2021学年第1节 重组DNA技术的基本工具课堂教学课件ppt

这是一份2021学年第1节 重组DNA技术的基本工具课堂教学课件ppt，共24页。PPT课件主要包含了基础知识，DNA的鉴定，二苯胺，沸水浴，NaCL溶液，DNA的溶解性等内容，欢迎下载使用。

探究实践：DNA的粗提取与鉴定
提取生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA等大分子的理化性质DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出。此外，DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，将DNA与蛋白质进一步分离。
根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？当氯化钠的物质的量浓度为 2 ml／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 ml／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？在NaCl溶液浓度低于0.14 ml/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 ml/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性（1）蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响（2）高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才会变性（3）洗涤剂——瓦解细胞膜，但对DNA没有影响
沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
实验原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如：DNA不溶于______，但某些蛋白质溶于______，利用这一原理， 可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的____________中溶解度不同，它能溶于2mlL的___________。在一定温度下，DNA遇到_________试剂会呈现蓝色，因此________试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
实验设计：（一）实验材料的选取（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液（三）除去滤液中的杂质（纯化）（四）DNA的析出与鉴定
实验材料的选取从下列材料中选取2～3种：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）思考：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核。
破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞：动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
破碎细胞，获取含DNA的滤液植物细胞：植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。讨论1：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。讨论2：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
破碎细胞，获取含DNA的滤液问题探讨：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA ）？加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA这个步骤过滤获得什么？获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3——4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理）
除去滤液中的杂质（纯化）方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2ml/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14ml/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2ml/L的NaCl溶液溶解DNA。 思考1：加入2ml/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？目的是使DNA充分溶解思考2：过滤溶解有DNA的2ml/L的NaCl溶液，获得什么？含DNA的滤液思考3：这一步过滤的目的是？获得含DNA的滤液，除去不溶的杂质
除去滤液中的杂质（纯化）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
除去滤液中的杂质（纯化）方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉（图5-3），反应10~l5min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。方案三：将滤液放在60~75℃的恒温水浴箱中保温10~l5min，注意严格控制温度范固。讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开；方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与DNA分离
DNA的析出与鉴定DNA的析出：加入与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水思考：搅拌的目的（玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌）？卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA冷却的酒精溶液（体积分数95％）作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
DNA的析出与鉴定DNA的鉴定（1）向两支试管中分别加入 2ml/L NaCl 溶液5ml（2）其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解（3）向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml（4）混匀后，置于沸水浴中加热5min（5）待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化。观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色
DNA的析出与鉴定DNA的鉴定原理：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色物质。思考：可以单独用甲基绿鉴定某种物质是否是DNA吗？不可以，甲基绿同样会和RNA结合呈绿色。
操作提示： 以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。二苯胺试剂的配制：称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。
四、结果分析与评价是否提取出了DNA 观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。分析DNA中的杂质本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
问题总结本实验中有三次过滤 ,获得什么？（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液→获得含核物质的滤液。 （2）过滤含粘稠物的0.14ml/LNaCl溶液→获取纱布上的DNA粘稠物 （3）过滤溶解有DNA的2ml/LNaCl溶液→得到含DNA的滤液
实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用？第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液第二次搅拌加2ml/L NaCl溶液的滤液第三次搅拌加蒸馏水至0.14ml/L NaCl溶液第四次搅拌放入2ml/L NaCl溶液中纱布上的粘稠物第五次搅拌体积分数为95%的酒精
加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA
目的是使DNA充分溶解在2ml/ LNaCl溶液中
稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
使DNA黏稠物充分溶解在2ml/L NaCl溶液中
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA