27_专题二十七基因工程和生物技术的安全性与伦理问题

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专题二十七　基因工程和生物技术的
安全性与伦理问题
考点一　基因工程（重组DNA技术）
1.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)

A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案　B　94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
2.(2021浙江6月选考,20,2分)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是(　　)
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案　B　受精卵在体外培养时,由于不同发育阶段的胚胎细胞所需的环境有所不同,因此需要更换不同成分的培养液,A正确;进行胚胎移植的早期胚胎通常为发育到8细胞以上的胚胎,如早期囊胚,B错误;利用胚胎干细胞通过核移植等技术来获得转基因小鼠时,可在短时间内获得大量的转基因小鼠胚胎,再通过胚胎移植技术大量培养转基因小鼠,C正确;根据题干信息可知,EGFP基因被定点插入Y染色体上,而Y染色体只有雄性才具有,因而观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎,D正确。
3.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案　D　根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
4.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　)
A.6　　　B.250　　　C.4 000　　　D.24 000
答案　C　根据题干信息可知,限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点是由6个碱基对构成的,若用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,则理论上得到DNA的的平均长度(碱基对)约为46碱基对,即约为4 000碱基对。故选C。
5.(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案　D　PCR反应中出现非特异性条带的主要原因是引物与模板DNA出现了非特异性结合,模板DNA不纯或过多易出现非特异性结合,A错误;延长热变性时间与非特异性条带无直接关系,B错误;延长延伸时间易出现非特异性结合,C错误;复性温度偏低易出现非特异性结合,故提高复性温度可减少反应中非特异条带的产生,D正确。
6.(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案　A　加入适量的木瓜蛋白酶能分解滤液中的主要杂质——蛋白质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,A符合题意;37~40 ℃达不到破坏蛋白质所需的温度,所选温度应该是60~75 ℃,此温度能够破坏滤液中主要杂质蛋白质的结构,进而去除这些杂质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,B不符合题意;与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精是题干中的“特定试剂”,C不符合题意;加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L,经过以上处理后DNA析出,过滤后DNA主要存在于纱布上的过滤物中,在滤液中含量极少,经过D项处理后应过滤去除溶液中的杂质,再用物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,D不符合题意。
7.(2020山东,15,2分)新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是(　　)
A.抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理
B.感染早期,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况
C.患者康复后,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况
D.感染该病毒但无症状者,因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测
答案　D　抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理,A正确;感染早期,新冠病毒的核酸已进入机体,但机体可能尚未进行体液免疫产生抗体,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况,B正确;患者康复后,体内留有记忆细胞和抗体,而新冠病毒已被机体清除,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况,C正确;感染该病毒但无症状者,其体内会发生体液免疫产生抗体,适用抗体检测法检测,D错误。
8.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是(　　)
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案　D　若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制酶,该酶会破坏重组质粒的结构,不利于重组质粒在受体中保持结构稳定,A错误;抗除草剂基因转入某抗盐植物获得的2个稳定遗传品系中有抗除草剂不抗盐的品系,抗盐性的改变可能与抗除草剂基因的转入有关,B错误;在DNA检测均含目的基因的条件下,抗性鉴定为抗除草剂说明目的基因完成了表达,抗性鉴定为不抗除草剂说明目的基因可能完成了转录而没有翻译成蛋白质,还有可能是目的基因没有转录,C错误;因为质粒为环形,用某限制酶完全酶切后出现3条带,说明酶切后的产物中有3种不同分子量的DNA,可以推测出质粒上至少有3个位置被该酶切开,D正确。
9.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(　　)

图1　酶切位点图

图2　电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案　D　本题通过对酶切位点图和电泳结果示意图的分析,考查基因工程工具酶的相关知识,以及观察图示、分析推理的能力,试题通过两种图示的分析体现了对科学思维素养中的演绎与推理要素的考查。图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道①②电泳结果知,泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。
10.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。

下列操作与实验目的不符的是(　　)
A.用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞
D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案　C　本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。
11.(2014重庆理综,4,6分)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述,正确的是(　　)
　　　　　　　　　　　　　　　


A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状
D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
答案　D　②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与,A错误;③侵染植物细胞后,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到④的染色体上,B错误;④的染色体上含有目的基因(抗虫基因)但不一定表达,C错误;基因工程依据的原理是基因重组,基因重组属于可遗传变异,D正确。
12.(2013大纲全国,5,6分)下列实践活动包含基因工程技术的是(　　)
A.水稻F1花药经培养和染色体加倍,获得基因型纯合新品种
B.抗虫小麦与矮秆小麦杂交,通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C.将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞,经组织培养获得抗病植株
D.用射线照射大豆使其基因结构发生改变,获得种子性状发生变异的大豆
答案　C　本题主要考查不同育种方式所用到的技术。A项为单倍体育种,用到植物组织培养技术;B项为传统的杂交育种;C项抗病植株的培育用到基因工程技术和植物组织培养技术;D项为诱变育种。
13.(2013安徽理综,6,6分)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是(　　)

A.根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目
B.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
C.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接
D.放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
答案　D　本题主要考查微生物的计数和DNA分子杂交等相关知识。根据培养皿中菌落数只能估算样品中含有的活菌数目;外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能够进行转录;重组质粒与探针因碱基互补配对能进行分子杂交;用放射性标记的DNA探针与特定DNA分子杂交后,洗去未结合的探针,放射自显影结果可以显示原培养皿中含特定DNA的细菌菌落位置。
14.(2012浙江理综,6,6分)天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰,下列操作正确的是(　　)
A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因B
B.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D.将基因B直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞
答案　A　此题考查基因工程及其应用的相关知识。要获取目的基因B,可先提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再经PCR技术扩增基因B,A正确;基因文库构建是将目的基因与载体连接起来,形成重组载体,再导入受体菌中储存和扩增,提取目的基因时不需使用限制酶,B错误;连接目的基因与质粒的酶是DNA连接酶,C错误;将目的基因导入植物细胞,常用农杆菌转化法,不使用大肠杆菌,D错误。
15.(2011四川理综,5,6分)北极比目鱼中有抗冻基因,其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列,该序列重复次数越多,抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图,有关叙述正确的是(　　)

A.过程①获取的目的基因,可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B.将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C.过程②构成的重组质粒缺乏标记基因,需要转入农杆菌才能进行筛选
D.应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
答案　B　将多个抗冻基因编码区相连成能表达的新基因,合成的蛋白质为新的蛋白质,不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白,故选项B正确;过程①是利用反转录法合成目的基因,由于没有非编码区和编码区中的内含子,不能用于比目鱼基因组测序;用作运载体的质粒,必须具有标记基因才能便于检测和筛选;应用DNA探针技术,可检测转基因抗冻番茄中目的基因的存在和转录,但不能检测是否成功表达,故选项A、C、D错误。
16.(2021全国乙,38,15分)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。 
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(4)表达载体含有启动子,启动子是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　限制酶切割位点　将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞　(4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
解析　(1)E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。
17.(2021全国甲,38,15分)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是　　　　　　(用数字序号表示)。 
(2)操作③中使用的酶是　　　　　　　。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、　　　　三步, 其中复性的结果是　 
　　　　　　　　　　　　。 
(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与　　　　　　　特异性结合。 
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 
答案　(1)④②③①　(2)DNA聚合酶　延伸　引物通过碱基互补配对与单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
解析　(1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①。(2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到55~60 ℃,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
18.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。 
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,理由是　 
 
　。 
答案　(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析　(1)观察图示可知,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切割位点,分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ的切割位点,但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,切割后载体的部分序列如图所示:

扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的片段连接起来。由题图中终止子及基因的位置可知,F1~F7末端添加序列后应与XhoⅠ切割的末端相连,R末端添加序列后应与MunⅠ切割的末端相连。由于调控序列及启动子中有XhoⅠ限制酶切割位点,所以需寻找切割后的末端能与XhoⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,SalⅠ符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;由于调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点,所以需寻找切割后的末端能与MunⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,EcoRⅠ符合这一要求,所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:

本实验中,用EcoRⅠ和SalⅠ切割扩增产物,用MunⅠ和XhoⅠ切割载体,故从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导P发挥作用,使BCL11A基因表达。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白的结合位点(荧光蛋白基因能表达),由此可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
19.(2019课标全国Ⅰ,38,15分)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括　　　　　和　　　　　。 
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是　　　。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是　　　　　　　　。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的　　　。 
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)基因组文库　cDNA文库　(2)解旋酶　加热至90~95 ℃　氢键　(3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析　本题借助目的基因的获取考查基因工程中的PCR技术以及考生对生物学问题进行科学解释的能力;试题通过PCR技术与体内DNA复制的比较,体现了对科学思维中归纳与概括要素的考查。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)体内DNA复制时,需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋,而PCR扩增目的基因时,是借助高温加热至90~95 ℃使DNA变性解旋。(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在70~75 ℃,则应使用耐高温的DNA聚合酶,即Taq酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
20.(2018课标全国Ⅰ,38,15分)回答下列问题:
(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了 
　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。 
(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的　　　方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与　　　　　　　　组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是　　　。 
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用　　　　　　　的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加　　　　的抑制剂。 
答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　本题主要考查基因工程的相关知识,试题通过三问并列的命题方式考查基因工程的原理与操作程序,考查考生的识记、理解能力,涉及科学思维素养中归纳与概括、演绎与推理等思维过程。本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。
21.[2018浙江4月选考,32(二),7分]回答与基因工程和植物克隆有关的问题:
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI 121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切,在切口处形成　　　　　　。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI 121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成　　　　　　　,获得重组质粒。 
(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成　　　　实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。 
(3)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行　　　　,然后接种到培养基中培养,幼胚发生　　　　　　形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出2点即可)。 
答案　(1)粘性末端　磷酸二酯键
(2)转化　使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
(3)消毒　脱分化　水稻的基因型、愈伤组织继代的次数
解析　(1)用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体PBⅠ121,可在切口处形成粘(黏)性末端,通过DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成磷酸二酯键,从而获得重组质粒。(2)经CaCl2处理过的农杆菌,成为感受态细胞,与重组质粒混合,使重组质粒进入细胞,从而完成转化实验。将其置于摇床慢速培养一段时间,目的是使经CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。(3)田间获取的水稻幼胚,需要先进行消毒处理,后接种培养,经脱分化形成愈伤组织,并进行继代培养。影响愈伤组织能否再生出植株的因素,除了培养条件,还有水稻本身的基因型这一内因,也跟继代培养次数有关。
易错警示　影响愈伤组织再生出植株的因素,题干中给出了外界培养条件,所以应从内因考虑。同时,一些植物在多次继代培养后也会丧失细胞全能性的表达能力,所以也跟继代培养次数有关。
22.(2017课标全国Ⅰ,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用　　　作为载体,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有　　　　　　　　　　　(答出两点即可)等优点。 
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是　　　　　　　　　　(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。 
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是　。 
答案　(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A　(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕　(3)繁殖快、容易培养　(4)蛋白A的抗体　(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析　本题主要涉及基因文库与cDNA文库的差异、基因工程的步骤、基因工程产物的检测方法等知识,意在考查考生提取知识、分析和归纳知识的能力。 (1)真核生物和原核生物的基因结构不同,真核生物的基因中存在内含子等不能编码蛋白质的序列,原核生物的基因中不存在内含子。真核生物在基因表达时,转录出的RNA需要将内含子对应的RNA序列切除后才可进行翻译。从人的基因组文库中获得的基因 A 中含有内含子,而作为原核生物的大肠杆菌不能切除内含子对应的RNA序列,故基因 A 在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。 (2)病毒对宿主细胞的侵染具有特异性,噬菌体是专门侵染细菌的病毒,不能侵染家蚕细胞,故可选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。 (3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点,因此在基因工程中常用原核生物作为受体细胞。(4)检测基因A 是否翻译出蛋白A,一般用抗原—抗体杂交的方法,即用蛋白 A 的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是 S型菌的 DNA 进入 R 型菌体内,并可在 R 型菌体内完成表达,这证明了 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因工程奠定了理论基础。
23.(2017课标全国Ⅱ,38,15分)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分,几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内,可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题:
(1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA,常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料,原因是　　　　　　　　　　　。提取RNA时,提取液中需添加RNA酶抑制剂,其目的是　　　　　　　　。 
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA,其原理是 
　。 
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。 
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键是　　　　　　　。 
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高,根据中心法则分析,其可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　(3)目的基因无复制原点;目的基因无表达所需启动子　(4)磷酸二酯键　(5)目的基因的转录或翻译异常
解析　本题主要考查基因工程的相关知识,考查学生获取知识,分析与归纳知识等能力。(1)从植物体中提取mRNA需要破碎组织细胞,嫩叶比老叶的组织细胞易破碎,mRNA提取效率高。由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解,所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低RNA酶的活性,保护提取的RNA不被分解。(2)cDNA是在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板,按照碱基互补配对的原则合成的。(3)由于目的基因无复制原点,也无基因表达所需的启动子和终止子,所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中,但是转基因植株抗真菌病的能力没有提高,说明转基因植株体内不存在抗菌活性蛋白,即几丁质酶基因的转录或翻译过程出现异常,从而导致几丁质酶基因没有正常表达合成抗菌活性蛋白。
24.(2015海南单科,31,15分)在体内,人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链,此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原,进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后,产生A、B两条肽链,再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前,利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题:
(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是　　　　　　,合成胰高血糖素的细胞是　　　　。 
(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的　　　　　　序列,用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成　　　　的基因工程菌。 
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,则用该工程菌进行工业发酵时,应从　　　　中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。 
答案　(1)胰岛B细胞　胰岛A细胞(每空3分,共6分)
(2)DNA　胰岛素原(每空3分,共6分)
(3)菌体(3分)
解析　(1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞,合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。(2)蛋白质工程生产胰岛素时,需根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因),然后再构建胰岛素原基因重组表达载体,导入细菌细胞内,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗原—抗体检测法检测胰岛素原时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。
25.(2014课标全国Ⅱ,40,15分)植物甲具有极强的耐旱性,其耐旱性与某个基因有关,若从该植物中获得该耐旱基因,并将其转移到耐旱性低的植物乙中,有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题:
(1)理论上,基因组文库含有生物的　　　　　　基因;而cDNA文库含有生物的　　　　　基因。 
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因,可首先建立该植物的基因组文库,再从中　　　　　　出所需的耐旱基因。 
(3)将耐旱基因导入农杆菌,并通过农杆菌转化法将其导入植物　　　　　　的体细胞中,经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达,应检测此再生植株中该基因的　　　　　　,如果检测结果呈阳性,再在田间实验中检测植株的　　　　　是否得到提高。 
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交,子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时,则可推测该耐旱基因整合到了　　　　　　(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。 
答案　(1)全部　部分　(2)筛选　(3)乙　表达产物　耐旱性　(4)同源染色体的一条上
解析　本题考查对基因工程应用的相关知识的识记和理解。(1)基因组文库包含某种生物的全部基因,cDNA文库又称为部分基因文库,含有生物的部分基因。(2)植物甲基因组文库中有该种植物的全部基因,从中可筛选出耐旱基因。(3)植物乙的耐旱性低,所以植物乙体细胞作为受体细胞;要确定耐旱基因是否正确表达,应检测该基因的表达产物,对于个体水平的检测,应在干旱的田间进行实验,检测植物乙耐旱性是否得到了提高。(4)将耐旱基因看作A,不耐旱基因看作a,Aa×Aa→耐旱与不耐旱数量比为3∶1,则耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。
26.(2012课标,40,15分)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有　　　　和　　　　。 
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,还可用另一种限制性内切酶切割,该酶必须具有的特点是　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即　　　　DNA连接酶和　　　　DNA连接酶。 
(4)反转录作用的模板是　　　　,产物是　　　　。若要在体外获得大量反转录产物,常采用　　　　技术。 
(5)基因工程中除质粒外,　　　　和　　　　也可作为运载体。 
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)黏性末端　平末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同(其他合理答案也可)
(3)大肠杆菌　T4
(4)mRNA(或RNA)　cDNA(或DNA)　PCR
(5)噬菌体　动植物病毒(其他合理答案也可)
(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱(其他合理答案也可)
解析　此题考查基因工程应用的相关知识。(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连,应使二者被切割后产生的末端相同,故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoRⅠ切割产生的末端相同。(3)根据酶的来源不同,DNA连接酶分为E·coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。(4)以RNA为模板,合成DNA的过程称为逆转录,若要体外获得大量DNA分子,可以使用PCR技术。(5)在基因工程中,通常利用质粒作为运载体,另外噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时,常用Ca2+处理,使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。
27.(2012海南单科,31,15分)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产,乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此,可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内,使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。
回答下列问题:
(1)为了获得丙种蛋白质的基因,在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上,推测出丙种蛋白质的　　　序列,据此可利用　　　方法合成目的基因。获得丙种蛋白质的基因还可用　　　　　和　　　方法。 
(2)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中,常需要使用　　　酶和　　　　　酶。 
(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养,筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织,由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗　　　　　的危害。 
(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口,则该植株的种子　　　(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。 
答案　(1)基因　化学　基因文库　PCR(每空2分,共8分,其他合理答案也给分)
(2)限制　DNA连接(每空1分,共2分)
(3)乙种昆虫(2分)
(4)不含(3分)
解析　本题考查抗虫作物培育过程的相关知识。(1)获取目的基因的方法主要有基因文库获取法、PCR技术扩增法和人工化学合成法三种。已知丙种蛋白质氨基酸序列,可通过推测丙种蛋白质的基因序列,然后利用化学方法人工合成丙种蛋白质基因。(2)在构建重组质粒的过程中,需要使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶,前者能识别特定的核苷酸序列,使每条链特定部位的核苷酸之间的磷酸二酯键断开,使其形成黏性末端,被喻为“分子手术刀”;后者能将两个带有相同黏性末端的DNA片段连接起来,被称为“分子针线”。(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的组织共培养,可筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织,而后培养出含有丙种蛋白质的抗乙种昆虫的植株。(4)若只用重组质粒感染甲种农作物叶片伤口,可在叶片组织中筛选出含丙种蛋白质的细胞,由于该重组质粒感染的是体细胞,故该植株的种子中不含有丙种蛋白质。
28.(2011海南单科,31,15分)回答有关基因工程的问题:
(1)构建基因工程表达载体时,用不同类型的限制酶切割DNA后,可能产生黏性末端,也可能产生　　　末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接,则应选择能使二者产生　　　(相同、不同)黏性末端的限制酶。 
(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时,构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等,其中启动子的作用是　　　。在用表达载体转化大肠杆菌时,常用　　　处理大肠杆菌,以利于表达载体进入;为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA,可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交,该杂交技术称为　　　。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成　　　,常用抗原—抗体杂交技术。 
(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞,先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的　　　中,然后用该农杆菌感染植物细胞,通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的　　　上。 
答案　(1)平　相同　(2)驱动胰岛素基因转录出mRNA(3分,其他合理答案也给分)　CaCl2溶液(或Ca2+)　分子杂交技术　蛋白质(2分,其他答案也给分)　(3)T-DNA　染色体DNA(2分,其他答案也给分)
解析　(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴两侧将DNA切开时,产生的是黏性末端,而当限制酶在它识别序列的中心轴线切开时,产生的是平末端。要使目的基因和质粒直接进行连接,应使用同种限制酶切割目的基因和质粒,使二者产生相同黏性末端。(2)一个基因表达载体的组成,除含有目的基因外,还必须有启动子、终止子和标记基因。启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因首端,是RNA聚合酶识别和结合部位,可以驱动目的基因转录出mRNA。在用表达载体转化大肠杆菌时,为便于表达载体进入,常用CaCl2处理大肠杆菌。要检测目的基因是否转录出对应的mRNA,可采用分子杂交技术,即用目的基因片段作探针,与mRNA杂交,如果显示出杂交带,则表明目的基因转录出了mRNA。(3)运用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞时,要先将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中,然后将该农杆菌感染植物细胞,通过DNA重组将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA上。
考点二　基因工程的应用与蛋白质工程
1.(2022浙江1月选考,21,2分)羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc,但不发病。当羊感染了PrPSc后,PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc,导致PrPSc积累,从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病。下列分析合理的是(　　)
A.动物体内的 PrPSc可全部被蛋白酶水解
B.患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C.产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D.给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc,小鼠不会发病
答案　D　感染性蛋白粒子PrPSc会将羊体内的PrPc不断转变为PrPSc,PrPSc在体内积累从而导致发病,可见动物体内的PrPSc并不会全部被蛋白酶水解,A错误;患病羊体内存在指导蛋白质PrPc合成的基因,而PrPSc并不是自身合成的,而是外界感染的,B错误;PrPSc在体内积累从而导致发病,说明产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用,C错误;把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病,原因是患瘙痒病的羊组织匀浆含有感染性蛋白粒子PrPSc,小鼠体内含有PrPc,PrPc基因敲除小鼠不含PrPc,接种PrPSc后也不会发生使PrPc转变为PrPSc并积累PrPSc而致病的现象,D正确。
2.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案　D　根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
3.(2013广东理综,3,4分)从某海洋动物中获得一基因,其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物,首先要做的是(　　)
A.合成编码目的肽的DNA片段
B.构建含目的肽DNA片段的表达载体
C.依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D.筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
答案　C　由题中信息“在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物”可推知本题考查蛋白质工程的相关知识。根据蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因),可推知答案为C。
4.(2011江苏单科,14,2分)关于现代生物技术应用的叙述,错误的是(　　)
A.蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质
B.体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体
C.植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒
D.动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育
答案　B　克隆动物是核移植工程的应用;茎尖分生能力强,没有病毒侵染,以茎尖为外植体,通过植物组织培养可获得无病毒植株;导入目的基因的受体细胞,需通过动物细胞培养技术获得早期胚胎,才能进一步培育成转基因动物。

5.(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对　　　　,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　,终止子的作用是　　　　　　　　　　　　。　 
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了　　　　　　　　,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　　,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 
答案　 (1)引物　(2)便于筛选含有目的基因的受体细胞　使转录在所需要的地方停下来　(3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量　(4)废弃物的资源化　减少了碳排放
解析　(1)利用PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因两端的核苷酸序列,根据这一序列设计并合成一对引物。(2)抗生素抗性基因作为标记基因,作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯,位于基因的下游,可使转录在所需要的地方停下来。(3)酶蛋白的大量合成消耗大量的物质和能量,导致重组梭菌用于自身生长、繁殖的物质和能量减少,菌体生长迟缓。(4)该技术使一个系统产出的污染物,能够成为本系统或另一个系统的生产原料,从而实现了废弃物的资源化。从“碳中和”的角度看,该技术减少了碳排放。
6.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　　,物质b是　　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　  　　　　　　　　　　。 

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　、　　　　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　　　　　。 
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　  　　　　　　　　　　。 


(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 
 
 
　。 
答案　(1)多肽链　mRNA　 mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性　(2)从基因文库中获取　人工合成　DNA半保留复制　(3)种类　酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同　 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
解析　(1)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。(3)由图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大。
7.[2022浙江1月选考,29(二),7分]我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩,但全球疫情形势仍然非常严峻,尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎,更是威胁着全人类的生命健康。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是:以新冠病毒的单链 RNA 为模板,利用　　　　酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的　　　　　　　,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 
(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是:将腺病毒的复制基因敲除;以新冠病毒的　　　　基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发特异性免疫反应。在此过程中,腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的　　　。将腺病毒复制基因敲除的目的是　　　　　　　　。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是:取免疫阳性小鼠的　　　　细胞与骨髓瘤细胞混合培养,使其融合,最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比,杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分,如胰岛素和　　　　　　　　　　。 
答案　(二)(1)逆转录　核酸探针　(2)抗原　载体　使腺病毒失去复制能力　(3)脾(B淋巴)　 动物血清
解析　(二)(1)以新冠病毒的单链RNA为模板,在逆转录酶催化下可合成相应的DNA。经PCR扩增后的DNA,可利用特定的核酸探针进行检测。(2)制备腺病毒载体疫苗时需将以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发人体的特异性免疫反应。因此,腺病毒相当于基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除,可使腺病毒失去复制能力,防止其在人体内增殖。(3)制备单克隆抗体时,要取免疫阳性小鼠的脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合,筛选获得特定的杂交瘤细胞。相比植物组织培养,动物细胞的培养需要动物血清等特殊成分。
8.(2022全国乙,38,15分) 新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是　　　　　　　,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的　　　　　　　　　　　　来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是　　　　　　　。 
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明　　　　　　　　　　(答出1种情况即可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明　　　　　　　　　　　　　。 
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)逆转录酶　(2)特异核苷酸序列　复性　(3)被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒　被检测者感染了病毒并产生了抗体　(4)获得目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析　(1)以病毒RNA为模板合成cDNA需要逆转录酶。(2)用PCR技术扩增新冠病毒RNA片段时,所需要的引物必须依据新冠病毒RNA中的特定核苷酸序列来进行设计。PCR过程每次循环分为变性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)和延伸(72 ℃左右)三个阶段,复性阶段温度最低。(3)同时进行核酸检测和抗体检测,若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒;若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明被检测者感染了病毒并产生了抗体。(4)基因工程技术获得大量蛋白S的基本操作流程:目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
9.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。

图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由　　　　　　组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是　　　　　　　　　　　　　　　。 
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是　　　　　　　　　。PCR扩增时,需在　　　　　　　催化下,在引物的　　　端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。 
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。

图Ⅱ

图Ⅲ
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M
①选择图Ⅱ引物　　　　;②PCR目的产物约为　　　bp 
确保M及连接处序列正确
③质粒测序,图Ⅲ中正确的是　　　(选填序列编号) 
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明　　　　　　　　　　 
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经　　　　形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的　　倍。 
答案　(1)脂质和蛋白质　发出星射线,形成纺锤体　(2)溶解DNA　Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶)　3'　(3)①a、b　②1 100　③Q4　④蛋白X定位于纤毛基部　(4)逆转录　32
解析　(1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:


用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
知识拓展　在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。
10.(2022河北,24,15分)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPin1A)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。
回答下列问题:
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 
　。 
(2)　　　　　　　　　是实施基因工程的核心。 
(3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的　　　　　上,此方法的不足之处是　　　　　　　　　　　　　　　。 
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有　　　　　　　　　　　　　　(写出两点即可)。 
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的　　　　　以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析　　　　　(填“NaPI”或“StPin1A”或“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其原因是　 　 。


(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生　　　　　,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(写出两点即可)。 
答案　(1)抑制害虫胰蛋白酶活性,从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的　(2)基因表达载体的构建　(3)T-DNA　该方法一般不适用于单子叶植物　(4)PCR技术、抗原—抗体杂交技术　(5)接种试验　NaPI+StPin1A　NaPI+StPin1A的转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多　(6)定向改变　昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;昆虫的胰蛋白酶基因发生突变,原有的胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用
解析　(1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道内的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性,使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质,从而达到抗虫的目的。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,可将Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞,并将其整合到受体细胞的染色体DNA上。故利用农杆菌转化法时,需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上。但农杆菌一般只感染双子叶植物和裸子植物,故其不足之处是该方法一般不适用于单子叶植物。(4)在分子水平上可通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上或检测目的基因是否转录出了mRNA;是否翻译出相应的蛋白质则需要使用抗原—抗体杂交技术。(5)抗虫基因导入植物细胞后,要鉴定其是否赋予植物抗虫特性,需要做抗虫接种试验。题图中,NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低,每株棉铃数最多,故其抗虫效果最佳。(6)昆虫种群本来就存在抗虫性强或弱的变异,在抗虫剂(蛋白酶抑制剂)的选择作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,使昆虫朝着一定的方向不断进化。蛋白酶抑制剂通过与害虫消化道内的蛋白酶结合使害虫不能消化蛋白质而死亡。昆虫具有抗胰蛋白酶抑制剂的能力可能是因为昆虫的胰蛋白酶发生突变,产生一种新胰蛋白酶,其不能与原有的胰蛋白酶抑制剂结合,使原有胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用;也可能是昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力。
11.(2021广东,22,12分)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(图13),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。

图13
　　回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有　。 
(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有　。 
(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备　　　　细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有　　　　　　　　　。 
(4)依图13所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是　　　　　　　　　　　　　　。在分子水平上,可以通过改变　　　　　　,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。 
答案　(1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成　(2)蛋白酶水解法、盐析法、60~75 ℃恒温水浴法　(3)感受态　抗原—抗体杂交　(4)部分酶失活,无法获得肌醇　基因结构
解析　(1)目前获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。(2)制备高质量DNA模板时,可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质,而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,当盐浓度较高时,蛋白质的溶解度下降并析出,这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性,严格控制温度范围,使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性,可将DNA与蛋白质分离。(3)将表达载体导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法是首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。然后将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白,可以从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已表达出蛋白质产品。(4)酶的作用条件较温和,在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活,不同酶的最适温度、最适pH一般不同,将4种酶放在同一体系中,控制温度、pH等条件一致,则部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活,不能达到实验目的,即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成,可以通过改造酶基因的结构,从而改变蛋白质的结构,进而实现对酶特性的改造和优化。
12.(2021河北,24,15分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为　　　　。 
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是　　　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是　　　　　　　　。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　　。 
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的　　　　(填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 

图1

图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(写出两点即可)。 
答案　(1)基因文库　(2)限制酶和DNA连接酶　鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来　(3)农杆菌转化法　防止YCF1基因随花粉扩散,给生态系统带来风险　(4)耐性　叶　(5)转基因杨树液泡膜上的Cd转运蛋白可将细胞质基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响　乔木比草本生物量大,与外界物质交换能力强
解析　(1)将含有某种生物细胞不同基因的许多DNA片段与载体连接起来,导入受体菌的群体中并储存,每个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,这个群体称为基因文库。(2)构建基因表达载体时需要用限制酶切割DNA分子和质粒,然后用DNA连接酶使获取的目的基因与质粒连接起来。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,以便筛选出含有目的基因的细胞。(3)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等,其中农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物最常用的方法;不育株系可以防止基因在繁殖过程通过花粉在生态系统中扩散。(4)据图1可知,转基因植株的干重比野生型的大,表明转基因植株对Cd具有更强的耐性;据图2可知,叶片对Cd的富集作用最强,所以对叶进行后续处理对缓解土壤Cd污染最为有效。(5)转基因杨树液泡膜上有Cd转运蛋白,可以将细胞质基质中的Cd运入液泡进行贮存,降低Cd对细胞代谢的影响,野生型不具有这个功能。与草本植物相比,乔木植株更大,生物量更多,与外界物质交换能力更强,可以富集更多的Cd。
13.(2021浙江6月选考,29(二),15分)斑马鱼是一种模式动物,体外受精发育,胚胎透明、便于观察,可用于水质监测、基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
(1)由于人类活动产生的生活污水日益增多,大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体　　　　　　,使藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼,可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。 
(2)为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制,用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成　　　　　　　　,导入大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆,质粒载体应含有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。提取质粒后,采用　　　　　　法,将该基因导入斑马鱼受精卵细胞中,培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。 
(3)为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选,可用　　　　　　分散斑马鱼囊胚的内细胞团,取分散细胞作为初始材料进行　　　　培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为　　　　　　　,以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 
答案　(1)富营养化　(2)重组DNA分子　限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因　显微注射　(3)胰蛋白酶　原代　饲养层细胞
解析　(1)未经处理的生活污水中含有大量有机物,直接排放到水体中会引起水体富营养化,从而使得水体中藻类大量繁殖。(2)用一定的方法获取目的基因后,将目的基因和质粒载体相互连接从而形成重组DNA分子,再将重组DNA分子导入受体细胞。质粒载体应含有限制性核酸内切酶的识别序列以便连接目的基因,同时也应含有抗生素抗性基因以便筛选导入目的基因的受体细胞。将含有目的基因的载体导入动物细胞,通常选用的方法是显微注射法。(3)动物组织细胞之间的粘连物主要是蛋白质,一般选用胰蛋白酶将动物组织细胞分散开。分散的动物细胞作为初始材料进行的动物细胞培养是原代培养。为了提高动物细胞克隆的形成率,可用成纤维细胞作为饲养层细胞以支持细胞生长。
14.(2021辽宁,24,10分)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9 kb (1 kb=1 000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题:
(1)为获取phb2基因,提取该动物肝脏组织的总RNA,再经　　　　过程得到cDNA,将其作为PCR反应的模板,并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 
(2)图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端分别引入　　　　和　　　　两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用　　　　　　　　(填 “E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 

图1
相关限制酶的识别序列及切割位点

注:箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于　　　　　　　　　　　　　　　　的生理状态,以提高转化效率。 
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养,随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用(2)中选用的两种限制酶进行酶切,酶切产物经电泳分离,结果如图2,　　　　号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。 

图2
注: M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2 kb的DNA分子条带未出现
在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中,培养24小时后,检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量,统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的　　　　(填“G1”或“S”或“G2/M”)期。 


答案　(1)反转录　(2)PvuⅡ　EcoRⅠ　T4 DNA连接酶　(3)一种能吸收周围环境中DNA分子　(4)3　(5)G2/M
解析　(1)提取该动物肝脏组织的总RNA,可经反转录过程得到cDNA。(2)phb2基因应插入质粒的启动子与终止子之间,在质粒的启动子与终止子之间有PvuⅡ、KpnⅠ、EcoRⅠ3个限制酶的切割位点,但KpnⅠ在终止子之外还有一个切割位点,据此推理,不能选用KpnⅠ进行切割,应选用PvuⅡ、EcoRⅠ两种限制酶进行切割,所以在扩增的phb2基因两端应分别引入PvuⅡ、EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列。用PvuⅡ切割质粒和目的基因后产生平末端,用EcoRⅠ切割质粒和目的基因后产生黏性末端,T4 DNA连接酶既能连接平末端,也能连接黏性末端,所以应选用T4 DNA连接酶对目的基因和载体进行连接。(3)在将重组质粒导入大肠杆菌细胞之前,可用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,以提高转化效率。(4)含phb2基因的重组质粒被PvuⅡ、EcoRⅠ切割后会产生2个片段,即质粒片段和phb2基因片段,这两个片段经电泳分离后会出现两个条带,已知phb2基因大小为0.9 kb,据此推理3号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。(5)观察图4,经PHB2蛋白处理后,G1期和S期的细胞百分比下降,而G2/M期的细胞百分比增加,据此推测PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的G2/M期。
15.(2021天津,16,12分)乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图,图2为构建表达载体时所需的关键条件。

图1

图2
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为　　　　　　　　　　。 
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下:
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,且能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和2。其中引物1的5'端序列应考虑　　　　　　　　　　　和　　　　　　　　　　。 
②将上述PCR产物和质粒重组后,导入大肠杆菌,筛选、鉴定,扩增重组质粒。
重组质粒上有　　　　　　　　　　,所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性,易被本物种的转录系统识别并启动转录,因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列　　　(能/不能)在大肠杆菌中高效表达。 
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株,在　　　　　　　　　　的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母,并进行鉴定。 
(3)以葡萄糖为碳源,利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵,结果既产生乳酸,也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量,下列措施中不合理的是　　　(单选)。 
A.进一步优化发酵条件
B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种
答案　(1)细胞质基质　(2)①包含BamHⅠ的识别序列　将GTG改为ATG　②原核生物复制原点　不能　③缺失尿嘧啶　(3)B
解析　(1)酿酒酵母为真核生物,其进行无氧呼吸的场所为细胞质基质,所以乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为细胞质基质。
(2)①因为扩增的目的基因的引物1对应5'端的序列的编码(非模板)链含有编码起始密码子的序列GTG,所以该引物5'端对应的序列含编码链的起始端,故该引物5'端序列需要满足两个条件:一是将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG改为真核生物偏好的ATG;二是引物5'端序列应加入BamHⅠ的识别序列(酶切位点),以便将扩增的目的基因以正确方向插入质粒。
②大肠杆菌为原核生物,若要在大肠杆菌内扩增,重组质粒上应有原核生物复制原点,以便被大肠杆菌的DNA聚合酶识别。因为插入的含乳酸脱氢酶基因的重组质粒没有大肠杆菌基因启动子,所以不能被大肠杆菌的转录系统识别并启动转录,无法在大肠杆菌中高效表达。
③实验所选的酿酒酵母菌株为尿嘧啶合成缺陷型,不能在缺失尿嘧啶的固体培养基上生长,若该菌株细胞中导入重组质粒,由于重组质粒中含有尿嘧啶合成酶基因,可使导入重组质粒的酿酒酵母恢复合成尿嘧啶的能力,因此可以用缺失尿嘧啶的固体培养基筛选出转基因酿酒酵母,并进行鉴定。
(3)若使用乳酸菌LDH基因自身的启动子,则不能被酿酒酵母的转录系统识别,所以不能提高其乳酸产量。
16.(2021北京,21,10分)近年来发现海藻糖-6-磷酸(T6P)是一种信号分子,在植物生长发育过程中起重要调节作用。研究者以豌豆为材料研究了T6P在种子发育过程中的作用。
(1)豌豆叶肉细胞通过光合作用在　　　　　　　中合成三碳糖,在细胞质基质中转化为蔗糖后运输到发育的种子中转化为淀粉贮存。 
(2)细胞内T6P的合成与转化途径如下:
底物T6P海藻糖
将P酶基因与启动子U(启动与之连接的基因仅在种子中表达)连接,获得U-P基因,导入野生型豌豆中获得U-P纯合转基因植株,预期U-P植株种子中T6P含量比野生型植株　　　　,检测结果证实了预期,同时发现U-P植株种子中淀粉含量降低,表现为皱粒。用同样方法获得U-S纯合转基因植株,检测发现植株种子中淀粉含量增加。 
(3)本实验使用的启动子U可以排除由于目的基因　　　　　　　对种子发育产生的间接影响。 
(4)在进一步探讨T6P对种子发育的调控机制时,发现U-P植株种子中一种生长素合成酶基因R的转录降低,U-S植株种子中R基因转录升高。已知R基因功能缺失突变体r的种子皱缩,淀粉含量下降。据此提出假说:T6P通过促进R基因的表达促进种子中淀粉的积累。请从①~⑤选择合适的基因与豌豆植株,进行转基因实验,为上述假说提供两个新的证据。写出相应组合并预期实验结果。
①U-R基因　②U-S基因　③野生型植株　④U-P植株　⑤突变体r植株
答案　(10分)(1)叶绿体基质
(2)低
(3)在其他器官(过量)表达
(4)②⑤　与突变体r植株相比,转基因植株种子的淀粉含量不变,仍皱缩
①④　与U-P植株相比,转基因植株种子淀粉含量增加,为圆粒
②④　与U-P植株相比,转基因植株种子R基因转录提高,淀粉含量增加,为圆粒(答出任意两条即可)
解析　(1)三碳糖合成的反应属于暗反应,故豌豆叶肉细胞光合作用合成三碳糖的场所为叶绿体基质。
(2)U-P基因使种子中P酶增加,促进了T6P转化为海藻糖,故U-P植株种子中T6P的含量比野生型植株低。
(3)通过题干信息可知,启动子U使与之相连的基因只在种子中表达,不在其他器官表达,故使用启动子U可排除目的基因在其他器官表达对种子发育产生的间接影响。
(4)U-S基因可使种子中T6P含量增多,将该基因转入突变体r植株(R基因功能缺失,种子皱缩),若假说成立,则转基因植株种子中U-S基因无法使种子中淀粉含量增加;U-P植株种子(皱缩)中R基因转录降低,将U-S基因转入U-P植株,若假说成立,则转基因植株种子中R基因转录升高,且淀粉含量增加,为圆粒;U-R基因可表达出生长素合成酶,将该基因转入U-P植株,若假说成立,则转基因植株种子中淀粉含量增加,为圆粒。
17.(2020山东,25,11分)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶是　　　　　　　　　　　　　　,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为　　　　。 
(2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了　　　　　　　　　　　　　　　　　,从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列　　　(填:“发生”或“不发生”)改变,原因是　。 
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经　　　　　　过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示,据图推测糯性最强的品系为　　　　,原因是　 
　。 

答案　(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶　转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录(或:反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或:引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强
解析　(1)构建重组载体所需的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶,重组载体进入受体细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录出mRNA,若启动子序列改变,将会影响RNA聚合酶与启动子的识别和结合,从而影响基因的转录;由题意知,3个突变品系发生改变的是Wx基因的启动子,而启动子位于基因的非编码区,编码直链淀粉合成酶的碱基序列(即编码区)中不含启动子,故3个突变品系合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列不发生改变,只是Wx基因的表达水平发生了改变。(3)检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经逆转录过程获得总cDNA。利用cDNA进行PCR扩增前需根据Wx基因的一段已知序列设计特定引物,从而专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,由于直链淀粉所占比例越小糯性越强,所以Wx基因表达量最少即Wx mRNA量最少的品系糯性最强,故品系3糯性最强。
18.(2020天津,16,10分)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原,能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱,从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验,使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原,为此构建重组表达载体,技术路线如下。

据图回答:
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达,需改造其编码序列。如图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析,转录形成的mRNA中,该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有　　　　个。 

(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列,确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是　　　　(多选)。 
A.引入短肽编码序列不能含终止子序列
B.引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C.引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D.引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中,SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体,可形成　　　种DNA片段。 
(4)检测转化的乳酸菌发现,信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测,信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是　　　　　　　　　　　。 
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后,小鼠体内出现人胰岛素抗原,能够特异性识别它的免疫细胞有　　　　(多选)。 
A.B细胞　　B.T细胞　　C.吞噬细胞　　D.浆细胞
答案　(共10分)(1)6　(2)ABCD　(3)3　(4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁　(5)AB
解析　(1)
改造
前单
链
TTT
GTG
AAC
CAA
CAC
CTG
TGC
GGC
TCA
CAC
改造
后单
链
TTT
GTC
AAC
CAA
CAT
TTA
TGT
GGA
TCA
CAT


对应
密码
子改变


对应
密码
子改变
对应
密码
子改变
对应
密码
子改变
对应
密码
子改变

对应
密码
子改变

据表及题图分析可知,转录形成的mRNA中,该段序列所对应的片段内共6个密码子发生了碱基替换。(2)对人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列后不应破坏其正常功能,若引入的短肽编码序列含有终止子序列,则会导致DNA转录提前结束,形成的mRNA过短,翻译成的多肽链将不完整而失效,A正确;如果引入的短肽编码序列含有终止密码子编码序列,则该mRNA的翻译过程将提前结束,氨基酸数目减少从而导致蛋白质失效,B正确;由题干分析可知,加入短肽编码序列的目的是使A、B肽链等比例表达,不能改变A、B肽链的氨基酸序列,更不能改变原人胰岛素的抗原性,C、D正确。(3)由重组表达载体图像分析可知,该环形DNA上有两个SacⅠ酶切位点和一个XbaⅠ酶切位点,则用这两种酶充分酶切重组表达载体后将产生三个短链(注意线形的DNA双链被限制酶充分酶切三个相应位点之后将形成4个DNA片段,而一个环形质粒被限制酶充分酶切三个相应的位点之后将形成3个DNA片段)。(4)由于乳酸菌为原核生物,没有细胞核且只有核糖体一种细胞器,再结合题意,所形成的蛋白质最终分布在细胞壁上,故综合分析可知,蛋白质在核糖体上合成,经细胞质基质后,先到达细胞膜再分布到细胞壁上。(5)根据免疫调节基础知识判断,能特异性识别抗原的细胞有B细胞、T细胞、效应T细胞、记忆细胞;吞噬细胞只有识别抗原的能力,但并不具有特异性识别抗原的能力;浆细胞没有识别抗原的能力,其分泌的抗体虽然有特异性识别抗原的能力,但是抗体是蛋白质,其不属于细胞结构。综合分析A、B选项正确。
19.(2020江苏单科,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例):

请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种　　　　　　　酶,它通过识别特定的　　　　　　　切割特定位点。 
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成　　　　　　　;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得　　　　　　;Taq DNA聚合酶的作用是催化　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。 

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列

PCR
引物
①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是　　　　。 
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
答案　(1)限制性核酸内切(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)EcoRⅠ是一种限制性核酸内切酶,它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点,使切割后的DNA片段带有相同的黏性末端。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成磷酸二酯键。在PCR循环中,升温到95 ℃是为了使DNA变性,DNA双链解旋为DNA单链,以作为DNA扩增的模板链。Taq DNA聚合酶以DNA单链为模板,以结合在特定DNA模板上的引物为出发点,将4种游离的脱氧核苷酸按5'→3'方向沿模板链顺序合成新的DNA子链,故其作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)片段F中,已知的DNA序列为
,要通过设计引物进行反向PCR,从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物(过程如反向PCR的原理示意图),则需要反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,因此要选择5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'和5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'这对引物。(4)据题图及反向PCR的原理示意图可知片段F的两端为EcoRⅠ切割后的黏性末端,故正确选项为B。

20.(2019天津理综,9,12分)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如图实验。

据图回答:
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中　　　　(单选)。 
A.含B基因的染色体缺失　B.DNA聚合酶失活
C.B基因发生基因突变　　　D.B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或　　　　中提取总RNA,构建　　　　文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。 
(3)在过程①、②转化筛选时,过程　　　　中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程　　　　在培养基中应加入卡那霉素。 
(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是　　　　(多选)。 
A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明 
　。 
答案　(1)D　(2)精子　cDNA　(3)②　①　(4)BCD　(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
解析　本题借助基因工程相关知识,考查考生运用所学知识对某些生物学问题进行推理、解释,并作出合理判断或得出正确结论的能力;试题通过B基因表达对卵细胞的影响,体现了对科学思维素养中演绎与推理要素的考查。(1)B基因的启动子无法启动转录,会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取的总RNA,经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程①需将基因表达载体导入农杆菌,所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程②农杆菌感染水稻愈伤组织,农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因,正常植株也会出现杂交带,故A错误;B、D选项是检测Luc基因及其产物,B、D正确;C选项检测对象是卵细胞中mRNA,正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA,C正确。(5)一般情况下,水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚,而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚,说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
21.[2019浙江4月选考,32(二),7分]回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题:
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原),可通过　　　　　　　技术获得特异性探针,并将　　　　　　中所有基因进行表达,然后利用该探针,找出能与探针特异性结合的表达产物,进而获得与之对应的目的基因。 
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达,应检测　　　　　(A.质粒载体　B.转录产物　C.抗性基因　D.病原微生物) 
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生　　　　　,可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入　　　　　　　　,并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用　　　　　　培养建立的细胞系用于筛选,则可快速获得稳定遗传的抗病植株。 
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中,有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株,可采用的方法是　　　　　　　　。 
答案　(1)单克隆抗体　基因文库　(2)B　(3)变异　高浓度致病真菌　花粉离体　(4)胚的离体培养
解析　(1)对于已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原),可通过单克隆抗体技术获得特异性探针,并将植株基因文库中所有基因进行表达,然后利用该探针,找出能与探针特异性结合的表达产物,进而获得与之对应的目的基因。(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达,应检测转录产物。(3)植物细胞在培养过程中往往会发生变异,可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入高浓度致病真菌,并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用花粉离体培养建立的细胞系用于筛选,则可快速获得稳定遗传的抗病植株。(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中,有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株,可采用的方法是胚的离体培养。
22.(2018课标全国Ⅱ,38,15分)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如图,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
启动子
L1基因
GFP基因
终止子

　 　　　　　　↑E1　　　　↑E2　　↑E3　↑E4
回答下列问题:
(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是　　　　。使用这两种酶进行酶切是为了保证　　　　　　,也是为了保证　　　　　　　　　。 
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了　　　　和　　　　过程。 
(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的　　　　　　移入牛的　　　　　　　　中、体外培养、胚胎移植等。 
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的　　　　(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。 
答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　(2)转录　翻译　(3)细胞核　去核卵母细胞　(4)核DNA
解析　本题综合考查基因工程与胚胎工程的相关知识,试题通过基因表达载体的构建、PCR技术的分析等考查考生能否根据文字或图示,运用演绎与推理等科学思维方法分析题意、展开探讨,得出答案。(1)构建基因表达载体时,使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的两种限制酶,可以防止自身环化,并且保证融合基因和质粒正确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光,说明L1基因已经表达,即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因,需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板,用PCR方法进行鉴定。
23.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用　　　　技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的　　　　,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。 
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与　　　　连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的　　　　进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。 
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加　　　　　　　　的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。 
特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是　　　(单选)。 
　　　　　　　　　　　　　　　
A.病毒的DNA聚合酶　　　B.宿主的DNA聚合酶
C.病毒的RNA聚合酶　　　D.宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起　　　　免疫,增强免疫保护效果。 
答案　(1)PCR　多肽(或蛋白质)　(2)载体　总RNA　(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)细胞
解析　本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。
24.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的α-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备α-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题:

(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前,需先获得细菌的　　　　　　　。 
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的　　　　端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中　　　的设定与引物有关,　　　　的设定与扩增片段的长度有关。(填序号) 
①变性温度　②退火温度　③延伸温度　④变性时间
⑤退火时间　⑥延伸时间
(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列:
5'-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3'
图中虚线框内mRNA片段包含　　　　个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有　　　　种。 
(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如表:
缓冲液
50 mmol/L
Na2HPO4 -KH2PO4
50 mmol/L
Tris-HCl
50 mmol/L
Gly-NaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相对
活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8

根据上述实验结果,初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(8分)(1)基因组DNA　(2)5'　使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连　(3)②　⑥　(4)8　13　(5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl
解析　本题主要考查PCR技术、密码子分析、外界因素对酶活性的影响等知识,考查考生识记知识、理解图示、分析判断的能力。试题中的图示、表格分析,体现了对考生科学思维素养中的演绎与推理要素、科学探究素养中的结果分析要素的考查。(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α-淀粉酶基因,因此在扩增α-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3'端相连的,由此确定需在引物的5'端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制性酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5'端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子的第一个碱基已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为4×4=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:α-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。
25.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:

(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过　　　获得　　　　用于PCR扩增。 
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的　　　　　　　　　位点。设计引物时需要避免引物之间形成　　　　　　　,而造成引物自连。 
(3)图中步骤1代表　　　　,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。 
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏　　　　　　　的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但　　　　　　的引物需要设定更高的退火温度。 
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有　　　　(填序号:①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。 
答案　(8分)(1)逆转录　cDNA　(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对　(3)变性　(4)引物与模板　GC含量高　(5)②③
解析　本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
知识归纳　关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。
26.(2016课标全国Ⅰ,40,15分)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:

(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有　　　　　　　　　　(答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。 
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　;并且　　　　　　　　　　　和　　　　　　　　　　　　　　　　的细胞也是不能区分的,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有　　　　的固体培养基。 
(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自　　　　。 
答案　(1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长　四环素
(3)受体细胞
解析　本题借助图示模型考查基因工程的技术,考查考生是否具有针对特定生物学问题,运用模型分析、演绎与推理等科学思维方法展开探讨的能力。(1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自受体细胞。
评分细则　(1)能自我复制(具有复制原点,具有复制起始位点),具有标记基因(具有抗性基因),具有限制性核酸内切酶酶切位点(限制酶酶切位点),以上每个得分点2分,任选2个即可得4分,答出一点给2分。
(2)二者均不含氨苄青霉素抗性基因Ampr,在该培养基上均不生长(2分),不含抗性基因为关键词。含有质粒载体(2分),含插入了目的基因的重组质粒(含重组质粒)(2分),此两问不分先后顺序。二者均含氨苄青霉素抗性基因Ampr,在该培养基上均能生长(2分),含有抗性基因为关键词。四环素/Tet(1分),中英文均可得分。
(3)受体细胞/宿主细胞(2分)。
27.(2016课标全国Ⅲ,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

图(a)

图(b)
根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　,不能表达的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 

图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有　　　　　　　和　　　　　　,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分)
(2)甲和丙(2分)　甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3分,其他合理答案可酌情给分)
(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给分)
解析　(1)分析图(a)可知,限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达,目的基因应插入在启动子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不符合要求,目的基因均不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
评分细则　(1)第一空答其他两种酶不给分。第二空答“两种酶切割后形成的黏性末端可互补”给全分。
(2)第二空原因答作“目的基因应插入至启动子与终止子之间”也给分。
(3)第一空、第二空顺序可颠倒,第三空答案唯一。
28.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取　　　　合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。 

(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是　　　　　(填写字母,单选)。 
A.人血细胞启动子　　　B.水稻胚乳细胞启动子
C.大肠杆菌启动子　　　D.农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比,选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(5)为证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与　　　　的生物学功能一致。 
答案　(1)总RNA(或mRNA)

(2)B
(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化
(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工
(5)HSA
解析　本题主要考查基因工程的相关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的,所以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA复制,DNA复制时,两条子链的延伸方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达,需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞,使农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物,无内质网和高尔基体,不能对多肽进行高效加工,而水稻是真核生物,具有内质网和高尔基体,可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
易错警示　注意PCR技术的原理是DNA复制,DNA复制时,两条母链分别作为模板,新合成的两条子链延伸的方向相反,由此确定引物的位置及扩增方向。
29.(2015课标全国Ⅱ,40,15分)已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:
(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的　　　　　　　进行改造。 
(2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰 
基因或合成　　　　基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括　 
的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过　　　　　　　　　　和　　　　　　　　　　,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物　　　　进行鉴定。 
答案　(1)氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分)
(2)P　P1(每空2分,共4分)　DNA和RNA(或遗传物质)(2分)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列(每空2分,共4分)　功能(1分)
解析　(1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括遗传信息的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
30.(2015课标全国Ⅰ,40,15分)HIV属于逆转录病毒,是艾滋病的病原体。回答下列问题:
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时,可先提取HIV中的　　　　,以其作为模板,在　　　　的作用下合成　　　　,获取该目的蛋白的基因,构建重组表达载体,随后导入受体细胞。 
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白,该蛋白作为抗原注入机体后,刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是　　　　,该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV,检测的原理是　　　　　　　　　　。 
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见,但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分　　　　细胞,降低了患者免疫系统的防卫功能。 
(4)人的免疫系统有　　　　　　癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷,易发生恶性肿瘤。 
答案　(1)RNA　逆转录酶　cDNA(或DNA)(每空2分,共6分)　(2)抗体(2分)　抗原抗体特异性结合(3分)　(3)T(或T淋巴)(2分)　(4)监控和清除(2分)
解析　本题以HIV为背景,主要考查了逆转录病毒的遗传信息流动、人体的免疫调节等。(1)HIV属于逆转录病毒,要获取目的蛋白的基因,可先从HIV中提取其RNA,再以其作为模板,在逆转录酶的作用下合成cDNA,此cDNA即含有该目的蛋白的基因。(2)目的蛋白作为抗原注入机体后,可启动机体的体液免疫,通过浆细胞产生抗体,而此抗体可与目的蛋白特异性结合。利用上述原理可检测受试者血清中是否含有HIV。(3)HIV致病的机理是HIV主要感染和破坏了患者的部分T细胞,降低了患者免疫系统的防卫功能。(4)人体的免疫系统有监控和清除癌细胞的功能。
31.(2015天津理综,8,16分)(16分)纤维素分子不能进入酵母细胞。为了使酵母菌能够利用环境中的纤维素为原料生产酒精,构建了含3种不同基因片段的重组质粒。下面是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。

据图回答:
(1)本研究构建重组质粒时可选用四种限制酶,其识别序列如下图。为防止酶切片段的自身连接,可选用的限制酶组合是　　　　或　　　　。 

A.①②　　　B.①③　　　C.②④　　　D.③④
(2)设置菌株Ⅰ为对照,是为了验证　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　不携带纤维素酶基因。 
(3)纤维素酶基因的表达包括　　　　和　　　　过程。与菌株Ⅱ相比,在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有　　　　　　　　。 
(4)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,菌株　　　　不能存活,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(5)酵母菌生成酒精的细胞部位是　　　　　　　　　　,产生酒精时细胞的呼吸方式是　　　　。在利用纤维素生产酒精时,菌株Ⅳ更具优势,因为导入的重组质粒含有　　　　,使分泌的纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,提高酶的利用率。 
答案　(16分)(1)B(或C)
C(或B)
(2)质粒DNA和酵母菌基因组
(3)转录　翻译　内质网、高尔基体
(4)Ⅱ　缺少信号肽编码序列,合成的纤维素酶不能分泌到胞外,细胞无可利用的碳源
(5)细胞质基质　无氧呼吸　A基因片段
解析　本题借助新情境材料考查对照实验结果分析、基因工程、分泌蛋白表达、呼吸等相关知识,考查学生获取信息能力、实验能力、理解能力。(1)为防止酶切片段的自身连接,必须用不同限制酶切割,且酶切片段两端的黏性末端不相同(不存在碱基互补片段)。从图示看,符合要求的限制酶有以下组合:①③、①④、②③、②④,B、C正确。(2)分析对照实验首先要确定自变量,本题中自变量是导入含不同基因片段的重组质粒。菌株Ⅰ为空白对照,与其他三个组别比较,不难发现设置菌株Ⅰ的目的是验证质粒自身及酵母菌原基因组不携带纤维素酶基因。(3)基因表达包括转录和翻译两个过程。通过图示来看菌株Ⅱ中,纤维素酶只分布在细胞质基质中,而菌株Ⅲ和菌株Ⅳ的纤维素酶分布在内质网、高尔基体、囊泡、细胞外,所以菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有内质网、高尔基体。(4)菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行对比,不难发现信号肽的作用是引导多肽(纤维素酶)进入内质网加工,再经高尔基体分泌到胞外,这样纤维素酶可在胞外将纤维素水解为葡萄糖,供酵母菌吸收利用。而菌株Ⅱ纤维素酶在胞内无法水解纤维素,故在以纤维素为唯一碳源的培养基上,菌株Ⅱ不能存活。(5)酵母菌无氧呼吸生成酒精,场所为细胞质基质。菌株Ⅲ和Ⅳ均能水解纤维素产生酒精,两组进行对比,菌株Ⅲ的纤维素酶流失多,菌株Ⅳ因导入A基因片段使得纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,酶的利用率更高。
32.(2012江苏单科,32,9分)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列,图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。
请回答下列问题:

图1

图2
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由　　　　　　　　　　连接。 
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段,产生的末端是　　　　末端,其产物长度为　　　　。 
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,产物中共有　　　种不同长度的DNA片段。 
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是　　　　。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添加　　　　的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达,其最可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
答案　(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖　(2)平　537 bp、790 bp、661 bp　(3)4　(4)BamHⅠ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D与质粒反向连接
解析　本题主要考查基因工程中限制酶的作用原理和重组质粒构建的相关知识。(1)通过分析DNA分子结构的特点可知,在DNA的一条链中,相邻两个碱基依次由脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖连接。(2)限制酶SmaⅠ的识别序列和酶切位点为CCC?GGG,酶切位点位于识别序列的中轴线上,所以酶切后形成的末端是平末端。在图1DNA片段中,有两个SmaⅠ的识别序列,完全切割后形成的产物长度分别为:534 bp+3 bp=537 bp;796 bp-3 bp-3 bp=790 bp;658 bp+3 bp=661 bp。(3)D基因突变为d基因后,其碱基序列中只含有一个SmaⅠ的识别序列,此时用SmaⅠ完全切割该DNA片段后产物的长度有两种,分别为:534 bp+796 bp-3 bp=1 327 bp;658 bp+3 bp=661 bp。所以,从杂合子(Dd)中分离出的D、d基因如图1对应的DNA片段被SmaⅠ完全切割,产物中有537 bp、790 bp、661 bp、1 327 bp 4种不同长度的DNA片段。(4)分析图1DNA片段上的限制酶酶切位点可知,为了防止目的基因被破坏,并将目的基因从DNA片段中切下来,可选择用BamHⅠ或MboⅠ对目的基因进行处理。质粒用MboⅠ处理后抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都会被破坏,质粒用BamHⅠ处理后,会破坏抗生素A抗性基因,但抗生素B抗性基因正常,所以应选用的限制酶是BamHⅠ。筛选含重组质粒的大肠杆菌时,一般需用添加抗生素B的培养基进行培养。因为用同种限制酶处理后目的基因和质粒上形成的黏性末端完全相同,所以部分目的基因D可能会反向连接在质粒上,此类重组质粒上的目的基因D将不能正确表达。
33.(2011山东理综,35,8分)人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。

(1)卵母细胞除从活体输卵管中采集外,还可从已处死的雌鼠　　　中获取。 
(2)图中的高血压相关基因作为　　　,质粒作为　　　,二者需用　　　切割后连接成重组载体,该过程与质粒上含有　　　有关。 
(3)子代大鼠如果　　　和　　　,即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达,然后可用其建立高血压转基因动物模型。 
(4)在上述转基因大鼠的培育过程中,所用到的主要胚胎工程技术是　　　、早期胚胎培养和胚胎移植。 
答案　(1)卵巢　(2)目的基因　载体　同种限制性核酸内切酶(或:同种限制酶)　限制酶切割位点　(3)检测到体内有相关蛋白　出现高血压　(4)体外受精
解析　(1)胚胎工程中卵母细胞的采集常从活体输卵管中获取,也可以从已处死的雌性动物卵巢中获取。(2)图示为转基因技术在胚胎工程中的应用,图中的高血压相关基因为目的基因,质粒作为载体。构建重组质粒时,需用同种限制酶切割目的基因和质粒分子,由于二者有相同限制酶切割位点,二者可以连接形成基因表达载体。(3)目的基因的表达检测可以分别在分子水平和个体水平检测,即检测体内是否产生相关蛋白质和是否出现高血压症状。(4)题中转基因大鼠培育过程中,用到的生物技术有转基因技术、体外受精技术、早期胚胎培养和胚胎移植技术,其中后三者从属于胚胎工程技术。
34.(2013课标Ⅰ,40,15分)阅读如下资料:
资料甲:科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵中,得到了体型巨大的“超级小鼠”;科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。
资料乙:T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T4溶菌酶的基因进行了改造,使其表达的T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸,在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键,提高了T4溶菌酶的耐热性。
资料丙:兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体,科学家将兔甲受精卵发育成的胚胎移植到兔乙体内,成功产出兔甲的后代,证实了同一物种的胚胎可在不同个体的体内发育。
回答下列问题:
(1)资料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用　　　　　法。构建基因表达载体常用的工具酶是　　　　　　　和　　　　　　　。在培育有些转基因植物时,常用农杆菌转化法,农杆菌的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(2)资料乙中的技术属于　　　　工程的范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础,通过基因修饰或基因合成,对　　　　　　　进行改造,或制造一种　　　　的技术。在该实例中,引起T4溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的　　　　序列发生了改变。 
(3)资料丙属于胚胎工程的范畴。胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到　　　　种的、生理状态相同的另一个雌性动物体内,使之继续发育成新个体的技术。在资料丙的实例中,兔甲称为　　　　体,兔乙称为　　　　体。 
答案　(1)显微注射　限制性内切酶　DNA连接酶　农杆菌可感染植物,将目的基因转移到受体细胞中
(2)蛋白质　现有的蛋白质　新蛋白质　氨基酸
(3)同　供　受
解析　(1)将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法;由于农杆菌可感染植物,并且其Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞染色体DNA上,故培育转基因植物时常用农杆菌转化法。(2)资料乙中的技术对T4溶菌酶完成了改造,这种对现有蛋白质进行改造或制造一种新蛋白质的技术属于蛋白质工程。(3)资料丙中兔甲和兔乙的作用分别是提供早期胚胎和接受并孕育胚胎,两者在胚胎工程中分别被称为供体和受体。
考点三　DNA的粗提取与鉴定
1.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是(　　)
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案　B　由于在低温条件下DNA酶的活性较低,因此过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A正确;DNA存在于上清液中,离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,B错误;沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C正确;并非所有蛋白质都可溶于冷酒精,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质,D正确。
2.(2012江苏单科,18,2分)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述,正确的是(　　)
A.洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B.将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C.常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取
D.用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少
答案　C　本题考查DNA粗提取与鉴定实验的基本知识。洗涤剂能瓦解细胞膜,但对DNA在NaCl溶液中的溶解度无影响,故A错误;DNA丝状物需先溶解在适宜浓度的NaCl溶液中,然后加入二苯胺试剂,混合均匀后沸水浴,待冷却后溶液变蓝,故B错误;常温下菜花匀浆中有些水解酶可能会使DNA水解而影响DNA的提取,故C正确;用玻棒朝一个方向缓慢搅拌可减轻对DNA分子的破坏,有利于DNA分子的提取,故D错误。
3.(2011江苏单科,19,2分)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中,相关叙述正确的是(　　)
A.用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L,滤去析出物
B.调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶,都可以去除部分杂质
C.将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈蓝色
D.用菜花替代鸡血作为实验材料,其实验操作步骤相同
答案　B　用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L时,滤取析出物;利用二苯胺试剂鉴定DNA时,需沸水浴加热几分钟,才呈蓝色;用菜花替代鸡血为实验材料,需要对材料的细胞壁进行处理。调节NaCl溶液浓度改变不同物质在其中的溶解度,加入木瓜蛋白酶分解蛋白质都可以去除部分杂质,故B正确。
考点四　生物技术的安全性与伦理问题
1.(2021北京,14,2分)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是(　　)
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案　A　高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
2.(2014重庆理综,2,6分)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述,错误的是(　　)
A.应严格选择转基因植物的目的基因,避免产生对人类有害的物质
B.当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验,但不反对治疗性克隆
C.反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
答案　D　在获得转基因植物时,要严格选择目的基因,避免产生对人类有害的毒性蛋白或过敏蛋白等物质,A正确;当今社会的普遍观点是禁止有关人类的生殖性克隆,但不反对治疗性克隆,B正确;反对设计试管婴儿的原因之一是有人将此技术用于设计婴儿性别,C正确;生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂及经过基因重组的致病菌等,干扰素不属于生物武器,D错误。
3.(2013江苏单科,15,2分)下列关于转基因生物安全性的叙述中,错误的是(　　)
A.我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B.国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C.开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D.目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
答案　B　本题考查了转基因生物安全性的有关知识。目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性两个方面;因对转基因生物的安全性还处于争论阶段,故不可能在转基因食品标签上警示性注明可能的危害;但我国已对转基因食品和农产品强制实施了产品标识制度,以维护消费者对转基因产品的知情权和选择权;开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提。
4.(2012江苏单科,13,2分)下列关于转基因生物安全性的叙述,错误的是(　　)
A.种植转基因作物应与传统农业种植区隔离
B.转基因作物被动物食用后,目的基因会转入动物体细胞中
C.种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性
D.转基因植物的目的基因可能转入根际微生物
答案　B　本题主要考查转基因生物安全性的相关问题,种植转基因作物时为了避免基因污染,应与传统农业种植区隔离,故A对;转基因作物被动物食用后,目的基因会被动物消化,不会转入动物体细胞中,故B错;转基因植物有可能将基因扩散至野生植物中,从而影响野生植物的遗传多样性,故C对;转基因植物的目的基因可被微生物利用,故D对。