备战2025年高考生物精品教案第十一章生物技术与工程课时6基因工程的基本工具与操作程序（Word版附解析）

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考点1 基因工程的基本工具
学生用书P343
1.基因工程的概念
（1）手段：按照人们的愿望，通过[1] 转基因 等技术，赋予生物新的遗传特性。
（2）目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和[2] 生物产品 。
（3）操作水平：[3] 分子水平 。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作[4] 重组DNA技术 。
2.基因工程的基本工具
教材补遗[选必3 P72“旁栏思考”]DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因：①DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶起作用时不需要模板。
3.与DNA有关的几种酶的比较
基础自测
1.重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。（ × ）
2.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列。（ × ）
3.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。（ × ）
4.限制酶和DNA连接酶的作用部位一致，但作用相反。（ √ ）
5.所有DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端。（ × ）
6.载体的种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等。（ √ ）
7.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。（ × ）
深度思考
1.原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 当外源DNA入侵时，原核生物会利用限制酶切割外源DNA以保证自身安全，这是原核生物在长期进化过程中形成的防御机制。
2.原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA？
提示 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。
3.基因工程中的载体与细胞膜上的载体相同吗？
提示 不同。基因工程中的载体通常是质粒、噬菌体、动植物病毒等，主要作用是携带外源基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA进行同步复制；细胞膜上的载体一般为蛋白质，主要是运载要进入细胞的特定物质。
4.天然质粒一般不能直接用作基因工程载体的原因是什么？
提示 只有具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的质粒才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然质粒一般不完全具备上述条件，其往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
学生用书P345
命题点 基因工程所需的工具酶分析
1.[2023新课标]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ C ）
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cli DNA连接酶连接
解析 只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，而且酶3切割产生平末端，E.cli DNA连接酶不能连接具有平末端的DNA片段，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；用酶4切割质粒会破坏标记基因，不能选择酶4切割，D错误。
通性通法
图解限制酶的选择依据
甲乙
（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择位于目的基因两端的限制酶，如图甲中可选择PstⅠ。
②不能选择目的基因内部的限制酶，如图甲中不能选择Sma Ⅰ。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①通常选择与待切割目的基因相同的限制酶，以确保出现相同的黏性末端，如图乙中的PstⅠ。
②在只有一种标记基因时，选择的限制酶不能破坏标记基因，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
2.[2023保定模拟，10分]如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
（1）a和质粒的化学本质相同，都是 DNA ，二者还具有其他共同点，如 能够自我复制 （写出一条即可）。
（2）若质粒的切割末端为，则与之连接的目的基因切割的黏性末端应为；可使用 DNA连接酶 把质粒和目的基因连接在一起。
（3）氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上作为 标记基因 ，其作用是 便于重组DNA的鉴定和筛选 。
（4）下列常在基因工程中作为载体的是（ C ）
A.苏云金杆菌抗虫基因
B.农杆菌环状RNA分子
C.大肠杆菌的质粒
D.动物细胞的染色体
（5）除质粒外，常用的载体还有 噬菌体 和 动植物病毒 等。
解析 （1）图中a是拟核DNA，拟核DNA和质粒的本质都是DNA分子，均能够自我复制。（2）DNA连接酶可以将具有互补末端的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，若质粒的切割末端为，则与之连接的目的基因切割的黏性末端应为。（3）质粒上常具有标记基因（如抗生素的抗性基因），便于重组DNA的鉴定与筛选。
考点2 基因工程的基本操作程序
学生用书P346
1.基因工程的基本操作程序
教材补遗 [选必3 P77“相关信息”]Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。
2.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR与体内DNA复制的异同
基础自测
1.基因表达载体中含有启动子和密码子。（ × ）
2.基因表达载体的构建是基因工程的核心。（ √ ）
3.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码子。（ × ）
4.Ti质粒上的T－DNA可与双子叶植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。（ √ ）
5.将重组表达载体导入动物受精卵常用基因枪法。（ × ）
6.PCR扩增时，50 ℃左右，引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合。（ √ ）
深度思考
1.构建基因表达载体时，为什么一般选用两种限制酶切割目的基因和载体？
提示 因为用不同的限制酶分别处理目的基因和载体时，可以使目的基因两侧和载体上各自具有两个不同的黏性末端，防止目的基因或载体发生自身环化及目的基因与载体反向连接。
2.启动子与起始密码子、终止子与终止密码子有什么不同？
提示 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.在构建基因表达载体时，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的识别序列，为什么？
提示 不能，因为目的基因的序列中若含有用到的限制酶的识别序列，目的基因可能会被切断。
4.在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上？
提示 Ti质粒的T－DNA是可转移的DNA，可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，就可以使目的基因进入植物细胞。
5.复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，但两条解开的DNA模板链结合的概率较低，其原因是什么？
提示 ①模板链一般较长，比引物复杂得多，重新结合的概率低；②加入引物的量足够多，而模板链较少，故引物和模板链结合的机会远大于模板链间的。
学生用书P347
命题点1 PCR的过程和应用分析
1.[2021湖北]某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ D ）
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
解析 PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量可以提高反应速率，但不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延伸的时间对延伸中的配对影响不大，故不能有效减少非特异性条带的产生，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低使引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。
2.[2022辽宁]抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ B ）
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
解析 预变性的温度为94 ℃，在这个温度下，双链DNA解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制，A错误。延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分，B正确。延伸过程需要引物与模板链结合，在引物的3'端加上相应的核苷酸，C错误。转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市，D错误。
命题点2 基因工程的基本操作程序分析
3.[2023全国乙节选，10分]GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如图所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 终止子 ；②为 启动子 ，其作用是 被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 密码子的简并使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 选择合适的运载体，利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和运载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测酵母菌是否会发黄色荧光 。
解析 （2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。（3）结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是密码子的简并使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前的相同。（4）基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的筛选与获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。
4.[2021福建节选，10分]微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
（1）根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图中甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 引物1和引物4 。
（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图中乙所示。
①选用 EcR Ⅴ 酶将载体P切开，再用 T4 DNA （填“T4 DNA”或“E.cliDNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P'。
②载体P'不具有表达MT基因的 启动子 和 终止子 。选用 Xh Ⅰ和Pst Ⅰ 酶组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入用 钙 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
解析 （1）据题中信息知，A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，若要通过PCR技术扩增MT基因，应选用引物1和引物4。（2）①通过PCR技术扩增出的MT基因的末端为平末端，载体P中有限制酶Xh Ⅰ、EcR Ⅴ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ 的酶切位点，用限制酶Xh Ⅰ、Pst Ⅰ 切割载体P得到的均为黏性末端，而用限制酶EcR Ⅴ和Sma Ⅰ 切割载体P得到的均是平末端，但不能用限制酶Sma Ⅰ 进行酶切，若用限制酶Sma Ⅰ 进行酶切，无法将目的基因插入载体E中，因此，应选用EcR Ⅴ酶将载体P切开，再用能连接平末端的T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P'。②载体P'不具有表达MT基因的启动子和终止子。再选用Xh Ⅰ 和Pst Ⅰ 酶组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入用钙离子处理的大肠杆菌中，筛出MT工程菌。
考点3 DNA的粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与鉴定
学生用书P348
1.DNA的粗提取与鉴定
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）原理
（2）方法步骤
基础自测
1.进行“DNA的粗提取”实验时，为获得较好的提取效果，应离心2次，第一次离心后应保留上清液，第二次离心后应弃去上清液，且两次离心的转速也不相同。（ √ ）
2.Taq DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶。（ √ ）
3.PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。（ × ）
4.电泳鉴定PCR产物时，应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。（ × ）
5.粗提取的DNA溶于2 ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色[2023江苏，T9D]。（ × ）
6.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解[2022山东，T13A]。（ √ ）
深度思考
1.能否选择哺乳动物的成熟红细胞作为DNA粗提取的实验材料，为什么？
提示 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体等，不含DNA。
2.DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？
提示 影响DNA分子迁移速率的因素有凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等。
学生用书P349
命题点1 DNA的粗提取与鉴定
1.[2023广东改编]“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ D ）
A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离：可去除混合物中的部分多糖、蛋白质等
C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析 “DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解、分离、沉淀、鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，分离过程中混合物中的部分多糖、蛋白质等可被去除，B正确。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度可去除杂质，反复多次以提高DNA的纯度，C正确。进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
命题点2 DNA片段的扩增与电泳鉴定
2.[2023浙江6月]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是（ B ）
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
解析 由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，且翻译的方向是沿mRNA从5'→3'，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
1.[2023辽宁]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ B ）
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
解析 由题意可知，若想使红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起，使其表达成一条多肽，则CD163基因和红色荧光蛋白RFP基因都需进行转录和翻译，再结合图示可知，CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则在翻译时会提前终止，无法表达出既含CD163蛋白又含红色荧光蛋白RFP的一整条多肽，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，A、C、D不符合题意。
2.[2023湖北]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ D ）
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pνu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
解析 若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是由含有目的基因的重组质粒形成的，也可能是由质粒自身连接的产物形成的，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用Sph Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌能在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中形成菌落，不能在含Tet（四环素）的培养基中形成菌落，D错误。
3.[2021山东]粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ A ）
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 ml/L
解析 木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，故在得到的滤液中加入适量的木瓜蛋白酶后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A符合题意。将制备的含有DNA的滤液放入60～75 ℃的水浴箱中保温10～15分钟，利用DNA和蛋白质对高温的耐受性不同，使蛋白质变性，从而更好地与DNA分离，B不符合题意。DNA不溶于体积分数为95％的冷却的酒精，因此向含有DNA的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95％的冷却的酒精后DNA会析出，C不符合题意。DNA在0.14 ml/L的NaCl溶液中的溶解度最低，因此将含DNA的NaCl溶液调至0.14 ml/L，滤液中几乎不含DNA，D不符合题意。
4.[2023山东，10分]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 RNA聚合酶 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 标记基因、复制原点 （答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 F2和R1（或F1和R2） 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物 F1 与图甲中J基因的 a链 （填“a链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 J-V5融合蛋白 ，条带2所检出的蛋白 不是 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
解析 （1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够驱动基因转录。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点等。（2）如果引物的结合位点全部位于目的基因上，则无论目的基因插入的方向如何，均可通过PCR进行扩增，因此若通过PCR检测目的基因是否正确插入，所选的一对引物中的一个必须与目的基因结合，另一个必须在目的基因外侧，这2个引物方向相反并且均指向目的基因。由以上分析可知，若要确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，则可利用图甲中引物F2和R1进行PCR扩增。若J基因没有连接到质粒中，则引物R1没有结合部位，扩增不出J基因；若J基因连接到质粒中但反向插入，则利用图甲中引物F2和R1扩增不出J基因。同理可知，还可选择图甲中引物F1和R2进行PCR扩增，以确定J基因连接到质粒中且插入方向正确。转录时mRNA的合成方向为5'→3'，又知J基因转录的模板链位于b链，所以b链左侧是3'端，右侧是5'端。PCR扩增时引物F1与模板链3'端的碱基进行互补配对，所以引物F1与图甲中J基因的b链左侧相应部分的序列互补，与a链相应部分的序列相同。（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平。分析题图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J-V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
5.[2023江苏，12分]为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 模板、引物 ，扩增程序中最主要的不同是 延伸时间 。
（2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 CD 。
A.ATGGTG……CAACCA
B.TGGTTG……CACCAT
C.GACGAG……CTGCAG
D.CTGCAG……CTCGTC
（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 限制酶、DNA连接酶 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有 ABC 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1
-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 P3、P4 。
（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列是否正确 。
解析 （1）进行PCR反应所需的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（一般要添加Mg2＋）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板、引物。扩增程序中最主要的不同是延伸的时间。（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段（AnB1），引物F1-R用于扩增F1片段（EGFP）。C选项中5'－CTGCAG－3'能与AnB1中左侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'－CTCGTC－3'能与EGFP中右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。（3）传统重组质粒构建时，会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，该过程不需要使用限制酶、DNA连接酶。（4）用稀释涂布平板法计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，稀释涂布平板不需要控制每个平板的菌落数，A错误；抗性平板上未长出菌落的原因可能是转化失败或涂布器温度过高，一般不是培养基温度太高，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能生长，故抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化微生物的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上接种后，长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。（5）EGFP的长度为720 bp，AnB1的长度为390 bp，二者的总长为720＋390＝1 100（bp），用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行PCR扩增，若质粒符合设计，则用引物F1-F和F2-R应扩增出长度为1 100 bp的片段，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。（6）电泳仅能检测DNA分子的大小，无法确定DNA分子的碱基序列是否正确，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
6.[2022辽宁节选，4分]某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。Ⅰ.N蛋白胞外段抗原制备，流程如图。
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 筛选出含目的基因（N蛋白胞外段基因）的病毒包装细胞 。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 双分子层中 （填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
（2）质粒在包装细胞内组装出由 N蛋白胞外段基因重组慢病毒质粒、辅助质粒和蛋白质外壳 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
解析 （1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，将病毒包装细胞置于含有氨苄青霉素的培养基上培养，就可以将含有目的基因（N蛋白胞外段基因）的病毒包装细胞筛选出来。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体的双分子层中。（2）质粒在包装细胞内组装出由N蛋白胞外段基因重组慢病毒质粒、辅助质粒和蛋白质外壳组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
学生用书·练习帮P529
一、选择题
1.[2024哈尔滨九中模拟]限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ A ）
A.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
B.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
解析 限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，A正确；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，B错误；E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。
2.[2024重庆南开中学模拟]常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列叙述错误的是（ B ）
A.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游
B.细胞分化与组织特异性启动子的调控有关，与组成型启动子无关
C.乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接
D.盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性
解析 启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动转录，A正确；根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”可知，细胞分化与组成型启动子有关，B错误；组织特异性启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，据此推知，乳腺生物反应器的构建需要将组织特异性启动子与目的基因连接，保证目的基因在乳腺细胞中表达，C正确；根据题干信息“诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高”可知，盐诱导型启动子在高盐环境中被激活，可增加农作物的抗逆性，D正确。
3.[2023武汉武昌区质检]关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列叙述正确的是（ B ）
A.实验中用95％的酒精预冷后可以更好地溶解DNA
B.将粗提物溶于NaCl后，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水浴鉴定
C.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液
D.还可选用新鲜菜花、香蕉或猪肝、猪血等作为本实验的材料
解析 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可初步将DNA与蛋白质分离，A错误；鉴定DNA时，将粗提物溶于NaCl，并与二苯胺试剂混合后进行沸水浴，观察颜色变化，B正确；将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去沉淀物，收集上清液，C错误；哺乳动物成熟红细胞中没有细胞核和细胞器，因此猪血不可用于“DNA的粗提取与鉴定”实验，D错误。
4.[2024福州一测]下列关于凝胶电泳实验操作，叙述错误的是（ B ）
A.加样孔应靠近负极端，以便带负电的DNA分子向正极移动
B.接通电源后电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子越小
C.紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关
D.通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳
解析 脱氧核苷酸是组成DNA分子的单体，其中的磷酸基团能解离出氢离子，使DNA分子带负电，加样孔靠近负极端，有利于DNA分子向正极移动，A正确。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA分子越小，其在凝胶中的迁移速率越快，电泳一段时间后，离加样孔越远，B错误。DNA含量越高，在紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度就越强，C正确。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，D正确。
5.[2023北京东城区二模]下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ B ）
A.PCR反应体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶
B.PCR过程中在引物的3'端添加脱氧核苷酸实现子链延伸
C.利用PCR对目的基因进行扩增时需要基因序列全部已知
D.在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补
解析 PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶，不需要添加解旋酶，A错误；合成子链时，引物先与模板链配对结合，然后在引物的3'端进行子链延伸，B正确；利用PCR对目的基因进行扩增时，知道目的基因两端的一小段序列即可，C错误；在设计两种引物时，两种引物之间的碱基序列不能互补配对，D错误。
6.[2024浙江大联考]用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切割后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并导入受体菌中。根据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（ A ）
A.质粒用限制酶HindⅢ切割后含有2个游离的磷酸基团
B.若用限制酶HindⅢ和ScaⅠ切割，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C.若用限制酶PvuⅠ切割，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D.若用限制酶SphⅠ切割，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中，待长成菌落，再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
解析 题图质粒中限制酶Hind Ⅲ的切割位点有1个，用该限制酶切割质粒，获得1个DNA片段，其含有2个游离的磷酸基团，A正确。由于题图质粒中限制酶Sca Ⅰ的切割位点有两个，若用限制酶Hind Ⅲ和Sca Ⅰ进行切割，不一定能防止目的基因和质粒的反向连接，B错误。由题图可知，氨苄青霉素抗性基因中含有限制酶Pvu Ⅰ的切割位点，若用限制酶Pvu Ⅰ切割质粒，则氨苄青霉素抗性基因会被破坏，而四环素抗性基因正常，在含有四环素的培养基中，导入重组质粒（含目的基因）或空质粒的受体菌均能形成菌落，C错误。由题图可知，四环素抗性基因中含有限制酶Sph Ⅰ的切割位点，若用限制酶Sph Ⅰ切割质粒，则会破坏四环素抗性基因，而氨苄青霉素抗性基因正常，进行筛选时，可先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中，待长成菌落（导入重组质粒的受体菌和导入空质粒的受体菌都能在含氨苄青霉素的培养基中形成菌落），再影印接种到含四环素的培养基中，在含四环素的培养基中不能生长的受体菌即为导入重组质粒的受体菌，D错误。
7.杨树被根瘤农杆菌感染后会长出瘤状物，称为冠瘿瘤。冠瘿瘤内的冠瘿碱是一种含氮有机物，这种有机物是根瘤农杆菌生存所需的碳源和氮源。冠瘿瘤的形成是由于根瘤农杆菌携带天然的Ti质粒，该质粒的结构如图所示。下列说法错误的是（ C ）
A.Ti质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用
B.Ti质粒上的T-DNA区域至少含有一个限制酶的切割位点
C.冠瘿碱合成基因在根瘤农杆菌细胞中表达并分泌到细胞外
D.根瘤农杆菌内Ti质粒的存在决定了其感染植物的范围
解析 Ti质粒上的生长素基因可随T-DNA整合到杨树细胞的染色体DNA上，并进行表达，故Ti质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用，A正确；Ti质粒上的T-DNA区域至少含有一个限制酶的切割位点，以便插入目的基因，B正确；冠瘿碱合成基因会随T-DNA整合到杨树细胞的染色体DNA上，并在杨树细胞中表达，C错误；根瘤农杆菌内Ti质粒的存在决定了其能感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，D正确。
二、非选择题
8.[写出实验思路/2024贵阳模拟，12分]研究发现作物M的品系甲有抗虫等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验：从品系乙中提取与甜度有关的S基因，通过基因重组技术，以Ti质粒为载体，以品系甲的叶片细胞为受体细胞，培育出转S基因的新品系。回答下列问题。
（1）利用PCR技术从品系乙的基因组中获取S基因时，需要在一定的缓冲液中进行，除需提供引物、原料外，还需提供的物质有 耐高温的DNA聚合酶、DNA模板 ，用于获取S基因的引物需满足的条件是 能与S基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 ，在利用PCR技术获取目的基因的过程中，4种脱氧核苷酸加在引物的 3' （填“3'”或“5'”）端。
（2）如图是S基因和载体上的限制酶的酶切位点。为了成功构建基因表达载体，确保目的基因插入载体的方向正确，最好选用限制酶 Xba Ⅰ、Hind Ⅲ 切割S基因和载体；由图可知，构建基因表达载体时，S基因须插在T-DNA上，T-DNA的作用是 将目的基因导入受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上 。
（3）若要通过实验检测S基因是否在转基因植株中表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
从转基因植株相应细胞中提取蛋白质，使用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否表达出S蛋白。
解析 （1）利用PCR技术扩增S基因时，需要有引物、4种脱氧核苷酸（原料）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、DNA模板等。用于获取S基因的引物需满足的条件是能与S基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸。PCR扩增的原理是DNA双链复制，PCR过程中，4种脱氧核苷酸加在引物的3'端。（2）据图分析，S基因上含有限制酶BamHⅠ的酶切位点，而限制酶Sal Ⅰ的酶切位点在T-DNA以外的区域，因此在构建基因表达载体时，以上两种限制酶均不能用。S基因上下游均有限制酶EcR Ⅰ的酶切位点，若使用该限制酶切割S基因和载体，则易导致目的基因、载体自身环化以及目的基因反向连接，因此最好选用限制酶Xba Ⅰ、Hind Ⅲ切割S基因和载体。构建基因表达载体时，S基因（目的基因）必须插在T-DNA上，因为T-DNA可将目的基因导入受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。（3）若要通过实验检测S基因是否在转基因植株中表达出目的蛋白，可采用抗原—抗体杂交技术进行检测，实验思路：从转基因植株相应细胞中提取蛋白质，使用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否表达出S蛋白。
9.[2023昆明质检，15分]如图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
回答下列问题。
（1）过程①选用限制酶的最佳方案是 B 。
A.EcR Ⅴ和EcR Ⅰ B.BamH Ⅰ和EcR Ⅰ
C.EcR Ⅴ和BamH Ⅰ D.只有BamH Ⅰ
（2）构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作用是 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动目的基因转录出mRNA 。
（3）为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入 青霉素 和 X-gal ，培养一段时间后挑选出 白色 （填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。实验室中通过发酵工程可以对目的菌进行扩大培养，一般选用 液体 （填“液体”或“固体”）培养基，理由是 大肠杆菌能与液体培养基中的营养物质和氧气充分接触，有利于其大量繁殖 。
（4）目的基因导入受体细胞后，常用 抗原—抗体杂交 技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳蛋白。
解析 （1）若选择EcR Ⅴ，会破坏青霉素抗性基因和目的基因，影响筛选，结合题图可知，构建重组质粒时选用限制酶的最佳方案是BamH Ⅰ和EcR Ⅰ，故选B。（2）构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动目的基因转录出mRNA。（3）转基因成功的大肠杆菌内含有青霉素抗性基因，且LacZ基因被破坏，因此需要在培养基中加入青霉素和X-gal。LacZ基因被破坏，不能分解X-gal，则菌落呈白色，有青霉素抗性基因，则大肠杆菌在含青霉素的培养基中能存活，因此若出现白色菌落，则说明基因表达载体成功转入大肠杆菌。实验室中通过发酵工程可以对目的菌进行扩大培养，一般选用液体培养基，这样大肠杆菌能与液体培养基中的营养物质和氧气充分接触，有利于其大量繁殖。（4）目的基因导入受体细胞后，检测目的基因是否翻译出蛋白质可用抗原—抗体杂交技术。
一、选择题
10.[2024武汉部分学校调研]如图是蛋白质工程中改造目的基因的一种技术路线。S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区；外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解核苷酸，产生不同长度的5'突出末端。下列叙述错误的是（ B ）
A.步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段M
B.步骤二、三分别使用了S1核酸酶、外切核酸酶Ⅲ
C.步骤四宜选用T4 DNA连接酶处理DNA片段
D.质粒载体2中目的基因片段N的长度可有多种
解析 经步骤一处理后，得到的目的基因片段一端是平末端，一端是黏性末端，则步骤一需使用两种限制酶切割目的基因片段M，A正确。经步骤二处理（用酶a处理）后，又增加了一个新的黏性末端，经步骤三处理（用酶b处理）后，黏性末端全部消失，又知S1核酸酶可以去除双链DNA突出的单链区，外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解核苷酸，则酶a最可能为外切核酸酶Ⅲ，酶b最可能为S1核酸酶，B错误。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，C正确。由于外切核酸酶Ⅲ只能从DNA双链的3'末端逐个水解单核苷酸，且水解后可以产生不同长度的5'突出末端，所以经过酶a、酶b处理后，可以得到多种目的基因片段，D正确。
11.[2024玉林联考]白细胞介素-2（IL-2）是一种免疫调节因子，化学本质是糖蛋白。科研人员将含IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K（部分结构如图所示）构建成重组质粒，并导入酵母菌GS115（组氨酸缺陷菌株）中，筛选得到了能分泌IL-2的工程菌株。下列有关叙述错误的是（ B ）
A.组氨酸合成基因可作为标记基因筛选导入重组质粒的酵母菌细胞
B.构建重组质粒时可选用Avr Ⅱ和Nt Ⅰ切割目的基因和质粒pPIC9K
C.RNA聚合酶识别并结合质粒上的启动子，驱动基因转录
D.酵母菌细胞内的内质网和高尔基体能对蛋白质进行加工修饰
解析 酵母菌GS115是组氨酸缺陷菌株，不能合成组氨酸，导入组氨酸合成基因后就可以合成组氨酸，可以用不含组氨酸的培养基筛选导入重组质粒的酵母菌GS115，A正确；据图可知，为保证目的基因（Avr Ⅱ会破坏目的基因）和启动子（Sac Ⅰ会破坏启动子）的完整性，可用EcR Ⅰ和Nt Ⅰ分别切割含有IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K，B错误；质粒上的启动子可作为RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录，C正确；酵母菌细胞是真核细胞，其含有的内质网和高尔基体能对蛋白质进行加工修饰，D正确。
12.[2023大同检测]为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中。
下列操作与实验目的不符的是（ C ）
A.用限制性内切核酸酶EcRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的农杆菌细胞
D.用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析 根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知，用限制性内切核酸酶EcR Ⅰ和DNA连接酶构建重组质粒，A不符合题意；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B不符合题意；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的农杆菌细胞，C符合题意；可采用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上，D不符合题意。
13.[2023长春模拟]用Xh Ⅰ和Sal Ⅰ 两种限制酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图1和图2所示。以下叙述错误的是（ C ）
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中泳道②的酶切产物说明该限制酶断开了4个磷酸二酯键
C.若用两种限制酶同时切割该DNA，电泳后泳道中将出现7条条带
D.图2泳道①中是用Sal Ⅰ 处理得到的酶切产物
解析 不同的限制酶识别并切割的核苷酸序列不同，图1中两种酶识别的核苷酸序列不同，A正确。分析图1和图2可知，泳道②是限制酶Xh Ⅰ的酶切产物分离结果，该DNA片段共有2个该限制酶酶切位点，所以断开了4个磷酸二酯键，B正确。由题图可知，若用两种限制酶同时切割该DNA，该DNA的每个酶切位点都会被切开，则将被切成6个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带；如果其中有片段分子大小相同，则条带数目小于6条，C错误。根据图2分析泳道①中是用Sal Ⅰ（其有3处切割位点，切割后产生4个DNA片段）处理得到的酶切产物分离结果，D正确。
14.[2023南京六校调研]大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物用作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是（ D ）
A.两轮PCR过程中复性时的温度一样
B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR的产物——DNA的两条链
D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
解析 单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，为了使引物与模板链准确配对，第二轮PCR的复性温度应比第一轮的高，A错误；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；由图可知，第二轮PCR需加入另一种侧翼引物，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
15.[情境创新/2023南通检测，多选]CAR-T细胞疗法是通过设计CAR基因，导入癌症患者的T细胞中，使其转化为CAR-T细胞，CAR-T细胞膜上的CAR蛋白与癌细胞表面抗原特异结合后，激活CAR-T细胞使其增殖、分化，从而实现对癌细胞的特异性杀伤和记忆，主要过程如图。肿瘤浸润淋巴细胞是对肿瘤起识别、抵抗和攻击作用的细胞群体。下列说法正确的是（ AD ）
A.胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞
B.CAR基因缺少启动子，无法在T细胞中复制，故过程②在导入T细胞前完成
C.重组分子导入T细胞后，应当用PCR技术检验指导CAR合成的基因是否表达成功
D.CAR-T细胞经过程④形成的效应细胞能准确识别癌细胞并引发细胞凋亡
解析 由题意可知，CAR-T细胞膜上的CAR蛋白可与癌细胞表面抗原特异结合，因此CAR蛋白的胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞，A正确；启动子能启动目的基因的转录，CAR基因缺少启动子，无法在T细胞中转录，故过程②在导入T细胞前完成，B错误；通过PCR技术可以检测目的基因是否成功插入或转录出mRNA，不能检验指导CAR合成的基因是否表达成功，C错误；CAR-T细胞经CAR蛋白的作用接受癌细胞的信息后，会增殖分化成效应细胞进而准确识别癌细胞并引发癌细胞凋亡，D正确。
二、非选择题
16.[2024广东七校第一次联考，12分]E蛋白是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟利用乳腺生物反应器合成E蛋白，主要过程如图所示。结合基因工程和胚胎工程的相关知识，回答问题。
（1）步骤①过程中需要将E基因和奶牛乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，目的是 使E基因能在乳腺细胞中特异性表达（或让E基因只在乳腺细胞中表达） 。步骤②通常采用 显微注射 法将基因表达载体导入奶牛的 受精卵 。为了提高移植后胚胎的发育率，通常需要等胚胎发育到 囊胚 阶段才进行步骤④。
（2）在进行步骤④之前，应该选取 滋养层 细胞进行性别鉴定，获取该细胞后，通过PCR反应扩增SRY基因（Y染色体上特有的性别决定基因）片段，然后对扩增产物进行检测，将检测反应呈 阴性 （填“阳性”或“阴性”）的胚胎进行胚胎移植。
（3）若要在分子水平上判断E基因是否翻译出E蛋白，可从转基因动物的乳汁中提取蛋白质，采用 抗原—抗体杂交 技术进行鉴定。
解析 （1）将目的基因与奶牛乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起的目的是让目的基因在乳腺细胞中特异性表达。将目的基因导入受体（奶牛）的常用方法是显微注射法。欲让目的基因能够在奶牛中成功表达，应该将重组载体导入奶牛的受精卵中。胚胎发育到囊胚阶段（注：由于本题中需对胚胎进行性别鉴定，胚胎需发育至囊胚阶段。）进行移植可提高移植后胚胎的发育率。（2）胚胎移植前，应选取滋养层细胞做性别鉴定。Y染色体是雄性个体中存在的染色体，而进行胚胎移植时应选择雌性的胚胎，因此获取滋养层细胞后，通过PCR反应扩增SRY基因片段，然后对扩增产物进行检测，需要选取反应呈阴性的胚胎进行移植。（3）可通过抗原—抗体杂交技术检测转基因动物的乳汁中是否含有E蛋白。
17.[角度创新/2024福州一测，15分]甜菜碱是重要的渗透调节物质。马铃薯自身不能积累甜菜碱，利用基因工程技术，可以把与甜菜碱合成相关的关键酶基因——甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）转入农作物，使其积累甜菜碱，以期达到增强抗逆性的目的。
（1）根据BADH基因的序列，甲同学设计了特异性引物进行PCR扩增以获取目的基因，他的引物设计如下（只标注了引物的部分碱基序列）
引物1：5'－CAAGACCT－3'
引物2：5'－AGGTCTTA－3'
此引物设计不合理，请说明理由： 引物1和引物2会因局部发生碱基互补配对而失效 。
（2）马铃薯外植体经 脱分化 形成愈伤组织，将其放入成功转入图1所示表达载体的农杆菌菌液中浸泡后，再在培养基中加入 潮霉素 ，从而筛选出 转入BADH基因的马铃薯细胞 。
（3）图中所示的基因表达载体需含有启动子，它是 RNA聚合酶 识别并结合的位点。现有两种启动子：组成型启动子和逆境诱导型启动子。组成型启动子能够持续、高效地启动目的基因在植物各种组织中表达，因此也会增加物质和能量的消耗，阻碍植物的生长发育。选择逆境诱导型启动子（目的基因只有在逆境诱导下才能表达）的优点是 避免外源基因持续大量表达，减少物质和能量的消耗 。
（4）为了检测目的基因是否成功导入，以从马铃薯细胞提取的DNA为模板，PCR扩增 BADH基因 片段，电泳结果如图2（1为空白对照组，2、3为转基因马铃薯组）。与3号相比，2号马铃薯株系抵抗逆境能力没有增强，可利用 PCR等 技术检测BADH基因是否转录出mRNA。
解析 （1）分析引物1和引物2的序列可知，引物1和引物2可发生局部碱基互补配对，导致引物失效，故引物设计不合理。（2）马铃薯外植体经脱分化可形成愈伤组织。据图1可知，T-DNA上含有潮霉素抗性基因，将愈伤组织放入成功转入图1所示表达载体的农杆菌菌液中浸泡后，再在培养基中添加潮霉素，可筛选出转入BADH基因的马铃薯细胞。（3）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。结合组成型启动子和逆境诱导型启动子的特点可知，逆境诱导型启动子的优点是可避免外源基因持续大量表达，减少物质和能量的消耗。（4）为了检测目的基因是否成功导入，可通过PCR等技术检测马铃薯的染色体DNA上是否插入了BADH基因或检测BADH基因是否转录出了mRNA。课标要求
核心考点
五年考情
核心素养对接
1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具；
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤；
3.DNA的提取和鉴定；
4.利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验
基因工程的基本工具
2023：重庆T12、湖北T4和T22（4）、新课标T6；
2022：湖北T24（3）；
2021：湖北T7、全国乙T38
1.科学思维——建立模型：基因工程的操作流程。分析与综合：理解基因工程的工具；PCR的原理，推断PCR反应所需的条件；根据基因表达的过程，推断目的基因检测与鉴定的方式。
2.科学探究——通过DNA的粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与鉴定的实际操作，培养科学探究能力
基因工程的基本操作程序
2023：辽宁T8和T25、江苏T22、天津T17、山东T25、湖南T19（2）、全国乙T38、浙江1月T24（5）；
2022：江苏T24、全国乙T38、辽宁T12和T24Ⅰ、天津T15；
2021：山东T25、辽宁T24、广东T22、湖北T16、全国甲T38、天津T16、江苏T23、福建T21、浙江6月T29（二）（2）；
2020：浙江7月T24和T29（二）（1）（2）、浙江1月T29（二）（2）；
2019：江苏T33、全国ⅠT38、天津T9
DNA的粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与鉴定
2023：江苏T9D、广东T11；
2022：山东T13；
2021：山东T13；
2020：海南T10；
2019：江苏T10
命题分析预测
1.基因工程是高考的重点，常以科研或生产实践为情境，考查基因工程的基本工具及基本操作程序，也常与核酸的结构、遗传的物质基础、细胞工程、胚胎工程等知识相结合进行综合考查，多以非选择题形式呈现，但也可以选择题的形式呈现。
2.预计2025年高考试题仍可能延续往年的考查形式及特点，分层设置问题，多角度考查基因工程的工具、操作程序等相关知识，同时原因分析型试题的比例将大大增加
项目
种类
作用底物
作用结果
限制酶
DNA分子
切开磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端
DNA连接酶
两个DNA分子片段
通过形成磷酸二酯键，进而形成新的DNA分子
DNA聚合酶
DNA片段、脱氧核苷酸
通过形成磷酸二酯键，进而形成新的单链DNA分子
DNA酶
[10] DNA分子
断开磷酸二酯键，形成脱氧核苷酸
解旋酶
双链DNA分子
断开碱基对间的氢键，形成单链DNA分子
RNA聚合酶
DNA片段、核糖核苷酸
通过形成磷酸二酯键，进而形成单链RNA分子
类型
PCR
体内DNA复制
时期
人工控制，随时进行
有丝分裂和减数分裂前的间期
场所
细胞外
细胞内
解旋方式
90 ℃以上高温条件下变性解旋
解旋酶催化
酶
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶等
子链合成方式
从两条引物的3'端开始连续合成
一条连续合成，另一条不连续合成
结果
扩增DNA片段或基因
合成整个DNA分子
相同点
①都需要DNA模板、引物、能量和一定的温度条件；②都遵循碱基互补配对原则；③DNA的合成都是从子链的5'端向3'端延伸
项目
本质
位置
功能
启动子
DNA片段
目的基因上游
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
终止子
DNA片段
目的基因下游
使转录在所需要的地方停下来
起始密码子
mRNA上三个
相邻的碱基
mRNA首端
翻译的起始信号（编码氨基酸）
终止密码子
mRNA上三个
相邻的碱基
mRNA尾端
翻译的结束信号（不编码氨基酸）