模板、2种 、4种_____ 、 DNA聚合酶，以及能自动调控 的仪器。
d.PCR产物的鉴定：常采用 来鉴定。
(1)耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。(2)引物(2种)的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(3)缓冲液的作用：维持反应体系pH稳定。(4)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
③通过构建 来获取目的基因。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代
(2)基因表达载体的组成及作用
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳
定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
4.目的基因的检测与鉴定
分析基因工程的基本操作程序接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：(1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有 。
用于筛选含有重组表达载体的细胞
(2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 并用 扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。________________________________________________________________________________。
染色体DNA(基因组DNA)
从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带
考向三　辨析基因工程的基本操作程序5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的 培养基中能形成菌落
双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
6.(2024·河池模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是A.将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有Xh Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA连接酶B.需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处 于一种易于吸收周围环境中DNA分 子的状态C.按图示构建的重组质粒导入大肠杆 菌后，大肠杆菌可正常表达该目的 基因D.在含X－gal的培养基上培养导入了 重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落
1.下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是A.与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料B.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低C.因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质D.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验E.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解F.加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌G.两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中H.将提取的丝状物溶解在2 ml/L NaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色
2.下列关于基因工程中工具酶的叙述，正确的是A.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取B.限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNAC.不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端D.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键 DNA 连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来
3.下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是A.基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等B.基因工程中用的载体大多数为天然质粒C.质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团D.必须具有自我复制能力E.具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入F.载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选
4.下列关于基因表达载体及其构建过程的说法，正确的是A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗 传给下一代C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止 密码子等结构D.基因表达载体的构建至少需要两种工具酶E.基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对F.诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达G.基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程
5.下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的A.农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受 体植物细胞的染色体DNA上B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌C.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内D.将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作E.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译F.某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)(2)EcR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)　(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
(1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解成葡萄糖　单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)　(2)NV基因　＞　突变体NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中碱基对增加而发生突变　(3)突变体　便于筛选出成功导入NV基因的细胞
(1)BglⅡ、BstE Ⅱ　—CATTG　(2)3　核酸染料(3)N　2、3　(4)A菌　B菌分解纤维素能力比A菌更强
一、选择题1.(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是A.限制酶失活，更换新的限制酶B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.(2024·石家庄调研)图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是A.在基因工程中若只用一种限制 酶完成对质粒和外源DNA的切 割，则可选EcR ⅠB.如果将一个外源DNA分子和一 个质粒分别用EcR Ⅰ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重 组DNA，此重组DNA中EcR Ⅰ切割位点有1个C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH Ⅰ和 HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因D.一个如图1所示的质粒分子经EcRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
3.(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
4.(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
5.(2025·黄石模拟)如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的是A.用PCR技术可检测GNA和 ACA基因是否导入棉花细 胞中B.将棉花细胞接种在含氨苄 青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞C.用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因D.与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向 正确
6.(2025·十堰调研)当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。
氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。如图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是
A.要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的 基因B.实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C.步骤④阶段使用的MS培养 基中要加入植物激素和卡那 霉素等物质D.为了评估目的基因抑制苹果 褐变的效果，可与导入含 pBI 121质粒的植株作对照
二、非选择题7.(2024·重庆，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是___________________________。
脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是_________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是___________________________________________________________________________________。
酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接)
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是_____。
酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是____________________________________________________________________。
品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更
8.(2024·贵州，21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示无)。
回答下列问题：(1)据表可推测______诱导了NV基因表达。NV酶的作用是______________________________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是___________________________________________(答出1点即可)。
代谢，将蔗糖分解成葡萄糖
时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等)
(2)表中突变体由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与________(填“T－DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度_____(填“>”“＝”或“