新高考生物总复习专题22基因工程练习课件

这是一份新高考生物总复习专题22基因工程练习课件，共60页。

考点1　重组DNA技术的基本工具1.(新教材)(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　    )A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.cli DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.cli DNA连接酶连接
2.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcRⅠ识别并切割 双链DNA,用EcRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 (　    )A.6　　B.250　　C.4 000　　D.24 000
3. [2022福建,21(一),4分]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在 断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细 胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:(一)基因工程抗原的制备(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知 DNA聚合酶催化引物的3‘-OH与加入的脱氧核苷酸的5’-P形成磷酸二酯键,则新合成链
的延伸方向是　　　    (填“5'→3'”或“3'→5'”)。(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhⅠ和SalⅠ分别酶 切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组 DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是　　　　　     　　　　　　　　　　　　　    。(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。答案    (一)(1)5'→3'    (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识 别序列)
4. (新情境)(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的 序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增 了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测, 以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
 (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶 识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　    ,在R末端 添加的序列所对应的限制酶是　　    。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个
过程共需要　　　    种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物 的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与 R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　    。(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含 F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对 应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位 点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    ,理由是        。
答案    (1)SalⅠ    EcRⅠ　6    (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不 表达    (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判 断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游 (右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的 上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
考点2　DNA的粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳鉴定5.(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取 与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是 (　    )A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNAD.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
6.(2023辽宁,19,3分)(不定项)基质金属蛋白酶MMP2和MMP9是癌细胞转移的关键 酶。MMP2和MMP9可以降解明胶,明胶可被某染液染成蓝色,因此可以利用含有明胶 的凝胶电泳检测这两种酶在不同条件下的活性。据图分析,下列叙述正确的是(　    )A.SDS可以提高MMP2和MMP9活性B.10 ℃保温降低了MMP2和MMP9活性C.缓冲液用于维持MMP2和MMP9活性D.MMP2和MMP9降解明胶不具有专一性
7.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是 (　    )A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
8.(热点透)(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因 品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序 如图所示。下列叙述正确的是 (　    ) A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
9.(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条 带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少 反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是 (　    )A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间D.提高复性的温度
10.(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过 滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取 出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是 (　    )A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精D.加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 ml/L
考点3　基因工程的基本操作程序11.(热点透)(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作 为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切 后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(        )A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能 形成菌落
12.(2023河北,22,15分)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质 合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体,转入硅藻细胞,以期获得高产生物 柴油的硅藻品系。回答下列问题:(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的　　　    差异获得硅藻粗提DNA, PCR扩增得到目的基因。(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、　　　    和　　         等。本研究中目的基因为　　　　　　    。(3)PCR扩增时引物通过　　　　　    原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设
计了图1所示的两条引物,对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR 检测,扩增产物电泳结果见图2。其中,样品1为本实验的　　    组,样品2有特异性扩增 产物,结果表明　　　　　　　　　　　　　　　    。 
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3 为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析,相对于品系A,品系B的胞内脂质含量平均 水平明显　　　    。同时,还需测定　　　　    以比较在相同发酵条件下品系A与B 的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表 明,品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析,ME基因超表达使线粒体中 NADH水平升高,　　　　　　　　　　　　　    ,最终促进胞内脂质合成。(6)相对于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为　    　　　　　　　　　　　　　　    。(答出两点即可)
答案    (1)溶解度    (2)启动子　终止子(答案“启动子”和“终止子”不分顺序)　苹 果酸酶基因(或“ME基因”)    (3)碱基互补配对　对照　引物间的载体序列整合到硅 藻细胞基因组中(或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”)    (4)增加　细胞数量     (5)有氧呼吸生成的ATP增多    (6)节约土地资源、不受季节和气候限制(或“节约 粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”)
13.(新思维)(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进 行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。  
(1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　    。除图甲中标出的结构外,作为载体, 质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　    (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若 仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　    。已知J基因转录的模板链位于b链,由 此可知引物F1与图甲中J基因的　　　    (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相 同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白 是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　     　　　    ,条带2所检出的蛋白　　　    (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。答案    (1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)    (2)F2和R1(或“F1和R2”)　a链    (3)J-V5融合蛋白　不是
14.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合 作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1 与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。 
回答下列问题。(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于　　　    ;从愈伤组织到幼苗的培养过 程需要的激素有生长素和　　　　　    ,该过程还需要光照,其作用是　　　　　     　　　　　　　　　　    。(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的　　　　　    。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 　　　　　　    。(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/ Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体 导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根 段的方法是　　　　　　　　　　　　    ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是　　　　　　　　　　    ,依据是　　　　　　　　　　     　　　    。(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是　　　　　　　　　　     　　    (答出2点即可)。
答案    (1)脱分化　细胞分裂素　诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用    (2) 遗传特性　转基因种子    (3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒 上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上    (4)检测毛状根段是否有绿色荧光 　植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增)　若导 入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带)    (5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操 作简便
15.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n= 10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1 基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与 其有关,开展相关实验。回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变 造成,则转基因植株的种子大小应与　　    植株的种子大小相近。(2)用PCR扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)对PCR产物和　     　　　　    进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备　　　　　　    。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也 可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出 单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突 变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳 性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 　    %的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　    (填“自交”“与野生型杂交”或“与突 变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到　　    %的 培养基中的幼苗即为目标转基因植株。　　为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段, 再使用限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)X切割产物,通过核酸电泳即可进行突 变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
答案    (1)野生型    (2)基因表达载体(或质粒,或载体)　启动子、终止子    (3)①T- DNA片段(或DA1基因,或目的基因)　②75　③自交　100(4) 
16.(热点透)(2022重庆,26节选,12分)改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生 “禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因,并 开展了相关探索。步骤Ⅰ: 步骤Ⅱ: 
(1)花药培养能缩短育种年限,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。在步骤Ⅰ的花药培养 过程中,可产生单倍体愈伤组织,将其培养于含　　　    的培养基上,可促进产生二倍 体愈伤组织。(2)步骤Ⅱ中,在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有　　　　　　　　　    。为筛选含 重组Ti质粒的菌株,需在培养基中添加　　　    。获得的农杆菌菌株经鉴定后,应侵染 Ⅰ中的　　　    ,以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 　　　　　　　    ,移栽后若发育为更高且丰产的稻株,则可望“禾下乘凉”。答案    (1)花药培养获得的单倍体经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离　秋水仙素    (2)限制酶和DNA连接酶　抗生素　愈伤组织　PCR
17.(新思维) (2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种 疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由　　　　    组成。基体由 中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是　　　　　　　　　　　    。 
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因 X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将 与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是　　　　　     　　    。PCR扩增时,需在　　　　　　    催化下,在引物的　　    端进行DNA链的 延伸,获得扩增产物用于测序。(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白 具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载 体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcRⅤ位点插入片段)。请完成题表。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人 基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经　　　    形成cDNA作为模板,PCR扩 增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值 是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环 的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的　    倍。答案    (1)脂质和蛋白质　发出星射线,形成纺锤体    (2)溶解DNA　耐热的DNA聚合 酶(Taq酶)　3'    (3)①a、b　②1 100　③Q4　④纤毛基部可能含有与X蛋白特异性结 合的物质(受体)    (4)逆转录　32
18.(新思维)(2022河北,24节选,13分)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途 径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPin1A)的基因单 独或共同转化棉花,获得了转基因植株。回答下列问题:(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是        。(2)　　　　　　　　    是实施基因工程的核心。(3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的　　　　    上。(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    (写出两点即可)。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的　　　　    以鉴定其 抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析　     　　    (填“NaPI”或“StPin1A”或“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳, 其原因是        。
 (6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生 　　　　    ,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因 作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是　　    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     　　　　　　    (写出两点即可)。
答案    (1)抑制害虫胰蛋白酶活性,使害虫不能正常消化食物而达到抗虫的目的    (2)基因表达载体的构建    (3)T-DNA    (4)PCR技术、抗原—抗体杂交技术    (5)接种试 验　NaPI+StPin1A　NaPI+StPin1A的转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多     (6)定向改变　昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升 了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;昆虫的胰蛋白酶基因发生突变,原有的胰蛋白酶抑制 剂不能发挥作用
19.(新情境)(2021河北,24节选,14分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土 壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例 如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染 土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了 相关指标。回答下列问题:(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是　　　　　　　    。 构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是        。(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用 最多的方法是　　　　　    。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采
用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　　　　　　　　　 　    。(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干 重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更 强的　　　    (填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的　　    进行 后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
图1 图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生 型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     　　　　　　　　　　　　 　    。相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于        (写出两点即可)。答案    (2)限制酶和DNA连接酶　便于重组DNA分子的筛选    (3)农杆菌转化法　防 止YCF1基因随花粉扩散,给生态系统带来风险    (4)耐性　叶    (5)转基因杨树液泡膜 上的Cd转运蛋白可将细胞质基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响　乔木比草本生物量大,与外界物质交换能力强
20.(新情境)(2021辽宁,24,10分)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某 动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白 的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9 kb(1 kb=1 000碱基对),利用大肠杆菌表达 该蛋白。回答下列问题:(1)为获取phb2基因,提取该动物肝脏组织的总RNA,再经　　　    过程得到cDNA,将 其作为PCR的模板,并设计一对特异性引物来扩增目的基因。(2)图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基 因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端 分别引入　　　    和　　　    两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的
phb2基因和载体进行连接时,可选用　　　　　　    (填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 
相关限制酶的识别序列及切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于　　　　　　　　　　　　　    的 生理状态,以提高转化效率。(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养,随机挑取单菌落 (分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用(2)中选用的两种限制酶进行酶切,酶切产 物经电泳分离,结果如图2,　　　    号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注:M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中,培养24小时后, 检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量,统计结果如图4。分析该蛋白 抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的　　　    (填“G1”或 “S”或“G2/M”)期。
答案    (1)逆转录    (2)PvuⅡ    EcRⅠ　T4 DNA连接酶    (3)一种能吸收周围环境中 DNA分子    (4)3    (5)G2/M    
考点4　基因工程的应用及蛋白质工程21.(新情境)(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领 域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热 稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是 (　    )A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一B.加入连接肽需要通过改造基因实现C.获得N1的过程需要进行转录和翻译D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
22.(2023全国甲,38,15分)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可 有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙 肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。 回答下列问题。(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是        。(2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因) 导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的 作用是　　　　　　　　　　　　    。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是　　　　　    。
(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞 中提取　　　　　    进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是        。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思 路。答案    (1)该疫苗不含乙肝病毒DNA,不会在人体细胞内增殖产生乙肝病毒    (2)作为 标记基因筛选出转化成功的酵母细胞　RNA聚合酶    (3)基因组DNA　放射性同位素 等标记的含有目的基因的DNA片段    (4)从酵母细胞中提取蛋白质,用乙肝病毒表面抗原的特异性抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,说明酵母细胞中表达出目 的蛋白。
23.(2023辽宁,25,11分)天然β-淀粉酶大多耐热性差,不利于工业化应用。我国学者借 助PCR改造β-淀粉酶基因,并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌,最终获 得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题:(1)上述过程属于　　　    工程。(2)PCR中使用的聚合酶属于　　　    (填写编号)。①以DNA为模板的RNA聚合酶②以RNA为模板的RNA聚合酶③以DNA为模板的DNA聚合酶④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成,研究发现,将该酶第476位天冬氨酸替换为天 冬酰胺,耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中,含已替换碱基的引 物是　　　    (填写编号)。 (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达,由图2所示的pLN23质粒构建 得到基因表达载体。除图示信息外,基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的
基因)和　　　　　    。 (5)目的基因(不含EcRⅠ酶切位点)全长为1.5 kb,将其插入BamHⅠ位点。用EcRⅠ 酶切来自不同大肠杆菌菌落的质粒DNA,经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度,这一 操作的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　    。正确连接的基因表达载体 被EcRⅠ酶切后长度为　　    kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录,根据中心法则,可通过　　         反应获得PCR的模板。答案    (1)蛋白质    (2)③    (3)①或④    (4)标记基因    (5)通过电泳鉴定目的基因是否 插入质粒中　5.7    (6)逆转录
24.(新情境)(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成 为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等 一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产 高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对　　　    ,利用PCR技术,在优化 反应条件后扩增得到目标酶基因。(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛 选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗 生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　    ,终止子的作用是　     　　　　　　　　　　　　　　    。(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其 原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　    ,此外丙酮的积累会伤害细胞, 需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了　　　　　　　    ,体现了循环经济 特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　    ,具有广泛的应用 前景和良好的社会效益。答案    (1)引物    (2)便于筛选含有目的基因的受体细胞　使转录在所需要的地方停下 来    (3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量    (4)废弃物的资源化　减少了碳排 放
25.(2022湖北,24,18分)“端稳中国碗,装满中国粮”,为了育好中国种,科研人员在杂交 育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲具有抗虫、 高产等多种优良性状,但甜度不高。为了改良品系甲,增加其甜度,育种工作者做了如 下实验:【实验一】遗传特性及杂交育种的研究在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系,用三个纯合品系进行杂交实验,结果 如表所示。
【实验二】甜度相关基因的筛选通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析,发现基因S与作物M的甜度相关。【实验三】转S基因新品系的培育提取品系乙的mRNA,通过基因重组技术,以Ti质粒为表达载体,以品系甲的叶片外植 体为受体,培育出转S基因的新品系。根据研究组的实验研究,回答下列问题:(1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb,则乙、丙杂交的F2中表现型为甜的植株基 因型有　    种。品系乙基因型为　　　    。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交,F3中 甜∶不甜比例为　　　    。
(2)图中,能解释(1)中杂交实验结果的代谢途径有    。 (3)如图1、2是载体的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)酶谱和S基因的cDNA。 为了成功构建重组表达载体,确保目的基因插入载体中方向正确,最好选用　　　        酶切割S基因的cDNA和载体。
(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体,其目的是        。(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外,能获得高甜度品系,同时保持甲的其 他优良性状的育种方法还有　　　　　　　　　　　　　　　　    (答出2点即可)。答案    (1)7　aabb　1∶5    (2)①③    (3)XbaⅠ和Hind Ⅲ    (4)通过农杆菌的转化作用, 使目的基因进入植物细胞    (5)单倍体育种、诱变育种
26.(新思维)(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭 蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构, 提高其抗凝血活性。回答下列问题:(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　    ,物质b是　　　　    。在生产过程 中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是        。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　    　　　    、　　　　    和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　     　　　　　    。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝 血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　     　    (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是        。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗 凝血活性差异,简要写出实验设计思路                。答案    (1)多肽链　mRNA　mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性    (2)从基因文 库中获取　人工合成　DNA半保留复制    (3)种类　酶处理后形成的肽中氨基酸的种 类、数目和排列顺序不同    (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋 白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所 需时间越长说明其抗凝血活性越大
时间:20 min一、单项选择题1.(2024届福建福州一模,7)下列关于凝胶电泳实验操作,叙述错误的是 (　    )A.应根据缓冲液pH的不同确定加样孔是靠近正极端还是负极端B.接通电源后电泳一段时间,离加样孔越近的DNA分子越小C.紫外灯照射下,凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
2.(2024届江苏扬州中学月考一,14)DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化或分析 PCR扩增后的待检DNA片段的技术。下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙 述,正确的是 (　    )A.mRNA也是核酸,因此可直接用PCR扩增仪扩增B.PCR的缓冲液中一般要添加ATP,以激活耐高温的DNA聚合酶C.带电量相同的情况下,相对分子质量比较大的DNA片段距离加样孔越近D.琼脂糖凝胶电泳中的电泳缓冲液中含指示剂,其可以在紫外灯下被检测出来
3.(2024届重庆万州二中月考二,10)图1、2中标注了相关限制酶的酶切位点(甲、乙、 丙为引物)。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是 (　    )A.若通过PCR获取该目的基因,应该选用引物甲和引物丙B.图中质粒和目的基因构建表达载体,应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切C.若将基因表达载体导入受体细胞中,需选用Ca2+转化法D.在受体细胞中,氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
4.(2023河北唐山一模,13)某一质粒如图所示,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示 四环素抗性基因。有人将此质粒用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因 混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化后得到多种大肠杆菌, 并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下列叙述错误的是 (　    )注:影印接种指用灭菌后的“印章”在培养基中轻按一下,将乙中菌落按相同位置接 种到培养基丙A.如图所示的质粒中还应含有复制原点和终止子等结构B.将经转化处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法C.配制培养基乙时应加入氨苄青霉素D.培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌
5.(2024届湖北孝感开学考,11)20世纪60年代末美国微生物学家哈密尔顿·史密斯发现 第一种限制性内切核酸酶,获得了开启DNA宝藏的钥匙,目前已发现的限制酶超过了4 000种,极大地推动了对DNA分子的研究和操作。表中列出了几种限制酶的识别序列 和切割位点。下列叙述正确的是 (　    )A.表中的6种限制酶切割形成的末端中,既有黏性末端又有平末端B.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端相互连接后,不能再被Sau3AⅠ切割C.Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的末端相互连接后,可以重新被Acc65Ⅰ或KpnⅠ切割D.分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割随机序列DNA,前者得到的片段长度明显短于后者
6.(新情境)(2024届湖北武汉一调,18)如图是蛋白质工程中改造目的基因的一种技术路 线。S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区;外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3‘末 端逐个水解单核苷酸,可以产生不同长度的5’突出末端。下列叙述错误的是 (　    )A.步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段B.步骤二、三分别使用了S1核酸酶、外切核酸酶ⅢC.步骤四宜选用T4 DNA连接酶处理DNA片段D.质粒载体2中目的基因片段N的长度有多种
二、不定项或多项选择题7.(2024届江苏淮安一调,18)(多选)引物在极大程度上决定了PCR的成败,下列关于引 物的说法正确的有 (　    )A.PCR和生物体内的DNA合成都需要引物,PCR引物可为单链DNAB.若引物的CG碱基含量相对较高,PCR复性步骤的温度需要适当升高C.在PCR的复性步骤中,两种引物分别结合在模板链的3'端和5'端D.若初始有10个胰岛素基因,PCR中进行10轮循环,至少需要20 460个引物分子
8.(2023辽宁葫芦岛一模,19)(不定项)基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方 面的应用发展迅速,如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径的部分 过程。下列叙述错误的是 (　    )A.若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的,则该基因中不含启动子序列B.扩增目的基因时,利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成C.导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞D.利用农杆菌转化法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体 DNA上
三、非选择题9.(2024届重庆一中开学考,19)目前科学家可利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰 岛素,如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。 据图回答下列问题: 
(1)启动子的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    ,除图中标 出的结构外,质粒作为载体还需具备的结构有　　　　　　　    。(2)PCR遵循的原理为　　　　　　　    ,因此在基因工程中PCR的作用是　　　　     　　　　    。为保证目的基因与载体的正向连接,在设计PCR引物时,应在引物的　     　    (填“3'”或“5'”)端添加限制酶　　　　　　　    (填种类)的识别序列。根据 上述信息,写出上游引物的15个碱基序列:5'-　　　　　　　　　    -3'。(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌 时,在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落,原因是　　　　　     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　　　　　　　　　　    (答出2点)。
答案    (1)RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA　终止子    (2)DNA 半保留复制(和DNA热变性)　获取和扩增目的基因　5'    XhⅠ和MunⅠ　CTCGA- GATGCCAATC    (3)只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了氨苄青霉素的培养基 上生长;目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构,使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶, 底物X-gal不会被分解
10.(2024届河北邯郸一调,23)为改善番茄口感和品质,科研人员将甜蛋白基因导入番茄 植株,获取转基因番茄,如图所示,回答下列问题: (1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段,能被　　　　　    识别并结合,驱动基因
的持续转录。为使甜蛋白基因在番茄植株中超量表达,应选用限制酶　　　    和　     　    切割图中的质粒和DNA片段。(2)已知转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3',得出甜蛋白基因以　　　    (填“A” 或“B”)链为转录模板链。(3)过程①称为　　　　　　　　　　　    。T-DNA的作用是将甜蛋白基因导入番茄 细胞并　　　　　　　　　　　　　    。(4)过程②将重组质粒导入农杆菌之前,一般先用　　　    处理农杆菌,目的是　　     　　　　　　　　　　　　　　　　　    。过程③将农杆菌与番茄愈伤组织共培养 后,在过程④的培养基中添加　　　    以便筛选出含目的基因的番茄植株。
答案    (1)RNA聚合酶    BamHⅠ    SmaⅠ    (2)B    (3)基因表达载体的构建　整合到其 染色体DNA上    (4)Ca2+　使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态     四环素
1.(新情境)(2024届重庆南开中学二检,13)常见的启动子可分为三类:组织特异型启动 子,调控基因只在某些特定的部位中表达;组成型启动子,驱动基因在所有细胞、组织 和器官中持续表达;诱导型启动子,通常在光、盐等信号作用下,使目的基因的转录水 平有所提高。下列叙述正确的是 (　    )A.启动子是一段有特殊序列的DNA片段,是DNA聚合酶识别和结合的部位B.细胞分化与组织特异型启动子的调控有关,与组成型启动子无关C.乳腺生物反应器的构建需要将组成型启动子与目的基因连接D.某植物在长日照下开花,与诱导型启动子被激活有关
2.(2023广东二模,12)二倍体马铃薯受核糖核酸酶基因(S-RNase)影响,普遍存在自交不 亲和的现象——自交不产生种子。我国科研人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲 除了马铃薯的S-RNase基因,获得了自交亲和的二倍体。如图是该技术的原理:由一条 单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割。下列叙述 错误的是 (　    )A.向导RNA和S-RNase基因识别结合的碱基互补配对方式与目标DNA双链中的碱基互补配对方式相同B.Cas9蛋白可催化磷酸二酯键水解,剪切特定DNA片段C.可让马铃薯自交看能否产生种子,从个体水平上检测该基因编辑技术是否成功D.向导RNA的序列越短,该基因编辑技术在编辑对象时出错的概率就越高
3.(2024届福建泉州一模,13)DNA分子杂交技术的原理是当两种生物的DNA单链具有 互补的碱基序列时,互补的碱基序列就会结合在一起,形成杂合双链区;在没有互补碱 基序列的部位,仍然是两条游离的单链,如图所示。关于DNA分子杂交技术的应用,下 列相关叙述正确的是 (　    )A.杂合双链区的一条链的序列是5'-GATACC-3',那么另一条链的序列是5'-CTATGG-3'B.该技术可用来比较不同物种DNA分子的差异,以分析生物亲缘关系的远近C.通过设计一种DNA引物与DNA的其中一条链结合,经PCR技术可大量扩增目的基因D.通过设计含有目的基因片段的DNA探针,可检测特定细胞中是否合成了目的蛋白
4.(2024届河北保定期初,18)(多选)琼脂糖凝胶电泳可用于鉴别DNA分子的长度,如图 为琼脂糖凝胶电泳图像,图中显示了空载体(不含目的基因X的质粒载体)和重组载体 (含有目的基因X的质粒载体)在限制酶的作用下呈现的线性DNA的电泳结果。SalⅠ 和XhⅠ为两种限制酶,且切割DNA均形成黏性末端,下列说法错误的是 (　    )A.凝胶中DNA分子的迁移速率仅取决于DNA分子的大小B.该质粒上SalⅠ和XhⅠ的识别序列和切割位点均相同C.目的基因X的长度是2 kbp,空载体的长度为5 kbpD.限制酶识别的DNA序列均由6个核苷酸组成
5.(2023河北邢台开学考,18)(多选)水蛭素是一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质。若 用赖氨酸(密码子为AAA、AAG)替换水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU),可以提高它的抗凝血活性。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的第47位点引入特定突变后(原理见图),合成了大量抗凝血活性增强的水蛭素。下列相关叙述正确的是 (　    )A.若原基因拟突变位点的碱基对为A—T,则让其突变为T—A后即能达到目的B.除图示物质外,过程②、③和⑤还需提供含Mg2+的缓冲液、耐高温的DNA聚合酶和 4种脱氧核苷酸C.过程②和③可在同一反应容器内同时进行,过程⑤的引物可使用引物1和引物4D.突变后的水蛭素基因需要与载体结合,并将其导入受体细胞内进行表达,才能获得 相应的蛋白质产品
6.(2024届福建福州一模,20)甜菜碱是重要的渗透调节物质。马铃薯自身不能积累甜 菜碱,利用基因工程技术,可以把与甜菜碱合成相关的关键酶BADH(甜菜碱醛脱氢酶) 基因转入农作物,使其积累甜菜碱,将有可能达到增强农作物抵抗逆境的目的。      (1)根据BADH基因的序列,甲同学设计了特异性引物进行PCR扩增以获取目的基因,他 的引物设计如下(只标注了引物的部分碱基序列)
引物1:5'-CAAGACCT-3',引物2:5'-ACCTCTTA-3'两个引物设计不合理,说明理由:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。(2)马铃薯外植体经　　　    形成愈伤组织,将其放入成功转入图1所示表达载体的农 杆菌液中浸泡后,再在培养基中加入　　　    从而筛选出。(3)图中所示的基因表达载体需含有启动子,它是　　　　　    识别并结合的位点。现 有两种启动子:组成型启动子和逆境诱导型启动子。组成型启动子能够持续、高效地 启动目的基因在植物各种组织中的表达,因此也会增加物质和能量的消耗,阻碍植物 的生长发育。选择逆境诱导型启动子(目的基因只有在逆境诱导下才能表达)的优点 是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　    。
(4)为了检测目的基因是否成功导入,以马铃薯细胞提取的DNA为模板,PCR扩增　     　　　    片段,电泳结果如图2(1为空白对照,2、3为转基因马铃薯植株)。与3号相比,2 号马铃薯株系抵抗逆境能力没有增强,可利用PCR技术检测BADH基因是否表达,则此 次PCR过程第一阶段需要增加　　　　　　　　　　　　 　　　    过程。答案    (1)引物1和引物2会因局部发生碱基互补配对而失效    (2)脱分化　潮霉素     (3)RNA聚合酶　避免外源基因持续大量表达,减少物质和能量的消耗    (4)BADH基因 　PCR技术检测BADH基因是否转录出mRNA
7.(2024届河北唐山摸底,22)为探索植物在盐胁迫下的应激机制以及抗逆性适应机理, 科研人员以小麦耐盐突变体RH8706-49和拟南芥为实验材料,构建TaRSTR基因的过表 达载体(如图1所示)并转化拟南芥幼苗,以检测TaRSTR基因在盐胁迫下的作用。已知 载体涉及的四种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。
回答下列问题:(1)从耐盐突变体小麦根细胞中提取总RNA经过　　    过程得到TaRSTR基因cDNA。 为防止目的基因和质粒自身环化,过程②要选择的限制酶是　　　　　　　    。(2)过程②是培育转基因植物的核心工作,其目的是　　　　　　　　　　　　　　     　　    ,构建的TaRSTR基因过表达载体包含目的基因、启动子和终止子等必需元件, 其中启动子是　　　　　　　　    的部位。(3)过程③常用　　　　　    法转化拟南芥幼苗,在筛选含有TaRSTR基因的拟南芥幼 苗时,除必要的营养物质,还需要在培养基中添加　　　　　　　　　    。
(4)为了检测TaRSTR基因在盐胁迫下的表达量,在175 mml/L的NaCl胁迫0、1、6、24、72 h时分别取转基因拟南芥的叶片和根,分析TaRSTR基因在胁迫不同时间点的叶 片和根中的表达量,其结果如图2所示。结果表明在盐胁迫条件下,TaRSTR基因在叶片 和根中表达的共同点是　　　　　　　　　　　　　　    。
(5)研究发现转基因拟南芥根细胞中的Ca2+浓度远高于野生型拟南芥(非转基因)。图3 为含有TaRSTR基因拟南芥耐盐性机理,请简要叙述该耐盐机理:        。