2023届高考生物二轮复习精研重难点(二)基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建学案

精研重难点(二)　 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建

从“高度”上研究高考

[典例]　(2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：

(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为__________。

(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。

①选用____________酶将载体P切开，再用__________(填“T4 DNA或“E.coli DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。

②载体P′不具有表达MT基因的____________和______________。选用____________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。

(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________________________________________。

[解析]　(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于A位点和B位点的外侧。

(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。

[答案]　(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4 DNA　②启动子　终止子　Xho Ⅰ和Pst Ⅰ　钙　(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定

从“深度”上提升知能

1．限制酶的选择技巧

(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶

(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)

2．基因表达载体的构建过程

从“宽度”上拓展训练

1．如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列(　 )

A．NdeⅠ和BamHⅠ　　　B．NdeⅠ和XbaⅠ

C．XbaⅠ和BamHⅠ  D．EcoRⅠ和KpnⅠ

解析：选A　构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。

2．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：

(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。

(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。

(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________________________________

________________________________________________________________________。

解析：(1)限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coli DNA连接酶连接，又可以用T4DNA连接酶连接，而限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体。质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入；质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。

答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ

(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一个至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞

(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程

[微课微练·一点一评]

一、选择题

1．图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。据此判断下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是(　 )

A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙

B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和HindⅢ剪切

C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌

D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达

解析：选D　PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图乙中引物甲和引物丙，A正确；选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确；将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中，需要用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，C正确；在构建基因表达载体时，使用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割质粒，氨苄青霉素抗性基因已被破坏，因此氨苄青霉素抗性基因在受体细胞中不能表达，D错误。

2．(2022·东城区一模)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述错误的是(　 )

A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因

B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ

C．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的

D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上

解析：选B　蓝色玫瑰细胞质基质中的靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子1一同切除，故只能用BamH Ⅰ，B错误；sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。

3．ACC合成酶是乙烯合成的关键酶，乙烯的合成会影响番茄的储藏和运输。如图为科学家利用ACC合成酶基因的反向连接构建载体，通过基因工程设计的耐储转基因番茄流程图。下列有关说法错误的是(　 )

A．引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键

B．反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，限制了细胞内乙烯的合成

C．可以在培养基中加入氨苄青霉素和四环素，存活下来的细胞内则含有携带目的基因的质粒

D．设计双酶切处理目的基因及载体的目的是更好地保证目的基因的反向连接

解析：选C　引物能与ACC合成酶基因通过碱基互补配对结合定位ACC合成酶基因的位置，因此引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键，A正确；反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，使ACC合成酶基因不能正常表达，限制了细胞内乙烯的合成，B正确；从题图中可知，基因表达载体中ACC合成酶基因破坏了四环素抗性基因，因此含有携带目的基因质粒的细胞能在氨苄青霉素培养基中存活，但不能在四环素培养基中存活，C错误；设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好地保证目的基因的反向连接，D正确。

二、非选择题

4．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被__________酶切后的产物连接，理由是_______________________________________________________________。

(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是__________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。

解析：(1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是—GATC—

—CTAG—，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

答案：(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　(3)E·coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶

5．(2022·聊城一模)甜柿鲜果肉中含有可溶性糖、微量元素、维生素和β-胡萝卜素等多种成分，营养价值高。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因(PDC)密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。已知启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响基因的表达水平。AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。据图回答下列问题。

(1)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在____________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行PCR，引物的作用是____________________，目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(2)利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点____(填序号1～5)作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图丙简述作出该推测的理由：_______________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于________工程，该工程的起点是____________________。

解析：(1)题干所述操作为目的基因与载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接，即在DNA连接酶的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，其作用是与模板链结合，提供DNA延伸起始位点。大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，Taq DNA聚合酶是耐高温的聚合酶，故在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶。(2)由图1分析可知，质粒A带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则用不含尿嘧啶的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。从甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，cDNA片段需要插入启动子与终止子之间，且不能破坏其他蛋白质基因的表达，因此选择2作为cDNA的插入位点。依据题干和图3，重组酵母Y187与Y1H接合子应同时含有质粒A、质粒G，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性，能在含有金担子素的培养基中生存。(3)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，即对蛋白质进行改造，这种技术属于蛋白质工程。蛋白质工程的起点是预期蛋白质的功能。

答案：(1)DNA连接酶　与模板链结合，提供DNA延伸起始位点　大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活　(2)尿嘧啶　2　接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性　(3)蛋白质　预期蛋白质的功能