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高考生物二轮复习基础保分专题12《基因工程与克隆技术》学案（含详解）
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这是一份高考生物二轮复习基础保分专题12《基因工程与克隆技术》学案（含详解），共25页。
基础保分专题十二基因工程与克隆技术
[课前循图忆知]
[做真题·明方向]
1．(全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_______________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
2．(全国卷Ⅱ节选)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是______________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证____________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析：(1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译 (3)核DNA
3．(全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有____________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________________________________________________________。
解析：(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，若以大肠杆菌作为受体细胞，由于不能切除内含子对应的RNA序列，所以无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此应选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原—抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体 (5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
4．(全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：____________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：
由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可) (2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
命题方向
基础类
第1题的(2)小题，第2题的(2)(3)小题，第3题的(3)(4)小题，第4题的(1)(2)小题
理解类
第1题的(1)(3)小题，第2题的(1)小题，第3题的(1)(2)(5)小题，第4题的(3)小题
复习方向
1.记忆基因的结构，基因工程的工具、过程，PCR技术的原理和步骤及注意事项，蛋白质工程的应用的相关知识。如第1题的(2)小题，第2题的(3)小题，第3题的(3)(4)小题，第4题的(1)(2)小题
2．重点理解基因工程原理、过程、注意事项及应用的相关知识。第1题的(1)(3)小题，第2题的(1)小题，第3题的(1)(2)(5)小题，第4题的(3)小题
[理教材·固根基]
1．比较记忆基因工程的三种工具(填表)
限制酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段，形成重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两个核苷酸之间
的磷酸二酯键
—
作用
特点
(条件)
①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列
②在特定位点上切割
①E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端
②T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端
①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制
②有一个至多个限制酶切割位点
③具有特殊的标记基因
常用
类型
EcoRⅠ限制酶
SmaⅠ限制酶
E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶
质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等
2．熟记基因工程的四个操作步骤(填图)
(1)目的基因的获取途径：
方法
具体操作
直接分离
从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取
人工合成
化学方法
已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板
逆转录法
以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成
PCR技术扩增
①原理：DNA复制
②条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定的DNA聚合酶
(2)基因表达载体(重组质粒)的构建：
①基因表达载体的组成：
②构建过程：
(3)将目的基因导入受体细胞：
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
(4)目的基因的检测与鉴定：
3．图解记忆蛋白质工程(填图)
[练热点·会迁移]
1．将某种植物中的耐盐基因，转入水稻细胞中培育出耐盐水稻新品系。如图是培育过程简图，请回答下列问题：
(1)阶段1的核心步骤是________________________，在这个过程中，理论上一般需用同种限制酶切割________个磷酸二酯键。
(2)为保证耐盐基因的正常转录，重组质粒b上耐盐基因的首端必须含有________，它是____________识别和结合的位点，尾端应含有________。
(3)由b到c常用的方法是________________，检测转基因植株是否培育成功的最简便方法是______________________________________________________________________。
(4)阶段2的培养基中除了必要的营养物质和琼脂外，还必须添加____________。
解析：(1)阶段1属于基因工程操作过程，基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。若用同种酶切割质粒和含目的基因的DNA片段，则在获取目的基因时，需要从目的基因两端切割，每个DNA分子有两条链，因此需要切开4个磷酸二酯键；对于质粒来说，只要切开一个切口即可，这样需切开2个磷酸二酯键，因此整个过程理论上一般需要切开6个磷酸二酯键。(2)转录是从基因的启动子部位开始的，因此必须保证基因首端有启动子。RNA聚合酶在转录时能识别并与启动子结合，在基因的尾端应有终止子，在此处RNA聚合酶与基因分离，转录停止。(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。本实验的目的是培育耐盐植物，因此可将转基因植物种植在盐碱地上观察其是否能正常生长。(4)在植物组织培养过程中，还必须在培养基中加入一定量的细胞分裂素和生长素。
答案：(1)基因表达载体的构建 6 (2)启动子 RNA聚合酶 终止子 (3)农杆菌转化法 将其种植在盐碱地上观察是否能正常生长(用一定浓度的盐水浇灌，观察其是否能正常生长) (4)植物激素(细胞分裂素和生长素)
2．MAP30蛋白是一种能使Ⅰ型核糖体失活的蛋白质，存在于苦瓜果实和种子中。MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗艾滋病的功能，近年来引起人们的广泛关注。
(1)人们已经清楚MAP30蛋白的氨基酸序列，可以用____________方法获得MAP30蛋白的基因。利用PCR技术扩增该基因，PCR反应体系的主要成分应该包含：______________、__________、__________、__________、扩增缓冲液(含Mg2＋)和水等。
(2)科学家用MAP30蛋白的基因与某种病毒的DNA构建基因表达载体，导入南瓜细胞中，在这个过程中，需要使用到的酶是__________________。为了避免出现“目的基因自我环化”、“目的基因在运载体上反向连接”的问题，请提出一种解决该问题的思路：_______________________________________________________________________。
(3)可用______________方法得到愈伤组织大规模生产MAP30蛋白，用______________方法检测MAP30的基因是否在南瓜果实中成功表达。
(4)弧菌是克氏原螯虾养殖中重要的致病菌，大规模暴发会给水产养殖带来巨大的经济损失。科研人员为了研究MAP30蛋白抗弧菌的效果，用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌，绘制弧菌生长曲线如图：
由图可以得出的结论是_____________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)在已知氨基酸排列顺序的情况下，可以用化学合成的方法来合成相应的基因。PCR反应体系的主要成分应该包含进行DNA复制的原料即4种脱氧核糖核苷酸，进行复制的模板DNA，引物对和热稳定DNA聚合酶(Taq酶)等。(2)构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶，如果用两种限制酶分别去切割目的基因和运载体，这样目的基因两端的黏性末端和运载体两端的黏性末端都不同，就不会自身环化，也不会出现目的基因在运载体上反向连接的情况了。(3)愈伤组织的获得需要用植物组织培养技术。检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交方法。(4)分析此图，要分析在横坐标相同时不同曲线的差异。从图中曲线变化趋势可知，在相同的培养时间内，随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强。当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时，弧菌生长完全被抑制。
答案：(1)化学合成(人工合成) 4种脱氧核糖核苷酸
模板DNA 引物对 热稳定DNA聚合酶(Taq酶) (2)限制酶、DNA连接酶 分别使用两种限制酶去剪切目的的基因和运载体 (3)植物组织培养 抗原—抗体杂交 (4)随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强；当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时，弧菌生长完全被抑制
3．过氧化氢酶广泛存在于自然界的生物体中，其能够将过氧化氢分解为水和分子氧，在纺织、造纸、食品、临床分析及医疗诊断等行业中也具有重要的应用价值。某科研小组用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA，转化大肠杆菌得到了耐热过氧化氢酶基因工程菌，工程菌的制备流程如图所示。请回答下列问题：
(1)基因工程操作的核心步骤是____________________，将目的基因导入大肠杆菌细胞的常用方法是__________________________________________________________。
(2)PCR技术体外扩增DNA的原理是____________________，从酶的角度比较PCR技术和人体内DNA复制的不同：___________________________________________________。
若通过PCR技术对perA扩增5代，共需要消耗引物的数量为________个。
(3)从分子水平检测大肠杆菌工程菌内是否产生了耐高温的过氧化氢酶的方法是____________，将原核细胞作为基因工程的受体细胞的突出优点是____________________。
(4)采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的________________。
解析：(1)基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建。将目的基因导入大肠杆菌细胞常用的方法是用钙离子处理大肠杆菌制备感受态细胞。(2)PCR技术体外扩增DNA的原理是DNA双链复制，从酶的角度分析，人体内DNA复制过程需要解旋酶和DNA聚合酶，PCR技术不需要解旋酶，但需要能耐高温的DNA聚合酶。若通过PCR技术对perA扩增5代，由于每条新合成的链都需要引物，因此共需要的引物数量为2＋4＋8＋16＋32＝62(个)。(3)从分子水平检测大肠杆菌工程菌内是否产生了耐高温的过氧化氢酶的方法是抗原—抗体杂交法。原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，因此常用作基因工程的受体细胞。(4)蛋白质工程的步骤是预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
答案：(1)基因表达载体的构建 钙离子处理法 (2)DNA双链复制 人体内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，PCR技术不需要解旋酶，但需要能耐高温的DNA聚合酶(合理即可) 62 (3)抗原—抗体杂交法 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 (4)脱氧核苷酸序列
考点二 克隆技术
[做真题·明方向]
1．(全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_______________________________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是________________________________________________________________。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目________(填“相同”或“不同”)，性染色体组合________(填“相同”或“不同”)。
解析：(1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。将重组细胞形成的早期胚胎移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞与提供细胞核的个体的体细胞的染色体数目相同。(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植获得克隆动物的难度明显高于胚胎细胞核移植。(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。
答案：(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中 不变 (2)小于 胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易 (3)相同 不同
2．(全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
解析：(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、原料dNTP。(3)①T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即对细胞进行传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。②据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG(TAC)，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 dNTP(脱氧核苷酸) (3)①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ②C
3．(全国卷Ⅱ)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为________________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用__________的方法。②代表的过程是______________。
(2)经过多次传代后，供体细胞中____________的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是________________________________________________________________________。
(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了________________________________________________________________________。
解析：(1)哺乳动物的正常细胞核中性染色体的组成为XX(雌性)或XY(雄性)。卵母细胞在培养至减数第二次分裂的中期时，常采用显微操作法去除细胞核。②过程是将早期胚胎移植到代孕个体的子宫中，即代表的是胚胎移植。(2)一般来说，动物细胞在传代培养到10～50代时，部分细胞的细胞核型可能会发生变化，即遗传物质的稳定性会降低。因此，选材时一般选10代以内的细胞，以保证细胞正常的二倍体核型。(3)获得的克隆动物性状与供体动物基本相同，但不完全相同，从遗传物质的角度分析，性状不完全相同的原因是克隆动物细胞质中的遗传物质来自去核卵母细胞的细胞质，细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响。(4)高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，但其细胞核的全能性在卵母细胞细胞质中的物质的作用下仍能得以表达。故克隆羊“多莉(利)”以及其他克隆动物的培育成功，证明了高度分化的动物体细胞的细胞核仍具有全能性。
答案：(1)XX或XY 显微操作 胚胎移植 (2)遗传物质 (3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 (4)动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
4．(2013·全国卷Ⅱ)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为______________________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指_____________________________________。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是_____________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖，经植物组织培养得到的______________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
解析：(1)要培育同时含有A和B的新型药用植物，可采用植物体细胞杂交技术。植物体细胞杂交技术的第一步是用纤维素酶和果胶酶去除两种植物细胞的细胞壁，获得具有活力的原生质体。诱导融合成功后获得的杂种细胞，经脱分化培养成愈伤组织，然后经过再分化形成完整的杂种植株。(2)多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。由于甲与乙有性杂交的后代中分别含有甲植物和乙植物的一个染色体组，两个染色体组中的染色体互不相同，杂交后代细胞中无同源染色体，减数分裂过程中不能发生联会，无法产生正常的生殖细胞，故该植株不可育。而体细胞杂交获得的杂种植物分别含有甲植物和乙植物的两个染色体组，含有同源染色体，减数分裂过程中联会正常，能产生正常的生殖细胞，故该杂种植株可育。(3)制备人工种子的材料可以是经植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等。
答案：(1)纤维素 果胶 原生质体 愈伤 再分化(或分化) 植物体细胞杂交技术 (2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体 在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常 (3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽(答对其中一个即可)
命题方向
基础类
第1题的(1)(3)小题，第2题的(2)(3)小题，第3题的(1)(2)(4)小题，第4题的(1)(3)小题
理解类
第1题的(2)小题，第2题的(1)小题，第3题的(3)小题，第4题的(2)小题
复习方向
1.记忆植物组织培养的过程及原理、动物细胞培养的过程及原理、植物体细胞杂交的过程及原理、动物核移植的过程及原理、动物细胞融合和单克隆抗体的制备过程。如第1题的(1)(3)小题，第2题的(3)小题；第3题的(1)(2)(4)小题，第4题的(1)(3)小题
2.重点理解植物组织培养的结果分析、体细胞克隆和生殖细胞克隆的区别。第1题的(2)小题，第3题的(3)小题，第4题的(2)小题
[理教材·固根基]
1．比较记忆植物组织培养与动物细胞培养(填表)
项目
植物组织培养
动物细胞培养
取材
植物幼嫩部位
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
过程
结
果
获得植株个体，可以体现全能性
获得新的细胞，不形成个体，不体现全能性
条件
①无菌
②营养物质
③适宜条件
④植物激素
①无菌、无毒
②营养物质，血清等
③温度和pH
④气体环境：O2、CO2
应用
①植株快速繁殖
②脱毒植株的培养
③人工种子
④生产药物、杀虫剂等
⑤转基因植物的培育
①蛋白质生物制品的生产
②皮肤移植材料的培育
③检测有毒物质
④生理、病理、药理学的研究
2．理清克隆动物培育流程(填图)
3．比较记忆植物体细胞杂交与动物细胞融合(填表)
项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞膜的流动性
过
程
相关酶
纤维素酶和果胶酶
胰蛋白酶或胶原蛋白酶
融合
方法
物理法：离心、电激、振动；
化学法：聚乙二醇等试剂诱导
除物理法和化学法外，还可以用灭活的病毒诱导
结果
杂种植株
杂交细胞
意
义
克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能
4．准确记忆单克隆抗体的“一过程两特点”(填空)
(1)制备过程：
(2)单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高。
[练热点·会迁移]
1．回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面__________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的__________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是__________。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现________________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成____________细胞，这种细胞的黏着性__________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量__________。
(3)用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。
(5)在细胞培养过程中，通常在________________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中__________的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低。
(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作________进行攻击。
解析：(1)在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶处理可以使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来。(2)随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞，这种细胞的细胞膜表面糖蛋白减少，细胞的黏着性降低。(3)由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。(4)由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此最好选用分裂到中期的细胞用显微镜观察染色体数目。(5)由于在冷冻(或超低温、液氮)条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低，通常在此条件下保存细胞。(6)机体把移植的皮肤当作抗原攻击，会发生免疫排斥反应现象。
答案：(1)相互接触 接触抑制 单层(或一层) 胰蛋白酶 (2)衰老甚至死亡 不死性 降低 减少 (3)活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色(或死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色) (4)中 (5)冷冻(或超低温、液氮) 酶 (6)抗原
2．下图是通过两种途径制备抗体的流程图。请回答下列问题：
(1)过程①表示__________，细胞乙称为____________，其特点是______________________________。
(2)过程④需要________酶，过程⑥需要用________处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使该细胞处于一种____________________________的生理状态。
(3)抗体1的特点是____________________________________________；抗体1、2空间结构不同的原因是_________________________________________________________。
(4)若要检测过程⑥中导入的目的基因是否转录出了mRNA，检测方法是________________。
解析：(1)图中过程①表示小鼠骨髓瘤细胞和免疫后产生的B细胞(浆细胞)的融合过程。细胞乙增殖后能产生大量抗体，所以细胞乙是杂交瘤细胞，其特点是既能无限增殖，又能产生专一抗体。(2)过程④表示以mRNA为模板获得目的基因的逆转录过程，需要逆转录酶。过程⑥表示将基因表达载体导入受体细胞，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使之成为能够吸收DNA分子的感受态细胞。(3)抗体1是单克隆抗体，它的特点是特异性强、灵敏度高，并可以大量制备。大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，所以抗体1、2空间结构不同。(4)检测目的基因是否转录出mRNA的方法是分子杂交技术。
答案：(1)细胞融合 杂交瘤细胞 既能无限增殖，又能产生专一抗体 (2)逆转录 Ca2＋ 能够吸收周围环境中DNA分子 (3)特异性强、灵敏度高，并可以大量制备 抗体2形成过程中没有经过内质网和高尔基体的加工，抗体1形成过程中经过内质网和高尔基体的加工(合理即可) (4)分子杂交技术
[课堂强化训练]
1．(保定一模)α1抗胰蛋白酶是肝脏产生的一种糖蛋白，缺乏会引起肺气肿。某公司成功研制出转基因羊，进入泌乳期后，其乳汁中含有人类的α1抗胰蛋白酶，可用于治疗肺气肿。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，需要在肝细胞中提取______，通过逆转录产生cDNA，再通过______技术进行快速扩增。
(2)将α1抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的________等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，然后通过____________技术，导入羊的受精卵中。
(3)受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到____________阶段，通过胚胎移植进入受体子宫孕育。为选育出能泌乳的雌羊，移植前须从胚胎的________部位取样，做DNA分析鉴定性别。
(4)α1抗胰蛋白酶是一种结构较复杂的糖蛋白，因此用上述方法生产，相对传统的转基因大肠杆菌生产，优势在于____________________________________。
解析：(1)α1抗胰蛋白酶基因在肝细胞中表达，所以可以在肝细胞中提取mRNA，通过逆转录产生相应cDNA，再通过PCR技术扩增。(2)为了使α1抗胰蛋白酶基因在乳腺细胞中表达，需要将其与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组，构建基因表达载体，然后通过显微注射技术，导入受精卵中。(3)牛和羊的胚胎一般发育到桑椹胚或囊胚阶段，才进行胚胎移植；DNA分析鉴定性别须从胚胎的滋养层部位取样，这样既保证了遗传信息一致，又不影响内细胞团进一步发育。(4)糖蛋白的形成需要进行蛋白质的加工，相对原核细胞而言，羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力。
答案：(1)mRNA PCR (2)启动子(或启动子、终止子) 显微注射 (3)桑椹胚或囊胚 滋养层 (4)羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力
2．紫草为常用中药材，其主要成分紫草宁及其衍生物属于萘醌类化合物，具有抗肿瘤、消炎等作用。请回答下列问题：
(1)若要通过植物组织培养的方法获得大量的紫草宁，该方法依据的原理是________________________。植物组织培养的两大步骤是__________和__________。
(2)营养因子对紫草的组织培养有影响，实验表明：葡萄糖和蔗糖可明显促进紫草宁的生产。它们的最适浓度均为6%，但葡萄糖优于蔗糖，推测原因可能是________________________________________________。
(3)紫草怕涝，而像垂柳、紫穗槐等是最耐涝植物。有科学家设想要通过植物细胞工程的方法获得可生产紫草宁的耐涝紫草，并进行大面积种植。具体方法：第一步，选择垂柳的细胞和紫草的细胞用纤维素酶和果胶酶处理后获得________________；第二步，二者融合后，诱导其再生出__________，获得杂种细胞；第三步，进行组织培养形成愈伤组织，再生出小植株，形成杂种植物，选育所需植株，移栽并推广。在选育的过程中，选择的植株需具备的两个条件是________________、__________________。
解析：(1)植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。植物组织培养需要经过脱分化和再分化过程。(2)葡萄糖是单糖，蔗糖是二糖，单糖更易被植物细胞吸收利用。(3)在进行植物体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得具有活力的原生质体；原生质体融合之后，需要诱导其再生出细胞壁。根据题意，选育时应该选择可正常生长且耐涝的植株，并且还要能产生紫草宁。
答案：(1)植物细胞的全能性 脱分化 再分化 (2)葡萄糖为单糖，更容易被植物细胞吸收利用(合理即可) (3)原生质体 细胞壁 可正常生长并且耐涝 可以产生紫草宁
3．(临沂模拟)DHA对脑神经发育至关重要。以A、B两种单细胞真核藻为亲本，利用细胞融合技术选育高产DHA融合藻。两种藻特性如下表。
亲本藻
优势代谢类型
生长速率[g/(L·d)]
固体培养基上菌落直径
DHA含量(%)
A藻
自养
0.06
小
0.7
B藻
异养
0.14
大
无
据表回答：
(1)选育的融合藻应具有A藻________________与B藻______________的优点。
(2)诱导融合前需用纤维素酶处理两种藻，其目的是获得______________。
(3)通过以下a、b、c三步筛选融合藻，步骤________可淘汰B藻，步骤________可淘汰生长速率较慢的藻落，再通过步骤________获取生产所需的融合藻。
步骤a：观察藻落的大小；
步骤b：用不含有机碳源(碳源——生物生长的碳素来源)的培养基进行光照培养；
步骤c：测定DHA含量。
(4)以获得的融合藻为材料进行甲、乙、丙三组实验，结果如下图。
与甲、丙两组相比，乙组融合藻生长速率较快，原因是在该培养条件下________________________________________________________________________。
甲、乙两组DHA产量均较高，但实际生产中往往采用甲组的培养条件，其原因是____________________________________________________________________________。
解析：(1)由表格信息可知，选育的融合藻要具有A藻的自养且能产生DHA的特性，还要具有B藻的生长速率快的特点。(2)藻类具有细胞壁，用纤维素酶可除去其细胞壁又不会损伤原生质体，由此可推知用纤维素酶处理的目的是获得原生质体。(3)用不含有机碳源的培养基进行光照培养可淘汰B藻和BB融合型藻类，观察藻落的大小，可淘汰生长速率较慢的藻落，再通过测定DHA含量的步骤获取生产所需的融合藻。(4)与甲、丙两组相比，乙组融合藻生长速率较快，原因是在光照、添加葡萄糖的培养条件下融合藻既能光能自养，又能异养。甲、乙两组DHA产量均较高，但实际生产中往往采用甲组的培养条件，因为融合藻利用光能和简单的无机物即能生长，不需添加葡萄糖，可降低成本，同时也可防止杂菌生长(因为多数细菌是异养型的)。
答案：(1)产生DHA、自养特性 快速生长 (2)原生质体 (3)b a c (4)融合藻既能光能自养又能异养 融合藻利用光能和简单的无机物即能生长，不需要添加葡萄糖，可降低成本，也可防止杂菌生长
[课后检测·增分强训]
1．(南充模拟)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：
(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的________序列发生改变。
(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作____________________________________。
(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的________，以其作为模板，在________酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。
(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
解析：(1)患者的血红蛋白分子β肽链第6位的谷氨酸变成了缬氨酸，此氨基酸的变化是由于控制合成血红蛋白分子的DNA的碱基序列发生了改变，从而导致了mRNA上密码子的改变。(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作没有对现有的蛋白质进行改造，不属于蛋白质工程。(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的RNA，以其作为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和DNA连接酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(4)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，用相应的抗体进行抗原—抗体特异性杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
答案：(1)碱基(脱氧核苷酸) (2)不属于 没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰) (3)mRNA 逆转录 DNA连接 (4)蛋白质 抗原—抗体
2．(内江一模)干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染和癌症。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性只有天然产品的十分之一，且体外保存相当困难。研究发现若将第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸，生产出的干扰素的抗病毒活性是原来的100倍，并且在－70 ℃的条件下，可以保存半年，给广大患者带来福音。
(1)从上述资料可知，若要改变干扰素的功能，可以考虑对于扰素________________进行改造。
(2)对干扰素进行改造，应该直接对________________(填“干扰素分子”或“干扰素的cDNA”)进行操作来实现，原因是________________________________________________。
(3)与蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产________________的蛋白质，不一定符合生产和生活的需要，而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过____________或____________，得到符合要求的________，再通过____________(填生理过程)实现相应蛋白质的合成，满足生产和生活需要。
解析：(1)从上述资料可知，若将第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸，生产出的干扰素的抗病毒活性是原来的100倍，故若要改变干扰素的功能，可以考虑对干扰素氨基酸序列进行改造。(2)对干扰素进行改造，应该直接对干扰素的cDNA进行操作来实现，原因是①蛋白质的结构由基因决定，蛋白质不能直接遗传，基因可以遗传；②对基因的改造比对蛋白质的改造要容易。(3)与蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，不一定符合生产和生活的需要，而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过基因修饰或基因合成，得到符合要求的基因，再通过转录和翻译实现相应蛋白质的合成，满足生产和生活需要。
答案：(1)氨基酸序列 (2)干扰素的cDNA ①蛋白质的结构由基因决定，蛋白质不能直接遗传，基因可以遗传；②对基因的改造比对蛋白质的改造要容易 (3)自然界已存在 基因修饰 基因合成 基因 转录和翻译
3．(华南师大附中三模)华蟾素是我国经典抗肿瘤药物。研究人员为探寻华蟾素注射液抗肝癌细胞的作用机理，进行了一系列实验。请回答下列问题：
Ⅰ.肝癌细胞的培养：
(1)培养肝癌细胞时，在培养基中加入适量的__________以补充合成培养基中缺乏的物质，为防止培养过程发生污染要加入___________。此外，每48 h更换1次培养液，目的是_____________________________________；同时还要提供适宜的温度、_________、氧气和二氧化碳等环境条件。
Ⅱ.探究华蟾素药效作用机理的实验：
(2)DNA拓扑异构酶Ⅱ(简称TopoⅡ)为真核生物所必需，在DNA复制、转录等方面发挥重要作用，TopoⅡ在肿瘤细胞中含量明显高于正常细胞。华蟾素注射液处理细胞48 h后，采用逆转录—聚合酶链式反应技术检测TopoⅡ基因的表达情况，结果如表。
华蟾素浓度(μg/mL)
0
0.10
0.20
0.40
TopoⅡ基因表达量
＋＋＋＋＋
＋＋＋＋
＋＋
＋
①逆转录—聚合酶链式反应的主要原理是：提取肝癌细胞中的总RNA，在___________酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，为完成该反应还需要添加________________________________________________________________________。
②由上可知，华蟾素注射液在分子水平上影响肝癌细胞的机理是________________________________________________________________________。
解析：(1)在动物细胞培养时，所需的营养物质有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，将这些物质按其类别和所需的数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需要加入血清、血浆等一些天然成分；为防止培养过程发生污染需要在培养基加入抗生素；为了防止代谢物积累对细胞自身造成危害，还要定时更换培养液；同时还要提供适宜的温度、pH、氧气和二氧化碳等环境条件。(2)①逆转录需要以提取的mRNA为模板，以游离的脱氧核苷酸为原料，在逆转录酶的催化下合成cDNA。进行PCR扩增时需要准备四类物质：模板(cDNA)、原料(四种脱氧核苷酸)、引物和Taq酶。②由题干信息和表中实验结果可知，华蟾素注射液在分子水平上影响肝癌细胞的机理是抑制TopoⅡ基因的转录，最终导致TopoⅡ含量降低。
答案：(1)血清(血浆) 抗生素 提供营养物质和防止代谢物积累对细胞自身造成危害 pH (2)①逆转录 引物、耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)和四种脱氧核苷酸 ②抑制TopoⅡ基因的转录，最终导致TopoⅡ含量降低
4．(南京三模)图1是利用两种不同生物技术将小鼠培育成大鼠的过程。图2中质粒是基因工程中常用的质粒pIJ702，其中tsr为硫链丝菌素抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限制酶ClaⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SphⅠ在pIJ702上分别只有一处识别序列。
pIJ702
pZHZ8
BglⅡ
5.7 kb
6.7 kb
ClaⅠ
5.7 kb
2.2 kb,4.5 kb
PstⅠ
5.7 kb
1.6 kb,5.1 kb
(1)图1中应用到的生物工程技术有_______________________。c分子称为__________，其上的生长激素基因表达产物的受体分布在丁鼠的全身细胞的______________。
(2)若大鼠甲和大鼠乙体内X染色体上均带有某种致病基因，则培育出的大鼠丙和大鼠丁携带致病基因的是______________(不考虑基因突变)。
(3)用SacⅠ和SphⅠ同时切割大鼠生长激素基因和质粒pIJ702，获取的目的基因去置换pIJ702上0.4 kb的片段，构成重组质粒pZHZ8。上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表中。由此判断目的基因的片段长度为_____________kb。参照表中数据，如果用PstⅠ和ClaⅠ同时酶切重组质粒pZHZ8，则两种酶可将pZHZ8切成______个片段。
(4)重组质粒pZHZ8上的标记基因是______________，在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰________色的菌落。
解析：(1)图1中技术Ⅰ为核移植技术，技术Ⅱ为转基因技术，应用到的生物工程技术有核移植技术、转基因技术、胚胎移植技术、动物细胞培养技术。c分子称为基因表达载体(重组DNA分子或重组质粒)，生长激素通过和细胞膜表面的受体结合调节细胞代谢。(2)大鼠甲体内X染色体上带有的某种致病基因会随细胞核传给大鼠丙，大鼠乙只为大鼠丁提供生长激素基因，丁不携带大鼠乙体内X染色体上携带的致病基因。(3)用SacⅠ和SphⅠ同时切割大鼠生长激素基因和质粒pIJ702，获取的目的基因去置换pIJ702上0.4 kb的片段，构成重组质粒pZHZ8。据表可知重组质粒pZHZ8比原质粒增加1.0 kb，说明目的基因的片段长度为0.4＋1.0＝1.4 (kb)。据表可知，PstⅠ和ClaⅠ在重组质粒pZHZ8上均具有两个酶切位点，则两种酶同时酶切重组质粒pZHZ8，可将pZHZ8切成4个片段。(4)黑色素合成基因mel会被破坏，重组质粒pZHZ8上的标记基因是tsr基因(硫链丝菌素抗性基因)，在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰黑色的菌落。
答案：(1)核移植技术、转基因技术、胚胎移植技术、动物细胞培养技术 基因表达载体(重组DNA分子或重组质粒) 细胞膜上 (2)大鼠丙携带，丁不携带 (3)1.4 4 (4)tsr基因(硫链丝菌素抗性基因) 黑
5．(山东名校联考)人的成纤维细胞与小鼠细胞进行融合获得部分杂种细胞，杂种细胞中人类染色体会随机丢失，各种杂种细胞保留人类染色体的种类和数量是不同的，由此可以分离得到许多种杂种细胞。请回答下列问题：
(1)诱导动物细胞融合常用的诱导因素有______________________(至少写出两种)。细胞融合体现了细胞膜的________。
(2)在培养容器中，诱导两类细胞两两融合，在加入诱导剂后，培养液中应该存在________种细胞。若只考虑人的成纤维细胞与鼠细胞两两融合形成的杂种细胞，假如每种杂种细胞只保留了人的1条染色体，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞最多可能有________种。
(3)培养杂种细胞的过程中，细胞需置于含CO2的混合气体的培养箱中培养，CO2的主要作用是维持培养液的________。
(4)动物细胞的培养相对植物细胞培养要困难得多，一般培养动物细胞时在培养基中必须要加入________，而培养植物细胞则不需要。
(5)运用细胞融合技术还可以进行____________的制备，请列举一项关于该物质的应用：______________________________________。
解析：(1)动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。细胞融合体现了细胞膜的流动性。(2)培养液中存在人—人融合细胞，人—鼠融合细胞，鼠—鼠融合细胞，以及没有融合的人成纤维细胞和小鼠细胞，共5种。人体细胞含有23对染色体，共有24种染色体(22种常染色体＋X＋Y)，所以当每种杂种细胞只保留了人的1条染色体时，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞最多可能有24种。(3)进行动物细胞培养时，需将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体培养箱中，CO2的主要作用是维持培养液的pH。(4)培养动物细胞时通常需要在培养基中加入血清、血浆等一些天然成分，而植物细胞培养则不需要。(5)运用细胞融合技术可以进行单克隆抗体的制备，单克隆抗体可以作为诊断试剂，也可以用于治疗疾病和运载药物。
答案：(1)聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激 流动性 (2)5 24 (3)pH (4)血清、血浆 (5)单克隆抗体 作为诊断试剂(或用于治疗疾病和运载药物)
6．青岛“崂山奶山羊乳腺生物反应器的研制”项目生产的药用蛋白具有表达效率高、成本低、安全性高、易于分离纯化的优点，可产生乙肝表面抗原及抗凝血酶Ⅲ等医药产品，造福人类。据图回答下列问题：
(1)在基因工程中，A表示____________，如果直接从苏云金芽孢杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶区别于其他酶的特点是_________________________________________。
(2)在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用________对目的基因进行扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶有____________________。
(3)将目的基因导入玉米(玉米是单子叶植物)受体细胞的过程中，在③过程中一般采用____________，在②过程中一般采用______________。
(4)由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其乳汁中是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么？___________________________________________。
解析：(1)在基因工程中，A表示目的基因。限制酶的作用特点是一种该酶(或限制酶)只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子。(2)目的基因的扩增用PCR技术，然后将目的基因与载体(或质粒)组合形成重组质粒，该重组的过程需要用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶。(3)③过程表示目的基因导入单子叶植物细胞，一般使用基因枪法；②过程表示目的基因导入动物受体细胞(受精卵)中，一般采用显微注射法。(4)在分子水平上检测转基因山羊的乳汁中是否存在药用蛋白的方法是用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。如果出现杂交带，表明乳汁中出现了药用蛋白；如果不出现杂交带，表明乳汁中未出现药用蛋白。
答案：(1)目的基因 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子 (2)PCR技术 限制酶、DNA连接酶 (3)基因枪法 显微注射法
(4)从转基因山羊的乳汁中提取蛋白质，用特异性抗体进行抗原—抗体杂交；如果出现杂交带，表明乳汁中出现了药用蛋白；如果不出现杂交带，表明乳汁中未出现药用蛋白
7．(海南高考)甲、乙两同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：
(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是____________________________________。
(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入了一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到________________。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是____________________(填“具有完整的细胞核”“具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。
(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是________________________。A中的愈伤组织是叶肉细胞经________形成的。
(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法来繁殖，在培养时，________(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是__________________________________________。
解析：(1)植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性。(2)蔗糖是一种二糖，可水解生成葡萄糖和果糖。具有完整细胞核的细胞才能作为材料进行组织培养获得幼苗。(3)植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的比值影响培养的结果，当二者比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成；比例适中时，促进愈伤组织的形成。A中的愈伤组织是经脱分化形成的。(4)要用组织培养方法获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，培养时不能采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，因为对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株。
答案：(1)绿色叶片和白色花瓣的细胞都具有全能性，在一定条件下能发育成完整的植株 (2)葡萄糖、果糖 具有完整的细胞核 (3)细胞分裂素、生长素 脱分化
(4)不能 对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株
8．(绵阳二诊)“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，由单克隆抗体与药物配合而成。单克隆抗体能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。单克隆抗体的制备过程如图所示，分析回答下列问题：
(1)图中A过程是从小鼠的脾脏中取得________细胞，提取该细胞之前，给小鼠注射的特定物质相当于________；B过程得到的杂交瘤细胞的特点是________________________________。
(2)体外培养杂交瘤细胞的培养基与用于植物组织培养的培养基在物理性质上的主要区别是前者要用________________，从培养基的成分来看，前者培养基中除了添加必要的营养物质外还需要加入含天然成分的__________________。
(3)特异性抗体也可以通过常规方法来制备：向动物反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物的血清中分离所需抗体。与这种常规方法相比，单克隆抗体具有__________________________________(答出三点即可)等优点。制备单克隆抗体的过程中至少需要________次对细胞的筛选。
解析：(1)A过程是从已产生免疫反应(注射特定的抗原)的小鼠脾脏中取得B淋巴(浆)细胞；杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。(2)从物理性质上看，体外培养杂交瘤细胞用液体培养基，植物组织培养用固体培养基；体外培养动物细胞的培养基需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常还需要加入血清、血浆等一些天然成分。(3)单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高，并可以大量制备。制备单克隆抗体的过程中至少需要两次筛选，第1次筛选出杂交瘤细胞，第2次筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
答案：(1)B淋巴(浆) 抗原 能产生抗体和无限增殖
(2)液体培养基 动物血清、血浆
(3)特异性强、灵敏度高，并可以大量制备 两
基础保分专题十二基因工程与克隆技术
[课前循图忆知]
[做真题·明方向]
1．(全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_______________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
2．(全国卷Ⅱ节选)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是______________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证____________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析：(1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译 (3)核DNA
3．(全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有____________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________________________________________________________。
解析：(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，若以大肠杆菌作为受体细胞，由于不能切除内含子对应的RNA序列，所以无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此应选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原—抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体 (5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
4．(全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：____________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：
由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可) (2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
命题方向
基础类
第1题的(2)小题，第2题的(2)(3)小题，第3题的(3)(4)小题，第4题的(1)(2)小题
理解类
第1题的(1)(3)小题，第2题的(1)小题，第3题的(1)(2)(5)小题，第4题的(3)小题
复习方向
1.记忆基因的结构，基因工程的工具、过程，PCR技术的原理和步骤及注意事项，蛋白质工程的应用的相关知识。如第1题的(2)小题，第2题的(3)小题，第3题的(3)(4)小题，第4题的(1)(2)小题
2．重点理解基因工程原理、过程、注意事项及应用的相关知识。第1题的(1)(3)小题，第2题的(1)小题，第3题的(1)(2)(5)小题，第4题的(3)小题
[理教材·固根基]
1．比较记忆基因工程的三种工具(填表)
限制酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段，形成重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两个核苷酸之间
的磷酸二酯键
—
作用
特点
(条件)
①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列
②在特定位点上切割
①E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端
②T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端
①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制
②有一个至多个限制酶切割位点
③具有特殊的标记基因
常用
类型
EcoRⅠ限制酶
SmaⅠ限制酶
E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶
质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等
2．熟记基因工程的四个操作步骤(填图)
(1)目的基因的获取途径：
方法
具体操作
直接分离
从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取
人工合成
化学方法
已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板
逆转录法
以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成
PCR技术扩增
①原理：DNA复制
②条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定的DNA聚合酶
(2)基因表达载体(重组质粒)的构建：
①基因表达载体的组成：
②构建过程：
(3)将目的基因导入受体细胞：
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
(4)目的基因的检测与鉴定：
3．图解记忆蛋白质工程(填图)
[练热点·会迁移]
1．将某种植物中的耐盐基因，转入水稻细胞中培育出耐盐水稻新品系。如图是培育过程简图，请回答下列问题：
(1)阶段1的核心步骤是________________________，在这个过程中，理论上一般需用同种限制酶切割________个磷酸二酯键。
(2)为保证耐盐基因的正常转录，重组质粒b上耐盐基因的首端必须含有________，它是____________识别和结合的位点，尾端应含有________。
(3)由b到c常用的方法是________________，检测转基因植株是否培育成功的最简便方法是______________________________________________________________________。
(4)阶段2的培养基中除了必要的营养物质和琼脂外，还必须添加____________。
解析：(1)阶段1属于基因工程操作过程，基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。若用同种酶切割质粒和含目的基因的DNA片段，则在获取目的基因时，需要从目的基因两端切割，每个DNA分子有两条链，因此需要切开4个磷酸二酯键；对于质粒来说，只要切开一个切口即可，这样需切开2个磷酸二酯键，因此整个过程理论上一般需要切开6个磷酸二酯键。(2)转录是从基因的启动子部位开始的，因此必须保证基因首端有启动子。RNA聚合酶在转录时能识别并与启动子结合，在基因的尾端应有终止子，在此处RNA聚合酶与基因分离，转录停止。(3)常用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。本实验的目的是培育耐盐植物，因此可将转基因植物种植在盐碱地上观察其是否能正常生长。(4)在植物组织培养过程中，还必须在培养基中加入一定量的细胞分裂素和生长素。
答案：(1)基因表达载体的构建 6 (2)启动子 RNA聚合酶 终止子 (3)农杆菌转化法 将其种植在盐碱地上观察是否能正常生长(用一定浓度的盐水浇灌，观察其是否能正常生长) (4)植物激素(细胞分裂素和生长素)
2．MAP30蛋白是一种能使Ⅰ型核糖体失活的蛋白质，存在于苦瓜果实和种子中。MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗艾滋病的功能，近年来引起人们的广泛关注。
(1)人们已经清楚MAP30蛋白的氨基酸序列，可以用____________方法获得MAP30蛋白的基因。利用PCR技术扩增该基因，PCR反应体系的主要成分应该包含：______________、__________、__________、__________、扩增缓冲液(含Mg2＋)和水等。
(2)科学家用MAP30蛋白的基因与某种病毒的DNA构建基因表达载体，导入南瓜细胞中，在这个过程中，需要使用到的酶是__________________。为了避免出现“目的基因自我环化”、“目的基因在运载体上反向连接”的问题，请提出一种解决该问题的思路：_______________________________________________________________________。
(3)可用______________方法得到愈伤组织大规模生产MAP30蛋白，用______________方法检测MAP30的基因是否在南瓜果实中成功表达。
(4)弧菌是克氏原螯虾养殖中重要的致病菌，大规模暴发会给水产养殖带来巨大的经济损失。科研人员为了研究MAP30蛋白抗弧菌的效果，用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌，绘制弧菌生长曲线如图：
由图可以得出的结论是_____________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)在已知氨基酸排列顺序的情况下，可以用化学合成的方法来合成相应的基因。PCR反应体系的主要成分应该包含进行DNA复制的原料即4种脱氧核糖核苷酸，进行复制的模板DNA，引物对和热稳定DNA聚合酶(Taq酶)等。(2)构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶，如果用两种限制酶分别去切割目的基因和运载体，这样目的基因两端的黏性末端和运载体两端的黏性末端都不同，就不会自身环化，也不会出现目的基因在运载体上反向连接的情况了。(3)愈伤组织的获得需要用植物组织培养技术。检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交方法。(4)分析此图，要分析在横坐标相同时不同曲线的差异。从图中曲线变化趋势可知，在相同的培养时间内，随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强。当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时，弧菌生长完全被抑制。
答案：(1)化学合成(人工合成) 4种脱氧核糖核苷酸
模板DNA 引物对 热稳定DNA聚合酶(Taq酶) (2)限制酶、DNA连接酶 分别使用两种限制酶去剪切目的的基因和运载体 (3)植物组织培养 抗原—抗体杂交 (4)随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强；当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时，弧菌生长完全被抑制
3．过氧化氢酶广泛存在于自然界的生物体中，其能够将过氧化氢分解为水和分子氧，在纺织、造纸、食品、临床分析及医疗诊断等行业中也具有重要的应用价值。某科研小组用PCR技术得到嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因perA，转化大肠杆菌得到了耐热过氧化氢酶基因工程菌，工程菌的制备流程如图所示。请回答下列问题：
(1)基因工程操作的核心步骤是____________________，将目的基因导入大肠杆菌细胞的常用方法是__________________________________________________________。
(2)PCR技术体外扩增DNA的原理是____________________，从酶的角度比较PCR技术和人体内DNA复制的不同：___________________________________________________。
若通过PCR技术对perA扩增5代，共需要消耗引物的数量为________个。
(3)从分子水平检测大肠杆菌工程菌内是否产生了耐高温的过氧化氢酶的方法是____________，将原核细胞作为基因工程的受体细胞的突出优点是____________________。
(4)采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的________________。
解析：(1)基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建。将目的基因导入大肠杆菌细胞常用的方法是用钙离子处理大肠杆菌制备感受态细胞。(2)PCR技术体外扩增DNA的原理是DNA双链复制，从酶的角度分析，人体内DNA复制过程需要解旋酶和DNA聚合酶，PCR技术不需要解旋酶，但需要能耐高温的DNA聚合酶。若通过PCR技术对perA扩增5代，由于每条新合成的链都需要引物，因此共需要的引物数量为2＋4＋8＋16＋32＝62(个)。(3)从分子水平检测大肠杆菌工程菌内是否产生了耐高温的过氧化氢酶的方法是抗原—抗体杂交法。原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，因此常用作基因工程的受体细胞。(4)蛋白质工程的步骤是预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
答案：(1)基因表达载体的构建 钙离子处理法 (2)DNA双链复制 人体内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，PCR技术不需要解旋酶，但需要能耐高温的DNA聚合酶(合理即可) 62 (3)抗原—抗体杂交法 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 (4)脱氧核苷酸序列
考点二 克隆技术
[做真题·明方向]
1．(全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_______________________________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是________________________________________________________________。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目________(填“相同”或“不同”)，性染色体组合________(填“相同”或“不同”)。
解析：(1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。将重组细胞形成的早期胚胎移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞与提供细胞核的个体的体细胞的染色体数目相同。(2)由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植获得克隆动物的难度明显高于胚胎细胞核移植。(3)哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。
答案：(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中 不变 (2)小于 胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易 (3)相同 不同
2．(全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
解析：(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、原料dNTP。(3)①T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即对细胞进行传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。②据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG(TAC)，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 dNTP(脱氧核苷酸) (3)①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ②C
3．(全国卷Ⅱ)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为________________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用__________的方法。②代表的过程是______________。
(2)经过多次传代后，供体细胞中____________的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是________________________________________________________________________。
(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了________________________________________________________________________。
解析：(1)哺乳动物的正常细胞核中性染色体的组成为XX(雌性)或XY(雄性)。卵母细胞在培养至减数第二次分裂的中期时，常采用显微操作法去除细胞核。②过程是将早期胚胎移植到代孕个体的子宫中，即代表的是胚胎移植。(2)一般来说，动物细胞在传代培养到10～50代时，部分细胞的细胞核型可能会发生变化，即遗传物质的稳定性会降低。因此，选材时一般选10代以内的细胞，以保证细胞正常的二倍体核型。(3)获得的克隆动物性状与供体动物基本相同，但不完全相同，从遗传物质的角度分析，性状不完全相同的原因是克隆动物细胞质中的遗传物质来自去核卵母细胞的细胞质，细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响。(4)高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，但其细胞核的全能性在卵母细胞细胞质中的物质的作用下仍能得以表达。故克隆羊“多莉(利)”以及其他克隆动物的培育成功，证明了高度分化的动物体细胞的细胞核仍具有全能性。
答案：(1)XX或XY 显微操作 胚胎移植 (2)遗传物质 (3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 (4)动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
4．(2013·全国卷Ⅱ)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为______________________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指_____________________________________。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是_____________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖，经植物组织培养得到的______________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
解析：(1)要培育同时含有A和B的新型药用植物，可采用植物体细胞杂交技术。植物体细胞杂交技术的第一步是用纤维素酶和果胶酶去除两种植物细胞的细胞壁，获得具有活力的原生质体。诱导融合成功后获得的杂种细胞，经脱分化培养成愈伤组织，然后经过再分化形成完整的杂种植株。(2)多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。由于甲与乙有性杂交的后代中分别含有甲植物和乙植物的一个染色体组，两个染色体组中的染色体互不相同，杂交后代细胞中无同源染色体，减数分裂过程中不能发生联会，无法产生正常的生殖细胞，故该植株不可育。而体细胞杂交获得的杂种植物分别含有甲植物和乙植物的两个染色体组，含有同源染色体，减数分裂过程中联会正常，能产生正常的生殖细胞，故该杂种植株可育。(3)制备人工种子的材料可以是经植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等。
答案：(1)纤维素 果胶 原生质体 愈伤 再分化(或分化) 植物体细胞杂交技术 (2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体 在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常 (3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽(答对其中一个即可)
命题方向
基础类
第1题的(1)(3)小题，第2题的(2)(3)小题，第3题的(1)(2)(4)小题，第4题的(1)(3)小题
理解类
第1题的(2)小题，第2题的(1)小题，第3题的(3)小题，第4题的(2)小题
复习方向
1.记忆植物组织培养的过程及原理、动物细胞培养的过程及原理、植物体细胞杂交的过程及原理、动物核移植的过程及原理、动物细胞融合和单克隆抗体的制备过程。如第1题的(1)(3)小题，第2题的(3)小题；第3题的(1)(2)(4)小题，第4题的(1)(3)小题
2.重点理解植物组织培养的结果分析、体细胞克隆和生殖细胞克隆的区别。第1题的(2)小题，第3题的(3)小题，第4题的(2)小题
[理教材·固根基]
1．比较记忆植物组织培养与动物细胞培养(填表)
项目
植物组织培养
动物细胞培养
取材
植物幼嫩部位
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
过程
结
果
获得植株个体，可以体现全能性
获得新的细胞，不形成个体，不体现全能性
条件
①无菌
②营养物质
③适宜条件
④植物激素
①无菌、无毒
②营养物质，血清等
③温度和pH
④气体环境：O2、CO2
应用
①植株快速繁殖
②脱毒植株的培养
③人工种子
④生产药物、杀虫剂等
⑤转基因植物的培育
①蛋白质生物制品的生产
②皮肤移植材料的培育
③检测有毒物质
④生理、病理、药理学的研究
2．理清克隆动物培育流程(填图)
3．比较记忆植物体细胞杂交与动物细胞融合(填表)
项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞膜的流动性
过
程
相关酶
纤维素酶和果胶酶
胰蛋白酶或胶原蛋白酶
融合
方法
物理法：离心、电激、振动；
化学法：聚乙二醇等试剂诱导
除物理法和化学法外，还可以用灭活的病毒诱导
结果
杂种植株
杂交细胞
意
义
克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能
4．准确记忆单克隆抗体的“一过程两特点”(填空)
(1)制备过程：
(2)单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高。
[练热点·会迁移]
1．回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面__________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的__________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是__________。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现________________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成____________细胞，这种细胞的黏着性__________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量__________。
(3)用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。
(5)在细胞培养过程中，通常在________________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中__________的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低。
(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作________进行攻击。
解析：(1)在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶处理可以使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来。(2)随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞，这种细胞的细胞膜表面糖蛋白减少，细胞的黏着性降低。(3)由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。(4)由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此最好选用分裂到中期的细胞用显微镜观察染色体数目。(5)由于在冷冻(或超低温、液氮)条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率很低，通常在此条件下保存细胞。(6)机体把移植的皮肤当作抗原攻击，会发生免疫排斥反应现象。
答案：(1)相互接触 接触抑制 单层(或一层) 胰蛋白酶 (2)衰老甚至死亡 不死性 降低 减少 (3)活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色(或死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色) (4)中 (5)冷冻(或超低温、液氮) 酶 (6)抗原
2．下图是通过两种途径制备抗体的流程图。请回答下列问题：
(1)过程①表示__________，细胞乙称为____________，其特点是______________________________。
(2)过程④需要________酶，过程⑥需要用________处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使该细胞处于一种____________________________的生理状态。
(3)抗体1的特点是____________________________________________；抗体1、2空间结构不同的原因是_________________________________________________________。
(4)若要检测过程⑥中导入的目的基因是否转录出了mRNA，检测方法是________________。
解析：(1)图中过程①表示小鼠骨髓瘤细胞和免疫后产生的B细胞(浆细胞)的融合过程。细胞乙增殖后能产生大量抗体，所以细胞乙是杂交瘤细胞，其特点是既能无限增殖，又能产生专一抗体。(2)过程④表示以mRNA为模板获得目的基因的逆转录过程，需要逆转录酶。过程⑥表示将基因表达载体导入受体细胞，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使之成为能够吸收DNA分子的感受态细胞。(3)抗体1是单克隆抗体，它的特点是特异性强、灵敏度高，并可以大量制备。大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，所以抗体1、2空间结构不同。(4)检测目的基因是否转录出mRNA的方法是分子杂交技术。
答案：(1)细胞融合 杂交瘤细胞 既能无限增殖，又能产生专一抗体 (2)逆转录 Ca2＋ 能够吸收周围环境中DNA分子 (3)特异性强、灵敏度高，并可以大量制备 抗体2形成过程中没有经过内质网和高尔基体的加工，抗体1形成过程中经过内质网和高尔基体的加工(合理即可) (4)分子杂交技术
[课堂强化训练]
1．(保定一模)α1抗胰蛋白酶是肝脏产生的一种糖蛋白，缺乏会引起肺气肿。某公司成功研制出转基因羊，进入泌乳期后，其乳汁中含有人类的α1抗胰蛋白酶，可用于治疗肺气肿。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，需要在肝细胞中提取______，通过逆转录产生cDNA，再通过______技术进行快速扩增。
(2)将α1抗胰蛋白酶基因与乳腺蛋白基因的________等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，然后通过____________技术，导入羊的受精卵中。
(3)受精卵通过早期胚胎培养，一般发育到____________阶段，通过胚胎移植进入受体子宫孕育。为选育出能泌乳的雌羊，移植前须从胚胎的________部位取样，做DNA分析鉴定性别。
(4)α1抗胰蛋白酶是一种结构较复杂的糖蛋白，因此用上述方法生产，相对传统的转基因大肠杆菌生产，优势在于____________________________________。
解析：(1)α1抗胰蛋白酶基因在肝细胞中表达，所以可以在肝细胞中提取mRNA，通过逆转录产生相应cDNA，再通过PCR技术扩增。(2)为了使α1抗胰蛋白酶基因在乳腺细胞中表达，需要将其与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组，构建基因表达载体，然后通过显微注射技术，导入受精卵中。(3)牛和羊的胚胎一般发育到桑椹胚或囊胚阶段，才进行胚胎移植；DNA分析鉴定性别须从胚胎的滋养层部位取样，这样既保证了遗传信息一致，又不影响内细胞团进一步发育。(4)糖蛋白的形成需要进行蛋白质的加工，相对原核细胞而言，羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力。
答案：(1)mRNA PCR (2)启动子(或启动子、终止子) 显微注射 (3)桑椹胚或囊胚 滋养层 (4)羊细胞有内质网和高尔基体，具备蛋白质加工的能力
2．紫草为常用中药材，其主要成分紫草宁及其衍生物属于萘醌类化合物，具有抗肿瘤、消炎等作用。请回答下列问题：
(1)若要通过植物组织培养的方法获得大量的紫草宁，该方法依据的原理是________________________。植物组织培养的两大步骤是__________和__________。
(2)营养因子对紫草的组织培养有影响，实验表明：葡萄糖和蔗糖可明显促进紫草宁的生产。它们的最适浓度均为6%，但葡萄糖优于蔗糖，推测原因可能是________________________________________________。
(3)紫草怕涝，而像垂柳、紫穗槐等是最耐涝植物。有科学家设想要通过植物细胞工程的方法获得可生产紫草宁的耐涝紫草，并进行大面积种植。具体方法：第一步，选择垂柳的细胞和紫草的细胞用纤维素酶和果胶酶处理后获得________________；第二步，二者融合后，诱导其再生出__________，获得杂种细胞；第三步，进行组织培养形成愈伤组织，再生出小植株，形成杂种植物，选育所需植株，移栽并推广。在选育的过程中，选择的植株需具备的两个条件是________________、__________________。
解析：(1)植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。植物组织培养需要经过脱分化和再分化过程。(2)葡萄糖是单糖，蔗糖是二糖，单糖更易被植物细胞吸收利用。(3)在进行植物体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得具有活力的原生质体；原生质体融合之后，需要诱导其再生出细胞壁。根据题意，选育时应该选择可正常生长且耐涝的植株，并且还要能产生紫草宁。
答案：(1)植物细胞的全能性 脱分化 再分化 (2)葡萄糖为单糖，更容易被植物细胞吸收利用(合理即可) (3)原生质体 细胞壁 可正常生长并且耐涝 可以产生紫草宁
3．(临沂模拟)DHA对脑神经发育至关重要。以A、B两种单细胞真核藻为亲本，利用细胞融合技术选育高产DHA融合藻。两种藻特性如下表。
亲本藻
优势代谢类型
生长速率[g/(L·d)]
固体培养基上菌落直径
DHA含量(%)
A藻
自养
0.06
小
0.7
B藻
异养
0.14
大
无
据表回答：
(1)选育的融合藻应具有A藻________________与B藻______________的优点。
(2)诱导融合前需用纤维素酶处理两种藻，其目的是获得______________。
(3)通过以下a、b、c三步筛选融合藻，步骤________可淘汰B藻，步骤________可淘汰生长速率较慢的藻落，再通过步骤________获取生产所需的融合藻。
步骤a：观察藻落的大小；
步骤b：用不含有机碳源(碳源——生物生长的碳素来源)的培养基进行光照培养；
步骤c：测定DHA含量。
(4)以获得的融合藻为材料进行甲、乙、丙三组实验，结果如下图。
与甲、丙两组相比，乙组融合藻生长速率较快，原因是在该培养条件下________________________________________________________________________。
甲、乙两组DHA产量均较高，但实际生产中往往采用甲组的培养条件，其原因是____________________________________________________________________________。
解析：(1)由表格信息可知，选育的融合藻要具有A藻的自养且能产生DHA的特性，还要具有B藻的生长速率快的特点。(2)藻类具有细胞壁，用纤维素酶可除去其细胞壁又不会损伤原生质体，由此可推知用纤维素酶处理的目的是获得原生质体。(3)用不含有机碳源的培养基进行光照培养可淘汰B藻和BB融合型藻类，观察藻落的大小，可淘汰生长速率较慢的藻落，再通过测定DHA含量的步骤获取生产所需的融合藻。(4)与甲、丙两组相比，乙组融合藻生长速率较快，原因是在光照、添加葡萄糖的培养条件下融合藻既能光能自养，又能异养。甲、乙两组DHA产量均较高，但实际生产中往往采用甲组的培养条件，因为融合藻利用光能和简单的无机物即能生长，不需添加葡萄糖，可降低成本，同时也可防止杂菌生长(因为多数细菌是异养型的)。
答案：(1)产生DHA、自养特性 快速生长 (2)原生质体 (3)b a c (4)融合藻既能光能自养又能异养 融合藻利用光能和简单的无机物即能生长，不需要添加葡萄糖，可降低成本，也可防止杂菌生长
[课后检测·增分强训]
1．(南充模拟)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：
(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的________序列发生改变。
(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作____________________________________。
(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的________，以其作为模板，在________酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。
(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
解析：(1)患者的血红蛋白分子β肽链第6位的谷氨酸变成了缬氨酸，此氨基酸的变化是由于控制合成血红蛋白分子的DNA的碱基序列发生了改变，从而导致了mRNA上密码子的改变。(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作没有对现有的蛋白质进行改造，不属于蛋白质工程。(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的RNA，以其作为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和DNA连接酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(4)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，用相应的抗体进行抗原—抗体特异性杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
答案：(1)碱基(脱氧核苷酸) (2)不属于 没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰) (3)mRNA 逆转录 DNA连接 (4)蛋白质 抗原—抗体
2．(内江一模)干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染和癌症。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性只有天然产品的十分之一，且体外保存相当困难。研究发现若将第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸，生产出的干扰素的抗病毒活性是原来的100倍，并且在－70 ℃的条件下，可以保存半年，给广大患者带来福音。
(1)从上述资料可知，若要改变干扰素的功能，可以考虑对于扰素________________进行改造。
(2)对干扰素进行改造，应该直接对________________(填“干扰素分子”或“干扰素的cDNA”)进行操作来实现，原因是________________________________________________。
(3)与蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产________________的蛋白质，不一定符合生产和生活的需要，而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过____________或____________，得到符合要求的________，再通过____________(填生理过程)实现相应蛋白质的合成，满足生产和生活需要。
解析：(1)从上述资料可知，若将第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸，生产出的干扰素的抗病毒活性是原来的100倍，故若要改变干扰素的功能，可以考虑对干扰素氨基酸序列进行改造。(2)对干扰素进行改造，应该直接对干扰素的cDNA进行操作来实现，原因是①蛋白质的结构由基因决定，蛋白质不能直接遗传，基因可以遗传；②对基因的改造比对蛋白质的改造要容易。(3)与蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，不一定符合生产和生活的需要，而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过基因修饰或基因合成，得到符合要求的基因，再通过转录和翻译实现相应蛋白质的合成，满足生产和生活需要。
答案：(1)氨基酸序列 (2)干扰素的cDNA ①蛋白质的结构由基因决定，蛋白质不能直接遗传，基因可以遗传；②对基因的改造比对蛋白质的改造要容易 (3)自然界已存在 基因修饰 基因合成 基因 转录和翻译
3．(华南师大附中三模)华蟾素是我国经典抗肿瘤药物。研究人员为探寻华蟾素注射液抗肝癌细胞的作用机理，进行了一系列实验。请回答下列问题：
Ⅰ.肝癌细胞的培养：
(1)培养肝癌细胞时，在培养基中加入适量的__________以补充合成培养基中缺乏的物质，为防止培养过程发生污染要加入___________。此外，每48 h更换1次培养液，目的是_____________________________________；同时还要提供适宜的温度、_________、氧气和二氧化碳等环境条件。
Ⅱ.探究华蟾素药效作用机理的实验：
(2)DNA拓扑异构酶Ⅱ(简称TopoⅡ)为真核生物所必需，在DNA复制、转录等方面发挥重要作用，TopoⅡ在肿瘤细胞中含量明显高于正常细胞。华蟾素注射液处理细胞48 h后，采用逆转录—聚合酶链式反应技术检测TopoⅡ基因的表达情况，结果如表。
华蟾素浓度(μg/mL)
0
0.10
0.20
0.40
TopoⅡ基因表达量
＋＋＋＋＋
＋＋＋＋
＋＋
＋
①逆转录—聚合酶链式反应的主要原理是：提取肝癌细胞中的总RNA，在___________酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，为完成该反应还需要添加________________________________________________________________________。
②由上可知，华蟾素注射液在分子水平上影响肝癌细胞的机理是________________________________________________________________________。
解析：(1)在动物细胞培养时，所需的营养物质有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，将这些物质按其类别和所需的数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需要加入血清、血浆等一些天然成分；为防止培养过程发生污染需要在培养基加入抗生素；为了防止代谢物积累对细胞自身造成危害，还要定时更换培养液；同时还要提供适宜的温度、pH、氧气和二氧化碳等环境条件。(2)①逆转录需要以提取的mRNA为模板，以游离的脱氧核苷酸为原料，在逆转录酶的催化下合成cDNA。进行PCR扩增时需要准备四类物质：模板(cDNA)、原料(四种脱氧核苷酸)、引物和Taq酶。②由题干信息和表中实验结果可知，华蟾素注射液在分子水平上影响肝癌细胞的机理是抑制TopoⅡ基因的转录，最终导致TopoⅡ含量降低。
答案：(1)血清(血浆) 抗生素 提供营养物质和防止代谢物积累对细胞自身造成危害 pH (2)①逆转录 引物、耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)和四种脱氧核苷酸 ②抑制TopoⅡ基因的转录，最终导致TopoⅡ含量降低
4．(南京三模)图1是利用两种不同生物技术将小鼠培育成大鼠的过程。图2中质粒是基因工程中常用的质粒pIJ702，其中tsr为硫链丝菌素抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限制酶ClaⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SphⅠ在pIJ702上分别只有一处识别序列。
pIJ702
pZHZ8
BglⅡ
5.7 kb
6.7 kb
ClaⅠ
5.7 kb
2.2 kb,4.5 kb
PstⅠ
5.7 kb
1.6 kb,5.1 kb
(1)图1中应用到的生物工程技术有_______________________。c分子称为__________，其上的生长激素基因表达产物的受体分布在丁鼠的全身细胞的______________。
(2)若大鼠甲和大鼠乙体内X染色体上均带有某种致病基因，则培育出的大鼠丙和大鼠丁携带致病基因的是______________(不考虑基因突变)。
(3)用SacⅠ和SphⅠ同时切割大鼠生长激素基因和质粒pIJ702，获取的目的基因去置换pIJ702上0.4 kb的片段，构成重组质粒pZHZ8。上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表中。由此判断目的基因的片段长度为_____________kb。参照表中数据，如果用PstⅠ和ClaⅠ同时酶切重组质粒pZHZ8，则两种酶可将pZHZ8切成______个片段。
(4)重组质粒pZHZ8上的标记基因是______________，在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰________色的菌落。
解析：(1)图1中技术Ⅰ为核移植技术，技术Ⅱ为转基因技术，应用到的生物工程技术有核移植技术、转基因技术、胚胎移植技术、动物细胞培养技术。c分子称为基因表达载体(重组DNA分子或重组质粒)，生长激素通过和细胞膜表面的受体结合调节细胞代谢。(2)大鼠甲体内X染色体上带有的某种致病基因会随细胞核传给大鼠丙，大鼠乙只为大鼠丁提供生长激素基因，丁不携带大鼠乙体内X染色体上携带的致病基因。(3)用SacⅠ和SphⅠ同时切割大鼠生长激素基因和质粒pIJ702，获取的目的基因去置换pIJ702上0.4 kb的片段，构成重组质粒pZHZ8。据表可知重组质粒pZHZ8比原质粒增加1.0 kb，说明目的基因的片段长度为0.4＋1.0＝1.4 (kb)。据表可知，PstⅠ和ClaⅠ在重组质粒pZHZ8上均具有两个酶切位点，则两种酶同时酶切重组质粒pZHZ8，可将pZHZ8切成4个片段。(4)黑色素合成基因mel会被破坏，重组质粒pZHZ8上的标记基因是tsr基因(硫链丝菌素抗性基因)，在含硫链丝菌素固体培养基上培养后，筛选过程中要淘汰黑色的菌落。
答案：(1)核移植技术、转基因技术、胚胎移植技术、动物细胞培养技术 基因表达载体(重组DNA分子或重组质粒) 细胞膜上 (2)大鼠丙携带，丁不携带 (3)1.4 4 (4)tsr基因(硫链丝菌素抗性基因) 黑
5．(山东名校联考)人的成纤维细胞与小鼠细胞进行融合获得部分杂种细胞，杂种细胞中人类染色体会随机丢失，各种杂种细胞保留人类染色体的种类和数量是不同的，由此可以分离得到许多种杂种细胞。请回答下列问题：
(1)诱导动物细胞融合常用的诱导因素有______________________(至少写出两种)。细胞融合体现了细胞膜的________。
(2)在培养容器中，诱导两类细胞两两融合，在加入诱导剂后，培养液中应该存在________种细胞。若只考虑人的成纤维细胞与鼠细胞两两融合形成的杂种细胞，假如每种杂种细胞只保留了人的1条染色体，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞最多可能有________种。
(3)培养杂种细胞的过程中，细胞需置于含CO2的混合气体的培养箱中培养，CO2的主要作用是维持培养液的________。
(4)动物细胞的培养相对植物细胞培养要困难得多，一般培养动物细胞时在培养基中必须要加入________，而培养植物细胞则不需要。
(5)运用细胞融合技术还可以进行____________的制备，请列举一项关于该物质的应用：______________________________________。
解析：(1)动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。细胞融合体现了细胞膜的流动性。(2)培养液中存在人—人融合细胞，人—鼠融合细胞，鼠—鼠融合细胞，以及没有融合的人成纤维细胞和小鼠细胞，共5种。人体细胞含有23对染色体，共有24种染色体(22种常染色体＋X＋Y)，所以当每种杂种细胞只保留了人的1条染色体时，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞最多可能有24种。(3)进行动物细胞培养时，需将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体培养箱中，CO2的主要作用是维持培养液的pH。(4)培养动物细胞时通常需要在培养基中加入血清、血浆等一些天然成分，而植物细胞培养则不需要。(5)运用细胞融合技术可以进行单克隆抗体的制备，单克隆抗体可以作为诊断试剂，也可以用于治疗疾病和运载药物。
答案：(1)聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激 流动性 (2)5 24 (3)pH (4)血清、血浆 (5)单克隆抗体 作为诊断试剂(或用于治疗疾病和运载药物)
6．青岛“崂山奶山羊乳腺生物反应器的研制”项目生产的药用蛋白具有表达效率高、成本低、安全性高、易于分离纯化的优点，可产生乙肝表面抗原及抗凝血酶Ⅲ等医药产品，造福人类。据图回答下列问题：
(1)在基因工程中，A表示____________，如果直接从苏云金芽孢杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶区别于其他酶的特点是_________________________________________。
(2)在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用________对目的基因进行扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶有____________________。
(3)将目的基因导入玉米(玉米是单子叶植物)受体细胞的过程中，在③过程中一般采用____________，在②过程中一般采用______________。
(4)由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其乳汁中是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么？___________________________________________。
解析：(1)在基因工程中，A表示目的基因。限制酶的作用特点是一种该酶(或限制酶)只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子。(2)目的基因的扩增用PCR技术，然后将目的基因与载体(或质粒)组合形成重组质粒，该重组的过程需要用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶。(3)③过程表示目的基因导入单子叶植物细胞，一般使用基因枪法；②过程表示目的基因导入动物受体细胞(受精卵)中，一般采用显微注射法。(4)在分子水平上检测转基因山羊的乳汁中是否存在药用蛋白的方法是用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。如果出现杂交带，表明乳汁中出现了药用蛋白；如果不出现杂交带，表明乳汁中未出现药用蛋白。
答案：(1)目的基因 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子 (2)PCR技术 限制酶、DNA连接酶 (3)基因枪法 显微注射法
(4)从转基因山羊的乳汁中提取蛋白质，用特异性抗体进行抗原—抗体杂交；如果出现杂交带，表明乳汁中出现了药用蛋白；如果不出现杂交带，表明乳汁中未出现药用蛋白
7．(海南高考)甲、乙两同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：
(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是____________________________________。
(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入了一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到________________。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是____________________(填“具有完整的细胞核”“具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。
(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是________________________。A中的愈伤组织是叶肉细胞经________形成的。
(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法来繁殖，在培养时，________(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是__________________________________________。
解析：(1)植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性。(2)蔗糖是一种二糖，可水解生成葡萄糖和果糖。具有完整细胞核的细胞才能作为材料进行组织培养获得幼苗。(3)植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的比值影响培养的结果，当二者比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成；比例适中时，促进愈伤组织的形成。A中的愈伤组织是经脱分化形成的。(4)要用组织培养方法获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，培养时不能采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，因为对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株。
答案：(1)绿色叶片和白色花瓣的细胞都具有全能性，在一定条件下能发育成完整的植株 (2)葡萄糖、果糖 具有完整的细胞核 (3)细胞分裂素、生长素 脱分化
(4)不能 对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株
8．(绵阳二诊)“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，由单克隆抗体与药物配合而成。单克隆抗体能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。单克隆抗体的制备过程如图所示，分析回答下列问题：
(1)图中A过程是从小鼠的脾脏中取得________细胞，提取该细胞之前，给小鼠注射的特定物质相当于________；B过程得到的杂交瘤细胞的特点是________________________________。
(2)体外培养杂交瘤细胞的培养基与用于植物组织培养的培养基在物理性质上的主要区别是前者要用________________，从培养基的成分来看，前者培养基中除了添加必要的营养物质外还需要加入含天然成分的__________________。
(3)特异性抗体也可以通过常规方法来制备：向动物反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物的血清中分离所需抗体。与这种常规方法相比，单克隆抗体具有__________________________________(答出三点即可)等优点。制备单克隆抗体的过程中至少需要________次对细胞的筛选。
解析：(1)A过程是从已产生免疫反应(注射特定的抗原)的小鼠脾脏中取得B淋巴(浆)细胞；杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。(2)从物理性质上看，体外培养杂交瘤细胞用液体培养基，植物组织培养用固体培养基；体外培养动物细胞的培养基需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常还需要加入血清、血浆等一些天然成分。(3)单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高，并可以大量制备。制备单克隆抗体的过程中至少需要两次筛选，第1次筛选出杂交瘤细胞，第2次筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
答案：(1)B淋巴(浆) 抗原 能产生抗体和无限增殖
(2)液体培养基 动物血清、血浆
(3)特异性强、灵敏度高，并可以大量制备 两
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