高中生物第1节 重组DNA技术的基本工具完美版ppt课件

这是一份高中生物第1节 重组DNA技术的基本工具完美版ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了转基因抗虫棉，限制性内切核酸酶，EcoRⅠ，HindI，HindII，HindIII，DNA连接酶，其他载体等内容，欢迎下载使用。

Transgenic insect resistant cttn
转基因抗虫棉与普通棉花相比
数据来源：《我国转基因棉花的发展状况及存在问题》
产生能毒杀害虫的某种蛋白质对人体无害
为什么苏云金杆菌的Bt毒蛋白基因能转移至棉花细胞中，并表达出相同的对害虫有毒害作用的蛋白质？
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则
③ 生物界共同一套遗传密码
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。
genetic engineering
转基因、基因编辑等技术
究竟使用了哪些“分子工具”？
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
Basic tls fr recmbinant DNA technlgy
《生物技术与工程》 第三章 基因工程 第1节
对DNA进行改造和拼接
将体外重组DNA导入受体细胞
Restrictin endnuclease
切割DNA分子的工具，又称限制酶
主要是原核生物 数千种
① 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
一般由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
② 断开特定部位的磷酸二酯键
例如：EcRI 限制酶
从大肠杆菌R型菌株中分离提纯出来
①特异性识别GAATTC序列
②切割G和A之间的磷酸二酯键
切点在识别序列中轴线两侧
例如：SmaⅠ限制酶
从粘质沙雷氏菌中分离提纯出来
①特异性识别CCCGGG序列
②切割C和G之间的磷酸二酯键
切点在识别序列中轴线上
1、请写出下列限制酶切割形成的黏性末端
2、两种来源不同的DNA，用同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
提示：由于限制酶的专一性，同种限制酶切割产生的黏性末端相同
3、不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示：不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端
4、限制酶在原核生物中的作用是什么？
提示：限制酶是一种防御工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，保证自身的安全。
5、为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
提示：因为含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或不具备这种限制酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
6、限制酶与DNA水解酶有何不同？
都能催化磷酸二酯键断开
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
属名Escherichia首字母
从中分离的第一个限制酶
流感嗜血杆菌(Haemphilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
两种来源不同的DNA，如果能产生相同的黏性末端
1、DNA连接酶“缝合”的是DNA的哪个部分？
提示：“缝合”被限制酶切割的磷酸二酯键
将双链DNA分子片段缝合起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
注意：连接平末端的效率相对较低
2、DNA连接酶与DNA聚合酶有什么不同？
参与DNA复制，以DNA的一条链为模板，通过碱基互补，将游离的脱氧核苷酸聚合成与模板链互补的一条子链。
都能催化形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
练习使用EcR I和DNA连接酶重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列
找到两条片段上EcR I的识别序列和切割位点，用剪刀进行“切割”，待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
问题1：剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
提示：剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
问题2：要将某个特定基因插入另一个DNA分子中，需要用限制酶至少切开几个切口？
提示：至少要切3个切口，产生6个黏性末端。
目的基因两侧各1个切口，DNA分子上1个切口
问题3：为什么切割特定基因和DNA，一般要使用同一种限制酶？
提示：使特定基因两侧和DNA切口上产生相同的黏性末端，便于之后双方拼接。
与核酸相关的几种酶的比较
将RNA片段水解为单个核糖核苷酸
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将双链DNA分子局部解旋为单链
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
以RNA为模板，合成DNA
以RNA为模板，合成RNA
外源基因很难进入细胞，进入后也不容易稳定存在并表达，怎么解决这个问题呢？
基因进入受体细胞的载体
Vectrs fr gene entry int recipient cells
将外源基因送入细胞的工具
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
① 有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因
问题2：携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，需要具备什么条件？
② 能在受体细胞中稳定保存并复制
问题3：为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
③ 具有特殊的标记基因，用于筛选含重组DNA分子的细胞。
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
也可以用荧光蛋白基因做标记。
独立于细胞核或拟核之外环状双链DNA分子
细菌、霉菌和酵母菌等的细胞质
侵染动物或植物细胞的病毒
(1)限制酶只能用于切割目的基因 (　　)(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 (　　)(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 (　　)(4)E·cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 (　　)(5)限制酶也可以识别和切割RNA (　　)(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶 (　　)(7)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达 (　　)
2.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
3.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
4.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是 （ ）A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
探究●实践 DNA的粗提取与鉴定
● 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
● DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用此原理可以初步分离DNA与蛋白质。
● DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 ml/L的NaCl溶液。
DNA遇二苯胺，在沸水浴条件下，会出现蓝色
二苯胺试剂要现配现用，鉴定时溶液蓝色的深浅与溶液中含量的多少有关。
新鲜的洋葱，菠菜，菜花，香蕉，草莓，新鲜的猪肝等
问题：可以选用猪的血液作为实验材料吗？为什么？
提示：不可以，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，DNA含量太少。
破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNA稳定，提高DNA溶解度
体积分数为95%的酒精
2 ml/L的NaCl溶液
降低NaCl溶液浓度，析出DNA
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
问题：过滤能用滤纸代替吗？
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液, 静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入离心管中，离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
问题1：冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用？
①使DNA形成絮状沉淀物析出（主要作用）
②抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解
③低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂
问题2：为什么要沿一个方向搅拌？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
问题1：选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
问题2：若用鸡血作为提取DNA的材料，操作时如何防止血液凝固？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固
问题3：用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
利用渗透原理，加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA
问题4：若鉴定结果呈现蓝色比较浅，说明什么问题？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果
● 鉴定结果不明显的可能原因
1.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验原理的叙述，正确的是 （ ）A．DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的升高而减小B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNAC．DNA是大分子有机物，易溶于水也溶于某些有机溶剂D．在沸水浴中，DNA遇二苯胺会出现紫色反应
2.DNA的粗提取中，加入与滤液体积相等的、冷却的某物质的溶液，静置2～3 min，溶液中会出现白色丝状物。上面提到的某物质的溶液是指 (　 　)A．0.9%的NaCl溶液B．0.14 ml/L的NaCl溶液C．质量分数为15%的HCl溶液D．体积分数为95%的酒精溶液
3.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作过程，有关分析错误的是 （ ）A．图①④中加入蒸馏水的目的不同B．图②操作的目的是纯化DNA，去除溶于95%酒精中的杂质C．图③中2 ml/L NaCl溶液能溶解黏稠物中的DNAD．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同
如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序是_______________________________(用序号与箭头表示)。(2)步骤④中使用2 ml/L NaCl溶液的目的是_______________。(3)步骤①的目的是________________________，其依据的原理是_______________________。
(4)步骤①中所得到的丝状物为_____色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加__________ 试剂，________________后，如果出现________则证明该丝状物的主要成分为DNA。
(5)由于鸡血较难找到，某学生试图用猪血代替，结果没有成功，其原因最可能是__________________________________________________________。
猪是哺乳动物，哺乳动物血液中成熟的红细胞没有细胞核