2024届人教版高考生物一轮复习重点研究“基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术”学案

第 2 讲　重点研究“基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术”

基因工程操作中目的基因的获取和基因表达载体的构建都离不开限制性内切核酸酶，只有选取合适的限制酶才能准确切取目的基因，因此限制酶的选取是基因工程操作的重点也是难点，近年来较难的高考试题大都围绕限制酶的选取进行考查。PCR技术既可以用于获取目的基因，又可以用于目的基因的检测与鉴定，是基因工程中重要技术之一，其应用较强，因此对PCR技术的考查也成为命题的热点。

1．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：

(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。

(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。

(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)表达载体含有启动子，启动子是指___________________________________________

________________________________________________________________________。

解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coli DNA连接酶连接，又可以用T4 DNA连接酶连接，而限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体。质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的酶切位点，便于目的基因的导入；质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。

答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程

2．(2022·山东高考)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。

(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。

(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是__________________________________________________________________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是____________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______________________________________________________________________________。

解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物需要满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对，并且是短单链核酸。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸添加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可以看出，P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。解决该问题的修改方案是在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基，使EcoRⅠ识别序列不影响P基因的正常翻译。

(3)①组仅添加UBC；②组添加UBC和FLAG-P；③组添加UBC、FLAG-P和药物A；④组添加UBC和FLAG-P△；⑤组添加UBC、FLAG-P△和药物A。按题中所述处理后，①组没出现杂交带，②③组出现杂交带，③组杂交带更加明显，说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组含有FLAG-P，出现杂交带，④⑤组含有FLAG-P△，没出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列的作用是参与P与UBC的结合。(4)根据(3)的分析推测，药物A通过增强P与UBC结合促进P降解，达到治疗该病的目的。

答案：(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基　(3)增强FLAG-P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 

知能集成(一)　探讨基因工程操作中限制酶的选择方法

1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。

(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

2．根据质粒的特点确定限制酶的种类

3．根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶

图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：

[典例]　玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白转基因玉米，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图所示。

请回答下列问题：

(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被 ________________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用 ____________________酶组合，将Ti质粒切开后构建重组表达载体。T-DNA在该实验中的作用是 ________________________________________________________________________

____________________________。

(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织去菌后进行植物组织培养，培养基中需加入______进行筛选，此物质属于氨基糖苷类抗生素，它能抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中合成，使植物的光合作用和 ________受到干扰，从而引起植物细胞死亡。

(3)愈伤组织是一种相对没有分化的 ________团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成 __________，再继续发育成转基因玉米株系。

[解析]　(1)启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，能驱动基因的转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，则需要强启动子，因此应优先选用BamHⅠ和SacⅠ酶组合，将Ti质粒切开后构建重组表达载体。农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此T-DNA在该实验中的作用是将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上。(2)由图可知，标记基因是G418抗性基因，因此将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织去菌后进行植物组织培养，培养基中需加入G418进行筛选，此物质属于氨基糖苷类抗生素，它能抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中合成，其中叶绿体是光合作用的场所，线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代谢)受到干扰，从而引起植物细胞死亡。(3)愈伤组织是一种相对没有分化的薄壁细胞团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成胚状体，再继续发育成转基因玉米株系。

[答案]　(1)RNA聚合酶　BamHⅠ和SacⅠ　将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上　(2)G418　呼吸作用(能量代谢)　(3)薄壁细胞　胚状体

[针对训练]

1．为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI 121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作与实验目的不符的是(　 )

A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因

B．与只用KpnⅠ相比，Kpn Ⅰ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确

C．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞

D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中

解析：选C　由图可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因，A正确；图中质粒与GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，B正确；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，C错误；PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，D正确。

2．将小菜蛾细胞的羧酸酯酶基因(CarE)导入水稻细胞，培育抗农药水稻新品种，过程如图所示。下列叙述错误的是(　 )

A．必须将含CarE基因的质粒导入水稻的受精卵

B．构建重组质粒时，应选用PstⅠ和SmaⅠ分别切割质粒和含CarE基因的DNA

C．Tetr的作用是鉴别和筛选含CarE基因的细胞

D．通过检测表达产物来判断CarE基因在水稻细胞中是否发挥功能作用

解析：选A　不一定要将含CarE基因的质粒导入水稻的受精卵，但是导入受精卵效果要好，A错误；Tetr是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，C正确。

知能集成(二)　PCR技术中引物的相关问题分析

1．PCR技术和DNA复制的比较

2.与引物相关的问题归纳概括

(1)PCR技术需要引物的原因。

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

(2)PCR扩增中需要引物数目的计算规律。

若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗引物数为2n＋1－2，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。

[典例]　IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1 183位碱基T突变为C，导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合)，主要过程如图1、2。分析回答：

(1)在PCR反应体系中，除加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入________________________________________________________________________等。

(2)在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：

则PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和图中大引物的________(填“①”或“②”)链。

(3)PCR的反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s,30个循环。在循环之前的94 ℃ 3 min处理为预变性；循环中72 ℃处理的目的是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)据图2分析代孕母鼠对移入子宫的胚胎基本不发生免疫反应，这为________________________提供了可能。

(5)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，请你设计完成获得SCID模型鼠的实验步骤：

①杂交亲本：______________，杂交得F1；

②F1雌雄鼠随机交配得F2；

③提取F2每只小鼠的基因组DNA，采用分子生物学方法，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，则____________________________________________________为模型鼠。

[解析]　(1)在PCR反应体系中，除加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。(2)在PCR1中，获取的是大引物，大引物中含有突变基因，所以应含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C；而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有HindⅢ识别的序列，从图中看，它是大引物的②链。(3)在PCR循环之前的94 ℃ 3 min处理为预变性，使DNA双链解开；循环中72 ℃处理的目的是使Taq DNA聚合酶从引物起始通过碱基互补配对进行互补链合成。(4)代孕母鼠对移入子宫的胚胎基本不发生免疫反应，这为胚胎在受体内存活提供了可能。(5)①研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，若要获得SCID模型鼠，可让F0与野生鼠杂交得F1；②F1雌雄鼠随机交配得F2；③模型鼠中应含有突变基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因组DNA，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，若IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带的则为模型鼠。

[答案]　(1)Taq DNA聚合酶(或热稳定DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸　(2)引物A和引物B　引物C　②　(3)使Taq DNA聚合酶从引物起始进行互补链合成　(4)胚胎在受体内存活　(5)①F0×野生鼠　③IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带

 [针对训练]

1．农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法错误的是(　 )

注：子链从引物的3′端开始延伸。

A．PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理

B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶

C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列

D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置

解析：选C　PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR中变性过程需要在高温条件下进行，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置，D正确。

2．中国某科研团队研制的重组流感疫苗制备流程如图1所示。回答下列问题：

(1)基因工程的核心步骤是____________________，被用作载体的Ad5应具有的特点有____________________________________________等。

(2)对流感重点地区输入的人员进行核酸检测需要用到用含放射性同位素的__________ 做探针，进行血清抗体检测的方法是________________杂交。

(3)为探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果，需要给不同组志愿者分别注射____________的疫苗，一段时间后采集血样检测相应抗体的水平。

(4)流感病毒的检测最常见的方法是荧光定量RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)，RT-PCR 的具体过程如图2所示。

①过程Ⅰ和Ⅱ都需要加入缓冲液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分别是________________________________________________________________________。

②RT-PCR过程通过对________的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。

③过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环扩增，理论上需要引物B为____________个。

解析：(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；作为基因工程的载体需要具备的条件有：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害等。(2)探针是指放射性同位素或荧光分子标记的目的基因；进行血清抗体检测的方法是抗原—抗体杂交。(3)探究疫苗的注射剂量对志愿者产生的免疫效果时，自变量是疫苗的剂量，因此需要给不同组志愿者分别注射不同剂量的疫苗，一段时间后采集血样检测相应抗体的水平。(4)①Ⅰ为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化；Ⅱ为PCR技术扩增过程，该过程需要耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。②RT-PCR过程通过对温度的控制影响酶的活性和DNA分子结构，从而使得整个反应过程有序地进行。③过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，由于起点是单链DNA，经过依次循环形成一个双链DNA分子，每个双链DNA分子都需要一个引物B，因此经过n次循环形成2n－1个子代DNA分子，也需要2n－1个引物B。

答案：(1)基因表达载体的构建　有一个或多个切割位点、有标记基因位点、对受体细胞无害　(2)目的基因　抗原—抗体　(3)不同剂量　(4)①逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶　②温度　③2n－1