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三年（2022-2024）高考生物真题分类汇编（全国通用）专题18 基因工程（原卷版）
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这是一份三年（2022-2024）高考生物真题分类汇编（全国通用）专题18 基因工程（原卷版），共28页。
考点01 基因工程的基本工具
1．（2024·山东）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
2．（2024·湖南）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
3．（2024·安徽）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
4．（2024·河北）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
5．（2024·山东）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
6．（2023·重庆）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI和CfI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．cli连接酶或T4连接酶
7．（2023·广东）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
8．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
9．（2022·山东）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
考点02 基因工程的基本操作程序
10．（2024·山东）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
A．①②B．②③C．①④D．③④
（2024·浙江）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
11．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
12．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1号和6号B．2号和4号
C．3号和5号D．1号、2号、4号和6号
13．（2024·吉林）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
14．（2024·湖南）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列正确的是（ ）
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
15．（2024·贵州）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
16．（2024·北京）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
17．（2024·安徽）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
18．（2024·甘肃）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。
注：混1和混2表示三种酶的混合物
19．（2024·吉林）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 和 。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
20．（2024·广东）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
21．（2024·全国）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
22．（2024·全国）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。
23．（2024·浙江）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示）
回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。
(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。
(3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示）
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。
24．（2024·浙江）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
25．（2023·辽宁）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163基因中编码起始密码子的序列
B．CD163基因中编码终止密码子的序列
C．RFP基因中编码起始密码子的序列
D．RFP基因中编码终止密码子的序列
26．（2023·湖北）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
27．（2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
28．（2023·山西）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
29．（2023·河北）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的 组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
30．（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基因表达载体被EcR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。
31．（2023·山东）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
32．（2023·湖南）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是 。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为 ）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
33．（2023·广东）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。
34．（2023·全国）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
35．（2023·全国）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
36．（2022·辽宁）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
37．（2022·天津）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入XhⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含 （EcRⅠ∕HindⅢ∕XhⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
38．（2022·重庆）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是 。
(2)步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
39．（2022·江苏）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0ml/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
40．（2022·河北）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有 （写出两点即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是 （写出两点即可）。
41．（2022·山东）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
42．（2022·浙江）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
43．（2022·全国）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
考点03 基因工程和蛋白质工程的应用
44．（2024·江西）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．cliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．cliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．cliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．cliA和E．cliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
45．（2024·浙江）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下：
筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X
回答下列问题：
(1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。
(2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。
(3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。
(4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。
46．（2024·河北）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Ns为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可）
47．（2023·湖南）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
48．（2023·天津）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为 (从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后，需要将菌株1在 的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图 的排布方式。
49．（2022·浙江）羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc，但不发病。当羊感染了PrPSc后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后，小鼠也会发病。下列分析合理的是（ ）
A．动物体内的PrPSc可全部被蛋白酶水解
B．患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C．产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D．给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc，小鼠不会发病
50．（2022·湖南）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。
考点
三年考情（2022-2024）
命题趋势
考点1 基因工程的基本工具
2024·山东、湖南、安徽、河北、山东
2023·重庆、广东、江苏
2022·山东
从近三年全国各地的高考试题来看，常出现的考点是基因工程的基本工具、基因工程的基本操作程序和基因工程和蛋白质工程的应用，此部分内容集中在非选择题部分考察。
考点2 基因工程的基本操作程序
2024·山东、浙江、吉林、湖南、贵州、北京、安徽、甘肃、广东、全国
2023·辽宁、湖北、浙江、山西、河北、辽宁、山东、湖南、广东、全国
2022·辽宁、天津、重庆、江苏、河北、山东、浙江、全国
考点3 基因工程和蛋白质工程的应用
2024·江西、浙江、河北
2023·湖南、天津
2022·浙江、湖南
反应管
加入的单链DNA
①
5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
②
5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③
5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④
5'-TTCACTGGCCAGT-3'
检测用菌株
蔗糖
NV酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌株
+
+
+
生物质原料
降解率（%）
协同系数
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麦秸秆
7.08
6.03
8.19
8.61
26.98
74.33
114.64
玉米秸秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR目的产物约为 bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
考点01 基因工程的基本工具
1．（2024·山东）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
2．（2024·湖南）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
3．（2024·安徽）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
4．（2024·河北）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
5．（2024·山东）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
6．（2023·重庆）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI和CfI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．cli连接酶或T4连接酶
7．（2023·广东）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
8．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
9．（2022·山东）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
考点02 基因工程的基本操作程序
10．（2024·山东）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
A．①②B．②③C．①④D．③④
（2024·浙江）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
11．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
12．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1号和6号B．2号和4号
C．3号和5号D．1号、2号、4号和6号
13．（2024·吉林）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
14．（2024·湖南）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列正确的是（ ）
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
15．（2024·贵州）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。
(3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。
16．（2024·北京）学习以下材料，回答（1）～（4）题。筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
17．（2024·安徽）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
18．（2024·甘肃）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。
注：混1和混2表示三种酶的混合物
19．（2024·吉林）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 ，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 和 。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
20．（2024·广东）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
21．（2024·全国）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
22．（2024·全国）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。
23．（2024·浙江）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示）
回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。
(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。
(3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示）
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。
24．（2024·浙江）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
25．（2023·辽宁）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163基因中编码起始密码子的序列
B．CD163基因中编码终止密码子的序列
C．RFP基因中编码起始密码子的序列
D．RFP基因中编码终止密码子的序列
26．（2023·湖北）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
27．（2023·浙江）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
28．（2023·山西）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
29．（2023·河北）单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题：
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的 组，样品2有特异性扩增产物，结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时，还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高， ，最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。（答出两点即可）
30．（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
(5)目的基因（不含EcRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是 。正确连接的基因表达载体被EcR Ⅰ酶切后长度为 kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR的模板。
31．（2023·山东）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
32．（2023·湖南）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是 。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为 ）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
33．（2023·广东）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。
34．（2023·全国）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
35．（2023·全国）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
36．（2022·辽宁）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
37．（2022·天津）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入XhⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含 （EcRⅠ∕HindⅢ∕XhⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
38．（2022·重庆）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是 。
(2)步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
39．（2022·江苏）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0ml/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
40．（2022·河北）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有 （写出两点即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是 （写出两点即可）。
41．（2022·山东）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
42．（2022·浙江）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
43．（2022·全国）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
考点03 基因工程和蛋白质工程的应用
44．（2024·江西）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．cliA．构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．cliB。下列叙述正确的是（ ）
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．cliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．cliA和E．cliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
45．（2024·浙江）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下：
筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X
回答下列问题：
(1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。
(2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。
(3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。
(4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。
46．（2024·河北）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Ns为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可）
47．（2023·湖南）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
48．（2023·天津）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法
同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为 (从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后，需要将菌株1在 的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。
(4)表达载体的构建 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图 的排布方式。
49．（2022·浙江）羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc，但不发病。当羊感染了PrPSc后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后，小鼠也会发病。下列分析合理的是（ ）
A．动物体内的PrPSc可全部被蛋白酶水解
B．患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C．产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D．给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc，小鼠不会发病
50．（2022·湖南）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。
考点
三年考情（2022-2024）
命题趋势
考点1 基因工程的基本工具
2024·山东、湖南、安徽、河北、山东
2023·重庆、广东、江苏
2022·山东
从近三年全国各地的高考试题来看，常出现的考点是基因工程的基本工具、基因工程的基本操作程序和基因工程和蛋白质工程的应用，此部分内容集中在非选择题部分考察。
考点2 基因工程的基本操作程序
2024·山东、浙江、吉林、湖南、贵州、北京、安徽、甘肃、广东、全国
2023·辽宁、湖北、浙江、山西、河北、辽宁、山东、湖南、广东、全国
2022·辽宁、天津、重庆、江苏、河北、山东、浙江、全国
考点3 基因工程和蛋白质工程的应用
2024·江西、浙江、河北
2023·湖南、天津
2022·浙江、湖南
反应管
加入的单链DNA
①
5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
②
5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③
5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④
5'-TTCACTGGCCAGT-3'
检测用菌株
蔗糖
NV酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌株
+
+
+
生物质原料
降解率（%）
协同系数
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麦秸秆
7.08
6.03
8.19
8.61
26.98
74.33
114.64
玉米秸秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR目的产物约为 bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
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