浙科版高考生物一轮复习第9单元生物技术与工程第30讲发酵工程课件

这是一份浙科版高考生物一轮复习第9单元生物技术与工程第30讲发酵工程课件，共60页。PPT课件主要包含了总结归纳，梯度稀释，稀释涂布平板，8×106，工业发酵，微生物的连续培养装置，结构和数目，菌落形态，腐草霉素抗性，启动子和终止子等内容，欢迎下载使用。

考点一　微生物的培养需要适宜条件
特别提醒(1)在满足微生物生长所需的各种物质的同时,还要考虑微生物生活所需要的能量来源。①异养型微生物能量来源:培养基中的有机物。②自养型微生物能量来源:光能或化学反应释放的能量。(2)在配制固体培养基时,加入的琼脂仅作为凝固剂,不能为微生物的生长提供能量和碳源等。(3)由于细胞与固体培养基的接触面积较小,细胞与环境间物质交换速度相对较慢,因此微生物在固体培养基表面的生长速度比在液体培养基中慢。(4)进行恒温培养时,如果正放培养皿,则皿盖上形成的水滴会落到培养基表面并且扩散开,会冲散菌体,污染菌落,达不到分离的目的,因此恒温培养时,培养皿必须倒置。
[练一练]1.判断下列说法正误。(1)“细菌喜荤,霉菌喜素”的意思是在配制培养基时要考虑不同微生物的代谢特性。(　　)(2)加入固体培养基中的凝固剂琼脂不仅起到凝固的作用还能被微生物利用,如可以提供碳源。(　　)提示 琼脂作为凝固剂只起到凝固的作用。
(3)接种环用高压蒸汽灭菌法进行灭菌,涂布器在使用的过程中常通过灼烧灭菌。(　　)提示 涂布器一般浸泡在75%的酒精中,使用前在酒精灯火焰上进行灼烧,接种环在使用的过程中常通过灼烧灭菌。(4)尿素和葡萄糖可以采用已在121 ℃下高压蒸汽灭菌的、孔径最小的G6玻璃砂漏斗进行过滤除菌后,再在超净工作台内添加到培养基中。(　　)
2.结合选择性必修3第7页“小资料”思考:灭菌、消毒和防腐的方法和结果分别是什么?
考向一　培养基(含配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基)[典例1]培养基可为目标微生物提供适宜的生长环境,下列叙述错误的是(　　)A.在LB培养基中加入甘露醇可为醋酸菌提供碳源B.在LB培养基中加入较高浓度氯化钠可筛选嗜盐细菌C.将蔗糖豆芽汁培养基的pH调成碱性有利于霉菌生长D.尿素固体培养基的尿素可为目标微生物提供氮源
解析 醋酸菌培养基中甘露醇的主要作用是提供碳源,而且也可以调节培养基的渗透压,A项正确;在LB培养基中加入较高浓度氯化钠,只有耐受高氯化钠浓度的微生物才能够在上面生存,从而可筛选嗜盐细菌,B项正确;霉菌适合在中性偏酸的环境中生长,C项错误;尿素可为目标微生物提供氮源, D项正确。
易错提示(1)不是所有微生物的培养基中都需要加入碳源、氮源。自养型微生物能利用无机碳源(如空气中的CO2),培养基中不用添加碳源;固氮微生物可利用N2,培养基中不用加入氮源。(2)培养基分装时不要让培养基粘附在三角瓶口、试管口、培养皿内壁上,以避免非目标微生物污染。(3)实验室常用的LB液体培养基的两种成分
[对点练] 1.(2023浙里卷天下高三百校联考)下列关于斜面培养基的叙述,错误的是(　　)A.灭菌过的固体培养基注入试管,将试管斜放在台面上凝固后制成B.常用于菌种的筛选C.可以用接种环进行划线接种D.优点是能增大接种面积、厚度增大、营养丰富等
解析 斜面培养基的制作应将灭菌过的固体培养基定量分装于试管内,将试管斜放在台面上凝固后制成,A项正确;斜面培养基可用于菌种的保存,B项错误;斜面培养基是固体培养基的一种,可以用接种环进行划线接种,C项正确;斜面培养基的优点是能增大接种面积、厚度增大、营养丰富等,D项正确。
2.下表是某同学培养微生物时配制的培养基,下列关于此培养基的说法,错误的是(　　)
A.培养基中的KH2PO4和Na2HPO4可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定B.葡萄糖可被微生物分解为丙酮酸,丙酮酸为该菌生长提供碳源和能源C.此固体培养基可用于土壤中分解尿素细菌的分离与计数D.培养基中加入酚红指示剂后,生成的菌落周围可能会变红
解析 无机盐可以作为缓冲剂能保持细胞生长过程中pH稳定,所以培养基中KH2PO4和Na2HPO4的作用之一是作为缓冲剂保持pH稳定,A项正确;葡萄糖作为碳源,可被微生物分解成丙酮酸,丙酮酸可为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料,B项错误;此固体培养基以尿素为唯一的氮源,可用于土壤中分解尿素细菌的分离与计数,C项正确;尿素分解菌将尿素分解成氨,使培养基pH升高,加入酚红指示剂后,生成的菌落周围可能会变红,D项正确。
考向二　灭菌和无菌操作技术[典例2](2023浙江金华一模)在一些传统食品的制作过程中,灭菌、消毒、防腐等是控制有害微生物的常用方法。下列叙述错误的是(　　)A.金华火腿制作过程中盐腌等防腐措施能抑制微生物生长繁殖B.微生物发酵培养基中均要添加一定量的抗生素以防止杂菌污染C.泡菜的制作过程中发酵装置清洗消毒后无需严格的高压蒸汽灭菌D.果酒和果醋制作过程中发酵产物对有害微生物有一定抑制作用
解析 金华火腿制作过程中盐腌等防腐措施能抑制微生物生长繁殖,这是因为食盐的主要成分是NaCl,当细胞的盐浓度过高就会导致微生物细胞失水,从而失去活性,A项正确;微生物培养基中会根据实际情况确定是否需要添加抗生素,并不是所有的培养基中都需要添加抗生素,如培养细菌的培养基中不能添加抗生素,B项错误;泡菜的制作过程中发酵装置清洗消毒后无需严格的高压蒸汽灭菌,这是因为整个发酵过程中乳酸菌产生大量的乳酸,使得其他细菌的活动受到抑制,C项正确;果酒和果醋制作过程中发酵产物分别是乙醇和醋酸,二者对有害微生物都具有一定的抑制作用,D项正确。
易错提示(1)消毒和灭菌的原理都是使微生物的蛋白质和核酸变性,借此杀死微生物。(2)无菌技术既要考虑效果,又要考虑操作对象的承受能力,例如活体生物材料、操作者的双手等只能消毒,而不能灭菌。(3)使用高压灭菌锅时,一定要将锅内冷空气彻底排出后,才能密闭升温,否则,可能造成锅内压力达到设定值而温度不能达到要求。(4)使用过的器皿、废弃物等都必须先经过高压灭菌再洗涤或倾倒,以免污染环境。
[对点练] 3.(2023浙江衢州质检)无菌操作是微生物培养过程中的关键环节,下列叙述错误的是(　　)A.煮沸可以杀死微生物细胞和一部分芽孢,达到消毒目的B.培养真菌时,在培养基中加入青霉素可抑制某些细菌的生长C.在酒精灯火焰旁操作可以减少空气中微生物落入培养基的可能性D.含葡萄糖的培养基需在121 ℃(1 kg/cm2)条件下高压蒸汽灭菌20 min
解析 葡萄糖在115 ℃以上会焦化,因此对含葡萄糖的培养基,应采用适当降低温度、压力(112 ℃,500 g/cm2)以及延长时间(30 min)的高压灭菌方法灭菌,D项错误。
4.(2022浙江Z20名校联盟第三次联考)防止杂菌污染和获得纯净微生物培养物是研究和应用微生物的前提,也是发酵工程的重要基础。下列关于无菌操作技术的叙述,正确的是(　　)A.将培养基转移到三角瓶和试管中时必须使用三角漏斗B.接种环在划线前后都要进行灼烧并立即划线以免灭菌失效C.无菌技术只能用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染D.高压蒸汽灭菌时,灭菌时间应从高压蒸汽灭菌锅开始加热时计时
解析 将培养基转移到三角瓶和试管中时必须使用三角漏斗,A项正确;接种环在划线前后都要进行灼烧并在冷却后才可划线,以免高温杀灭菌种,B项错误;无菌技术能用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染,还能有效避免操作者自身被微生物感染,C项错误;高压蒸汽灭菌时,灭菌时间应从高压蒸汽灭菌锅达到要求温度时开始计时,直至灭菌完成为止,D项错误。
考点二　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
1.平板划线法与稀释涂布平板法
特别提醒(1)利用选择培养基分离纯化某种微生物①在基本培养基中加入青霉素可分离纯化酵母菌、霉菌;在基本培养基中加入高浓度的食盐可分离纯化金黄色葡萄球菌。②普通培养基在无氧条件下培养可分离出厌氧型、兼性厌氧型微生物;在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。③不含氮源的培养基:分离纯化固氮菌。④不含有机碳源的培养基:分离纯化自养型细菌,如硝化细菌。
(2)利用鉴别培养基检验某种微生物是否存在鉴别培养基是根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而的,用以鉴别不同种类的微生物。例如,在培养基中加入伊红和亚甲蓝,可以鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌,生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色,并带有金属光泽。
2.微生物的计数方法
特别提醒(1)血细胞计数板血细胞计数板有两种规格,如图所示,对于16×25的规格而言,计四角的4个中方格共计100个小方格中的个体数量;而对于25×16的规格而言,计四角和正中间的(共5个)中方格共计80个小方格中的个体数量。
(2)计算方法(以25×16为例)大方格长度为1 mm,高度为0.1 mm(即规格为1 mm×1 mm×0.1 mm),则每个大方格的体积为0.1 mm3(10-4 mL),故1 mL菌液中细胞个数=(80个小方格细胞总数/80)×400×104×稀释倍数。(3)注意事项在计数每一中方格中的细胞数时,为了避免重复计数压在中方格边缘线上细胞的数目,应只计数每一中方格上方和左侧线条上的细胞数,即“计上不计下,计左不计右”。
[练一练]判断下列说法正误。(1)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落,都可用于细胞计数。(　　)提示 平板划线法不能用于细胞计数。(2)用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,其原理是当样品稀释度足够高时,平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌。(　　)
(3)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物,而保留利用尿素的微生物。(　　)提示 以尿素为唯一氮源的固体培养基是选择培养基,能利用尿素的微生物在培养基上能生长,其他微生物不能生长,而不是迅速杀死其他微生物。(4)用血细胞计数板计数时,为了保证结果的可信度,消除误差,应对同一红细胞计数区中的细胞数进行3次计数后取平均值,再按比例进行换算。(　　)
考向一　平板划线法和稀释涂布平板法(含活动“接种、培养并分离酵母菌”)[典例1](2023浙江1月选考)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌,进行了如下实验:取泡菜汁样品,划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基,经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是(　　)A.培养基pH需偏碱性B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种C.需在无氧条件下培养D.分离得到的微生物均为乳酸菌
解析 乳酸菌经过无氧呼吸产生乳酸,故其生活的环境偏酸性,培养基pH需偏酸性,A项错误;平板划线接种时不需要稀释,B项错误;乳酸菌是厌氧型微生物,所以需在无氧条件下培养,C项正确;参与泡菜发酵的微生物有植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等,所以分离得到的微生物除了乳酸菌,还会有其他耐高盐的微生物,D项错误。
[对点练] 1.(2023浙江精诚联盟三模)下图为不同稀释度的酵母菌培养液涂布后的实验结果图,下列叙述正确的是(　　)A.实验中使用接种环完成上述涂布过程B.涂布时应避免涂布到琼脂边缘,因为沿着琼脂边缘计数菌落更加困难C.酵母菌扩大培养过程中需要使用液体培养基静置培养D.计数10-5稀释度下培养皿的菌落数,可以计算出每毫升培养液的酵母细胞个数
解析 由图可知,培养基上菌落分布均匀,使用的接种方法应为稀释涂布平板法,故应用涂布器完成上述涂布过程,A项错误;由于菌落生长在琼脂边缘时,容易连成片,不易计数,故涂布时应避免涂布到琼脂边缘,B项正确;酵母菌在氧气充足的条件下大量增殖,酵母菌扩大培养过程中需要使用液体培养基振荡培养,增大培养液中氧气的含量,C项错误;符合计数的培养基上的菌落数在30~300之间,10-5稀释度下培养皿的菌落数很少,故不可用于计算每毫升培养液的酵母细胞个数,D项错误。
2.(2023浙江嘉兴二模)将两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌(菌株a和b)进行如图所示的实验。下列叙述正确的是(　　)A.基本培养基中包含菌株a和b的生长因子B.菌株a和b需要的生长因子一定有所不同C.接种至基本培养基时宜用划线分离法D.基本培养基出现的少量菌落皆为单菌落
解析 单独培养菌株a和b时,培养基中均无菌落,而当a和b共同培养时,培养基中有少量菌落产生,因此培养基中不含菌株a和b的生长因子,A项错误;a单独培养和b单独培养均不能生长,a和b混合培养能生长,说明它们能够相互提供相应的生长因子,因此它们所需要的生长因子一定有所不同,B项正确;根据菌株a和菌株b混合后菌落的分布情况可知,接种至基本培养基时宜用稀释涂布平板法,C项错误;基本培养基出现的少量菌落为同时含有菌株a和b的复合菌落,D项错误。
考向二　能分解尿素的微生物的分离与计数[典例2](2023浙江杭州联考)如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析,下列说法错误的是(　　)A.某一稀释度下至少涂3个平板,该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少B.3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个D.该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照,用以判断选择培养基是否有选择作用
解析 设置重复组,增强实验的说服力与准确性,故某一稀释度下至少涂3个平板,稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落的情况,使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要少,A项正确;据图可知,将10 g土样加到90 mL无菌水中定容至100 mL后,此时土样稀释倍数为10倍,再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品,故3号试管中样品的稀释倍数是104倍,B项正确;5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3×106÷0.1=1.7×109(个),C项错误;要判断选择培养基是否起到选择作用,需设置接种了菌液的牛肉膏蛋白胨培养基在相同培养条件下作对照,若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落类型多于选择培养基上的菌落类型,则说明选择培养基起到了选择作用,D项正确。
[对点练] 3.“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验中,在尿素固体培养基中生长的尿素分解菌直接利用的氮源是(　　)A.尿素B.氨C.琼脂糖D.蛋白胨
解析 尿素分解菌分泌脲酶,将尿素降解为氨,氨可作为其生长的氮源。
4.(2023浙江宁波十校联考)甘蔗既是人们喜爱的一种食品,又是制取蔗糖的重要原材料。甘蔗渣除用作燃料、造纸等之外,近年来研究人员还发现其有其他经济价值。回答下列问题。(1)甘蔗渣中含有一种多酚类物质,该物质具有预防鸡和鸡蛋感染沙门氏菌的作用,因而能够降低鸡的死亡率。该物质可用萃取法提取。萃取前需将原料干燥和粉碎,干燥和粉碎目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(2)为了解甘蔗渣中微生物数量,称取1 g甘蔗渣样品,转入99 mL无菌水中,经　　　　　　后,获得细胞密度不同的菌悬液。用　　　　　　　法将0.1 mL稀释液接种于培养基上,其中104倍稀释度的菌悬液培养后平均长出了88个菌落,则每克甘蔗渣微生物数量为　　　　　　个。 
有利于萃取剂溶解该多酚类物质,使原料与萃取剂充分接触
(3)甘蔗渣中富含纤维素,人们发现醋酸菌也能合成纤维素,因此筛选出的优良菌株可以用于工业化生产细菌纤维素。培养筛选得到的醋酸菌时,在液体培养基中加入乙醇作为　　　　。经多次传代培养以获得目标菌株。此外,选育优良菌株的方法还有　　　　　　　　　　　　　　　　等。
诱变育种、基因工程育种
解析 (1)萃取前将原料干燥、粉碎的目的是有利于萃取剂溶解该多酚类物质,使原料与萃取剂充分接触。(2)经梯度稀释后,用稀释涂布平板法取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上,其中104倍稀释的菌悬液培养后平均长出了88个菌落,则该样本中每克甘蔗渣约含微生物=88÷0.1×104=8.8×106(个)。(3)在缺少糖源的液体培养基中,醋酸菌以乙醇为碳源,先把乙醇氧化为乙醛,再把乙醛氧化为乙酸。选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。
考点三　发酵工程为人类提供多种多样的产品
1.传统发酵——果酒、果醋和泡菜制作
特别提醒(1)果酒制作的初期,发酵液中酵母菌数目增多,后期不再增多;在果醋制作的任何阶段,只要条件适宜,发酵液中醋酸菌数目可以不断增多,在发酵液表面形成菌膜。(2)在制作泡菜前,可以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”,其可提供乳酸菌菌种,缩短腌制时间。
特别提醒(1)工业发酵所用菌种需要满足的5个条件:①选择高产的菌种,使菌种的发酵产物中,需要的产物多,不需要的产物少。②培养基来源充足且廉价,被转化的效率高。③菌种发酵产物易于分离。④菌种对环境没有明显或潜在的危害。⑤菌种的遗传特性和生产能力稳定。(2)分离或提纯发酵产品:①如果发酵的产品是菌体本身,可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来。
②如果发酵产品是微生物的代谢产物,则可采用真空发酵、吸附发酵、萃取发酵等方法进行提取。
[练一练]1.判断下列说法正误。(1)生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同,但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌。(　　)(2)用白萝卜制作泡菜的过程中,采用向容器中通入无菌空气的方法可缩短腌制时间。(　　)提示 可采用将白萝卜切成小块、添加已经腌制过的泡菜汁、用沸水短时处理白萝卜块等方法缩短腌制时间。制作泡菜需要无氧的环境。
(3)不同微生物或同种微生物在不同环境条件下进行的代谢活动,所形成的代谢产物不同,制成的发酵食品的风味也就不同。(　　)(4)发酵工程的产品如果是微生物细胞本身,可以采用过滤、沉淀、萃取发酵等方法提取。(　　)提示 发酵工程的产品如果是微生物细胞本身,可采用过滤、沉淀等方法提取,萃取发酵适用于微生物代谢产物的提取。
2.结合选择性必修3第33页“小资料”思考:谷氨酸发酵的培养基成分主要有葡萄糖、氨水、磷酸盐、生物素等,发酵装置如图所示。某厂用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸,结果代谢物中出现了大量的乳酸,从发酵条件看,其原因很可能是什么?
提示 发酵过程中通气量不足。
3.长句训练。用高产醋酸菌制作苹果醋,苹果酸和醋酸等总酸达到一定浓度时不再增加,其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
提示 乙醇消耗完毕或酸度过高抑制醋酸菌的代谢活动
考向一　传统发酵——果酒、果醋和泡菜制作[典例1](2023浙江6月选考节选)小曲白酒清香纯正,以大米、大麦、小麦等为原料,以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌,还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。
关于小曲白酒的酿造过程,下列叙述错误的是(　　)A.糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖B.发酵液样品的蒸馏产物有无酒精,可用酸性重铬酸钾溶液检测C.若酿造过程中酒变酸,则发酵坛密封不严D.蒸熟并摊晾的原料加入糟醅,立即密封可高效进行乙醇发酵
解析 酵母菌不能直接利用淀粉发酵产生酒精(乙醇),霉菌分泌的淀粉酶可将淀粉水解为葡萄糖,以供发酵利用,该过程称为糖化,A项正确。酸性的重铬酸钾与酒精反应呈灰绿色,可用于检测发酵液样品的蒸馏产物中有无酒精,B项正确。酿造过程应在无氧条件下进行,若发酵坛密封不严,会有空气进入,导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸,C项正确。蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅,以免高温杀死菌种,且需要在有氧条件下培养一段时间,让酵母菌大量繁殖,此后再密封进行乙醇发酵,D项错误。
易错提示(1)果酒和果醋发酵过程中发酵液的变化①放出气体:由于发酵作用,葡萄汁中的糖大部分转变为CO2、C2H5OH及少量的发酵副产品。②放热:发酵过程产热,会使发酵液温度上升,但乙醇发酵温度应控制在25 ℃左右。③颜色变化:发酵过程中,果皮上的色素及其他成分逐渐进入发酵液中。
(2)泡菜制作时的注意事项①蔬菜应新鲜,若放置时间过长,蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。②要控制好盐水的浓度:配制盐水时,盐水浓度过高,会使乳酸发酵受到抑制,泡菜“咸而不酸”;盐水浓度过低,杂菌易繁殖,泡菜易变质。③泡菜制作前盐水煮沸的目的:一是除去水中的氧气,二是杀灭盐水中的其他微生物。④防止杂菌污染:每次取样用具要洗净,并迅速封口。⑤泡菜坛要选择密闭性好的容器,以创造无氧环境,有利于乳酸菌发酵,防止蔬菜腐烂。⑥泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水,以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境,并注意在发酵过程中经常向水槽中补水。⑦控制适宜的温度:控制在室温即可,否则不利于乳酸发酵。
[对点练] 1.(2023浙江宁波十校联考)下列关于传统发酵技术应用的叙述,正确的是(　　)A.腌制泡菜时,发酵温度过低可能会使泡菜“咸而不酸”B.啤酒发酵过程中,需始终保持严格的无菌和厌氧环境C.在果酒基础上进行醋酸发酵时,产生的气泡量明显增加D.制作泡菜时,泡菜坛只能装八成满以利于乳酸菌繁殖
解析 泡菜“咸而不酸”可能是食盐浓度过高或发酵温度过低,抑制乳酸菌发酵产生乳酸,A项正确;啤酒发酵过程中,为了缩短发酵时间,发酵初期应适当提供氧气,有利于酵母菌进行需氧呼吸快速繁殖,B项错误;果酒发酵时会产生二氧化碳,醋酸发酵过程中无气体产生,C项错误;制作泡菜时,泡菜坛只能装八成满,主要是为了防止发酵液溢出,此外也防止装得过满,盐水无法淹没材料而腐烂,D项错误。
考向二　工业发酵[典例2](2023浙江台州第二次教学质量评估)产黄青霉是青霉素工业生产的常用菌,利用诱变育种和基因工程育种方法获得高产菌并进行发酵生产。回答下列问题。(一)菌种的选育及保存。(二)发酵过程及产物分离纯化。发酵流程为:活化培养→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐(发酵)→放罐。
(1)诱变育种。在山梨醇溶液中用酶水解产黄青霉细胞壁,得到原生质体,推测山梨醇溶液的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。用15 W的紫外线在距离培养瓶20 cm处照射产黄青霉原生质体,诱发其发生变异。为检测是否发生变异,可利用显微镜观察其细胞核中染色体　　　　　　　　　变化,也可以接种到固体培养基上,经培养后观察　　　　　　　　变化。
防止原生质体被破坏(维持较高渗透压)
(2)基因工程育种。①将产黄青霉涂布于三种抗生素的一系列不同浓度的平板上,在26 ℃培养箱中培养12 h,研究菌落的生长情况。结果发现,四环素浓度达250 μL/mL,菌落数开始减少,氯霉素浓度高达500 μL/mL,菌落仍然能正常生长,10 μL/mL腐草霉素足以抑制菌落生长。据此推测,应该选用　　　 　　　基因作为筛选标记基因。 ②获得促进产黄青霉大量合成青霉素的目的基因,经PCR扩增后,连接到真菌表达载体上,真菌表达载体上除了有标记基因、复制起点还有　　　　　　　　　　　,使目的基因得以表达。 ③利用PEG介导的原生质体转化法将表达载体导入产黄青霉原生质体。影响转化效率的因素除表达载体的大小和数量、PEG浓度及外界因素外,还有　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　等(写出2点)。 
原生质体数量、原生质体生理状态、PEG作用时间
(3)菌种保存。以上两种方法筛选得到的高产菌,一般通过制备繁殖体孢子,利用真空干燥,低温长期保存。采用孢子保存而不直接保存菌丝的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)发酵条件的控制:产黄青霉菌丝生长温度为27 ℃左右,分泌青霉素温度为20 ℃左右。所以种子罐的温度一般要比发酵罐的　　　。产黄青霉培养基的pH应控制为　　　　　　　　　　,增加培养基中溶氧量的方法有控制通入无菌空气的速度和控制　　　　速度。发酵过程会产生泡沫,需要用消沫剂除去泡沫,以提高发酵效率。下列哪些因素会使发酵液产生的泡沫增多?　　　　。 A.发酵菌细胞呼吸产气增多B.加速搅拌发酵液C.通气增多D.培养基黏度高
孢子处于休眠状态,不易突变
(5)产物的分离纯化:发酵过程结束后,可通过　　　　　　　　　　得到发酵液,加少量絮凝剂沉淀蛋白后,根据青霉素易溶于有机溶剂的特性,可采用　　　　的方法进一步分离纯化。 
解析 (1)为得到原生质体,加入一定浓度的山梨醇溶液,其作用主要是维持渗透压。染色体变异分为染色体结构变异和染色体数目变异,为了检测是否发生变异,可利用显微镜观察其细胞核中染色体结构和数目的变化,菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等,当产黄青霉发生变异时,其菌落形态也有可能发生变化,因此可以将其接种到固体培养基上,经培养后观察菌落形态变化。
(2)①标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选,产黄青霉对腐草霉素最敏感,因此可以用腐草霉素抗性基因作为筛选标记基因。②基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤,基因表达载体包括目的基因、复制起点、启动子、终止子和标记基因等。③利用PEG介导的原生质体转化法将表达载体导入产黄青霉原生质体,影响转化效率的因素包括表达载体的大小和数量、PEG浓度及外界因素、原生质体数量、原生质体生理状态、PEG作用时间等。(3)在保存菌种时,由于孢子处于休眠状态,不易突变,故常采用孢子保存而不直接保存菌丝。
(4)产黄青霉菌丝生长温度为27 ℃左右,分泌青霉素温度为20 ℃左右,种子罐是为了扩大菌种的数量,发酵罐是为了得到发酵产物,因此种子罐的温度一般要比发酵罐的高。培养霉菌时,需要将培养基调至中性偏酸,产黄青霉菌是霉菌,故应将pH应控制为中性偏酸。发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧量、通气量与转速等发酵条件,增加培养基中溶氧量的方法有控制通入无菌空气的速度和控制搅拌速度。发酵菌细胞呼吸产气增多,会增加发酵液中的泡沫量,A项正确;加速搅拌发酵液或通气增多,会增加培养基中的溶氧量,发酵菌呼吸速率加快,会增加发酵液中的泡沫量,B、C两项正确;培养基黏度高,浓度越大,生成的泡沫稳定性就越高,会增加发酵液中的泡沫量,D项正确。
(5)发酵过程结束后,可通离心或过滤得到发酵液。萃取是利用被萃取物质易溶于有机溶剂的特性进行提取的一种方法,青霉素易溶于有机溶剂,可采用萃取的方法进一步分离纯化。
总结归纳(1)发酵工程的基本环节
(2)注意事项①选育高产、优质的菌种是发酵工业的前提条件。②要得到符合要求的菌种,需要筛选并不断地选育或改良菌种,以保持菌种旺盛的生命力。③将菌种扩大培养能满足大规模生产的需要。④对发酵过程进行控制才能获得所需的产品。⑤控制发酵过程是保证发酵生产高效顺利进行的重要措施。
[对点练] 2.(2023浙江嘉兴一模)青霉素是人类发现的第一种抗生素,由青霉菌分泌。科学家发现青霉菌在葡萄糖含量较低时会分泌青霉素杀死其他细菌,以保证自身生存所需的能量供应。下列关于工业化大规模生产青霉素过程的叙述,正确的是(　　)A.青霉素具有杀菌作用,发酵罐无需严格灭菌B.选育出的高产青霉菌菌株可直接用于大型发酵C.降低发酵液中的葡萄糖浓度,有利于青霉菌增殖D.发酵过程中需严格控制温度、pH和溶解氧等培养条件
解析 某些杂菌能分泌青霉素酶,从而分解青霉素,为防止杂菌生长,发酵罐需要严格灭菌,A项错误;青霉素高产菌种是诱变育种产生的,选育出的高产菌种需经扩大培养和纯化后,确保能增加自身的浓度和纯度,才可以接种到发酵罐,以保证发酵效率的提高,B项错误;降低发酵液中的葡萄糖浓度,有利于青霉素的产生,但不利于青霉菌的增殖,C项错误;青霉菌属于需氧生物,在发酵罐内发酵需严格控制溶解氧、温度、pH等条件,D项正确。
3.(2023浙江温州第三次适应性考试)利用微生物发酵技术可将秸秆、木屑等经发酵生产获得乙醇。研究人员经过诱变、筛选、纯化,选育出高产纤维素酶菌株,并利用木质纤维素为原料经蒸煮、糖化、发酵、加工等步骤生产乙醇,主要过程如图所示。注:富集培养是指利用培养基及培养条件的控制将目标微生物培养成优势种的培养方式。