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高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具学案
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这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具学案，共14页。
[学习目标] 阐明重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
一、基因工程的概念和工具酶
1．基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．基因工程的工具酶
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
②种类
判断正误
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种( )
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( )
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同( )
答案 (1)√ (2)× (3)× (4)×
解析 (2)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(3)DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(4)限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
任务一：基因工程的理论基础
1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
提示 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
2．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
提示 (1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
3．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
提示 (1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。
任务二：限制性内切核酸酶(限制酶)
1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
提示 不能。
(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
提示 断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
2．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
提示 限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
3．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhⅠ切割形成的黏性末端。
提示 SpeⅠ： HindⅢ：
XbaⅠ： XhⅠ：
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示 同种限制酶产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能会形成相同的黏性末端。
(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
提示 限制酶XbaⅠ；因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能再被所用的限制酶识别；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
与DNA相关的几种酶的比较
拓展延伸
1．回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcRⅠ限制酶识别的DNA序列为eq \(=======,\s\up7(GAATTC),\s\d5(CTTAAG))，为回文序列。
2．同尾酶
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1．以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是( )
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为eq \a\vs4\al\c1(GAATT,CTTAA)的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
答案 D
解析 图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，A错误；②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是( )
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
答案 A
解析 DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
2．常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
判断正误
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体( )
(3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同( )
(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体( )
答案 (1)× (2)√ (3)× (4)×
解析 (1)作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。(3)载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜中的载体的成分是蛋白质。(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶。
任务三：载体需具备的条件和载体的选择
1．载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
提示 具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
2．要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
提示 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
3．我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
提示 具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
4．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
提示 合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
5．若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
提示 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3．(2023·贵州安顺高二联考)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
答案 D
解析 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA上后复制，C错误。
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
A.①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
答案 A
题组一 基因工程的概念和工具酶
1．玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是( )
A．该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B．该技术的操作环境是生物体内
C．该技术的原理是基因重组
D．该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
答案 B
解析 由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。
2．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是( )
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
答案 D
解析 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
3．据图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是( )
A．限制性内切核酸酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
答案 D
解析 限制酶可以切断脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，即a处，A正确；DNA聚合酶可以连接脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，即a处，B正确；解旋酶可以使氢键断裂，即b处，C正确；DNA连接酶可以连接DNA片段形成磷酸二酯键，即a处，D错误。
4．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是( )
A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C．E.cli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
答案 B
解析 DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。
5．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图所示为四种限制酶BamH Ⅰ、EcR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ 的识别序列，箭头表示每一种限制酶的特定切割位点，切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的是 (限制酶)，其正确的末端互补序列应该为( )
A．BamH Ⅰ 和EcR Ⅰ；末端互补序列为AATT—
B．BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ；末端互补序列为GATC—
C．EcR Ⅰ 和Hind Ⅲ；末端互补序列为AATT—
D．BamH Ⅰ 和Bgl Ⅱ；末端互补序列为GATC—
答案 D
6．(2023·江苏南京高二期中)下列关于如图所示黏性末端的说法，错误的是( )
A．DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
B．甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的
C．切割甲的限制酶也能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
D．甲、乙黏性末端可形成重组DNA分子
答案 C
解析 切割甲的限制酶的识别序列是－GAATTC－，切割乙的限制酶的识别序列是－CAATTG－，所以甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的，B正确；甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列是－CAATTC－，而切割甲的限制酶的识别序列是－GAATTC－，所以该限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，C错误。
题组二 “分子运输车”——载体
7．质粒是基因工程中常用的载体。下列有关质粒的说法，正确的是( )
A．质粒上的基因表达不遵循中心法则，所以可用作外源DNA分子的载体
B．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
C．质粒上的抗生素合成基因可作为标记基因
D．作为外源DNA分子的载体，质粒需具有限制酶能够切割的位点
答案 D
解析 质粒上的基因表达遵循中心法则，A错误；标记基因是用于重组质粒的筛选和鉴定，与目的基因的表达无关，B错误；质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，用于重组质粒的筛选和鉴定，C错误。
8．(2023·河北秦皇岛高二期末)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．基因工程中使用的载体只有质粒
B．质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
答案 B
解析 基因工程中常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等，A错误；噬菌体是专门寄生在细菌体内的病毒，不可以作为动物基因工程的载体，C错误；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造，D错误。
9．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列有关说法正确的是( )
A．BamH Ⅰ 切割的是氢键，Alu Ⅰ 切割的是磷酸二酯键
B．Sau3A Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还能被Sau3A Ⅰ 切割
C．DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D．E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低
答案 B
解析 BamH Ⅰ 与Alu Ⅰ 切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamH Ⅰ 切割，Sau3A Ⅰ 切割，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后能被Sau3A Ⅰ 切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E.cliDNA连接酶是从大肠杆菌中获得的DNA连接酶，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
10．某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关叙述不正确的是( )
A.a酶与b酶切断的化学键相同
B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C．a酶与b酶切割该DNA分子位点分别有3个和5个
D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
答案 C
解析 限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出a酶和b酶切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，B正确；由表格中可以看出，a酶可以把原有DNA切成4段，说明该DNA分子上有3个切口，即a酶的切割位点有3个；b酶把大小是2 100 bp的DNA切成大小分别为1 900 bp和200 bp两个片段，再把大小是1 400 bp的DNA切成大小分别为800 bp和600 bp两个片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切口，即b酶的切割位点有2个，C错误。
11．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )
A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
答案 B
解析 用限制酶酶切获得一个外源基因时，得到两个切口，有4个磷酸二酯键被断开，A错误；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。
12．(2023·福建泉州高二期末)如表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是( )
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A．限制酶SmaⅠ切割后形成的末端可用E.cli DNA连接酶连接
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成不同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 B
解析 限制酶SmaⅠ的切割位点在中轴线上，切割后形成平末端，E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，A错误；一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。
13．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制酶切割DNA分子后产生的DNA片段，其末端类型通常有 和 。
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：
eq \b\lc\ \rc\ (\a\vs4\al\c1(AATTC……G, G……CTTAA))
该酶识别的序列为 ，切割的部位是 。
(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是 。
(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即 DNA连接酶和 DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。
(5)基因工程中除质粒外， 和 也可作为载体。
答案 (1)黏性末端 平末端 (2) eq \b\lc\ \rc\ (\a\vs4\al\c1(—GAATTC—,—CTTAAG—))
G和A之间的磷酸二酯键 (3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同 (4)T4 E.cli
(5)噬菌体 动植物病毒
解析 (2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶Y切割，说明限制酶Y与限制酶X切割产生的黏性末端相同。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E.cli DNA连接酶。
14．(2021·全国乙，38节选)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，题图中 酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接，题图中 切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
答案 (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一至多个限制酶的切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
解析 (1)限制酶EcRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割形成的是平末端，E.cli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.cli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的插入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。来源
主要来自原核生物
种类
数千种
作用
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
结果
产生黏性末端或平末端
种类
来源
特点
E.cli DNA连接酶
大肠杆菌
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
T4 DNA连接酶
T4噬菌体
既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低
项目
DNA连接酶
限制酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
作用对象
DNA片段
DNA
单个的脱氧核苷酸
DNA
作用结果
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
条件
原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
插入点
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况
细菌在含四环素的培养基上的生长状况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
2 100；1 400；1 000；500
1 900；200；800；600；1 000；500
限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHⅠ
KpnⅠ
EcRⅠ
Sau3AⅠ
HindⅡ
SmaⅠ
[学习目标] 阐明重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
一、基因工程的概念和工具酶
1．基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．基因工程的工具酶
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
②种类
判断正误
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种( )
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( )
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同( )
答案 (1)√ (2)× (3)× (4)×
解析 (2)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(3)DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(4)限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
任务一：基因工程的理论基础
1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
提示 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
2．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
提示 (1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
3．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
提示 (1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。
任务二：限制性内切核酸酶(限制酶)
1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
提示 不能。
(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
提示 断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
2．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
提示 限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
3．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhⅠ切割形成的黏性末端。
提示 SpeⅠ： HindⅢ：
XbaⅠ： XhⅠ：
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示 同种限制酶产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能会形成相同的黏性末端。
(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
提示 限制酶XbaⅠ；因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能再被所用的限制酶识别；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
与DNA相关的几种酶的比较
拓展延伸
1．回文序列
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcRⅠ限制酶识别的DNA序列为eq \(=======,\s\up7(GAATTC),\s\d5(CTTAAG))，为回文序列。
2．同尾酶
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1．以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是( )
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为eq \a\vs4\al\c1(GAATT,CTTAA)的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
答案 D
解析 图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，A错误；②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是( )
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
答案 A
解析 DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。
二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
2．常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(2)质粒作为载体所具备的条件及原因
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
判断正误
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体( )
(3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同( )
(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体( )
答案 (1)× (2)√ (3)× (4)×
解析 (1)作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。(3)载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜中的载体的成分是蛋白质。(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶。
任务三：载体需具备的条件和载体的选择
1．载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
提示 具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
2．要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
提示 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
3．我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
提示 具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
4．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
提示 合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
5．若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
提示 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3．(2023·贵州安顺高二联考)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
答案 D
解析 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA上后复制，C错误。
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
A.①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
答案 A
题组一 基因工程的概念和工具酶
1．玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是( )
A．该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B．该技术的操作环境是生物体内
C．该技术的原理是基因重组
D．该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
答案 B
解析 由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。
2．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是( )
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
答案 D
解析 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
3．据图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是( )
A．限制性内切核酸酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
答案 D
解析 限制酶可以切断脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，即a处，A正确；DNA聚合酶可以连接脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，即a处，B正确；解旋酶可以使氢键断裂，即b处，C正确；DNA连接酶可以连接DNA片段形成磷酸二酯键，即a处，D错误。
4．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是( )
A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C．E.cli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
答案 B
解析 DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。
5．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图所示为四种限制酶BamH Ⅰ、EcR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ 的识别序列，箭头表示每一种限制酶的特定切割位点，切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的是 (限制酶)，其正确的末端互补序列应该为( )
A．BamH Ⅰ 和EcR Ⅰ；末端互补序列为AATT—
B．BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ；末端互补序列为GATC—
C．EcR Ⅰ 和Hind Ⅲ；末端互补序列为AATT—
D．BamH Ⅰ 和Bgl Ⅱ；末端互补序列为GATC—
答案 D
6．(2023·江苏南京高二期中)下列关于如图所示黏性末端的说法，错误的是( )
A．DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
B．甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的
C．切割甲的限制酶也能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
D．甲、乙黏性末端可形成重组DNA分子
答案 C
解析 切割甲的限制酶的识别序列是－GAATTC－，切割乙的限制酶的识别序列是－CAATTG－，所以甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的，B正确；甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列是－CAATTC－，而切割甲的限制酶的识别序列是－GAATTC－，所以该限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，C错误。
题组二 “分子运输车”——载体
7．质粒是基因工程中常用的载体。下列有关质粒的说法，正确的是( )
A．质粒上的基因表达不遵循中心法则，所以可用作外源DNA分子的载体
B．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
C．质粒上的抗生素合成基因可作为标记基因
D．作为外源DNA分子的载体，质粒需具有限制酶能够切割的位点
答案 D
解析 质粒上的基因表达遵循中心法则，A错误；标记基因是用于重组质粒的筛选和鉴定，与目的基因的表达无关，B错误；质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，用于重组质粒的筛选和鉴定，C错误。
8．(2023·河北秦皇岛高二期末)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．基因工程中使用的载体只有质粒
B．质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体
D．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞
答案 B
解析 基因工程中常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等，A错误；噬菌体是专门寄生在细菌体内的病毒，不可以作为动物基因工程的载体，C错误；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造，D错误。
9．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列有关说法正确的是( )
A．BamH Ⅰ 切割的是氢键，Alu Ⅰ 切割的是磷酸二酯键
B．Sau3A Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还能被Sau3A Ⅰ 切割
C．DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D．E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低
答案 B
解析 BamH Ⅰ 与Alu Ⅰ 切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamH Ⅰ 切割，Sau3A Ⅰ 切割，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后能被Sau3A Ⅰ 切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E.cliDNA连接酶是从大肠杆菌中获得的DNA连接酶，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
10．某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关叙述不正确的是( )
A.a酶与b酶切断的化学键相同
B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C．a酶与b酶切割该DNA分子位点分别有3个和5个
D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
答案 C
解析 限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出a酶和b酶切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，B正确；由表格中可以看出，a酶可以把原有DNA切成4段，说明该DNA分子上有3个切口，即a酶的切割位点有3个；b酶把大小是2 100 bp的DNA切成大小分别为1 900 bp和200 bp两个片段，再把大小是1 400 bp的DNA切成大小分别为800 bp和600 bp两个片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切口，即b酶的切割位点有2个，C错误。
11．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )
A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
答案 B
解析 用限制酶酶切获得一个外源基因时，得到两个切口，有4个磷酸二酯键被断开，A错误；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。
12．(2023·福建泉州高二期末)如表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是( )
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A．限制酶SmaⅠ切割后形成的末端可用E.cli DNA连接酶连接
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成不同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案 B
解析 限制酶SmaⅠ的切割位点在中轴线上，切割后形成平末端，E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，A错误；一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。
13．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制酶切割DNA分子后产生的DNA片段，其末端类型通常有 和 。
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：
eq \b\lc\ \rc\ (\a\vs4\al\c1(AATTC……G, G……CTTAA))
该酶识别的序列为 ，切割的部位是 。
(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是 。
(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即 DNA连接酶和 DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。
(5)基因工程中除质粒外， 和 也可作为载体。
答案 (1)黏性末端 平末端 (2) eq \b\lc\ \rc\ (\a\vs4\al\c1(—GAATTC—,—CTTAAG—))
G和A之间的磷酸二酯键 (3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同 (4)T4 E.cli
(5)噬菌体 动植物病毒
解析 (2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶Y切割，说明限制酶Y与限制酶X切割产生的黏性末端相同。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E.cli DNA连接酶。
14．(2021·全国乙，38节选)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，题图中 酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接，题图中 切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
答案 (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一至多个限制酶的切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
解析 (1)限制酶EcRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割形成的是平末端，E.cli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.cli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的插入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。来源
主要来自原核生物
种类
数千种
作用
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
结果
产生黏性末端或平末端
种类
来源
特点
E.cli DNA连接酶
大肠杆菌
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
T4 DNA连接酶
T4噬菌体
既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低
项目
DNA连接酶
限制酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
作用对象
DNA片段
DNA
单个的脱氧核苷酸
DNA
作用结果
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
条件
原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
插入点
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况
细菌在含四环素的培养基上的生长状况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
2 100；1 400；1 000；500
1 900；200；800；600；1 000；500
限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHⅠ
KpnⅠ
EcRⅠ
Sau3AⅠ
HindⅡ
SmaⅠ
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