2020年高考生物一轮复习讲义：选修3第十单元第35讲基因工程

第35讲　基因工程

[考纲明细]　1.基因工程的诞生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)　3.基因工程的应用(Ⅱ)　4.蛋白质工程(Ⅰ)　实验：DNA的粗提取与鉴定

知识自主梳理

一、基因工程的概念及基本工具

1．基因工程概念

2．DNA重组技术的基本工具

(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)

①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

②作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

③结果：产生黏性末端或平末端。

例：如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是—CCCGGG—，切割位点在C和G之间；说明限制酶具有特异性。

④本质：蛋白质。

[深入思考]　限制酶为何不切割自身DNA?

提示　限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

(2)DNA连接酶

①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

②类型

③DNA连接酶和限制酶的关系

(3)载体

①载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。

②常用载体：质粒。其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。

③质粒

a．概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。

b．特点：能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

二、基因工程的基本操作程序

1．目的基因的获取

目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。

(1)从基因文库中获取

①前提条件：目的基因序列未知。

②基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，可分为基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库)。

③构建过程

(2)利用PCR技术扩增目的基因

①PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

②PCR原理：DNA双链复制。

③前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

④要求

模板：目的基因两条链。

原料：四种脱氧核苷酸。

酶：热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。

引物：人工合成的两条DNA片段(引物1，引物2)。

⑤PCR反应过程

⑥方式：指数形式扩增(2n，n为扩增循环的次数)。

⑦结果：短时间内大量扩增目的基因。

(3)人工合成

①前提条件：核苷酸序列已知，基因比较小。

②方法

a．反转录法：目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(目的基因)

b．化学合成法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因

2．基因表达载体的构建——基因工程的核心

(1)操作目的

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

(2)组成

(3)构建过程

[深入思考]　获取目的基因与切割载体时只能用同一种限制酶吗？

提示　不是只能用一种限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和载体的黏性末端相同即可。

3．将目的基因导入受体细胞

(1)将目的基因导入植物细胞

①农杆菌转化法：最常用的方法。

a．受体细胞：植物体细胞或受精卵。

b．操作过程：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上―→转入农杆菌―→导入植物细胞―→T­DNA上的目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上―→目的基因表达。

②基因枪法：适用于单子叶植物，成本较高。

③花粉管通道法：将目的基因通过花粉管通道导入受体细胞，十分简便经济。

(2)将目的基因导入动物细胞

①方法：显微注射技术。

②受体细胞：动物的受精卵。

③操作过程：将含有目的基因的表达载体提纯―→取卵(受精卵)―→显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内―→获得具有新性状的动物。

[深入思考]　获得转基因动物时，通常选择受精卵做受体细胞的原因？

提示　受精卵全能性高，可使目的基因在相应的组织细胞内表达。

(3)将目的基因导入微生物细胞

①转化方法

a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。

b．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。

②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。

③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

4．目的基因的检测与鉴定

(1)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。

(2)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。

三、基因工程的应用

1．转基因植物

植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。

2．转基因动物

动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。

3．基因工程药物

(1)来源：转基因的工程菌。

(2)成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。

(3)作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。

4．基因治疗

(1)方法：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。

(2)效果：治疗遗传病的最有效的手段。

(3)分类：体内基因治疗和体外基因治疗。

四、蛋白质工程

1．概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。

2．基本途径：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)。

考点题型突破

考点1　　基因工程的操作工具

题型一 限制性核酸内切酶及DNA连接酶等酶的作用

1．(2016·全国卷Ⅲ)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________

_________________________________________________________。

(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图c所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是____________

________________________________________________________。

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________。

答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端

(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)

(3)E·coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(其他合理答案也可)

解析　(1)分析图a可知，限制酶Sau3A Ⅰ与BamH Ⅰ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。

(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被转录。

(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

知识拓展

与DNA相关的六种酶的比较

题型二 载体的作用及特点

2．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________________________________________________；并且____________和____________________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是_______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________________的固体培养基。

(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于______________。

答案　(1)能自我复制、具有标记基因

(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素

(3)受体细胞

解析　(1)质粒作为载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。

(2)由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因(四环素抗性基因被破坏)，所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能，所以可用含有四环素的培养基，筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。

(3)噬菌体属于病毒，病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。

考点2　　基因工程的基本操作程序

题型一 目的基因的获取

1．基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：

Ⅰ.(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即________和从________中分离。

(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是________________________。

(3)在基因表达载体中，启动子是________聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是________。

Ⅱ.将外源生长激素基因导入绵羊体内，转基因绵羊的生长速度比一般绵羊提高30%，体型增大50%。外源生长激素基因除可以从基因组文库中获取外，还可通过以下途径合成：一是利用从供体动物的________细胞中提取的mRNA，在________酶催化下合成；二是通过分析生长激素的________序列推测基因的结构，进而人工合成。这两种途径合成的生长激素基因________(填“相同”或“不同”)，原因是_____________________________________________________。

答案　Ⅰ.(1)人工合成　已有物种

(2)cDNA文库中只含有叶片细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因

(3)RNA　大肠杆菌

Ⅱ.垂体　逆转录　氨基酸　不同　一种氨基酸可能不只由一种密码子决定(密码子的简并性)

解析　Ⅰ.(1)获取目的基因的途径，一是人工合成，二是从自然界已有物种中分离。

(2)基因组文库中含有该植物的所有基因，而cDNA文库中只含有已经转录的基因。

(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位；最常用的原核生物受体细胞是大肠杆菌。

Ⅱ.生长激素是垂体合成分泌的，故只有在垂体细胞中才能提取到生长激素基因转录形成的mRNA，再在逆转录酶的催化作用下合成生长激素基因；也可以通过分析生长激素的氨基酸序列，推测出其mRNA中的碱基序列，进而推测出生长激素基因中的碱基序列，最后用化学方法人工合成。因为决定氨基酸的密码子具有简并性，因而这两种方法合成的生长激素基因结构可能不同。

技法提升

获取目的基因的方法选择

(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。

(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。

(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过PCR技术扩增目的基因。

题型二 PCR技术原理及应用

2．多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是(　　)

A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术

B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板

C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增

D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变

答案　C

解析　PCR技术是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，所需原料是脱氧核苷酸，并以指数方式扩增，B正确，C错误。

3．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。

(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的____________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________，而造成引物自连。

(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。

(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。

答案　(1)逆转录　cDNA

(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对

(3)变性

(4)引物与模板　GC含量高

(5)②③

解析　(1)目的基因的获取：从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR的扩增。

(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便基因与载体相连构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。

(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。

(4)退火温度过高，会破坏引物与模板的碱基配对。因A、T之间形成两个氢键，G、C之间形成三个氢键，形成G、C碱基对需要更多的能量，故需要更高的温度。

(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板结合。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。

知识拓展

PCR技术与体内DNA复制的异同点

题型三 基因表达载体的构建

4．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是(　　)

①一个表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子

②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA

③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止

④所有基因表达载体的构建是完全相同的

A．②③  B．①②  C．①④  D．③④

答案　C

解析　一个表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，①错误；启动子能启动转录过程，即有了启动子才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，③正确；不同的基因表达载体构建方法不同，④错误。综上所述，C符合题意。

5．(2016·江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌中。

(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________________________。

(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。

(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。

答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA连接　感受

(2)四环素　引物甲和引物丙

(3)　都不能

(4)7

解析　(1)由题图可知，质粒的两个标记基因中都含有BamHⅠ的切点，因此不能用BamHⅠ进行切割，结合题干及表中信息可知质粒中不含Sau3AⅠ的切点，因此也不能用Sau3AⅠ进行切割，所以只能用质粒中和目的基因两端都含有切点的BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。要将重组质粒转入大肠杆菌，要先用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态。

(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，含有重组质粒的大肠杆菌能在该平板上长出菌落。要用PCR扩增目的基因，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，因为从图2中可以看出，引物甲与引物丙与模板链结合后能完成目的基因的复制。

(3)BamHⅠ酶切的DNA末端是，BclⅠ酶切的DNA末端是，这两个末端连接后的连接部位的6个碱基对序列为，由于连接后的6个碱基对序列中没有BamHⅠ和BclⅠ能识别的酶切位点，故对于该部位BamHⅠ和BclⅠ都不能将其切开。

(4)因为质粒的BamHⅠ和BclⅠ识别序列中都有Sau3AⅠ的识别序列和切割位点，所以用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ切点及得到的7种大小不同的DNA片段情况如下：①切点在1或2或3的位置可以分别得到1种DNA分子，但其大小相同；②切点在1和2的位置可以得到2种DNA分子；③切点在1和3的位置可以得到2种DNA分子；④切点在2和3的位置可以得到2种DNA分子，故最多可能获得7种大小不同的DNA片段。

技法提升

1.基因表达载体构建时限制酶的选择

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。

2.基因表达载体中启动子、终止子的来源

(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。

(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。

题型四 目的基因的导入与检测

6．下面为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　)

A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与

B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上

C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状

D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异

答案　D

解析　构建重组质粒需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，A错误；含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的T­DNA整合到受体细胞的染色体上，而不是重组Ti质粒整合到受体细胞的染色体上，B错误；导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状，C错误；⑤表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异，D正确。

7．(2019·威海模拟)科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如下图)。请据图分析回答：

(1)细菌是理想的受体细胞，这是因为它__________________。

(2)质粒A与目的基因结合时，首先需要用________酶将质粒切开“缺口”，然后用________酶将质粒与目的基因“缝合”起来。

(3)若将细菌B先接种在含有________的培养基上能生长，说明该细菌中已经导入外源质粒，但不能说明外源质粒是否成功插入目的基因；若将细菌B再重新接种在含有________的培养基上不能生长，则说明细菌B中已经导入了插入目的基因的重组质粒。

答案　(1)繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少

(2)限制性核酸内切　DNA连接

(3)氨苄青霉素　四环素

解析　(1)细菌具有繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少等优点，因此是基因工程中的理想的受体细胞。

(2)构建基因表达载体时，需先用限制酶分别切割目的基因和载体，再用DNA连接酶将两者连接起来。

(3)质粒A和重组质粒中都有完整的氨苄青霉素抗性基因，因此细菌有氨苄青霉素抗性说明该细菌中已经导入外源质粒，但不能说明外源质粒是否成功插入目的基因；重组质粒中四环素抗性基因内插入了目的基因，不能表达，因此若细菌再对四环素无抗性，则说明细菌B中已经导入了插入目的基因的重组质粒。

技法提升

如何筛选出含有目的基因的受体细胞

(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。

(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。

(3)筛选方法：将含有重组质粒的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

考点3　基因工程的应用及蛋白质工程

题型一 基因工程的应用

1．(2018·山东聊城二模)普通番茄细胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(简称PG)，PG能破坏细胞壁使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。如图表示抗PG基因的作用原理，回答下列问题：

(1)据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是______________________________。

(2)为培育抗软化番茄，应采用________技术将抗PG基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入________，这个基因的表达需要________等不可缺少的调控组件。

(3)将抗PG基因插入Ti质粒的________上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功表达，在个体生物学水平上应检测______________________。

(4)为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入________(填“细胞核”或“细胞质”)。

答案　(1)抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG

(2)PCR(多聚酶链式反应)　热稳定DNA聚合酶(Taq酶)　启动子、终止子

(3)T－DNA　转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短

(4)细胞质

解析　(1)据题图可知，抗PG基因转录成的mRNA能够与PG基因转录成的mRNA结合，阻止了PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG，不能破坏细胞壁而使转基因番茄抗软化且保鲜时间延长。

(2)采用PCR技术将抗PG基因进行体外扩增；PCR过程所需要的条件有：模板(抗PG基因)、引物、原料(四种游离的脱氧核糖核苷酸)、热稳定DNA聚合酶；启动子、终止子等是基因表达不可缺少的调控组件。

(3)将抗PG基因插入Ti质粒的T－DNA上构建基因表达载体，通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功表达，在个体生物学水平上应检测转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短。

(4)花粉中的雄配子几乎不含质基因，所以为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入细胞质。

题后归纳

有关基因工程应用的四个易错点

(1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。

(2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。

(3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。

(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。

题型二 蛋白质工程

2．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：

(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。

(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________。

(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。

答案　(1)氨基酸序列(或结构)

(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)

(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能

解析　(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸序列进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。

(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。所获得的基因表达遵循中心法则时，中心法则的全部内容包括DNA和RNA复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白质。

(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。

知识拓展

蛋白质工程与基因工程的比较

实验16　　DNA的粗提取与鉴定

1．DNA粗提取和鉴定的原理

(1)提取思路：利用DNA和其他物质在理化性质方面的差异，提取DNA。

(2)DNA的理化性质(提取和鉴定原理)：

①DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同

②DNA不溶于酒精；

③对酶、高温和洗涤剂的耐受性强；

④DNA＋二苯胺试剂蓝色。

2．DNA粗提取和鉴定的操作流程

1．(2018·扬州江都中学段考)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)

A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水

B．向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了释放出DNA

C．向浓盐溶液中加蒸馏水是为了析出DNA

D．用菜花替代鸡血做实验，其实验操作步骤相同

答案　D

解析　DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了让鸡血细胞吸水涨破，从而释放出DNA，B正确；向溶解DNA的浓盐溶液中加蒸馏水是为了降低DNA的溶解度，进而析出DNA，C正确；用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤不完全相同，如植物细胞有细胞壁，破碎细胞时需要充分搅拌和研磨并加入食盐和洗涤剂，D错误。

2．下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验依据原理的叙述，错误的是(　　)

A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白质能溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离

B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离

C．利用二苯胺与DNA沸水浴呈现蓝色可用于DNA的鉴定

D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离

答案　B

解析　高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在60～80 ℃发生变性，而DNA在80 ℃以上才变性，不能将DNA与蛋白质分离。

3．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)

答案　A

解析　蒸馏水与鸡血细胞混合的目的是使红细胞吸水涨破，释放出核物质，B错误；将蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C错误；加入冷却酒精的目的是进一步析出DNA，D错误。

题后归纳

DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”

方向真题体验

1．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：

(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是____________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证__________________。

(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。

(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________________________中、体外培养、胚胎移植等。

(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。

答案　(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接

(2)转录　翻译

(3)细胞核　去核卵母细胞

(4)核DNA

解析　(1)甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。

(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。

(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。

(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。

2．(2018·江苏高考)为生产具有特定性能的α－淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656个碱基对)，利用基因工程大量制备α－淀粉酶，实验流程如图。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增α－淀粉酶基因前，需先获得细菌的________。

(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________。

(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)

①变性温度　②退火温度　③延伸温度　④变性时间

⑤退火时间　⑥延伸时间

(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α－淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：

5′－U……－3′

图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。

(5)获得工程菌表达的α－淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：

根据上述实验结果，初步判断该α－淀粉酶活性最高的条件为____________________________________________________。

答案　(1)基因组DNA

(2)5′　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连

(3)②　⑥　(4)8　13

(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tirs－HCl

解析　(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α－淀粉酶基因，因此在扩增α－淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。

(2)由于引物的作用是引导子链的延伸，将脱氧核苷酸连接到引物上时，是与引物的3′端相连的，由此确定需在引物的5′端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，防止自身相连。

(3)进行PCR扩增时，退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。

(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基，该mRNA 上5′端为AUG(起始密码子)，因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基，可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子的第一个碱基已经固定为U，因此还有2个碱基未知，共可能有的种数为4×4＝16，又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子，因此决定氨基酸的密码子最多有13种。

(5)据表格数据可知：α－淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl的条件下相对活性为99.5%，初步判断此条件下酶活性最高。

3．(2018·天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。

(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒，并保存。

(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。

(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。

A．病毒的DNA聚合酶  B．宿主的DNA聚合酶

C．病毒的RNA聚合酶  D．宿主的RNA聚合酶

(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。

答案　(1)PCR　多肽(或蛋白质)

(2)载体　总RNA

(3)非天然氨基酸(Uaa)　D

(4)细胞

解析　(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列，则改造后的基因转录合成的mRNA中，终止密码子提前出现，将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。

(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。

(3)由(2)知，转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA，该tRNA的反密码子可与终止密码子配对，并可携带非天然氨基酸(Uaa)，所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时，识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。

(4)因该病毒疫苗具有侵染性，故可引起细胞免疫。

4．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：

(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_____________________(答出两点即可)。

(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是____________。

(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。

答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达

(2)转化　外壳蛋白(噬菌体蛋白)　细菌

(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶

解析　(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。

(2)用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以增大细胞膜的通透性，使重组的质粒更容易导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞。噬菌体主要寄生在细菌体内，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。

(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。

5．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：

(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是____________________________

________________________________________________________。

(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是

_________________________________________________________。

(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有

____________________________________________________________(答出两点即可)等优点。

(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。

(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是

_________________________________________________________。

答案　(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A

(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕

(3)繁殖快、容易培养

(4)蛋白A的抗体

(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体

解析　(1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。

(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。

(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。

(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用相应的抗体即蛋白A的抗体进行抗原—抗体杂交。

(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。