清单04 PCR 专题 一案搞定PCR-备战2025年高考生物二轮热点背练清单（新高考通用）

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1.【PCR基因定点突变】重叠延伸PCR
有个地方不清楚 可沿引物3 引物4 3´端延伸
我直接拿手写这样方便大家熟悉这个过程，以免高考题出信息情境题，所以这个方法还是要了解一下流程。
2.(实时)荧光定量PCR技术
先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。
3.RT-PCR技术
如果想克隆一段已知mRNA序列的cDNA，可使用反转录酶PCR（reverse transcrip1 ase PCR，RT-PCR）技术。RT-PCR与刚才介绍的PCR技术的主要区别在于它是从mRNA而不是双链DNA开始的。先利用反向引物在反转录酶催化下将mRNA反转录成单链DNA；DNA-RNA杂交链变性后，再用正向引物将单链DNA转换成双链DNA；接着在DNA聚合酶催化下，正向引物起始cDNA第二链合成，将单链DNA转换成双链DNA；最后用常规PCR技术扩增足量的cDNA用于克隆。
一、单选题
1．（24-25高三上·天津·阶段练习）某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对不同个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部两条带是一对等位基因的扩增产物，下部两条带是另一对等位基因的扩增产物，这两对等位基因位于非同源染色体上。下列相关叙述错误的是（ ）
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有三条带
C．①自交子代的PCR产物电泳结果有1/2与④电泳结果相同
D．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
【答案】C
【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
【详解】A、由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A、a分别为上部两条带的等位基因，B、b分别为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1为AAbb，P2为aaBB，F1为AaBb，F2中①基因型为AaBB，②基因型为Aabb，都为杂合子，F2中③基因型为AABb，占F2的比例为2/16，⑤基因型为AABB，占F2的比例为1/16，故F2中③所占比例大于⑤，A正确；
B、由电泳图可知，F2中①～⑧基因型依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有三条带，B正确；
C、由电泳图可知，①基因型为AaBB，自交子代为AABB（占比为1/4）、AaBB（占比为2/4）、aaBB（占比为1/4），因此①自交子代的PCR产物电泳结果有1/4与④（aaBB）电泳结果相同，C错误。
D、由电泳图可知，③基因型为AABb和⑦基因型为aabb，杂交后代为Aabb、 AaBb，其PCR产物电泳结果与②（Aabb）、⑧（AaBb）电泳结果相同，D正确；
故选C。
2．（24-25高三上·湖北·期中）图1是某单基因遗传病的遗传系谱图，该病在人群中的发病率为1/8100。科研人员提取了四名女性的DNA，用PCR扩增了与此病相关的基因片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。相关叙述正确的是（ ）
A．该病的遗传方式可能为伴X染色体隐性遗传
B．Ⅱ-1与Ⅱ-2婚配生一个患病男孩的概率为1/91
C．该突变基因新增的酶切位点可能位于310bp或118bp中
D．扩增Ⅱ-2与此病相关的基因片段，酶切后电泳将产生3种条带
【答案】D
【分析】分析图1，Ⅰ-1和Ⅰ-2表现正常，但生下了Ⅱ-2的患病女性，所以该病是常染色体隐性遗传病，用A/a表示控制该病的基因，所以，Ⅰ-1和Ⅰ-2基因型是Aa。从图2中可以看出，Ⅱ-3、Ⅱ-4和Ⅰ-2电泳图相同，所以基因型都是Aa，Ⅱ-5与他们不同，但表现正常，基因型是AA。
【详解】A、Ⅰ-1和Ⅰ-2表现正常，但生下了Ⅱ-2的患病女性，所以该病是常染色体隐性遗传病，A错误；
B、该病在人群中的患病率为1/8100，则致病基因频率为1/90，正常基因频率为89/90，根据基因平衡定律，Ⅱ-1表现正常，基因型为Aa的概率=Aa/（AA+Aa）=(2×A基因频率×a基因频率)/(A基因频率×A基因频率+2×A基因频率×a基因频率)=(2×1/90×89/90)/（1/90×1/90+2×1/90×89/90）=2/91，其与Ⅱ-2Aa婚配生一个患病男孩的概率为2/91×1/4=1/182，B错误；
C、结合图2可知，正常基因酶切后可形成长度为310bp和118bp的两种DNA片段，而基因突变酶切后可形成长度为217bp、93bp和118bp的三种DNA片段，这说明突变基因新增的酶切位点位于长度为310bp（217+93）的DNA片段中，C错误；
D、基因突变酶切后可形成长度为217bp、93bp和118bp的三种DNA片段，Ⅱ-2基因型是aa，只含有突变基因，所以酶切后电泳将产生三种条带，D正确。
故选D。
3．（23-24高三上·浙江·阶段练习）实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）是指先逆转录得到DNA，然后进行PCR扩增。加入的Taqman荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，每复制一次，就有一个荧光分子生成，当荧光强度达到一定程度就可以被仪器检测到，原理如图所示。下列叙述错误的是（ ）
（注：Ct值是指PCR扩增过程中，缓冲液中的荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。）
A．图中的TaqDNA聚合酶具有5´外切酶活性
B．荧光报告基团连接在Taqman探针的5´端
C．该PCR过程只需要加入1种足量的引物
D．Ct值越小，说明体系中目标RNA越多
【答案】C
【分析】实时荧光定量PCR技术中，TaqDNA聚合酶有两个作用，一是形成子链的磷酸二酯键，二是水解探针，破坏磷酸二酯键；破坏探针导致荧光出现。
【详解】A、在该反应中TaqDNA聚合酶有两个作用，一是形成子链的磷酸二酯键，二是水解探针，破坏磷酸二酯键，R端是5'端，TaqDNA聚合酶具有5´外切酶活性，A正确；
B、因为引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，从图中引物的方向可以分析出，荧光报告基团连接在Taqman探针的5´端，B正确；
C、该PCR过程需要加入2种引物，C错误；
D、Ct值越小，达到荧光阈值所经历的循环次数越少，说明体系中目标RNA越多，D正确。
故选C。
4．（22-23高三下·河南焦作·阶段练习）RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）

A．过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中存在的碱基配对方式相同
B．图中A、B两种引物的核苷酸序列不同，但参与子链合成的酶均相同
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
【答案】D
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的简称，利用DNA复制的原理，RT-PCR需要先完成逆转录过程再进行DNA复制，逆转录和DNA复制都遵循碱基互补配对原则。
【详解】ABC、过程Ⅰ是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以mRNA为模板逆转录合成DNA的过程，催化该过程的酶是逆转录酶，存在的碱基配对方式是U—A、A—T、C—G、G—C；过程Ⅱ是DNA单链复制过程，是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以DNA单链为模板合成DNA单链的过程，催化该过程的酶为TaqDNA聚合酶，该过程中存在的碱基配对方式是A—T、G—C，ABC错误；
D、过程Ⅱ中，若进行6轮循环，最终产生的DNA单链数为26=64（条)，新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，共需要加入引物的数量为63个，D正确。
故选D。
二、多选题
5．（24-25高三上·湖北·阶段练习）某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻番茄新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物，将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中，获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是（ ）

A．过程②还需要四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA连接酶
B．过程③至少需要进行2次循环才能得到两条链等长的DNA分子
C．过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因
D．常采用显微注射法将获得的目的基因导入番茄细胞培育抗冻新品种
【答案】BC
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。 前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双 链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
【详解】A、PCR过程需要的是四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，A错误；
B、过程③扩增一次得到的是长链和短链，第二次扩增才能得到两条等长的短链，B正确；
C、根据引物的延伸方向是5＇→3＇方向，且过程④是利用已有的模板作引物，因此过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因，C正确；
D、将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，而将目的基因导入植物细胞采用农杆菌转化法或花粉管通道法，D错误。
故选BC。
三、非选择题
6．（2024·广东深圳·模拟预测）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶原蛋白的基因 kit 导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。请据图回答下列问题：
(1)若导入到原核生物大肠杆菌中，但由于原核细胞中缺少 （细胞器），影响表达产物进一步加工，可能会影响蛋白质的功能。
(2)已知 kit基因的部分序列如下图，采用PCR技术进行扩增时，选用的引物为 （填字母）。为使基因与质粒成功连接，需要在引物的 端添加 两种限制酶识别序列。
A．5'-GCCCTAGGT-3' B．5'—CGGAATTCT-3'
C． 5'-CGGGATCCA-3' D．5'—GCCTTAAGA-3'
(3)酶切 kit基因, 并与质粒中长度为170bp片段进行置换, 构建重组质粒pET-28a（+）- kit，用 Hind Ⅲ酶分别酶切pET-28a（+）和pET-28a （+）- kit，获得如下表所示片段,
则 kit基因长度为 ，由此判定 kit 基因上有 个 HindⅢ酶切位点。
(4)菌液PCR 是直接以菌体热解后的DNA 为模板、以目的基因两端序列为引物进行扩增的方法，PCR 产物需要用 法进行鉴定，若结果出现大量杂带，其原因可能有 。（答出两点）
【答案】(1)内质网、高尔基体
(2) BC 5' BamHⅠ和EcRⅠ
(3) 320bp 2
(4) 琼脂糖凝胶电泳 模板受到污染；引物的特异性不强；复性温度偏低。
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
【详解】（1）若导入到原核生物大肠杆菌中，由于原核细胞中缺少内质网、高尔基体等细胞器，这些细胞器在真核细胞中负责蛋白质的进一步加工和修饰，因此原核细胞表达的蛋白质可能会缺少某些加工步骤，从而影响蛋白质的功能。
（2）在PCR中，引物与模板链的3'端碱基互补配对，并且引物的方向与模板链走向相反，因此与图中kit 基因上面一条链结合的引物，其序列应为5'-CGGAATTCT-3'，与kit 基因下面一条链结合的引物其序列应为5' -CGGGATCCA-3'，综上所述，AD错误，BC正确；由于ri复制原点中含有限制酶HindⅢ的识别序列，因此不能用限制酶HindⅢ来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamHⅠ和EcRⅠ对质粒 pET-28a(+)进行双酶切，这样可以防止目的基因与质粒的自身环化以及任意连接；同时要在 kit 基因两端也连上限制酶BamHⅠ和EcRⅠ的识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸延伸子链，因此必须将限制酶BamHⅠ和EcRⅠ的识别序列连接至引物的5'端。
（3）观察质粒 pET-28a(+) 图可知，在该质粒上有两个HindⅢ的识别序列，一个在启动子和终止子之间，一个在复制原点ri中，因此用HindⅢ切割质粒 pET-28a(+)后，可得到两个片段，通过表格可知，这两个片段长度分别为1000bp和2550bp，说明质粒pET-28a(+) 总长度是1000bp+2550bp=3550bp；利用双酶切法将 kit 基因与质粒 pET-28a(+) 长度为170bp片段进行置换后，形成的重组质粒 pET-28a（+）-kit 能被HindⅢ切割成三个片段，长度分别是1000bp、2000bp、700bp，说明置换后的kit 基因上含有两个HindⅢ的识别序列，再加上复制原点ri中的一个HindⅢ的识别序列，共三个HindⅢ的识别序列，经HindⅢ酶切后才能将重组质粒pET-28a（+）-kit 切成3段。利用这三段的长度可计算出重组质粒 pET-28a（+）-kit 的总长度为1000bp+2000bp+700bp=3700bp，由于kit 基因与长度为170bp片段进行置换，设kit 基因长度为n，可列出等式：3550+n-170=3700bp，故可计算出kit 基因长度为n=320bp。
（4）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。若结果出现大量杂带即获得的产物有非目的DNA序列，原因可能是：模板受到污染，里面混有其他DNA；引物的特异性不强，与非目的序列结合；复性温度偏低，导致引物特异性降低；Mg2+浓度过高，导致PCR特异性不强等。
7．（24-25高三上·天津滨海新·阶段练习）四尾栅藻是一种淡水藻类，繁殖快、适应性强，可作为制备生物柴油的重要原料之一。为提高四尾栅藻油脂含量，研究人员将从含油量高的紫苏中获得的二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT1）与pBI121质粒构建表达载体，经转化成功获得高产油脂四尾栅藻，主要研究过程如下图，其中DGAT1-F（）和DGAT1-R（）是以DGAT1基因为依据设计的一对引物，lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请回答下列问题。
(1)过程①中需要的酶有 和 ，过程②应选用的限制酶是 和 。
(2)在保存DGAT1基因时，将克隆载体导入大肠杆菌的优点有 （多选）。
①稳定保存②准确复制③快速表达④方便取用
(3)过程③经转化的大肠杆菌通过 （方法）接种到培养基上继续培养。为筛选获得目标菌株，培养基应加入的成分有 。
(4)为检测表达载体转化四尾栅藻的情况及确定目的基因是否表达，研究人员进行了如下实验，请完成下表。
【答案】(1) 逆转录酶 耐高温的DNA聚合酶 BamH Ⅰ Xba Ⅰ
(2)①②④
(3) 稀释涂布平板法 氨苄青霉素、X-gal、IPTG
(4) 卡那霉素 （等量的）转化后和未转化的四尾栅藻
【分析】1、基因工程的基本工具：限制性内切核酸酶，识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 DNA连接酶，将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。载体，将外源基因送入受体细胞。
2、基因工程的基本过程：目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定。
【详解】（1）过程①包括逆转录和PCR，逆转录需要逆转录酶的参与，PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶；限制酶的作用是识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，对比几种限制酶的结合位点和DGAT1-F、DGAT1-R的碱基序列，可知过程②应选用的限制酶是BamH I（切割DGAT1-R所在序列）和Xba I（切割DGAT1-F所在序列）。
（2）将克隆载体导入大肠杆菌，可以与外界环境隔离，能够稳定保存，准确复制，大肠杆菌比基因方便取用，故选①②④。
（3）根据培养基上菌落的分布（各菌落分散分布）可知所用接种方法是稀释涂布平板法；克隆载体中含有氨苄青霉素抗性基因、1acZ基因，氨苄青霉素抗性基因用于筛选成功导入质粒（含目的基因的重组质粒和不含目的基因的空白质粒），由图可知，经过程②质粒上的LacZ基因被目的基因破坏，故LacZ基因可用于筛选导入含目的基因的重组质粒，1acZ基因编码产物在X-ga1和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色，所以为筛选获得目标菌株，培养基应加入的成分有氨苄青霉素、X-gal、IPTG。
（4）pBI121质粒中含有卡那霉素抗性基因，所以经转化后的四尾栅藻接种于含卡那霉素的BG11固体培养基并放置于人工气候箱培养，一段时间后观察其生长情况；上一步骤中用未转化的四尾栅藻作对照，所以利用索氏抽提法分别测定（等量的）转化后和未转化的四尾栅藻的油脂含量，从而检测表达载体转化四尾栅藻的情况及确定目的基因是否表达。
8．（24-25高三上·江西赣州·阶段练习）番茄不耐寒，冬季容易冻坏，难以储藏。我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtCOR15a，经过一系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。回答下列问题：
(1)用PCR 技术扩增AtCOR15a 基因时需要添加引物，引物的作用是 。
(2)如果要将 AtCOR15a 基因与质粒构建重组 DNA 分子，一般采用双酶切法，据图分析选用的两种限制酶组合是 。
(3)图中是采用 法将目的基因转移到番茄细胞中，并将其整合到该细胞的 上。
(4)为了提高 AtCOR15a 基因的表达能力，可将 AtCOR15a 基因与外源强启动子连接，如下图所示。
（注：图中①、②、③、④表示引物）
利用PCR 检测上述连接是否正确，可选择的引物组合是 (填字母)，该 PCR反应体系中需加入 酶。
A．①+② B．①+③ C．②+③ D．③+④
【答案】(1)使DNA 聚合酶能够从引物的 3’端开始复制
(2)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ
(3) 农杆菌转化法 染色体DNA
(4) B TaqDNA 聚合（耐高温DNA 聚合）
【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建（核心）；第三步：将目的基因导入受体细胞1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程；第四步：目的基因的检测和表达。
【详解】（1）用 PCR 技术扩增AtCOR15a 基因时需要添加引物，引物是根据已知一段目的基因的核苷酸序列设计的，其能与目的基因两端的碱基序列实现互补配对，进而使PCR扩增过程中子链的延伸发生在引物的3‘端，即引物的作用是使 DNA 聚合酶能够从引物的 3’端开始复制。
（2）为了能筛选重组DNA 分子，必须保留抗生素抗性基因，不能选择SmaⅠ，若选择EcRⅠ，则目的基因两端具有相同的黏性末端，目的基因会自身环化，综上分析，采用双酶切法，据图分析选用的两种限制酶组合是 Hind Ⅲ和BamHⅠ。
（3）将目的基因转移到植物细胞常使用农杆菌转化法，即当②农杆菌侵染番茄细胞后，利用农杆菌转化法将目的基因转移到番茄细胞中，并且将其整合到受体细胞的染色体 DNA 上。
（4） 为了提高 AtCOR15a 基因的表达能力，可将 AtCOR15a 基因与外源强启动子连接，如图示，在利用 PCR 检测连接是否成功，应当将强启动子和AtCOR15a 基因都扩增出来，所以可选择的引物组合是①+③。故选B。该PCR 反应体系中需加入TaqDNA 聚合（耐高温DNA 聚合）酶，以此来扩增 DNA。
9．（22-23高二下·江苏扬州·阶段练习）引起新冠肺炎的新冠病毒是一种带包膜的RNA病毒，包膜表面有与人体细胞膜表面的ACE2受体结合的S蛋白。疫苗接种和病毒检测是当前新冠肺炎疫情防控工作的重要举措。请回答下列问题：
Ⅰ、疫苗的研发和接种
(1)灭活疫苗。工业生产上利用Ver细胞能无限增殖的特性培养新冠病毒，可实现 的目的。
(2)腺病毒载体疫苗。该疫苗主要成分是活的、有复制缺陷、能表达S蛋白的重组人5型腺病毒。这种方式生产的疫苗由于重组腺病毒 ，从而提高了疫苗的安全性。
(3)重组亚单位疫苗。其技术线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT酶PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因→构建基因表达载体→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入 酶；扩增RBD蛋白基因时，应选择的引物为 。PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以 为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。图3中3号泳道出现杂带，原因一般有 （至少答出两点）。基因表达载体构建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图1中选择的限制酶是 。
Ⅱ、新冠病毒的检测
(4)核酸检测
图4是我国自主设计的新冠病毒核酸检测平台示意图，图5为RT-PCR（实时荧光逆转录聚合酶链式反应）示意图。当探针完整时，荧光基团（R）发出的荧光信号被淬灭基团（Q）吸收而不发荧光；当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。
①在自动化PCR体系配置中加入引物和探针，引物和探针与模板结合发生在PCR循环中的 阶段。
②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TaqMan探针，设置R发出的荧光信号的值为1．若经n次的PCR扩增，实时荧光信号强度 （填“增强”“减弱”或“不变”），说明样液中病毒的核酸数量为0；
(5)抗原和抗体检测: 为了及早发现新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测的有效补充措施。对于已注射过灭活疫苗的人员，应选择 （填字母）检测。
a、核酸检测 b、抗原检测 c、抗体检测
【答案】(1)获得大量新冠病毒，降低生产成本
(2)无法在人体宿主细胞内复制（增殖）
(3) 逆转录酶、Taq酶 引物4、引物5 （提纯的）RBD蛋白基因片段 模板受到污染；引物的特异性不强；退火温度偏低 BamH Ⅰ和Hind Ⅲ
(4) 复性（或退火） 不变
(5)ab
【分析】常见的疫苗种类有：
（1）灭活疫苗，首先灭活病毒，使其失去传染性和致病性，但保留了病毒完整结构，具有能够让免疫系统识别的抗原性。
（2）腺病毒载体疫苗是选择一种对人体无害的，不致病的腺病毒作为载体，利用基因工程技术将病毒基因经过一定的安全处理，使其成为一种只能对人体有一个细胞周期侵染能力的复制缺陷性病毒，然后将新冠病毒侵入人体的关键基因植入到这种复制缺陷的腺病毒基因中，利用这种技术制成疫苗，可使新冠病毒的抗原搭载腺病毒之船进入人体，因此这类疫苗被称为腺病毒载体疫苗。
（3）重组亚单位疫苗通过各种方式培养病毒抗原蛋白，将特异性抗原的基因插入易于增殖的病毒或细胞，以表达有效特异性抗原，经纯化后制备的疫苗。在研发过程中会使用到RT-PCR技术，将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
【详解】（1）ver细胞是指非洲绿猴肾细胞，可用于检查大肠杆菌毒素，作为培养病毒的细胞宿主和真核寄生虫的宿主细胞。之所以选择ver细胞生产病毒，是因为它容易培养，传播稳定，可以无限分裂，所以ver细胞用于生产许多疫苗。如工业生产上利用Ver细胞能无限增殖特性培养新冠病毒，可实现获得大量新冠病毒，降低生产成本。
（2）腺病毒载体疫苗，是利用基因工程技术，把致病病毒的关键基因片段植入到改造后的无害病毒中，重组成疫苗。这个疫苗和无害病毒B一样不致病，却拥有致病病毒的长相，能使免疫系统认识致病病毒，并产生免疫记忆，从而阻断致病病毒的入侵。在疫苗研发中，改造后的腺病毒不能在体内复制，也无法整合进宿主细胞基因组中，所以，从理论性上来讲，对人体不会造成危害。
（3） RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。重组亚单位疫苗的技术线路是：提取新冠病毒RNA→利用RT酶PCR技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因→构建基因表达载体→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq酶。扩增RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5，因为通过这两种引物能扩增出带有限制酶序列的目的基因。PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。PCR技术受到温度，酶，所用蛋白材料等因素的影响，因此，图3中3号泳带出现杂带原因可能是引物的特异性不强，结合到模板的其他地方；模板不纯受到污染，结合到其他模板；目的片段与引物有多处结合；退火温度偏低等。根据图1可以分析出基因表达载体构建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图1中选择的限制酶是BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。
（4） ①PCR原理是体外DNA复制，其过程包括变性、复性和延伸，复性指的是引物与模板链之间形成氢键的过程；加入自动化PCR体系配置中的引物和探针的设计依据是新冠病毒的基因对应的部分核苷酸序列。引物和探针与模板结合发生在PCR循环中的复性（或退火）阶段。
②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TaqMan探针，设置R发出的荧光信号的值为1，可见荧光强度与核算数量相对应，则经n次的PCR扩增，样液中病毒的核酸数量为0，则说明实时荧光信号强度不变。
（5） 为了及早发现新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测的有效补充措施。这两种试剂盒的检测原理为抗原抗体的特异性结合，即抗原-抗体杂交。对于已注射过灭活疫苗的人员，由于其体内发生了相应的特异性免疫反应。因而体内含有较多的抗体，因此，应选择核酸检测和抗原检测。
10．（22-23高三上·江苏扬州·阶段练习）科研人员发现在人类肿瘤细胞中LMNA基因表达异常，LMNA基因编码的核纤层蛋白与维持细胞核的正常形态有关。科研人员利用CRISPR/Cas9技术对体外培养的HepG2（人源肺癌细胞）细胞株进行基因编辑，获得了LMNA基因敲除的稳定细胞系。
(1)Cas9是一种核酸内切酶，它与sgRNA（向导RNA）构成的复合体能与DNA分子特定碱基序列结合，如图1。作用时sgRNA与DNA单链进行碱基互补配对，然后Cas9催化 水解，从而使DNA在PAM序列（几乎存在于所有基因中）的 （填“上游”或“下游”）被切断。
(2)一般来说，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和 （填“相同”或“不同”）的sgRNA结合构成复合体进行相关基因的编辑，其中Cas9对DNA的切割 （填“具有”或“不具有”）类似于限制酶的“限制性”。
(3)HepG2细胞中没有编码Cas9的基因，需将Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并与质粒结合导入HepG2细胞，sgRNA的合成需要 酶的催化。
(4)用图2中的质粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段构建表达载体时，应选用 进行酶切。将构建好的表达载体与用 处理的细菌置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含 的平板培养基上，37℃培养，24h后挑取菌落，提取质粒作为模板，选择图3中引物组合 和 ，通过PCR和电泳技术鉴定是否重组成功。

(5)用鉴定成功的工程菌对HepG2细胞进行转染，培养三天后收集HepG2细胞，从分子水平和细胞水平检测导入是否成功。
①提取HepG2细胞的基因组，对DNA分子的 序列进行检测。
②请写出细胞水平的一项检测指标： 。
【答案】(1) 磷酸二酯键 上游
(2) 不同 不具有
(3)RNA聚合酶
(4) EcRI Ca2+（CaCl2） 嘌呤霉素 I Ш（两空位置可调换）
(5) 碱基 (或核苷酸) HepG2细胞的细胞核形态或单位时间内细胞数目的增长量等
【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、基因工程的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导人受体细胞、目的基因的检测与鉴定。通常利用PCR获取和扩增目的基因。在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子；一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。将目的基因导入受体细胞的方法有：将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌介导转化技术(农杆菌转化法)，其次还有基因枪法和花粉管通道技术(花粉管通道法)；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术；将目的基因导入微生物细胞常用Ca2+处理法。目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从受体细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应蛋白等；其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。
【详解】（1）Cas9是一种核酸内切酶，其作用特点是使两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，故Cas9催化脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键水解；结合图1，NGG为PAM序列，单链DNA的方向是由5'端到3'端，故左侧为PAM序列的上游，Cas9的切点在PAM序列左侧，故Cas9使DNA在PAM序列的上游被切断。
（2）根据碱基互补配对原则，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和不同的sgRNA进行基因的相关编辑，因为Cas9与sgRNA（向导RNA）构成的复合体能与DNA分子特定碱基序列结合，而Cas9本身不能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，也因此Cas9对DNA的切割不具有类似于限制酶的“限制性”。
（3）RNA的合成需要RNA聚合酶的参与，因此，sgRNA的合成也需要RNA聚合酶的催化。
（4）根据图2，应选用EcRI进行酶切，因为BamHI基因会切割嘌呤霉素抗性基因，导致重组质粒没有标记基因；将构建好的表达载体与用Ca2+（CaCl2）处理的细菌置于适宜反应体系中培养；由于重组质粒的标记基因为嘌呤霉素抗性基因，因此将培养的细菌涂布于含嘌呤霉素的平板培养基上培养；37℃培养，24h后挑取菌落，提取质粒作为模板，引物的设计是针对目的基因的上下游序列设计的，其分别与目的基因两端的两条DNA单链碱基互补，因此引物有两个，分别为图3中I和Ⅲ。
（5）从分子水平检测，可以直接对DNA分子碱基序列进行检测；根据题干信息，人类肿瘤细胞中LMNA基因表达异常，LMNA基因编码的核纤层蛋白与维持细胞核的正常形态有关，因此，在细胞水平可以检测HepG2细胞的细胞核形态或单位时间内细胞数目的增长量等。
11．（2024高三上·广东江门·专题练习）在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，其凝乳功能可使奶制品形成独特风味和质地，因此被广泛应用于奶酪和酸奶生产。现利用生物工程大量生产牛凝乳酶，如图为目的基因及质粒的示意图，请回答相关问题。
(1)图中的牛凝乳酶cDNA是由未断奶小牛胃细胞中分离出的mRNA经 过程获得。
(2)已知牛凝乳酶cDNA中的b链为转录的模板链，为实现牛凝乳酶基因与质粒的准确连接，PCR扩增牛凝乳酶cDNA时需选择适当的引物并在引物的5’端添加相应的限制酶识别序列。请据图分析并完成下表：
(3)将构建的表达载体导入受体菌后，用含 的培养基培养受体菌，进行鉴定。含重组质粒的菌落将呈现白色，原因是 。
(4)与细菌相比，选用具有酵母菌作为受体菌更能对目的基因的表达产物进行 （填“转录”或“翻译”）后修饰，使凝乳酶具有更优的生物学活性。由于不同物种对编码相同氨基酸的不同密码子的使用频率存在差异，当外源基因的密码子对应的 在受体细胞中数量较少时就会影响翻译的效率。
【答案】(1)逆转录/反转录
(2) P3 XhI
(3) 氨苄青霉素 重组质粒的两种限制酶会破坏LacZ基因
(4) 翻译 氨基酸
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由mRNA到cDNA的过程属于逆转录过程，故图中的牛凝乳酶cDNA是由未断奶小牛胃细胞中分离出的mRNA经逆转录过程获得。
（2）据图可知，质粒上共有3种酶的酶切位点，但EcRI会破坏氨苄青霉素抗性基因，且在质粒上有两个酶切位点，故不能选择，应选择NcI和XhI进行切割，已知牛凝乳酶cDNA中的b链为转录的模板链，转录的方向是5'→3'，且引物需要模板的3'端结合，结合质粒上启动子方向可知，应选择P2和P3引物，且应在引物P3的5'端添加NcⅠ限制酶，而引物P2的5’端添加XhI限制酶识别序列。
（3）据图可知，重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，故将构建的表达载体导入受体菌后，用含氨苄青霉素的培养基培养受体菌，进行鉴定；LacZ是B-半乳糖甘酶基因，编码的酶能将无色化合物X-ga1切 割成半乳糖和蓝色物质，使菌 落呈现蓝色，但重组质粒的两种限制酶会破坏LacZ基因，故菌落呈白色。
（4）转录的产物是RNA，翻译的产物是蛋白质（多肽），细菌是原核生物，只含有核糖体一种细胞器，不能对蛋白质进行进一步加工，故选用具有酵母菌作为受体菌更能对目的基因的表达产物进行翻译修饰；密码子是mRNA上编码氨基酸的三个相邻碱基，由于不同物种对编码相同氨基酸的不同密码子的使用频率存在差异，当外源基因的密码子对应的氨基酸在受体细胞中数量较少时就会影响翻译的效率。
12．（24-25高三上·浙江杭州·阶段练习）研究人员从分解纤维素的细菌（A菌）中提取出一种纤维素酶基因（CBHII）并进行PCR扩增，然后与高效表达载体DUT质粒（图1）连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌（B菌），请回答下列问题：
几种限制酶识别序列及酶切位点
(1)构建成重组质粒时，应选择限制酶 对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段（X和Y），X两端的黏性末端分别为-CTAG和-CAATG，则Y两端的黏性末端分别为-CTAG和 。
(2)CBHII基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，PCR扩增过程中，最早经过 轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。为了能在波长为300nm紫外灯下检测出DNA分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的 。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素 （填“M”或“N”）的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示（片段过小时检测不到条带）。据图分析，菌落 中成功导入了重组质粒。
(4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种 ，说明 。
【答案】(1) BglⅡ、BstEⅡ —CATTG
(2) 3/三 核酸染料
(3) N 2、3
(4) A菌 B菌分解纤维素能力比A菌更强
【分析】基因工程的基本程序：⑴目的基因的获取：这涉及到从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或人工合成目的基因；⑵基因表达载体的构建：这是基因工程中的核心步骤，涉及将目的基因与运载体（如质粒）重组，通常使用同种限制酶切割运载体和目的基因，产生互补的黏性末端，然后用DNA连接酶连接；⑶将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞（如微生物、植物或动物细胞）的不同，导入方法也会有所不同，例如，微生物细胞常用感受态细胞法，植物细胞可使用农杆菌转化法或基因枪法，而动物细胞则常用显微注射法；⑷目的基因的检测与表达：这包括在分子水平上检测转基因生物染色体DNA中是否插入目的基因，以及目的基因是否转录和翻译成蛋白质；在个体水平上进行抗虫、抗病或活性鉴定等。
【详解】（1）需要将目的基因插入高效启动子之后，至少保留一个标记基因M或N，故选择BglⅡ、BstEⅡ对质粒进行酶切；根据表格中BstEⅡ识别序列和切割位点，X端的黏性末端有—CAATG，则Y端与之互补为—CATTG。
（2）第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链；因此PCR扩增过程中，最早经过3轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。为了便于对分离后的DNA片段进行检测，在凝胶制备中加入核酸染料，能够与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
（3）BstEⅡ破坏了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒导入A菌，并将其接种在含抗生素N的培养基上培养，图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。
（4）分析图4，因变量是纤维素含量，对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由柱状图长短可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强。
13．（2024·四川巴中·一模）巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）属于普通PCR的衍生技术，相较于普通PCR，巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例，增加PCR的灵敏度和特异性。巢式PCR通常包括两个连续的扩增反应，每个反应使用不同的一对引物。第一次PCR用一对外引物进行扩增，其产物会被用作第二次PCR的模板，第二次PCR由一对内引物（结合位点位于外引物对结合点的内部）扩增目的基因，过程如下图所示。

(1)巢式PCR反应体系所需的试剂如下，请补齐空白处：
其中 PCR反应缓冲液中Mg2+的作用是 ，相比直接使用4种脱氧核苷酸，在反应体系中加入dNTP的优势有 。
(2)与普通PCR相比巢式PCR中设计的引物只是在模板DNA的结合位置有所差异。进行巢式PCR前，根据已知的模板DNA序列，可设计合成内外引物对，引物设计的要求有 （答出两点即可）；同时，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的 （填“5＇端”或“3＇端”）添加限制性内切核酸酶位点。
(3)将题（1）中试剂按顺序加入扩增离心管中，按下表参数在PCR仪中进行扩增：
在扩增后对PCR的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，此时可适当 （填“提高”或“降低”）复性温度来减少非特异性条带，原因是 。
(4)巢式PCR可大大提高扩增特异性的原因是 。
【答案】(1) DNA聚合酶 激活DNA聚合酶 既可以提供能量，也可以提供原料
(2) 能与DNA母链碱基互补配对；两种引物之间不能构成碱基互补配对；引物的5'端应具有限制酶酶切位点 5'
(3) 提高 可以降低非特异性序列与引物之间的杂交效率
(4)巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段
【分析】PCR技术：
①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；
②原理：DNA复制；
③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；
④方式：以指数的方式扩增，即约2n；
⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸
【详解】（1）依据PCR反应体系的要求，应具有解旋酶（可用高温替代），模板链，4种脱氧核苷酸，DNA聚合酶，引物等，故①应表示耐高温的DNA聚合酶，其中Mg2+的作用为激活耐高温的DNA聚合酶，相比直接使用4种脱氧核苷酸，在反应体系中加入dNTP的优势有在高温条件下会分dNTP水解，高能磷酸键断裂，为化学反应（PCR）的进行提供能量，其水解后的产物（脱氧核苷酸）还可以作用原料。
（2）引物设计的要求是：①能与DNA母链碱基互补配对；②两种引物之间不能构成碱基互补配对；③引物的5'端应该有限制酶酶切位点等。所以，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的5'端添加限制酶酶切位点。
（3）若在扩增后对PCR的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，可适当提高复性温度来减少该现象，其原因是复性温度的提高可以降低非特异性序列与引物之间的杂交效率。
（4）巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，也使获得的产物特异性更高。
14．（2024·湖南长沙·二模）对某冠状病毒进行核酸检测其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）法。为检测某人是否感染了该冠状病毒，需要进行以下相关操作：①分析PCR扩增结果；②从组织样本中提取RNA；③RT（逆转录）成cDNA；④采集样本（咽拭子或鼻拭子）；⑤利用PCR扩增DNA片段。回答下列问题：
(1)若要得到正确的核酸检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。核酸检测样本多采集于咽、鼻，这些部位存在多种微生物，提取物中核酸种类可能有多种，但通过PCR技术可专一地对该冠状病毒的核酸序列进行扩增，原因是 。
(2)操作⑤中，需设计2种引物，需要提供引物的原因是 ；复性时温度的设定是该步操作成败的关键，而复性的作用是 。
(3)PCR扩增时，在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针，其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团，如图所示：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； 在催化子链延伸时，还具有外切酶活性，它可以沿着 （填“5'→3'”或“3'→5'”）方向将探针酶切，使报告基团和淬灭基团分离，随着DNA扩增次数的增加，荧光的强度会逐渐增大，从而实现荧光信号的变化与 的形成完全同步。
(4)除了荧光检测法，还可以通过 法分析PCR扩增结果。
【答案】(1) ④②③⑤① 引物是根据冠状病毒的核酸的一段已知序列设计合成的（或引物能与冠状病毒核酸的cDNA特异性结合）。
(2) DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3'端延伸DNA链； 使2个引物分别与各自互补的DNA单链结合，形成氢键。
(3) 耐高温的DNA聚合酶 5'→3' PCR产物
(4)琼脂糖凝胶电泳
【分析】cDNA文库与基因组DNA文库不同，它是由组织细胞提取分离的mRNA经逆转录酶作用获得的互补DNA （cDNA）构建的。某种意义上， cDNA文库可看是表达基因的文库，它所包含的cDNA片段代表了该特定组织细胞中正在表达基因的外显子部分。因而由发育进程和组织细胞种类不同，基因组中表达功能的其因存在差异，所建的cDNA文库就不同。这就成为研究不同发育分化的正常细胞与肿瘤细胞等进行差异显示的理论基础。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
【详解】（1）RT-PCR法的主要操作步骤为采集样本（咽拭子或鼻拭子）→从组织样本中提取RNA→RT（逆转录）成cDNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果。进行PCR扩增时，需要加入设计好的2种引物。由于引物是根据该冠状病毒cDNA的一段已知序列设计合成的，故能够专一地扩增该冠状病毒的cDNA序列。
（2）DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3'端延伸DNA链，因此在体外扩增目的基因时，需要根据目的基因的核苷酸序列人工合成两种引物。PCR过程中复性的作用是使2个引物分别与各自互补的DNA单链结合，形成氢键。
（3）根据题干信息可知，PCR反应中，耐高温的DNA聚合酶的作用是催化子链延伸，同时还具有外切酶活性，可以沿着5'→3'方向将探针酶切，报告基团分离出来后会显示荧光，随着DNA扩增次数的增加，探针中的报告基团分离增多，荧光的强度增加，荧光信号的变化与PCR产物的形成完全同步。
（4）可利用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物的大小，从而确定是否存在目的片段。
15．（23-24高三上·广东·阶段练习）研究表明， Lm - PHB2蛋白在细胞核内起调节细胞周期的作用。为研究 Lm-PHB2蛋白的生物学活性， 研究人员进行了以下实验。RT- PCR是将RNA的反转录（逆转录 ， RT)和cDNA的聚合酶链扩增（PCR)相结合的技术， LacZ基因的编码产物在x - ga1和IPTG存在下， 可使大肠杆菌菌落呈现蓝色， 否则菌落呈现白色。 回答下列问题.
(1)过程①需要的酶有 ， 该过程需要在目的基因上添加适宜的酶切位点， 扩增时， 引物和酶切位点的设计依据分别是Lm-PHB2基因两侧的脱氧核苷酸序列和 。
(2)过程③中筛选和培养大肠杆菌的培养基中需要加入 和碳源、氮源、水和无机盐 等物质， 挑取 色菌落中的微生物培养并提取质粒， 用限制酶进行酶切， 再对产物进行检测。
(3)为检测过程⑤得到的大肠杆菌是否表达Lm- PHB2基因， 研究人员以注射了 后获得的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞制备单克隆抗体， 之后再用制备的单克隆抗体与大肠杆菌中蛋白质进行 实验。
【答案】(1) 逆转录酶和TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶） HindⅢ和EcRI识别的脱氧核苷酸序列
(2) X-gal、IPTG、卡那霉素 白
(3) Lm-PHB2蛋白 抗原一抗体杂交
【分析】分析题干“RT-PCR是将RNA的反转录（逆转录，RT）和cDNA的聚合酶链扩增（PCR）相结合的技术”可知，逆转录的过程中需要逆转录酶，PCR过程中需要Taq酶。
【详解】（1）①为由mRNA获得大量DNA的RT-PCR过程，需要的酶有逆转录酶和TaqDNA聚合酶，该过程需要的引物的设计依据是Lm-PHB2基因两侧的脱氧核苷酸序列，根据图像发现将Lm-PHB2基因插入载体时，使用的是限制酶HindⅢ和EcRⅠ，因此在引物的5'端要加入HindⅢ和EcRI识别的脱氧核苷酸序列。
（2）分析题图可知，载体pMD18-T-Lm-PHB2中LacZ基因被破坏，卡那霉素抗性基因完整，因此含有重组质粒的大肠杆菌可在含有卡那霉素的培养基中形成菌落，因此筛选和培养大肠杆菌的培养基中需要加入卡那霉素、X-gal、IPTG（结合题干“LacZ基因的编码产物在X-gal和IPTG存在下”可知需要加这两种物质）、和碳源，氮源，水和无机盐等物质，由于插入目的基因后LacZ基因被破坏，而题干中“LacZ基因的编码产物在X-gal和IPTG存在下，可使大肠杆菌菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色”可知需要挑选白色菌落中的微生物培养并提取质粒，用限制酶进行酶切，再对产物进行检测。
（3）单克隆抗体是利用已经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后得到的杂交瘤细胞产生的，此单克隆抗体可与Lm-PB2蛋白发生特异性结合，因此应该给小鼠注射Lm-PB2蛋白，以得到能产生相应抗体的B淋巴细胞；之后再用制备的单克隆抗体与大肠杆菌中蛋白质进行抗原一抗体杂交实验。
16．（22-23高二下·湖南·阶段练习）聚乳酸（PLA）具有良好的生物可降解性与相容性，其机械性能及物理性能良好，被认为是传统石化来源类塑料的环保替代品。PLA可以以三种立体结构存在：聚L—乳酸（PLLA）、聚D—乳酸（PDLA）和聚DL—乳酸（PDLLA），它们分别是L—乳酸、D—乳酸和DL-乳酸的聚合物。几乎所有的乳酸菌都同时具有L—乳酸脱氢酶（L—LDH）和D—乳酸脱氢酶（D—LDH）。
(1)已知乳酸芽孢杆菌可生产纯度相对较高的D—乳酸，其在无氧情况下，能将葡萄糖分解为乳酸，反应简式为 。
(2)为得到足够浓度的乳酸芽孢杆菌，研究者对其进行富集培养，并且每间隔一段时间采用 法进行活菌计数。某次实验时，甲、乙两组研究者分别吸取经稀释10倍的菌液0.1mL进行涂布后计数，甲组统计的菌落数分别为45、40、37，乙组统计的菌落数分别为280、350、295，请计算出此时培养液中乳酸芽孢杆菌浓度为 （保留小数点后一位）个/mL。
(3)为增加D—乳酸的产量，科学家对乳酸芽孢杆菌的D—LDH基因特定位点进行了定点突变，以增强D-LDH的活性。重叠延伸PCR技术是常见的定点突变手段之一，其过程如下图所示：

①科学家从乳酸芽孢杆菌中获取D—LDH基因并定向突变后，构建表达载体需要用到的工具酶是 。将构建好的表达载体导入乳酸芽孢杆菌细胞中，需要用 处理乳酸芽孢杆菌细胞。
②在第一阶段，引物2和引物3不可置于同一个反应体系中同时进行PCR扩增，原因是 。
【答案】(1)C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量
(2) 稀释涂布平板 4.1×103
(3) 限制酶和DNA连接酶 CaCl2（Ca2＋） 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】（1）酸芽孢杆菌无氧条件下产生乳酸，其反应式为C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量。
（2）对微生物进行计数的方法是稀释涂布平板法；稀释涂布平板法计数时需要选择菌落数在30-300之间的菌落进行计数，由于乙组有一个菌落在350，不符合要求，故应选择甲组的统计数据，则甲组统计的菌落数分别为45、40、37，故培养液中乳酸芽孢杆菌浓度为（45＋40＋37）/3÷0.1×10≈4.1×103个/mL。
（3）①构建表达载体需要用到的工具酶是限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接酶（连接切割后的目的基因和运载体）；将目的基因导入受体细胞的方法是感受态细胞法，即用Ca2＋处理，使其处于易于接收外界DNA分子的状态，故将构建好的表达载体导入乳酸芽孢杆菌细胞中，需要用Ca2＋处理乳酸芽孢杆菌细胞。
②由于引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用，故引物2和引物3不可置于同一个反应体系中同时进行PCR扩增。
17．（22-23高三下·重庆·阶段练习）PCR定点突变技术是最常用的基因突变技术，通过定点诱变可以在体外改造DNA分子。重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术，操作过程如图甲，可通过测序检验定点突变是否成功。现欲 将改造后的基因构建重组质粒导入大肠杆菌，质粒结构如图乙（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示 四环素抗性基因，质粒上的小箭头表示相关限制酶的酶切位点）。回答下列问题：
(1)图中4次PCR使用的引物不完全相同，其中不需要使用引物的过程是 ，图中PCR1选 择的引物是 ，PCR4选择的引物是 。
(2)若在一个反应系统中同时进行PCR1和PCR2，可能不会得到目标产物的原因是 。PCR1和PCR2得到的产物混合、变性后杂交，能得到 种新类型的杂 交DNA分子。
(3)若要将突变的基因定向插入质粒并构建表达载体，应在PCR4所用引物的 端分别添加相应的限制酶识别序列。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了 目的基因的重组质粒的大肠杆菌。为筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，通常采用 影印法：先使用无菌的绒毡布压在含有 的固体培养基的菌落上，带出少许菌种，再平移并压在含有 的固体培养基上，最终通过对比在含 的固体培养基上获得目的菌落。
【答案】(1) PCR3 引物A和引物B 引物A和引物D
(2) 引物B和引物C存在碱基互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用 2
(3) 5′ 氨苄青霉素 四环素 氨苄青霉素
【分析】 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR第三次时，杂交DNA的两条链可以互为模板和引物，不需要引物。根据图中PCR1扩增的蛋白A基因部分，推出该过程需要的引物是引物A和引物B。由于PCR4扩增的是新的蛋白A基因，推出该过程需要的引物是引物A和引物D。
（2）因为引物B和引物C为互补序列，在一个反应系统中同时进行PCR1和PCR2时，引物B和引物C会因发生结合而失去作用。将PCR1和PCR2得到的产物混合、变性后杂交，除能得到原本的PCR1和PCR2产物外，还有和两种新类型的杂交DNA分子，可用下图表示： 和 。
（3）因为引入的限制酶识别序列在模板链上没有对应的互补序列，所以应在引物的5＇端引入，不影响3＇端子链的延伸。因为重组质粒中的四环素抗性基因被破坏，所以在含氨苄青霉素的固体培养基上含质粒和含重组质粒的大肠杆菌能存活，而在含四环素的培养基上仅含质粒的大肠杆菌能存活。应先使用无菌的绒毡布压在含氨苄青霉素的固体培养基的菌落上，带出含质粒的大肠杆菌和含重组质粒的大肠杆菌，再平移并压在含有四环素的固体培养基上，最终通过对比在含氨苄青霉素的固体培养基上获得含重组质粒的菌落。
质粒类型
pET—28a（+）
pET—28a（+）—kit
HindIII 酶切片段
1000bp、2550bp
1000bp、2000bp、700bp
实验步骤
简要操作过程
初筛培养
经转化后的四尾栅藻接种于含① 的BG11固体培养基并放置于人工气候箱培养，一段时间后观察其生长情况
扩大培养
在BG11固体培养基上分别挑取数个单藻落接种至BG11液体培养基中光照摇床培养，编号备用
PCR验证
收集四尾栅藻藻体，提取基因组DNA，以DGAT1-F和DGAT1-R为引物，进行PCR验证，未转化的四尾栅藻作对照
油脂含量测定
利用索氏抽提法，分别测定② 的油脂含量
结果处理
统计并比较PCR验证结果及藻体中油脂的含量
应选择的引物
5’端添加序列所对应的限制酶
①
NcⅠ
P2
②
限制酶
识别序列及酶切位点
BglⅡ
5'-A↓GATCT-3'
BstEⅡ
5'-G↓GTNACC-3'(N为任意碱基)
SacI
5'-G↓AGCTC-3'
Msp I
5'-C↓CGG-3'
BamH I
5'-G↓GATCC-3'
PCR反应缓冲液（含有MgCl2）
dNTP混合液（所有四种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）
引物：内引物1，内引物2，外引物1，外引物2
模板 DNA

H2O
周期数
变性
复性
延伸
1-30
94℃下30s
50℃下30s
72℃下2.5min