专题10 生物技术工程（3大模板）-2025年高考生物答题技巧与模板构建讲练（新高考通用）

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模板01 酶切位点的选择-既要相同又要不同
【核心】相同黏性末端，正确连接方向
酶切位点的选择实际上有许多需要考虑的逻辑，但核心点是两个：
要保证质粒和目的基因的黏性末端相同，才能让质粒和目的基因的黏性末端相互连接。
要保证基因的头对着启动子，尾对着终止子，才能保证正确的转录。
除这两个原则之外，很多题目还会有额外的信息，如基因中间或质粒其他位置存在相同酶切位点、同尾酶等，要根据题目信息具体判断。
【基本知识】
（1）限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
（2）限制酶的选择
1.不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
2.保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
3.善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
4.巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。

技巧01 酶切位点的选择-既要相同又要不同
研究人员为寻求炎症性疾病的高敏感检测方法，以重组S100A8蛋白作为免疫抗原，制备了抗S100A8蛋白的单克隆抗体。下图是重组S100A8蛋白的制备过程，结合下表4种相关限制酶的识别序列和切割位点，可知切割质粒的限制酶为（ ）

（注：S100A8蛋白是炎症反应时高度表达的一种蛋白质，可作为炎症性疾病诊断的重要标志物。）
A．Hind III和NcⅠB．BglⅡ和XhⅠ
C．NcⅠ和XhⅠD．HindⅢ和BglⅡ
【技巧点拨】【核心】相同黏性末端，正确连接方向-要保证质粒和目的基因的黏性末端相同，才能让质粒和目的基因的黏性末端相互连接；要保证基因的头对着启动子，尾对着终止子，才能保证正确的转录。
【思路详解】依据题干信息，S100A8蛋白基因经切割后所产生的黏性末端为5'CATG3'、5'TCGA3'，依据表格中限制酶的识别序列，可知，HindⅢ产生的黏性末端为5'AGCT3'，NcⅠ产生的黏性末端为5'CATG3'（与目的基因一端的粘性末端能碱基互补），BglⅡ产生的黏性末端为5'GATC3'，XhⅠ产生的黏性末端为5'TCGA3'（与目的基因另一端的粘性末端能碱基互补），为了确保目的基因和质粒的正向连接，防止自身环化，故应选择两种能产生不同的黏性末端的限制酶，所以可选NcⅠ和XhⅠ进行切割质粒，C正确，ABD错误。
【答案】C
研究人员用酶和酶两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（ ）
A．该DNA分子和质粒上均含有酶的一个切割位点和酶的一个切割位点
B．根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C．用T4D NA连接酶或E.cli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D．片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
【答案】D
【分析】1、分析图形：图中所示的是酶M和酶N两种限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒的结果。
2、限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的；
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性；
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
【详解】A、该DNA分子经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了三个DNA片段且两个切口形成的黏性末端不同，说明该DNA分子含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点；质粒为环状DNA，其经酶M和酶N两种限制酶切割后，产生了两个DNA片段，观察两个切口形成的黏性末端，可推出质粒含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点，A正确；
B、根据图中黏性末端可知，酶M和酶N识别的序列可能是或，但无法确定其对应关系，B正确；
C、图中经酶切后形成的片段均是黏性末端，T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也可以“缝合”双链DNA片段的平末端，而E.cliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，片段乙和片段丁黏性末端互补，C正确；
D、根据图中黏性末端可知，片段乙、片段丁、片段戊三个片段不能连接成环状DNA分子，D错误。
模板02 双标记筛选金标准—二去其一是为真
【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体
双标记让载体具有两个标记性状，如四环素抗性和青霉素抗性，在基因表达载体的构建中会破坏其中一个，如破坏四环素抗性，含有目的基因的基因表达载体此时只有青霉素抗性，而空载体依然具有四环素抗性和青霉素抗性，通过在培养基中添加四环素，可以区分出含有目的基因的载体和空载体。
标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养基中加入该种抗生素就可以只保留成功转入载体且抗生素抗性基因表达的受体细胞。
双标记原理
单标记的区分问题：仅有一个标记基因时，含有目的基因的载体和空载体都有标记，在筛选时无法区分。
双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组载体的细菌和含空载体的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布将上述5个菌落影印到含有四环素的培养基上，如上图，能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
标记基因的作用：在宏观水平上看到微观分子的变化，例如抗生素抗性基因作为标记基因时，可以用抗生素筛选出具有抗药性的菌落，从而快速对转基因的结果进行鉴定。标记基因本身也是一个能正常表达的基因，具有自己的启动子和终止子。
受体细胞不同，标记基因种类也不同：受体细胞为细菌时，标记基因通常是抗生素抗性基因；受体细胞为真核细胞，尤其是动植物细胞时，抗生素很多时候不能杀死未标记的细胞，无法起到筛选的效果，此时标记基因通常选择荧光基因等。
技巧02 失去一个标记基因的载体才是好载体
（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【技巧点拨】【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体-双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。
【思路详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
【答案】D
（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
【答案】C
【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
1．Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如表所示。某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（ ）
A．两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同
B．能被Sau3AI识别的DNA位点均能被BamHI识别
C．该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点
D．该DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6个片段
【答案】C
【详解】A、BamHI和Sau3AI两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC，A错误；
B、分析表格可知，BamHI的识别序列为GGATCC，Sau3AI的识别序列为GATC，由此可知，能被BamHⅠ识别的序列中包含了被Sau3AI识别的序列，所以能被BamHⅠ识别的序列也一定能被Sau3AI识别，但能被Sau3AI识别的DNA位点不一定能被BamHI识别，B错误；
C、分析题意，某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段，由此可知，该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点，C正确；
D、该DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，有2个BamHI的酶切位点，但是BamHI识别序列中包含Sau3AI的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。
2．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA溶于2ml/LNaCl溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶I和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
【答案】D
【详解】A、由于蛋白质可溶于酒精，而DNA在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA时加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA析出，A正确；
B、由于DNA在2ml/LNaCl溶液中溶解度较大，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA溶于2ml/LNaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B正确；
C、DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，C正确；
D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。
3．BamHI、MbI、SmaI三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-G↓GATCC-3'、5'↓GATC-3'、5′-CCC↓GGG-3'。下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（ ）
A．若用SmaI完全切割该DNA，则其产物的长度为634bp、896bp、758bp
B．若虚线方框内的碱基对被T-A替换，则用SmaI完全切割该DNA可产生3种片段
C．若用MbI和BamHI切割DNA，可形成相同的黏性末端
D．用SmaI切割DNA产生的片段，可用E．cliDNA连接酶重新将其连接
【答案】C
【详解】A、限制酶SmaⅠ的酶切位点是5′-CCC↓GGG-3'，在图1中有两个限制酶SmaⅠ的酶切位点，DNA将被切割成三个片段，结合图解，三个片段的长度分别是637bp、890bp、761bp，A错误；
B、发生碱基对替换后，基因中只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点，用SmaI完全切割后出现长度分别是634+896-3=1527bp、761bp的两种片段，B错误；
C、由题可知，MbI和BamHI识别序列的中间序列相同，因此若用MbI和BamHI切割DNA，可形成相同的黏性末端，C正确；
D、用SmaI切割DNA产生的片段产生的是平末端，E.cliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，
4．从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（ ）

A．②，BamHⅠB．①，EcRⅠ
C．①，EcRⅠ和HindⅢD．②，EcRⅠ和HindⅢ
【答案】C
【详解】分析图1可知，重组质粒被EcRⅠ酶切后，得到5.8kb的片段，说明重组质粒中只有一个EcRⅠ的酶切位点；重组质粒被BamHⅠ酶切后产生3.8kb和2.0kb两种片段，说明重组质粒中有2个BamHⅠ的酶切位点；重组质粒被EcRⅠ和HindⅢ酶切后，产生4.5kb和1.3kb两种片段，说明重组质粒中有EcRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且二种酶切位点之间的片段为4.5kb和1.3kb。结合图2分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，重组质粒②中EcRⅠ和HindⅢ酶切位点之间的片段为2.3kb和3.5kb，不符合图1酶切的结果。综上所述，C正确，ABD错误。
5．如图表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n分别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（ ）
A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcⅠ
C．据图推测，目的基因S转录的模板链最可能是b链
D．SUC2可作标记基因，对导入B的酵母菌进行筛选
【答案】C
【详解】A、过程①表示RNA→DNA，是逆转录，需要逆转录酶和DNA聚合酶，A正确；
B、②过程为对DNA进行切割形成黏性末端，需要两种限制性内切酶，因目的基因的黏性末端序列分别为5'-GATC-3'、3'-GATC-5'，然后结合表格中给出的限制酶的识别序列和酶切位点，确定选用的两种酶分别是Sau3AⅠ、NcI，B正确；
C、结合质粒上限制酶的酶切位点可知，目的基因a链位于图中重组质粒的内侧，b链位于外侧；而转录方向为m→n，为确保转录产物从5'→3'延伸，因此转录只能从模板链的为3'端开始，因此a链是模板链，C错误；
D、SUC2作为B上的标记基因，可以对导入B的酵母菌进行筛选，D正确。
6．下列有关实验操作的说法，正确的是（ ）
A．克隆时，用载体或蛋白酶合成抑制剂激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程
B．电泳时，将PCR产物与含有染色剂的凝胶载样缓冲液混合后，加入点样孔
C．提取DNA时，在研磨液中加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液
D．体外受精时，用高浓度的ATP溶液处理采集到的精子使其获能
【答案】A
【详解】A、用电刺激、Ca2+载体、乙醇或蛋白酶合成抑制剂等方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，A正确；
B、载样缓冲液中的指示剂不与DNA结合，起到指示电泳进程的作用，凝胶中的DNA分子通过与核酸染料结合，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B错误；
C、提取DNA时，将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去沉淀物，收集上清液，C错误；
D、精子获能指的是获得受精的能力，而不是获得能量，采集到的精子需用专门的获能液处理使其获能，D错误。
7．由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E，图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（ ）

A．构建重组载体P时，应选择EcRV或SmaI进行酶切，再用T4DNA连接酶连接
B．要使中间载体P接入载体E，同时防止自身环化，可选用XhI和PstI进行酶切
C．载体P不能作为基因表达载体，因为它不含起始密码子和终止密码子
D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞
【答案】B
【详解】AB、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhI和PstI酶识别序列，故可选用XhI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，连接平末端只能用T4DNA连接酶，A错误，B正确；
C、由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，C错误；
D、受体细胞表现出··抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。
8．如图表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n分别是启动子和终止子。下表中是可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（ ）

A．过程①所需的酶是逆转录酶和DNA聚合酶
B．过程②所使用的两种限制酶是Sau3AⅠ和NcⅠ
C．据图推测，目的基因S转录的模板链最可能是b链
D．SUC2可作标记基因，对导入B的酵母菌进行筛选
【答案】C
【详解】A、过程①表示RNADNA双链的过程，其中需经过RNADNA单链DNA双链，所以过程①所需的酶是逆转录酶和DNA聚合酶，A正确；
B、②过程为对DNA进行切割形成黏性末端，需要两种限制性核酸内切酶，从黏性末端可看出是识别序列分别为5'-G↓GATCC-3'/5'-↓GATC-3'、5'-C↓CATGG-3'，因此选用的两种酶分别是NheI/Sau3A Ⅰ、NcI，B正确；
C、结合质粒上限制酶酶切位点可知，目的基因的上链位于重组质粒的内侧，下链位于外侧，转录方向为m→n，且转录只能从模板链的为3'端开始，因此上链（a链）是模板链（3'→5'方向与m→n相同），C错误；
D、SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，SUC2作为B上的标记基因，可以对导入B的酵母菌进行筛选，D对。
9．转Bt基因抗虫棉可以有效杀死棉铃虫，其原理是Bt基因表达的产物Bt抗虫蛋白能与棉铃虫肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，使细胞膜穿孔，导致棉铃虫死亡。下列相关叙述错误的是（ ）
A．转Bt基因抗虫棉的培育利用的原理是基因重组
B．Bt基因在抗虫棉细胞中表达需要经过转录和翻译过程
C．培育转基因抗虫棉时，导入Bt基因的受体细胞不能是棉花的叶肉细胞
D．若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，可能会影响抗虫效果
【答案】C
【详解】A、转Bt基因抗虫棉的培育过程，利用的是转基因技术，其原理是基因重组，A正确；
B、Bt基因在抗虫棉细胞中表达需要经过Bt基因mRNABt抗虫蛋白的过程，B正确；
C、培育转基因抗虫棉时，导入Bt基因的受体细胞可以是棉花的叶肉细胞，C错误；
D、若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，则Bt抗虫蛋白就不能与其结合，进而不会使细胞膜穿孔，棉铃虫不会死亡，影响抗虫效果，D正确。
10．某科研小组用PCR扩增酵母菌的rRNA基因。PCR包括多个循环，每个循环可以分为变性、退火、延伸3个步骤。下列叙述正确的是（ ）
A．设计引物时需知道rRNA基因的部分序列
B．延伸时间取决于酵母菌基因组DNA的长度
C．引物浓度大小不会影响PCR扩增获得酵母菌rRNA基因的数量
D．PCR反应前常对微量离心管进行离心以确保反应液分散于管内
【答案】A
【详解】A、PCR扩增需要引物，设计引物时需知道rRNA基因的部分序列，A正确；
B、延伸时间取决于需要扩增部分的长度，不是基因组DNA长度，B错误；
C、复制需要引物与模板结合，每条DNA链复制都需要消耗一个引物，故引物浓度大小会影响 PCR扩增获得酵母菌rRNA基因的数量，C错误；
D、 PCR反应前常对微量离心管进行离心以确保反应液集中在管底部，D错误。
11．利用pBR322质粒将人胰岛素基因导入大肠杆菌（如图1）可进行工业化生产。为检验基因表达载体是否成功导入，将处理后的大肠杆菌接种在培养基上，长出的四个菌落用无菌纸分别盖印至四种不同的培养基上（如图2，菌落相对位置不变），菌落生长状况如图所示，则成功导入基因表达载体的菌落是（ ）
A．菌落1、2、3B．菌落1
C．菌落2、3D．菌落4
【答案】C
【详解】从图1看出，胰岛素基因和pBR322质粒都用了限制酶BamHⅠ进行切割，而质粒上的BamHⅠ切割位点在抗四环素基因的位置，因此基因表达载体不抗四环素，但由于含有抗氨苄青霉素基因，所以该导入成功的细菌可以抗氨苄青霉素，即菌落不能在含有四环素的培养基上生长，但能够在含有青霉素的培养基上生长；
从图2看出，菌落2和菌落3在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但不能在含有四环素的培养基上生长，因此菌落2、3 是成功导入基因表达载体的菌落。
12．乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程如图，质粒中LacZ基因可使细菌能够利用物质X-gal，从而使菌落呈现蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述错误的是（ ）
A．过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度及比例等有关
B．过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落
C．大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，可用抗原—抗体杂交法进行检测
D．该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高
【答案】B
【详解】A、①获取目的基因，构建重组质粒过程中，增加载体和目的基因的浓度及比例，可以增加目的基因与质粒碰撞机会，提高目的基因和载体重组的效率，A正确；
B、过程表②示将重组质粒导入受体细胞，培养基中加青霉素和X-gal可以用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌，BamHI和EcRI由于破坏了质粒中LacZ基因，却保留了青霉素抗性基因，故白色的大肠杆菌菌落才为所需菌落，B错误；
C、乙肝病毒外壳为蛋白质，可用抗原—抗体杂交法检测大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，C正确；
D、基因工程疫苗由于只利用了乙肝病毒的外壳，不含其遗传物质，所以不能完成病毒的增殖和感染，D对。
13．在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β-半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β-半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题：
(1)使用限制酶 和 对质粒和插入DNA片段进行切割。
(2)在转化大肠杆菌前，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
(3)重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是 。
(4)将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X-gal的培养基中培养，若观察到 色菌落，可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是 。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是 。
(5)溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是 。
【答案】(1) HindIII BamHI
(2)Ca2＋
(3)启动子
(4) 蓝 大肠杆菌缺失内源性β-半乳糖苷酶基因，导入成功的大肠杆菌含有的重组质粒中含有β-半乳糖苷酶基因，表达出的β-半乳糖苷酶分解X-gal产生蓝色 目的基导入不成功
(5)切割β-半乳糖苷酶和胰岛素A链结合而成的融合蛋白，获得成熟的人的胰岛素
【详解】（1）据图分析，EcRI和EcRV都会破坏目的基因，故不能选择，且SacI会破坏复制原点，也不能选择，则目的基因左侧只能选择BamHI，右侧应选择与质粒共同的酶，即HindIII，故使用限制酶BamHI和HindIII对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可用于驱动基因的转录，故重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是启动子。
（4）分析题意，大肠杆菌缺失内源性β-半乳糖苷酶基因，若导入成功，则重组质粒中含有β-半乳糖苷酶基因，表达出的β-半乳糖苷酶分解X-gal产生蓝色；另一种颜色（白色）的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是导入率并非100%，故可能是因为导入不成功。
（5）在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β-半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端 ，溴化氰可以切割β-半乳糖苷酶和胰岛素A链结合而成的融合蛋白，获得成熟的人的胰岛素。
14．科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大肠杆菌，以期获得能监测生物组织或环境中四环素水平的“报警器”。限制酶识别序列及切割位点如下表。TetR基因是一种转录调节基因，GFp基因为绿色荧光蛋白基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ri为复制原点。请回答下列问题：
(1)使用工具酶拼接DNA片段1和2，拼接后的片段连接处部分序列为5＇ 3＇（写出6个碱基），TetR基因和GFP基因转录的模板链 （“是”或“不是”）该拼接DNM的同一条链。
(2)构建重组质粒时，选择 对质粒和拼接的DNA片段进行酶切，在DNA连接酶的作用下恢复 键。再根据 的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
(3)将重组质粒导入经 理的大肠杆菌后，在含 的固体培养基中筛选出工程菌。
(4)工程菌监测四环素的原理如图2，当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌 （能/不能）发出荧光，其原因是 。
【答案】(1) TCTAGT或ACTAGA 不是
(2) BamHⅠ，EcRⅠ 磷酸二酯键 琼脂糖凝胶电泳
(3) CaCl2 氨苄青霉素
(4) 能 当环境中含四环素时，抑制TctR蛋白作用增强，解除TctR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光
【详解】（1）据图1分析可知，DNA片段1两端的限制酶识别序列分别是Xba Ⅰ和EcR Ⅰ，而DNA片段2两端的限制酶识别序列是Spe Ⅰ和BamH Ⅰ，若要让两个DNA片段连接在一起，需要经酶切后获得相同的黏性末端。据表格分析，XbaⅠ和SpeⅠ酶切能获得相同的黏性末端，因此DNA片段1用XbaⅠ酶切，DNA片段2用SpeⅠ酶切，然后在用DNA连接酶将两个DNA片段连接在一起，由于无法得知DNA片段两条链具体的方向，所以在特定工具酶作用下能成功拼接的位点处碱基序列为5’-TCTAGT-3’或5’-ACTAGA-3’；DNA片段1和DNA片段2连接后，两个片段启动子方向相反，故TetR基因和GFP基因转录的模板链不是该拼接DNA的同一条链。
（2）据图可知，重组质粒含有3种酶的酶切位点，且使用工具酶拼接DNA片段1和2后两端的酶是BamHⅠ，EcRI，故构建重组质粒时，选择BamHⅠ，EcRⅠ对质粒和拼接的DNA片段进行酶切；在DNA连接酶的作用下恢复磷酸二酯键；琼脂糖凝胶电泳可以将不同大小的DNA片段分离开，故根据琼脂糖凝胶电泳的结果判断重组质粒的大小是否符合预期。
（3）钙离子能促进细菌摄 取外源的 DNA，科学家常使用 CaCl2溶液制备感受态细胞，使其处于感受态；图示重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，故将重组质粒导入经CaCl2处理的大肠杆菌后，在含氨苄青霉素的固体培养基中筛选出工程菌。
（4）分析题图可知，当环境中含四环素时，抑制TetR蛋白作用增强，解除TetR蛋白对启动子2的抑制作用，使GFP基因能表达出绿色荧光蛋白（GFP蛋白）而发光，因此当环境中含四环素时，该大肠杆菌工程菌能发出绿色荧光。
命题点
真题在线
常见设问/关键词
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设问关键词：限制酶的选择、目的基因的鉴定、PCR过程
植物体细胞杂交技术
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命题预测
基因表达载体的构建；标记基因的选择
关键技巧
目的基因和载体的酶切和连接是设计的核心；根据题目的具体信息判断保留和破坏的标记基因的类型
HindⅢ
NcⅠ
BglⅡ
XhⅠ
5＇-A↓AGCTT-3＇
5＇-C↓CATGG-3＇
5＇-A↓GATCT-3＇
5＇-C↓TCGAG-3＇
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHI
G↓GATCC
Sau3AI
↓GATC
限制酶
BamHⅠ
NheⅠ
NcⅠ
SphⅠ
Sau3AⅠ
识别序列和酶切位点
5'-G↓GATCC-3'
5'-G↓CTAGC-3'
5'-C↓CATGG-3'
5'-GCATG↓C-3'
5'-↓GATC-3'
限制酶
BamHⅠ
NheⅠ
NcⅠ
SphⅠ
Sau3AⅠ
识别序列和酶切位点
限制酶
EcRⅠ
XbaⅠ
SpeⅠ
BamHⅠ
识别序列及切割位点