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2024届高考生物一轮总复习选择性必修3第34章基因工程生物技术的安全性和伦理问题课件
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这是一份2024届高考生物一轮总复习选择性必修3第34章基因工程生物技术的安全性和伦理问题课件，共60页。PPT课件主要包含了考情分析，基因工程的概念，人们的愿望，转基因，遗传性状，3载体，标记基因的作用，目的基因，DNA半保留复制，复性和延伸等内容，欢迎下载使用。
第3、4章
基因工程、生物技术的
安全性和伦理问题
[考情分析]
(续表)
考点一 DNA 重组技术的基本工具
1.基因工程的概念。
人们的愿望
转基因
(1)手段：按照____________，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：______水平。
分子
(4) 优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的
__________。
遗传性状
(1)限制酶的识别序列与被作用的 DNA 序列是不同的。前者一般由 6 个核苷酸组成，少数由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。
(2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。 (3)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此DNA 分子，产生 4 个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶。
(3)载体。
限制酶的选择方法 根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
甲
乙
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组 DNA 的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用 Sma Ⅰ切割。
3.标记基因的作用。
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
考点二 基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取。
(1)目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中
筛选。
(2)目的基因的获取方法。
①利用 PCR 获取和扩增目的基因。②人工合成目的基因。
a.反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的 mRNA 为模板，借助逆转录酶合成双链 DNA，其过程如下。
b.化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因
序列，然后直接合成目的基因，其过程如下。
③从基因文库中获取目的基因。 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA，以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
(3)利用 PCR 获取和扩增____________。
目的基因
DNA 半保留复制
①原理：__________________。②条件。
(续表)
③过程：PCR 过程包括______________________三步。a.变性：在温度为 90～95 ℃的高温中，DNA 碱基对之间的氢
键断裂，双链解旋为单链。
变性、复性和延伸
b.复性(退火)：温度下降到 50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链 DNA 结合。
c.延伸：温度上升到 72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。
结果：DNA 分子以指数形式扩增(约为 2n，其中 n 为扩增循环
次数)。
PCR 技术和 DNA 复制的比较
2.基因表达载体的构建——核心。
受体细胞
(1)目的：使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)组成。
启动子≠起始密码子 终止子≠终止密码子
(1)启动子是位于基因上游的一段特殊序列，它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因下游的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。
(2)起始密码子和终止密码子均位于 mRNA 上，分别控制翻译
过程的启动和终止。
(3)构建过程。
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
(2)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体 DNA 上。存在于染色体 DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定。
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用。(1)食品工业方面。
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因
技术大量生产凝乳酶。
(2)医药卫生领域。
供体
①器官移植：用转基因动物作器官移植的________，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 ②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
乳腺生物反应器与工程菌的比较
(续表)
结构规律
改造或合成
(1)概念：以蛋白质分子的__________及其与生物功能的关系作为基础，通过____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (2)操作手段和结果。
(3)基本思路。
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
考点四 生物技术的安全性与伦理问题1.转基因产品的安全性。
2.关注生殖性克隆人。
(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆人“有违人类尊严”。
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不
健全的人，严重违反了人类伦理道德。
③克隆技术尚不成熟，面临构建重构胚胎成功率低，胚胎移植到母体子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。
(2)我国禁止生殖性克隆人。
①中国政府积极支持制定《禁止生殖性克隆人国际公约》，坚
决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验。
②我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、
不接受任何生殖性克隆人实验。
③我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
(3)重要过程。
治疗性克隆和生殖性克隆的比较
3.试管婴儿与设计试管婴儿的异同点。(1)不同点。
①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断 HLA 的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了 d 过程。
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试
管婴儿用于白血病、致命贫血症等疾病的治疗。
(2)相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要
经过胚胎移植，都是有性生殖。
4.生物武器。(1)种类。①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改
造的流感病毒等。
生化毒剂
致病能力强，攻击范围广
③________类：肉毒杆菌毒素等。 (2)特点：__________________________。 (3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
(4)《禁止生物武器公约》。
①1972 年 4 月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁
止生物武器公约》，并于 1975 年 3 月生效。 ②1984 年 11 月，我国也加入了这一公约。
③1998 年 6 月，中美两国元首重申了在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
④2010 年，在第 65 届联合国大会上，我国政府主张全面禁止
和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
【基础测评】1.易错诊断(1)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳
定存在并表达。(
)
(2)外源 DNA 在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进
行复制。(
)
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常
表达。(
)
(4)如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性
问题。(
)
(5)蛋白质工程的目标是对基因的结构进行分子设计。(
)
答案：(1)√ (2)× (3)√ (4)×
(5)×
2.下列关于载体的相关叙述，错误的是(
)
A.目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒B.天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞C.载体 DNA 分子上要有一个至多个限制酶切割位点D.载体上的标记基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞答案：B
3.科学家为提高玉米中赖氨酸的含量，计划将天冬氨酸激酶第352 位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中 104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离
)
赖氨酸含量分别提高 5 倍和 2 倍。此操作过程是( A.直接通过分子水平改造蛋白质 B.直接改造相应的 mRNA C.直接改造相应的基因 D.重新合成新的基因 答案：C
)
4.关于我国的生物技术研究与应用的叙述，错误的是(A.禁止运用转基因技术改造农作物B.反对生物武器及其技术和设备的扩散C.不赞成、不接受、不进行任何生殖性克隆人实验D.成立相关伦理专家委员会应对重大医学伦理问题答案：A
考向 1 基因工程所需工具
[典例 1](2021 年全国乙卷)用 DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题。
(1)常用的 DNA 连接酶有 E.coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。上图中____________酶切割后的 DNA 片段可以用 E.coli DNA连接酶连接。上图中______________酶切割后的 DNA 片段可以用T4 DNA 连接酶连接。
(2)DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成
的化学键是__________。
(3)DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒 DNA 分子上有______________，便于外源 DNA 插入；质粒DNA 分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________
____________________。
解析：(1)限制酶 EcoR Ⅰ和 Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶 Sma Ⅰ和 EcoR V 切割形成的是平末端，E.coli DNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而 T4 DNA 连接酶来源于 T4 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中 EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割后的 DNA 片段(黏性末端)可以用 E.coli DNA 连接酶连接，除了这两种限制酶切割的 DNA 片段，限制酶 Sma Ⅰ和 EcoRV 切割后的 DNA 片段(平末端)也可以用 T4 DNA 连接酶连接。(2)DNA 连接酶将两个 DNA 片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是
小型环状的 DNA 分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒 DNA 分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的 DNA片段，位于基因的上游，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA，最终获得需要的蛋白质。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和 EcoR V(2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因上游的一段特殊 DNA 序列，是 RNA 聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【考向集训】
1.(2022 年广东四校联考)人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程。图中 TetR 表示四环素抗性基因，AmpR 表示氨苄青霉素抗性基因，四种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题。
(1)一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是___________________________________________________________________________________________。
(2)为构建重组载体，应选择____________酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的6 个碱基对序列为____________________。
(3)以大肠杆菌为受体细胞，将酶切后的连接产物导入受体细胞。为筛选出导入目的基因的受体菌，首先需要将得到的上述大肠杆菌接种到含________培养基(A)上，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含______培养基(B)上，在 B 上能生长的_______(填“是”或“不是”)成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是__________________________________________________。
解析：(1)cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片段，与载体连接后导入受体菌群体储存。(2)根据表中 4 种酶的识别序列及切割位点可知，BamHⅠ酶和 BclⅠ酶识别的序列相同，可以切出相同的黏性末端，因此可选择这 2 种酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的 6 个
碱基对序列为
、
。(3)用 BamHⅠ酶切割后会破
坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生存下来，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含四环素培养基(B)上，在B 上能生长的不是成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是用 BamHⅠ酶和 BclⅠ酶切形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接。
答案：(1)人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片
段，与载体连接后导入受体菌群体储存
(2)BamHⅠ和 BclⅠ
(3)氨苄青霉素 四环素 不是 用 BamHⅠ酶和 BclⅠ酶切割
形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
考向 2 PCR 技术的应用
[典例 2](2021 年山东高考)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_____________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于____________________，理由是______________________________________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子 P 的扩增后的产物读取方向
与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的 R 端与荧光蛋白基因中限制酶 Mun Ⅰ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和 Xho Ⅰ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶 Mun Ⅰ和Xho Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶
Mun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与限制酶 EcoR Ⅰ识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是 Sal Ⅰ；荧光蛋白基因中含有限制酶 EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶 Mun Ⅰ和 Xho Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶 Mun Ⅰ和 Xho Ⅰ切割，对扩增后的产物用限制酶 EcoR Ⅰ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，然后在 DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用 Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩
增到载体构建完成的整个过程共需要 6 种酶，分别是 Taq 酶、限制酶 EcoR Ⅰ、限制酶 Sal Ⅰ、限制酶 Mun Ⅰ、限制酶 Xho Ⅰ、DNA 连接酶。(2)受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要 RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的 BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与 BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F4 与引物 R 之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F5 的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)Sal Ⅰ
EcoRⅠ 6 (2)F7 与 R 扩增产物不含完整
的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上
所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以
通过 DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基
因又比较大，可以通过 PCR 技术扩增目的基因。
【考向集训】
2.(2022 年广东二模)图 1 是我国自主设计的“本地＋移动”一站式新型冠状病毒核酸检测平台示意图，单平台混样日检测量可达 13 万人次。图 2 为 RT-PCR(逆转录荧光 PCR 技术)的原理：PCR过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和猝灭基团(抑制荧光发出)，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与猝灭基团分离而发出荧光。
图 1
图 2
回答下列问题。
(1)PCR 技术的目的是____________________________。RT-PCR 过程中，需先将 RNA 逆转录成 cDNA，故装置中需
添加的酶有________。
(2)对新型冠状病毒进行检测时，探针的设计依据是_______________________________________________________________。探针与模板结合发生在 PCR 循环中的________( 选填“变性”“复性”或“延伸”)阶段。
(3)若监测系统检测到荧光信号，则可判定该检测样本为阳性，其原理是__________________________________________________________________________________________。
(4)为了在没有核酸检测的条件下及早发现新型冠状病毒，我国于 2022 年 3 月 11 日推出新型冠状病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是_________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR 技术的目的是大量扩增目的基因片段，用于基因工程或检测。以 RNA 为模板逆转录成 cDNA，是逆转录过程，需要用到逆转录酶。(2)探针是可以与模板结合的一小段 DNA 序列，故设计的依据是一段已知目的基因的核苷酸序列，变性过程是 DNA 双链打开的过程，复性时，引物与探针结合到模板 DNA上。(3)根据题意，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与猝灭基团分离而发出荧光。因此，样本中有新型冠状病毒核酸时，能进行快速复制，导致其荧光信号加强。(4)因为抗原与抗体的结合具有特异性，新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测原理是抗原抗体的特异性结合。
答案：(1)大量扩增目的基因片段，用于检测 逆转录酶(2)一段已知目的基因的核苷酸序列 复性
(3)样本中的新型冠状病毒核酸会被探针识别，从而进行快速
复制，导致其荧光信号倍增 (4)抗原抗体的特异性结合
考向 3 基因工程的基本操作程序
[典例 3](2021 年广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题。
(1)研究人员采用 PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________。(答出两种即可)
(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，方法有_____________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将 4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________。在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了 PCR 技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出
目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，可根据 DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的 DNA 分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技
术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 答案：(1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【考向集训】
3.(2022 年广东高考)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含 CO2 等温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题。
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用 PCR 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体 pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是___________________________________________________，终止子的作用是_________________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用 PCR 技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的 3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等温室气体为原料，实现了废物的
资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 答案：(1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的
受体细胞
终止转录，使转录在需要的地方停下来
(3)二氧化碳
等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
(4)废物
不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的
的资源化二氧化碳
考向 4 基因工程的应用
[典例 4](2022 年广东深圳一模)人体中血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时参与维持血浆正常的渗透压，在临床上应用广泛。但从人体中直接提取的血清白蛋白含量少，且易受污染，生物反应器可以解决此项难题。回答下列问题。
(1)从人体获取的血清白蛋白基因可通过________技术进行扩增，扩增后的血清白蛋白基因与启动子、________和________等
构建成基因表达载体。构建乳腺生物反应器时选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是_________________________________________________________________________。
(2)科学家将构建好的基因表达载体通过________技术导入奶牛的受精卵中。受精卵继续培养至胚胎。当胚胎发育至______阶段，取其________做 DNA 分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的______(填“雌”或“雄”)性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物，将来可从牛奶中提取得到大量的人血清白蛋白。
(3)有人提议将乳腺蛋白基因的启动子换成 uroplakinⅡ基因的启动子(高效促进目的蛋白在膀胱特异性表达及分泌)，可增加血清白蛋白的产量。请分析产量高的原因________________________________________________________________________________。 解析：(1)利用 PCR 技术可扩增血清白蛋白基因。扩增后的血清白蛋白基因与启动子、终止子、标记基因等构建成基因表达载体。而且目的基因必须插入到启动子和终止子之间。由于基因的选择性表达，要想基因特异性地只在乳腺细胞中表达，选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是使目的基因在动物体内的乳腺
细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品。(2)将重组质粒导入动物细胞通常使用显微注射技术，所以基因表达载体通过显微注射技术导入奶牛的受精卵中进行体外培养。受精卵继续培养至胚胎。当胚胎发育至囊胚阶段，取滋养层细胞做 DNA 分析来进行性别鉴定，目的产物要从乳汁中获取，所以筛选出发育状态良好的雌性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物。(3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大，因此将乳腺蛋白基因的启动子换成 uroplakinⅡ基因的启动子，可增加血清白蛋白的产量。
答案：(1) PCR 终止子 标记基因 使目的基因在动物体内
的乳腺细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品 (2)显微注射
囊胚 滋养层细胞 雌 (3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，
而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
【考向集训】
4.(2021 年广东珠海质量监测)变异链球菌在牙面的黏附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因(PAcA 基因)转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题。 (1)转基因植物的制备。
单一使用 PAcA 基因，机体的免疫应答不理想，霍乱毒素中有
增强机体免疫应答的氨基酸序列(CTB)，将 CTB 基因与 PAcA 基因连接成嵌合(PAcA-CTB)基因，作为______与 Ti 质粒的 T-DNA 拼接，构建表达载体。用________法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。
(2)转基因植株目的基因的 PCR 鉴定与检测。
已知 PAcA-CTB 基因部分序列如下(左侧为基因的首端)：5′…CCGTGT……ATGCCT—3′3′…GGCACA……TACGGA—5′
根据上述序列选择引物________( 填字母) 对目的基因进行PCR 扩增。
A.引物：5′－GGCACA－3′C.引物：5′－CCGUGU－3′
B.引物：5′－AGGCAT－3′D.引物：5′－CCGTGT－3′
反应结束后，通过电泳检测 PCR 产物，结果如右图(1 号来自未转化植株，2 号是含 PAcA-CTB基因的质粒，3～8 号来自转基因植物)，从结果可以看出，_______号植物含有 PAcA-CTB 基因。若
获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，其可能的原因是_________________________________________________________。
解析：(1)将 CTB 基因与 PAcA 基因连接成嵌合(PAcA-CTB)基因，作为目的基因与 Ti 质粒的 T-DNA 拼接，构建表达载体。将基因表达载体导入离体的黄瓜叶肉细胞中可以用农杆菌转化法。(2)PCR 技术中，子链合成的方向是从 5′到 3′，因此应该选择引物B、D。1 号来自未转化植株，2号是含PAcA-CTB基因的质粒，3～
8 号来自转基因植物，从结果可以看出，3 、5 、8 号植物含有PAcA-CTB 基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，可能的原因是目的基因(PAcA-CTB 基因)没有转录或转录的 mRNA 没有翻译。
答案：(1)目的基因 农杆菌转化 (2)B、D 3、5、8 目的
基因(PAcA-CTB 基因)没有转录或转录的 mRNA 没有翻译
考向 5 蛋白质工程
[典例 5](2022 年湖南高考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题。
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质 a 是____________，物质b 是_______。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________、_______________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是______________________________________________________________________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理
后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是___________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路
________________________________________________________
________________________________。
解析：(1)据分析可知，物质 a 是多肽链中的氨基酸序列，物质 b 是 mRNA。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过 DNA 合
成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其
活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入 1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
答案：(1)多肽链中的氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性
(2)从基因文库中获取目的基因
通过 DNA 合成仪用化学方法直
接人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解
时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度
破坏
(4)取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭
素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入 1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【考向集训】
5.(2022 年海南海口模拟)利用木聚糖酶进行纸浆漂白，可以大幅度减少氯化物的用量，减轻造纸工业对环境的污染。纸浆漂白需要在高温碱性条件下进行，因此需要耐热耐碱的木聚糖酶。根据生产需要，科学家对已知氨基酸序列的木聚糖酶进行改造，获得了耐高温耐碱的新木聚糖酶，减少了纸浆漂白时木聚糖酶的用量，提高了生产效率。回答下列问题。
(1)蛋白质工程的目标是根据人们对______________的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程原则上只能生产________，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要。
(2)在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞，原因是大肠杆菌________________________________________________________________________________________(答出两点)。分离纯化大肠杆菌时，可使用接种环采用________法将聚集的菌
种逐步分离并培养成单菌落；实验室中利用选择培养基筛选微生物的原理是__________________________________________。 (3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前要先构建________，以使目的基因能够表达和发挥作用。若要将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱木聚糖酶应用于造纸工业生产，除了需要研究木聚糖酶的产量外，还需要检测木聚糖酶的________。
(4)有研究表明，在木聚糖酶中特定部位引入精氨酸可以增加木聚糖酶中的离子键数目，从而增加该酶在碱性环境中的稳定性。利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是___________________________________________________________________。根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计新木聚糖酶的基因，会设计出多种脱氧核苷酸序列，原因是_____________________________________________________________________________________。
解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。(2)由于大肠杆菌为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少，所以在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞。采用平板划线法分离纯化大肠杆菌时，使用的接种工具为接种环。实验室中利用选择培养基筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌
生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前，需要先将其与载体结合，构建基因表达载体，以使目的基因能够表达和发挥作用。在将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱的木聚糖酶应用于造纸工业生产前，需要研究该木聚糖酶的产量并对木聚糖酶的生物活性(或催化效率)进行检测。(4)利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是：根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因。由于密码子
具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)，导致根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计的新木聚糖酶的基因会有多种脱氧核苷酸序列。 答案：(1)蛋白质功能 自然界中已存在的蛋白质 (2)为单细
胞、繁殖快、遗传物质相对较少
平板划线
人为提供有利于目
的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长 (3)基因表
达载体
生物活性(或催化效率)
(4)根据需要对耐碱的木聚糖酶
的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基
酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因 密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)
荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。
考向 6 生物技术的安全性和伦理问题
[典例 6](2022 年北京高考)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E 物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色
________________________________________________________
__________________，因而被用于制备监测鱼(MO)。
(2)为监测 E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 ERE 和酵母来源的 UAS 是两种诱导型启动子，分别被 E 物质－受体复合物和酵母来源的 Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案 1 相比，方案 2 的主要优势是_______
方案 1
方案 2
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P 生)
④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P 肌)
(3)现拟制备一种不育的监测鱼 SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本(X)杂交获得。欲获得 X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：________。
(5)使拟用于实际监测的 SM 不育的目的是________________
_________________________________。
Ⅱ.基因：________
A.GFPB.Gal4
C.雌激素受体基因(ER)
D.仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM 不育的原因是：成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合
后____________造成不育。
得 SM，MO 是方案 2 获得的，所以亲本 X 启动子选择 UAS。要获得 SM 是不育个体，MO 是可育的，所以 X 必须有仅导致生殖
解析：(1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。(2)由图可知，方案 1 中的 E 物质—受体复合物激活 ERE，使 GFP基因表达，方案 2 中的 E 物质—受体复合物先激活 ERE 获得 Gal4蛋白，然后 Gal4 蛋白激活 UAS 启动子，使 GFP 基因表达，方案2 中的 GFP 蛋白表达量大，更灵敏。(3)MO 和另一亲本(X)杂交获
答案：(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ②
D (4)激活
ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 结合 UAS 诱导 dg 表达，生殖细胞凋
亡
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
细胞凋亡的基因(dg)。(4)成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活 ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 与 UAS 启动子结合诱导 dg 表达，使生殖细胞凋亡。(5)监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要 SM 不育。
A.消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的
重要方面
B.由于技术问题，生殖性克隆可能孕育出有严重生理缺陷的
克隆动物
【考向集训】 6.(2022 年广东梅州期末)生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风
险。下列相关叙述错误的是(
)
解析：在生物恐怖威胁不断上升、全球传染病疫情频发的情况下，消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面，A 正确。由于克隆技术尚不成熟，现在做克隆人很可能孕育出有严重生理缺陷的孩子。理由是重构胚胎成功率低，移
C.为避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露
基因检测的结果
D.从外来入侵害虫的原产地引入天敌进行治理，不会对入侵
地造成生态影响
进行治理，由于短期内天敌没有资源和空间等的限制，可能会对入侵地造成生态影响，D 错误。
答案：D
植入母体子宫后胚胎着床率低、流产率高、胎儿畸形率高，出生后死亡率高等，正常的个体极少，B 正确。为了尽力规避基因诊断的风险，避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露基因检测的结果，C 正确。从外来入侵害虫的原产地引入天敌
DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA 的粗提取与鉴定。(1)原理。
(2)方法步骤。
①研磨材料：新鲜洋葱，加研磨液充分研磨。
②获取含 DNA 的滤液：过滤(纱布)、提取滤液(或在 1500 r·
min-1 转速下离心 5 min 取上清液)。
③析出 DNA：在上清液中加入体积分数为 95%的酒精溶液，静置后用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起白色丝状物，或在 10 000 r·min-1 转速下离心 5 min 取沉淀物。
④溶解 DNA：将丝状物或沉淀溶解在 2 mol·L-1 的 NaCl 溶液中。⑤鉴定 DNA：在溶有 DNA 的溶液中加入二苯胺试剂，混合
均匀后将试管在沸水中加热 5 min，溶液变成蓝色。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定。(1)原理。
①PCR 原理：DNA 热变性原理。
②电泳。
a.概念：是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程。
b.原理：在一定的 pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
c.作用过程：由于各种分子的带电性质差异、大小不同、形状不同，在电场作用下会产生不同的迁移速率，从而实现各种分子的分离。
d.方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶
电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(2)方法步骤。①PCR 扩增。
②鉴定 PCR 产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
[典例 1](2021 年山东高考)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对
含量较高的白色丝状物的处理方式是(
)
A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D.加入 NaCl 调节浓度至 2 mol·L-1→过滤→调节滤液中 NaCl浓度至 0.14 mol·L-1
解析：木瓜蛋白酶可以水解 DNA 中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解 DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状物，A 正确。37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在 60～75 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B 错误。向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时 DNA 析出，不会进入滤液中，C 错误。加入 NaCl 调节浓度至 2 mol·L-1→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 mol·L-1，DNA 在 0.14 mol·L-1 的 NaCl 溶液中溶解度小，DNA 析出，不会进入滤液中，D 错误。
答案：A
[典例 2](2022 年山东青岛一模)DNA 琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的 DNA 片段。下列
说法错误的是(
)
A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物 B.双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，用于分离后 DNA 的检测 D.凝胶中的 DNA 分子通过染色，可在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离，可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物，A正确。凝胶中 DNA 分子的迁移速率与 DNA 分子的大小有关，双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误。凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，用于分离后 DNA 的检测，C 正确。DNA 分子的大小和构象等有关，凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来，D 正确。
答案：B
【举一反三】1.(2022 年山东高考)关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下
列说法错误的是(
)
A.过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行是为了防止 DNA 降解B.离心研磨液是为了加速 DNA 的沉淀C.在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质
解析：过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行可以使酶的活性降低，可以防止 DNA 降解，A 正确。离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B 错误。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C 正确。粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质，D 正确。
答案：B
2.(2022 年山东实验中学模拟)水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述
错误的是(
)
A.PCR 技术可用于固氮基因的获取和检测 B.为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度
C.PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前
必须进行高压蒸汽灭菌处理
D.实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选 解析：PCR 技术的原理是模拟生物体内 DNA 分子复制过程，故用 PCR 技术可从根瘤菌 DNA 中获取固氮基因，也可用于固氮基因的检测，A 正确。PCR 技术包括变性、复性(退火) 、延伸三步，当复性温度提高时，只有引物与模板碱基匹配程度高，才能结合到模板上，而引物与模板匹配度低的区域则不能结合，这样
扩增出来的产物种类少，特异性增强，因此为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当提高复性温度，B错误。为避免外源DNA等的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理，C 正确。具有固氮基因的水稻根系微生物能利用空气中的氮气，故培养基中不需要加入氮源，从而对转基因水稻进行筛选，即实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选，D 正确。
答案：B
第3、4章
基因工程、生物技术的
安全性和伦理问题
[考情分析]
(续表)
考点一 DNA 重组技术的基本工具
1.基因工程的概念。
人们的愿望
转基因
(1)手段：按照____________，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：______水平。
分子
(4) 优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的
__________。
遗传性状
(1)限制酶的识别序列与被作用的 DNA 序列是不同的。前者一般由 6 个核苷酸组成，少数由 4 个、8 个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。
(2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。 (3)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此DNA 分子，产生 4 个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶。
(3)载体。
限制酶的选择方法 根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
甲
乙
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组 DNA 的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用 Sma Ⅰ切割。
3.标记基因的作用。
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
考点二 基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取。
(1)目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中
筛选。
(2)目的基因的获取方法。
①利用 PCR 获取和扩增目的基因。②人工合成目的基因。
a.反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的 mRNA 为模板，借助逆转录酶合成双链 DNA，其过程如下。
b.化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因
序列，然后直接合成目的基因，其过程如下。
③从基因文库中获取目的基因。 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA，以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
(3)利用 PCR 获取和扩增____________。
目的基因
DNA 半保留复制
①原理：__________________。②条件。
(续表)
③过程：PCR 过程包括______________________三步。a.变性：在温度为 90～95 ℃的高温中，DNA 碱基对之间的氢
键断裂，双链解旋为单链。
变性、复性和延伸
b.复性(退火)：温度下降到 50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链 DNA 结合。
c.延伸：温度上升到 72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。
结果：DNA 分子以指数形式扩增(约为 2n，其中 n 为扩增循环
次数)。
PCR 技术和 DNA 复制的比较
2.基因表达载体的构建——核心。
受体细胞
(1)目的：使目的基因在__________中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)组成。
启动子≠起始密码子 终止子≠终止密码子
(1)启动子是位于基因上游的一段特殊序列，它是 RNA 聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因下游的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。
(2)起始密码子和终止密码子均位于 mRNA 上，分别控制翻译
过程的启动和终止。
(3)构建过程。
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞的染色体 DNA 上；第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
(2)导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体 DNA 上。存在于染色体 DNA 上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定。
考点三 基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程的应用。(1)食品工业方面。
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因
技术大量生产凝乳酶。
(2)医药卫生领域。
供体
①器官移植：用转基因动物作器官移植的________，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 ②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
乳腺生物反应器与工程菌的比较
(续表)
结构规律
改造或合成
(1)概念：以蛋白质分子的__________及其与生物功能的关系作为基础，通过____________基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (2)操作手段和结果。
(3)基本思路。
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
考点四 生物技术的安全性与伦理问题1.转基因产品的安全性。
2.关注生殖性克隆人。
(1)生殖性克隆人面临的伦理问题。①生殖性克隆人“有违人类尊严”。
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不
健全的人，严重违反了人类伦理道德。
③克隆技术尚不成熟，面临构建重构胚胎成功率低，胚胎移植到母体子宫后着床率低、流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。
(2)我国禁止生殖性克隆人。
①中国政府积极支持制定《禁止生殖性克隆人国际公约》，坚
决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验。
②我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、
不接受任何生殖性克隆人实验。
③我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
(3)重要过程。
治疗性克隆和生殖性克隆的比较
3.试管婴儿与设计试管婴儿的异同点。(1)不同点。
①所用技术手段：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断 HLA 的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了 d 过程。
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试
管婴儿用于白血病、致命贫血症等疾病的治疗。
(2)相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要
经过胚胎移植，都是有性生殖。
4.生物武器。(1)种类。①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等。②病毒类：天花病毒、某些动物的痘病毒、通过基因工程改
造的流感病毒等。
生化毒剂
致病能力强，攻击范围广
③________类：肉毒杆菌毒素等。 (2)特点：__________________________。 (3)散布途径：可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。
(4)《禁止生物武器公约》。
①1972 年 4 月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁
止生物武器公约》，并于 1975 年 3 月生效。 ②1984 年 11 月，我国也加入了这一公约。
③1998 年 6 月，中美两国元首重申了在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
④2010 年，在第 65 届联合国大会上，我国政府主张全面禁止
和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
【基础测评】1.易错诊断(1)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳
定存在并表达。(
)
(2)外源 DNA 在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进
行复制。(
)
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常
表达。(
)
(4)如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性
问题。(
)
(5)蛋白质工程的目标是对基因的结构进行分子设计。(
)
答案：(1)√ (2)× (3)√ (4)×
(5)×
2.下列关于载体的相关叙述，错误的是(
)
A.目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒B.天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞C.载体 DNA 分子上要有一个至多个限制酶切割位点D.载体上的标记基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞答案：B
3.科学家为提高玉米中赖氨酸的含量，计划将天冬氨酸激酶第352 位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中 104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离
)
赖氨酸含量分别提高 5 倍和 2 倍。此操作过程是( A.直接通过分子水平改造蛋白质 B.直接改造相应的 mRNA C.直接改造相应的基因 D.重新合成新的基因 答案：C
)
4.关于我国的生物技术研究与应用的叙述，错误的是(A.禁止运用转基因技术改造农作物B.反对生物武器及其技术和设备的扩散C.不赞成、不接受、不进行任何生殖性克隆人实验D.成立相关伦理专家委员会应对重大医学伦理问题答案：A
考向 1 基因工程所需工具
[典例 1](2021 年全国乙卷)用 DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中 4 种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题。
(1)常用的 DNA 连接酶有 E.coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。上图中____________酶切割后的 DNA 片段可以用 E.coli DNA连接酶连接。上图中______________酶切割后的 DNA 片段可以用T4 DNA 连接酶连接。
(2)DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成
的化学键是__________。
(3)DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒 DNA 分子上有______________，便于外源 DNA 插入；质粒DNA 分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________
____________________。
解析：(1)限制酶 EcoR Ⅰ和 Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶 Sma Ⅰ和 EcoR V 切割形成的是平末端，E.coli DNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而 T4 DNA 连接酶来源于 T4 噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中 EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割后的 DNA 片段(黏性末端)可以用 E.coli DNA 连接酶连接，除了这两种限制酶切割的 DNA 片段，限制酶 Sma Ⅰ和 EcoRV 切割后的 DNA 片段(平末端)也可以用 T4 DNA 连接酶连接。(2)DNA 连接酶将两个 DNA 片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是
小型环状的 DNA 分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒 DNA 分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的 DNA片段，位于基因的上游，它是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA，最终获得需要的蛋白质。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和 EcoR V(2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因上游的一段特殊 DNA 序列，是 RNA 聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【考向集训】
1.(2022 年广东四校联考)人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程。图中 TetR 表示四环素抗性基因，AmpR 表示氨苄青霉素抗性基因，四种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题。
(1)一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是___________________________________________________________________________________________。
(2)为构建重组载体，应选择____________酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的6 个碱基对序列为____________________。
(3)以大肠杆菌为受体细胞，将酶切后的连接产物导入受体细胞。为筛选出导入目的基因的受体菌，首先需要将得到的上述大肠杆菌接种到含________培养基(A)上，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含______培养基(B)上，在 B 上能生长的_______(填“是”或“不是”)成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是__________________________________________________。
解析：(1)cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。一般从 cDNA 文库中获取人乳铁蛋白基因，该文库的建立方法是人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片段，与载体连接后导入受体菌群体储存。(2)根据表中 4 种酶的识别序列及切割位点可知，BamHⅠ酶和 BclⅠ酶识别的序列相同，可以切出相同的黏性末端，因此可选择这 2 种酶对目的基因和质粒进行切割。将上述酶切后得到 DNA 末端连接起来，连接部位的 6 个
碱基对序列为
、
。(3)用 BamHⅠ酶切割后会破
坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生存下来，一段时间后，将 A 上生长的菌落拓印到含四环素培养基(B)上，在B 上能生长的不是成功导入重组质的受体菌。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能表达，其最可能的原因是用 BamHⅠ酶和 BclⅠ酶切形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接。
答案：(1)人体发育某个时期的 mRNA 经反转录产生 DNA 片
段，与载体连接后导入受体菌群体储存
(2)BamHⅠ和 BclⅠ
(3)氨苄青霉素 四环素 不是 用 BamHⅠ酶和 BclⅠ酶切割
形成的黏性末端相同，部分目的基因与质粒反向连接
考向 2 PCR 技术的应用
[典例 2](2021 年山东高考)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是________，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。
(2)将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_____________________________。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于____________________，理由是______________________________________________________。
解析：(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子 P 的扩增后的产物读取方向
与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的 R 端与荧光蛋白基因中限制酶 Mun Ⅰ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和 Xho Ⅰ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶 Mun Ⅰ和Xho Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶
Mun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与限制酶 EcoR Ⅰ识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是 Sal Ⅰ；荧光蛋白基因中含有限制酶 EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶 Mun Ⅰ和 Xho Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶 Mun Ⅰ和 Xho Ⅰ切割，对扩增后的产物用限制酶 EcoR Ⅰ和限制酶 Sal Ⅰ识别序列，然后在 DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用 Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩
增到载体构建完成的整个过程共需要 6 种酶，分别是 Taq 酶、限制酶 EcoR Ⅰ、限制酶 Sal Ⅰ、限制酶 Mun Ⅰ、限制酶 Xho Ⅰ、DNA 连接酶。(2)受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要 RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6 与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7 与 R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的 BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，BCL11A 蛋白与 BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F4 与引物 R 之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明 BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物 F5 的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案：(1)Sal Ⅰ
EcoRⅠ 6 (2)F7 与 R 扩增产物不含完整
的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上
所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以
通过 DNA 合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基
因又比较大，可以通过 PCR 技术扩增目的基因。
【考向集训】
2.(2022 年广东二模)图 1 是我国自主设计的“本地＋移动”一站式新型冠状病毒核酸检测平台示意图，单平台混样日检测量可达 13 万人次。图 2 为 RT-PCR(逆转录荧光 PCR 技术)的原理：PCR过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和猝灭基团(抑制荧光发出)，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与猝灭基团分离而发出荧光。
图 1
图 2
回答下列问题。
(1)PCR 技术的目的是____________________________。RT-PCR 过程中，需先将 RNA 逆转录成 cDNA，故装置中需
添加的酶有________。
(2)对新型冠状病毒进行检测时，探针的设计依据是_______________________________________________________________。探针与模板结合发生在 PCR 循环中的________( 选填“变性”“复性”或“延伸”)阶段。
(3)若监测系统检测到荧光信号，则可判定该检测样本为阳性，其原理是__________________________________________________________________________________________。
(4)为了在没有核酸检测的条件下及早发现新型冠状病毒，我国于 2022 年 3 月 11 日推出新型冠状病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是_________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR 技术的目的是大量扩增目的基因片段，用于基因工程或检测。以 RNA 为模板逆转录成 cDNA，是逆转录过程，需要用到逆转录酶。(2)探针是可以与模板结合的一小段 DNA 序列，故设计的依据是一段已知目的基因的核苷酸序列，变性过程是 DNA 双链打开的过程，复性时，引物与探针结合到模板 DNA上。(3)根据题意，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与猝灭基团分离而发出荧光。因此，样本中有新型冠状病毒核酸时，能进行快速复制，导致其荧光信号加强。(4)因为抗原与抗体的结合具有特异性，新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测原理是抗原抗体的特异性结合。
答案：(1)大量扩增目的基因片段，用于检测 逆转录酶(2)一段已知目的基因的核苷酸序列 复性
(3)样本中的新型冠状病毒核酸会被探针识别，从而进行快速
复制，导致其荧光信号倍增 (4)抗原抗体的特异性结合
考向 3 基因工程的基本操作程序
[典例 3](2021 年广东高考)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题。
(1)研究人员采用 PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________。(答出两种即可)
(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，方法有_____________________。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将 4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________。在分子水平上，可以通过改变__________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了 PCR 技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的 DNA 模板是成功扩增出
目的基因的前提条件之一。在制备高质量 DNA 模板时必须除去蛋白，可根据 DNA 和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌 BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行 4 种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的 DNA 分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技
术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 答案：(1)基因文库中获取、人工合成法 (2)盐析法、酶解法或高温变性 (3)感受态 抗原—抗体杂交技术 (4)有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【考向集训】
3.(2022 年广东高考)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含 CO2 等温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题。
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用 PCR 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体 pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是___________________________________________________，终止子的作用是_________________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于__________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析：(1)利用 PCR 技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的 3′端延伸子链。(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等温室气体为原料，实现了废物的
资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 答案：(1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的
受体细胞
终止转录，使转录在需要的地方停下来
(3)二氧化碳
等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
(4)废物
不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的
的资源化二氧化碳
考向 4 基因工程的应用
[典例 4](2022 年广东深圳一模)人体中血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时参与维持血浆正常的渗透压，在临床上应用广泛。但从人体中直接提取的血清白蛋白含量少，且易受污染，生物反应器可以解决此项难题。回答下列问题。
(1)从人体获取的血清白蛋白基因可通过________技术进行扩增，扩增后的血清白蛋白基因与启动子、________和________等
构建成基因表达载体。构建乳腺生物反应器时选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是_________________________________________________________________________。
(2)科学家将构建好的基因表达载体通过________技术导入奶牛的受精卵中。受精卵继续培养至胚胎。当胚胎发育至______阶段，取其________做 DNA 分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的______(填“雌”或“雄”)性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物，将来可从牛奶中提取得到大量的人血清白蛋白。
(3)有人提议将乳腺蛋白基因的启动子换成 uroplakinⅡ基因的启动子(高效促进目的蛋白在膀胱特异性表达及分泌)，可增加血清白蛋白的产量。请分析产量高的原因________________________________________________________________________________。 解析：(1)利用 PCR 技术可扩增血清白蛋白基因。扩增后的血清白蛋白基因与启动子、终止子、标记基因等构建成基因表达载体。而且目的基因必须插入到启动子和终止子之间。由于基因的选择性表达，要想基因特异性地只在乳腺细胞中表达，选用的是乳腺蛋白基因的启动子，其目的是使目的基因在动物体内的乳腺
细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品。(2)将重组质粒导入动物细胞通常使用显微注射技术，所以基因表达载体通过显微注射技术导入奶牛的受精卵中进行体外培养。受精卵继续培养至胚胎。当胚胎发育至囊胚阶段，取滋养层细胞做 DNA 分析来进行性别鉴定，目的产物要从乳汁中获取，所以筛选出发育状态良好的雌性胚胎进行移植，使其生长发育成转基因动物。(3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大，因此将乳腺蛋白基因的启动子换成 uroplakinⅡ基因的启动子，可增加血清白蛋白的产量。
答案：(1) PCR 终止子 标记基因 使目的基因在动物体内
的乳腺细胞中表达，从而在乳汁中获取所需产品 (2)显微注射
囊胚 滋养层细胞 雌 (3)雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，
而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
【考向集训】
4.(2021 年广东珠海质量监测)变异链球菌在牙面的黏附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因(PAcA 基因)转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题。 (1)转基因植物的制备。
单一使用 PAcA 基因，机体的免疫应答不理想，霍乱毒素中有
增强机体免疫应答的氨基酸序列(CTB)，将 CTB 基因与 PAcA 基因连接成嵌合(PAcA-CTB)基因，作为______与 Ti 质粒的 T-DNA 拼接，构建表达载体。用________法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株。
(2)转基因植株目的基因的 PCR 鉴定与检测。
已知 PAcA-CTB 基因部分序列如下(左侧为基因的首端)：5′…CCGTGT……ATGCCT—3′3′…GGCACA……TACGGA—5′
根据上述序列选择引物________( 填字母) 对目的基因进行PCR 扩增。
A.引物：5′－GGCACA－3′C.引物：5′－CCGUGU－3′
B.引物：5′－AGGCAT－3′D.引物：5′－CCGTGT－3′
反应结束后，通过电泳检测 PCR 产物，结果如右图(1 号来自未转化植株，2 号是含 PAcA-CTB基因的质粒，3～8 号来自转基因植物)，从结果可以看出，_______号植物含有 PAcA-CTB 基因。若
获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，其可能的原因是_________________________________________________________。
解析：(1)将 CTB 基因与 PAcA 基因连接成嵌合(PAcA-CTB)基因，作为目的基因与 Ti 质粒的 T-DNA 拼接，构建表达载体。将基因表达载体导入离体的黄瓜叶肉细胞中可以用农杆菌转化法。(2)PCR 技术中，子链合成的方向是从 5′到 3′，因此应该选择引物B、D。1 号来自未转化植株，2号是含PAcA-CTB基因的质粒，3～
8 号来自转基因植物，从结果可以看出，3 、5 、8 号植物含有PAcA-CTB 基因。若获得的转基因植物并没有产生相应的基因工程疫苗，根据中心法则分析，可能的原因是目的基因(PAcA-CTB 基因)没有转录或转录的 mRNA 没有翻译。
答案：(1)目的基因 农杆菌转化 (2)B、D 3、5、8 目的
基因(PAcA-CTB 基因)没有转录或转录的 mRNA 没有翻译
考向 5 蛋白质工程
[典例 5](2022 年湖南高考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题。
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质 a 是____________，物质b 是_______。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______________、_______________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是______________________________________________________________________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理
后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是___________________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路
________________________________________________________
________________________________。
解析：(1)据分析可知，物质 a 是多肽链中的氨基酸序列，物质 b 是 mRNA。在生产过程中，物质 b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过 DNA 合
成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA 双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其
活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入 1、2、3 号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
答案：(1)多肽链中的氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性
(2)从基因文库中获取目的基因
通过 DNA 合成仪用化学方法直
接人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解
时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度
破坏
(4)取 3 支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭
素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入 1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【考向集训】
5.(2022 年海南海口模拟)利用木聚糖酶进行纸浆漂白，可以大幅度减少氯化物的用量，减轻造纸工业对环境的污染。纸浆漂白需要在高温碱性条件下进行，因此需要耐热耐碱的木聚糖酶。根据生产需要，科学家对已知氨基酸序列的木聚糖酶进行改造，获得了耐高温耐碱的新木聚糖酶，减少了纸浆漂白时木聚糖酶的用量，提高了生产效率。回答下列问题。
(1)蛋白质工程的目标是根据人们对______________的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程原则上只能生产________，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要。
(2)在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞，原因是大肠杆菌________________________________________________________________________________________(答出两点)。分离纯化大肠杆菌时，可使用接种环采用________法将聚集的菌
种逐步分离并培养成单菌落；实验室中利用选择培养基筛选微生物的原理是__________________________________________。 (3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前要先构建________，以使目的基因能够表达和发挥作用。若要将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱木聚糖酶应用于造纸工业生产，除了需要研究木聚糖酶的产量外，还需要检测木聚糖酶的________。
(4)有研究表明，在木聚糖酶中特定部位引入精氨酸可以增加木聚糖酶中的离子键数目，从而增加该酶在碱性环境中的稳定性。利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是___________________________________________________________________。根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计新木聚糖酶的基因，会设计出多种脱氧核苷酸序列，原因是_____________________________________________________________________________________。
解析：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。(2)由于大肠杆菌为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少，所以在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞。采用平板划线法分离纯化大肠杆菌时，使用的接种工具为接种环。实验室中利用选择培养基筛选微生物的原理是：人为提供有利于目的菌
生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前，需要先将其与载体结合，构建基因表达载体，以使目的基因能够表达和发挥作用。在将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱的木聚糖酶应用于造纸工业生产前，需要研究该木聚糖酶的产量并对木聚糖酶的生物活性(或催化效率)进行检测。(4)利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是：根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因。由于密码子
具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)，导致根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计的新木聚糖酶的基因会有多种脱氧核苷酸序列。 答案：(1)蛋白质功能 自然界中已存在的蛋白质 (2)为单细
胞、繁殖快、遗传物质相对较少
平板划线
人为提供有利于目
的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长 (3)基因表
达载体
生物活性(或催化效率)
(4)根据需要对耐碱的木聚糖酶
的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基
酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用 DNA 合成仪合成新木聚糖酶基因 密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)
荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。
考向 6 生物技术的安全性和伦理问题
[典例 6](2022 年北京高考)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E 物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色
________________________________________________________
__________________，因而被用于制备监测鱼(MO)。
(2)为监测 E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 ERE 和酵母来源的 UAS 是两种诱导型启动子，分别被 E 物质－受体复合物和酵母来源的 Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案 1 相比，方案 2 的主要优势是_______
方案 1
方案 2
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P 生)
④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P 肌)
(3)现拟制备一种不育的监测鱼 SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本(X)杂交获得。欲获得 X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子：________。
(5)使拟用于实际监测的 SM 不育的目的是________________
_________________________________。
Ⅱ.基因：________
A.GFPB.Gal4
C.雌激素受体基因(ER)
D.仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM 不育的原因是：成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合
后____________造成不育。
得 SM，MO 是方案 2 获得的，所以亲本 X 启动子选择 UAS。要获得 SM 是不育个体，MO 是可育的，所以 X 必须有仅导致生殖
解析：(1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。(2)由图可知，方案 1 中的 E 物质—受体复合物激活 ERE，使 GFP基因表达，方案 2 中的 E 物质—受体复合物先激活 ERE 获得 Gal4蛋白，然后 Gal4 蛋白激活 UAS 启动子，使 GFP 基因表达，方案2 中的 GFP 蛋白表达量大，更灵敏。(3)MO 和另一亲本(X)杂交获
答案：(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ②
D (4)激活
ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 结合 UAS 诱导 dg 表达，生殖细胞凋
亡
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
细胞凋亡的基因(dg)。(4)成体 SM 自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活 ERE 诱导 Gal4 表达，Gal4 与 UAS 启动子结合诱导 dg 表达，使生殖细胞凋亡。(5)监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要 SM 不育。
A.消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的
重要方面
B.由于技术问题，生殖性克隆可能孕育出有严重生理缺陷的
克隆动物
【考向集训】 6.(2022 年广东梅州期末)生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风
险。下列相关叙述错误的是(
)
解析：在生物恐怖威胁不断上升、全球传染病疫情频发的情况下，消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面，A 正确。由于克隆技术尚不成熟，现在做克隆人很可能孕育出有严重生理缺陷的孩子。理由是重构胚胎成功率低，移
C.为避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露
基因检测的结果
D.从外来入侵害虫的原产地引入天敌进行治理，不会对入侵
地造成生态影响
进行治理，由于短期内天敌没有资源和空间等的限制，可能会对入侵地造成生态影响，D 错误。
答案：D
植入母体子宫后胚胎着床率低、流产率高、胎儿畸形率高，出生后死亡率高等，正常的个体极少，B 正确。为了尽力规避基因诊断的风险，避免可能产生的基因歧视，基因检测机构不能随意泄露基因检测的结果，C 正确。从外来入侵害虫的原产地引入天敌
DNA 的粗提取与鉴定、DNA 片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA 的粗提取与鉴定。(1)原理。
(2)方法步骤。
①研磨材料：新鲜洋葱，加研磨液充分研磨。
②获取含 DNA 的滤液：过滤(纱布)、提取滤液(或在 1500 r·
min-1 转速下离心 5 min 取上清液)。
③析出 DNA：在上清液中加入体积分数为 95%的酒精溶液，静置后用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起白色丝状物，或在 10 000 r·min-1 转速下离心 5 min 取沉淀物。
④溶解 DNA：将丝状物或沉淀溶解在 2 mol·L-1 的 NaCl 溶液中。⑤鉴定 DNA：在溶有 DNA 的溶液中加入二苯胺试剂，混合
均匀后将试管在沸水中加热 5 min，溶液变成蓝色。
2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定。(1)原理。
①PCR 原理：DNA 热变性原理。
②电泳。
a.概念：是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程。
b.原理：在一定的 pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
c.作用过程：由于各种分子的带电性质差异、大小不同、形状不同，在电场作用下会产生不同的迁移速率，从而实现各种分子的分离。
d.方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶
电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(2)方法步骤。①PCR 扩增。
②鉴定 PCR 产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
[典例 1](2021 年山东高考)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对
含量较高的白色丝状物的处理方式是(
)
A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D.加入 NaCl 调节浓度至 2 mol·L-1→过滤→调节滤液中 NaCl浓度至 0.14 mol·L-1
解析：木瓜蛋白酶可以水解 DNA 中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解 DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA 相对含量较高的白色丝状物，A 正确。37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在 60～75 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B 错误。向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时 DNA 析出，不会进入滤液中，C 错误。加入 NaCl 调节浓度至 2 mol·L-1→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 mol·L-1，DNA 在 0.14 mol·L-1 的 NaCl 溶液中溶解度小，DNA 析出，不会进入滤液中，D 错误。
答案：A
[典例 2](2022 年山东青岛一模)DNA 琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的 DNA 片段。下列
说法错误的是(
)
A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物 B.双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，用于分离后 DNA 的检测 D.凝胶中的 DNA 分子通过染色，可在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离，可用于分离、鉴定 DNA 分子的混合物，A正确。凝胶中 DNA 分子的迁移速率与 DNA 分子的大小有关，双链 DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误。凝胶制备中加入的核酸染料能与 DNA 分子结合，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，用于分离后 DNA 的检测，C 正确。DNA 分子的大小和构象等有关，凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为 300 nm 的紫外灯下被检测出来，D 正确。
答案：B
【举一反三】1.(2022 年山东高考)关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下
列说法错误的是(
)
A.过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行是为了防止 DNA 降解B.离心研磨液是为了加速 DNA 的沉淀C.在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质
解析：过滤液沉淀过程在 4 ℃冰箱中进行可以使酶的活性降低，可以防止 DNA 降解，A 正确。离心研磨液是为了加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质等的沉淀，B 错误。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C 正确。粗提取的 DNA 中可能含有蛋白质，D 正确。
答案：B
2.(2022 年山东实验中学模拟)水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述
错误的是(
)
A.PCR 技术可用于固氮基因的获取和检测 B.为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度
C.PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前
必须进行高压蒸汽灭菌处理
D.实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选 解析：PCR 技术的原理是模拟生物体内 DNA 分子复制过程，故用 PCR 技术可从根瘤菌 DNA 中获取固氮基因，也可用于固氮基因的检测，A 正确。PCR 技术包括变性、复性(退火) 、延伸三步，当复性温度提高时，只有引物与模板碱基匹配程度高，才能结合到模板上，而引物与模板匹配度低的区域则不能结合，这样
扩增出来的产物种类少，特异性增强，因此为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当提高复性温度，B错误。为避免外源DNA等的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理，C 正确。具有固氮基因的水稻根系微生物能利用空气中的氮气，故培养基中不需要加入氮源，从而对转基因水稻进行筛选，即实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选，D 正确。
答案：B
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