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第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题-【备战一轮】最新高考生物一轮复习优质课件
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这是一份第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题-【备战一轮】最新高考生物一轮复习优质课件，共60页。PPT课件主要包含了高考生物一轮复习策略，基因工程的概念，转基因，新的生物类型，分子水平，重组DNA技术，基因重组，②操作水平，⑤操作结果，①操作原理等内容，欢迎下载使用。
1、落实考点。一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。2、注重理论联系实际。生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。 4、学而不思则罔，思而不学则殆。这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
重组DNA技术的基本工具与基本操作程序
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
基因工程的应用及蛋白质工程
生物技术的安全性与伦理问题
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
获得新的生物类型和生物产品
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。
目的（外源）基因在受体细胞中为什么能表达？
剪切→拼接→导入→表达
②不同生物的基因在表达时都遵循 “中心法则”，在受体细胞内定向表达；
①不同生物的DNA分子的结构基本相同；
③所有生物共用一套遗传密码。
准确切割DNA分子——限制性内切核酸酶
将DNA片段连接起来——DNA连接酶
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞——载体
二、基因工程的基本工具
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
限制酶不是一种酶，而是一类酶
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
（5）限制酶名字的由来
限制酶的命名是根据细菌种类而定：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。以EcRI为例: E：Escherichia (属) c：cli (种) R：RY13 (品系) I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
EcRⅠ：大肠杆菌（Escherichia cli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
实例1：EcR Ⅰ限制酶的切割
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
实例2：Sma Ⅰ限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ: EcR Ⅰ:Hind Ⅲ:Bgl Ⅱ:
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
2.练习使用EcR I剪切目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
（1）要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
（2）如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割， 会怎样呢？
（3）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
（4）推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
（5）为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3.请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
4.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点， 据图回答：
（1）用EcR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
（2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率 相同。
5.判断以下说法是否正确：
因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶 连接起来。
（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
都能催化形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子或DNA的一条链
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
6.请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端， 再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列， 能否再被所用的限制酶识别。
（1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcR Ⅰ）切割后所得， （填“能”或“不能”） 再被所用的限制酶识别。
（2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的 识别序列 （填“能” 或“不能”）再被所用的 限制酶识别。
（1）通过基因工程产生的变异是不定向的 （ ）（2）限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 （ ）（3）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （ ）（4）E.cli DNA连接酶既可连接平末端， 又可连接黏性末端 （ ）（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ ）
7.判断常考语句，澄清易混易错
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
（3）最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
其基因属于细胞质基因。
（4）运载体需具备的条件
③具有标记基因，便于筛选含有 重组DNA分子的细胞；
④对受体细胞无害、易分离。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制 或整合到受体DNA上，随受体DNA同 步复制；
②有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入（携带）目的基因；
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。 产生相同末端，便于连接。
8.目的基因是要与运载体结合的， 那如何处理质粒？
用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶（同尾酶）分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
a、b、c、d四个黏性末端相同。
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。
目的基因与质粒不会发生反向连接
确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。
9.获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了 。但是使用该法缺点是容易发生 以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
10.获取一个目的基因需限制酶切割 次, 共产生 个游离的磷酸基团。
11.选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
12.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
A.a酶与b酶切断的化学键不相同B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
三、基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程
普通棉花（无抗虫特性）
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
（2）目的基因的获取方法
③利用PCR获取和扩增目的基因
②通过DNA合成仪直接合成
1.基因文库的构建过程
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
部分基因文库（主要是cDNA文库）
（1）基因组文库的构建
每个受体菌含有一段不同的DNA片段
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
双链cDNA(cDNA)
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，cDNA文库中的基因不含以上结构。
13.下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是( )A.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因， 基因组文库中含有某种生物的全部基因B.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因 与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同， 则这两个基因的结构也完全相同C.cDNA文库中的基因没有启动子D.一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种
通过DNA合成仪直接合成
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
单链DNA (cDNA）
双链DNA(即目的基因)
根据已知的氨基酸序列合成DNA
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR——聚合酶链式反应
2.体内DNA复制所需的基本条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
子链的延伸方向是5 ′→3 ′
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端
引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
引物是决定PCR特异性的关键。
3.体外DNA复制所需的基本条件
耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
激活DNA聚合酶的活性
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
每一次循环后目的基因的量可以增加_____， 即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性：加热至90℃以上，___________________; 复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行 互补链的合成。如此重复循环多次。
DNA聚合酶只能特异性地复制处于 之间的DNA序列,使其成指数倍增加。
比较细胞内DNA的复制与PCR技术
DNA在高温下变性解旋全部解旋后再复制
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
控制温度，需在不同温度下进行
扩增特定的DNA片段或基因
14.用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
15.延伸时需要加入两种引物，原因是:
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
16.两种引物的要求：
①引物自身不能环化；
②两种引物之间不能互补配对；
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合。
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
中长链-短链DNA____个
短链-短链DNA______个
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：①子代DNA分子数为：___个②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个③子代含有的目的基因数目：_____个④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个⑤复制过程中共需引物_______个⑥第n次复制需要引物___个
17.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有( )
A.8个 B.6个 C.4个 D.2个
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
2.基因表达载体的构建
（1）基因表达载体的作用
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代;
②使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。
（2）基因表达载体的组成
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
同种限制酶或同尾酶或两种酶
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
①基因工程中的基因表达载体≠载体： 基因表达载体与载体相比增加了 。
②目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
激活或抑制目的基因表达
18.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( )A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的比较
mRNA上三个相邻碱基
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
花粉管通道法、农杆菌转化法
Ca2+处理法(感受态细胞法)
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
3.将目的基因导入受体细胞——植物细胞
我国科学家独创的一种方法。
①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进 入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的 DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株 的全套人工培养过程。
①农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为_______
含目的基因的重组Ti质粒
含重组Ti质粒的农杆菌
将目的基因插入染色体DNA中
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体 细胞染色体的DNA上。
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
3.将目的基因导入受体细胞——动物细胞
将含有目的基因的表达裁体提纯→显微注射入动物的受精卵→受精卵发育→获得具有新性状的动物
19.为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？
受精卵具有全能性且体积大，易操作；而动物体细胞的全能性受限。
如果做转基因植物的话，受体细胞可以采用植物的体细胞，因为植物可以组培，即便一个体细胞也可以让他发育成一个完整的植株，但是如果做转基因动物，那就不能用体细胞作为受体细胞，因为要保证全身上下的细胞都带有目的基因，如果已经是一个成熟的个体，只往它身上的某个部位比如肝脏细胞导入基因，就不能保证身体所有细胞都带上，所以唯一的受体细胞就是受精卵。
3.将目的基因导入受体细胞——微生物细胞
原核生物的作为受体细胞的优点
使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
用原核生物生产胰岛素示意图
注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①检测目的基因是否导入受体细胞
②检测目的基因是否转录
③检测目的基因是否翻译
方法2： DNA分子杂交技术
带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
a.首先取出转基因生物的基因组DNA。
b.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。
c.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带， 表明目的基因已插入染色体DNA中。
基因探针： 一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
方法1： RT-PCR扩增
RNA分子杂交(Nrthern Blt)流程图
方法：抗原— 抗体杂交技术
放射性检测 （杂交带）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
检测目的基因是否表现出相应的性状。
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
1.目的基因的筛选和获取-前提DNA合成仪合成基因文库获取利用PCR获取和扩增2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物)4.目的基因的检测与鉴定-保证分子水平：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
20.实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
用模板DNA和目的基因相关引物扩增
用待测DNA和相关引物扩增
有扩增产物则含有目的基因
无扩增产物则不含目的基因
可在引物中或引物的5`端引入突变序列
21.SRY—PCR是对移植前的胚胎进行性别鉴定的技术。以Y染色体上SRY基因（性别决定基因）的一段序列作引物，用被测胚胎DNA作_____进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20～24个核苷酸，其不宜过短的原因主要是__________________。两种引物中G＋C的含量相差不宜过大，原因主要是________________________________。
一、DNA的粗提取与鉴定
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
①研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中②研磨时间不宜太长：防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： 研磨效果好（有利于充分研磨）④研磨不宜太用力
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布
可能含有核蛋白、多糖等杂质
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
（3）冷却酒精析出DNA
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2ml/L氯化钠溶液
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
4.实验结果不明显的可能原因
①材料中的核物质没有充分释放出来， 如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14ml/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2ml/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
加2ml/L的NaCl溶液的目的
溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。
除低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。
方法一：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定
① PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温 度的仪器。
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
② PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 一次PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
① DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
② PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
①无菌水、琼脂糖；②电泳缓冲液（TAE或TBE）；③凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；④核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
① PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
注意：加不同样品时，需要更换枪头
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子， 以形成加样孔。
（4） 配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
凝胶载样缓冲液类似层析液
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
（5）PCR扩增不能随意加大试剂用量。
21.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述， 正确的是（ ）A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡， 观察颜色变化
22.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是（ ）A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前 必须进行高压蒸汽灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须更换
23.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ）A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
1.在农牧业方面的应用
污染环境，损害人类健康，增加生产成本。
从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，导入作物，使其具有抗虫性，是目前防治作物虫害的一种发展趋势。
减少化学农药的使用，降低生产成本，提高产量。
植物病害是多种多样的，从根茎叶到花和果实都有病害发生。
许多栽培作物自身缺少抗病基因。
将某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物。
（3）转基因抗除草剂植物
杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。
杂草对除草剂产生抗性，残留除草剂对人体有危害。
将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。
在喷洒除草剂时，田间杂草会被杀死而作物不会受到损伤。
随着生活水平的提高，人们越来越关注植物的营养价值、观赏价值等。
利用转基因技术改良植物的营养价值、观赏价值等。
①使食品的营养成分均衡。
②丰富花品颜色，提高观赏价值。
①使食品的营养成分均衡
将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物，或改变这种氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。
将富含氨基酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量提高30%。
将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色。
（5）提高动物的生长速率
外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得很快。
将外源生长激素基因导入动物体内，以提高动物生长速率。
我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼，在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%～115%。
（6）改善畜产品的品质
有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。
我国约有⅓的成年人对乳糖不耐受。
将乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。
优点：避免食物过敏、腹泻、恶心等不适。
2.在医药卫生领域的应用
在传统的蛋白质类药物生产中，是直接从生物的组织、细胞或血液中提取而来的，因为受到原料来源的限制，产量低，价格贵，远不能满足患者的需求。
如：传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取， 每300L血液只能提取出1mg干扰素。
是人体或动物受到病毒侵染后产生的一种细胞因子，是一种具有干扰病毒复制作用的 ，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。
（1） 基因工程改造微生物或动植物的细胞生产药物
传统生产方法：从人血液中的白细胞提取。
大量可以生产干扰素的大肠杆菌或酵母菌
1993年我国批准生产重组人干扰素α-1b，它是我国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等。
抗生素≠干扰素①抗生素：抗细菌药物②干扰素：抗病毒药物
（2）利用转基因哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器
乳腺中特异表达的基因的启动子
1.乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？
让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达
不是，乳腺生物反应器指的就是这个转基因生物
2.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等 调控元件重组在一起？
3.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？
A.动物泌乳期有间隔B.有些蛋白不能在乳腺里表达C.某些蛋白在乳腺中的修饰可能与天然状态不同
A.适合于表达高等动物体内的复杂蛋白B.制备乳腺反应器的方法成熟C.乳腺是天然的高效合成蛋白质的器官D.乳汁中重组蛋白的提取和纯化相对容易
（2）利用转基因哺乳动物批量生产药物——膀胱生物反应器
①可以从动物一出生就收集产物， 不论动物的性别和是否处于生殖期。②从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。
（3）用转基因动物作为器官移植的供体
人体移植器官短缺是世界性难题
寻求可替代的移植器官，如利用基因工程对猪的器官进行改造，来解决人类器官移植的来源问题。
①猪的内脏构造、大小、血管分布与人相似；
②猪体内隐藏的致病基因远远少于灵长类动物。
②设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会 引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
①在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定 基因的表达；
3.在食品工业方面的应用
基因工程构建基因工程菌
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。
杀死未断奶的小牛，将其第四胃的黏膜取出来提取。
将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品用到的脂酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高，生产成本显著降低，生产效率较高。
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别（在生产人的药物蛋白方面）
哺乳动物基因的结构与人类结构基本相同。
细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异。
与天然蛋白质完全相同。
细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性。
Ca2+处理法（感受态细胞法）
不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大。
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件。
从动物乳汁中提取，相对简单。
（一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂。
利用经过基因改造的微生物生产清洁能源
培育可以降解多种污染物的“超级细菌”治理环境污染
1.蛋白质工程崛起的缘由
基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质(天然蛋白质)
天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要
需要对天然蛋白进行改造产生更符合人类需要的蛋白质
352位的苏氨酸变成异亮氨酸
104位的天冬酰胺变成异亮氨酸
指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
（1）改造蛋白质的方法
（2）蛋白质工程的基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
4.对天然的蛋白质进行改造，为什么不是直接对蛋白质分子进行 操作，还是通过对基因的操作来实现的？
①基因决定蛋白质的合成，改造基因即为改造蛋白质；②改造基因可以遗传，改造蛋白质无法遗传；③改造基因比改造蛋白质更容易操作。
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
①实例1：研发速效胰岛素类似物
天然胰岛素易形成二聚体或六聚体
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
改变B链第20～29位氨基酸组成
②实例2：延长干扰素体外保存时间
天然干扰素（体外保存困难）
改造后的干扰素（-70℃可保存半年）
③实例3：制备人鼠嵌合抗体
医学问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应， 从而导致治疗效果大大降低。
解决办法：通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域 （即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区） 上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就 会减低很多。
枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。
广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶
利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。
①改造某些参与调控光合作用的酶
科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。
还有科学家将蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
②改造微生物蛋白质结构，防治害虫
三、蛋白质工程与基因工程的区别和联系
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的新的生物类型和生物产品
创造出自然界不存在的蛋白质
生产出自然界已有的蛋白质
①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶可以通过蛋白质工程进行修饰、改造
如何确定一个操作过程是基因工程技术还是蛋白质工程技术？
是否对原有基因进行改造
5.胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述错误的是（ ）A.新的胰岛素的预期功能是构建新胰岛素模型的主要依据B.新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则C.若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2＋处理大肠杆菌D.新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构
一、转基因产品的安全性
①自然原因：当人们面对原本是自然造就的生命形式被人为改造后具有了全新特征的现实时，出现激烈的争论是正常的。
②社会原因：人们所生活的国家或社会、政治制度、意识形态、宗教信仰、经济发展水平、历史背景、传统文化和伦理道德观念等的差异，决定了人们具有不同的价值观取向。
指转基因农作物中只要某些重要成分没有发生改变，就可以认为与天然品种没有差别。
2.转基因产品的优缺点
外源基因通过转基因作物或家养动物扩散到其他栽培作物或自然野生物种中，并成为后者基因的一部分，在环境生物学中称为基因污染。基因污染主要是由基因重组引起的。
①转基因植物的相关基因通过花粉传播而进入附近的野生植物或 邻近的非转基因农作物。
②转基因作物在自然条件下存活并发育成为野生的、杂草化的 转基因植物。
③土壤微生物或动物肠道微生物吸收转基因作物后获得外源基因。
（2）防止基因污染的方法
①基因工程中，若将目的基因导入并整合到受体细胞的染色体DNA上，减数分裂形成的花粉中可能含有目的基因，通过传粉，可能造成基因污染；
花粉即为植物的精子，有细胞结构，所含的细胞器：线粒体、内质网、中心体、高尔基体、核糖体等，但没有叶绿体。 可以把目的基因导入细胞质的叶绿体DNA上，避免基因污染。
植物和微生物的生长和繁殖可能使基因污染成为一种蔓延性的灾难，而更为可怕的是，基因污染是不可逆的。
②我国科学家将来自于玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉 ，因而可以防止转基因花粉的传播。
【问题】生产上常将转基因抗虫棉与普通棉花混合播种， 其目的是？
降低害虫种群中抗虫基因频率的增长速率，延缓害虫抗性的产生和发展。
1.下列关于转基因生物与安全性的叙述，正确的是( )A.转基因培育的植物，理论上目的基因只存在于特定的组织中B.转基因技术与植物体细胞杂交技术均可打破生殖隔离， 实现远缘杂交育种，培育出杂种新物种C.种植转基因抗虫棉时，常间行种植普通棉花以供害虫取食， 其主要目的是保护物种多样性D.转基因花粉中若有毒蛋白或过敏蛋白，则它有通过食物链传递 而引发人类食品安全问题的可能
1.生殖性克隆和治疗性克隆的比较
产生新个体或新组织，遗传信息主要与供体相同
①生殖性克隆人的生殖方式是无性生殖， 其遗传不遵循孟德尔遗传规律。②生殖性克隆人依据的原理是动物细胞核的全能性。
2.关于生殖性克隆人的争论
3.我国对待生殖性克隆人的态度
不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
4.我国政府对治疗性克隆的态度
我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
第 1 代试管婴儿技术
通过常规的体外受精和胚胎移植技术直到临床妊娠分娩。此技术主要适用于因女方因素引起的不孕症患者。
第 2 代试管婴儿技术
通过显微人工受精技术, 帮助精子通过透明带或穿过卵细胞膜, 直至临床妊娠分娩主要适用于男方因素引起的不孕症患者, 也适用于上述女方因素引起的不孕。
第 3 代试管婴儿技术
第3代“试管婴儿”是 指胚胎着床前进行遗传学诊断。剔除带有疾病遗传物质的胚胎。通过此技术可以提高出生试管婴儿的质量。
20世纪90年代中期，有一名19岁的始娘患了白血病，需要进行骨髓移植。然而，她唯一的哥哥的骨髓配型并不适合她，在骨髓库中也找不到合适配型的骨髓。她的父母通过“设计试管婴儿”（植入前对胚胎进行遗传学诊断）生下了一个配型适合她的婴儿。
克隆、试管婴儿与设计试管婴儿的辨析
1.克隆动物的早期胚胎是通过细胞核移植，形成重组细胞后培养得到的，该过程中没有减数分裂和受精作用，属于无性生殖。2.试管婴儿培育过程中有受精作用，属于典型的有性生殖，只是受精过程和早期胚胎发育前期发生在体外。3.设计试管婴儿技术重在“设计”，“设计”是指在胚胎移植之前进行遗传学诊断。
2.“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的精子和卵细胞取出，在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育到如图所示的时期，再将胚胎植入女性子宫内发育成胎儿，该技术使一部分不能生育的夫妇重新获得了生育的机会。下列叙述正确的是（ ）A.“试管婴儿”技术在生物学上所依据的原理是无性生殖B.如图所示时期是胚胎发育的囊胚期，①代表内细胞团，②代表囊胚腔，③代表滋养层C.“试管婴儿”的形成用到的技术有人工授精、体内培养、核移植D.“试管婴儿”技术诞生后，继而出现了“设计试管婴儿”技术，二者对人类的作用是相同的
生物战剂及施放它的武器、器材总称。
生物战剂：指在军事行动中用以杀死人、畜和破坏农作物的微生物、毒素和其他生物活性物质的统称。
波特淋菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌
天花病毒、SARS病毒
肉毒杆菌毒素、河豚毒素、黄曲霉毒素
少量使用即可使人患病。在缺乏防护、人员密集、平时卫生条件差的地区，因其所致的疾病极易传播、蔓延。
直接喷洒的生物气溶胶，可随风飘到较远的地区，杀伤范围可达数百至数千平方公里。
生物战剂分散成微小的粒子悬浮在空气中，这种微粒和空气的混合体叫气溶胶。
可通过气溶胶、牲畜、植物、昆虫、信件等多种不同形式释放传播。
④传播方法简单、使用方便
生物武器可以随身携带。使用时不需要其他相关设备和装置，使用后一般不会留下痕迹。
多数生物武器传播的是传染病，传染病一般具有潜伏期，早期不易被发现，所以更容易大面积爆发。
有人将生物武器形容为“穷国家的核武器"。
5. 《禁止生物武器公约》
彻底销毁生物武器是全世界爱好和平的人民的共同期望。1972年4月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁止发展、生产、储存细菌（生物）及毒素武器和销毁此种武器公约》（简称《禁止生物武器公约》），该公约于1975年3月生效。1984年11月，我国也加入了这一公约。
在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
3.新冠肺炎使我们对病毒的威力有深刻感受，所以生物武器更是人类要严格禁止的。下列关于生物武器的说法，错误的是（ ）A.生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类等B.利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性极强、致死率极高的特点C.中美两国发布联合声明，重申在一般情况下不发展、不生产、不储存生物武器D.彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识
1、落实考点。一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。2、注重理论联系实际。生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。 4、学而不思则罔，思而不学则殆。这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
重组DNA技术的基本工具与基本操作程序
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
基因工程的应用及蛋白质工程
生物技术的安全性与伦理问题
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
获得新的生物类型和生物产品
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。
目的（外源）基因在受体细胞中为什么能表达？
剪切→拼接→导入→表达
②不同生物的基因在表达时都遵循 “中心法则”，在受体细胞内定向表达；
①不同生物的DNA分子的结构基本相同；
③所有生物共用一套遗传密码。
准确切割DNA分子——限制性内切核酸酶
将DNA片段连接起来——DNA连接酶
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞——载体
二、基因工程的基本工具
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
限制酶不是一种酶，而是一类酶
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
（5）限制酶名字的由来
限制酶的命名是根据细菌种类而定：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。以EcRI为例: E：Escherichia (属) c：cli (种) R：RY13 (品系) I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
EcRⅠ：大肠杆菌（Escherichia cli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
实例1：EcR Ⅰ限制酶的切割
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
实例2：Sma Ⅰ限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ: EcR Ⅰ:Hind Ⅲ:Bgl Ⅱ:
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
2.练习使用EcR I剪切目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
（1）要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
（2）如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割， 会怎样呢？
（3）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
（4）推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
（5）为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3.请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
4.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点， 据图回答：
（1）用EcR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
（2）T4 DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率 相同。
5.判断以下说法是否正确：
因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。
（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶 连接起来。
（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
都能催化形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子或DNA的一条链
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
6.请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端， 再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列， 能否再被所用的限制酶识别。
（1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcR Ⅰ）切割后所得， （填“能”或“不能”） 再被所用的限制酶识别。
（2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的 识别序列 （填“能” 或“不能”）再被所用的 限制酶识别。
（1）通过基因工程产生的变异是不定向的 （ ）（2）限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 （ ）（3）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （ ）（4）E.cli DNA连接酶既可连接平末端， 又可连接黏性末端 （ ）（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ ）
7.判断常考语句，澄清易混易错
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
（3）最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
其基因属于细胞质基因。
（4）运载体需具备的条件
③具有标记基因，便于筛选含有 重组DNA分子的细胞；
④对受体细胞无害、易分离。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制 或整合到受体DNA上，随受体DNA同 步复制；
②有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入（携带）目的基因；
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。 产生相同末端，便于连接。
8.目的基因是要与运载体结合的， 那如何处理质粒？
用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶（同尾酶）分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
a、b、c、d四个黏性末端相同。
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。
目的基因与质粒不会发生反向连接
确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。
9.获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了 。但是使用该法缺点是容易发生 以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
10.获取一个目的基因需限制酶切割 次, 共产生 个游离的磷酸基团。
11.选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
12.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
A.a酶与b酶切断的化学键不相同B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
三、基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程
普通棉花（无抗虫特性）
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
（2）目的基因的获取方法
③利用PCR获取和扩增目的基因
②通过DNA合成仪直接合成
1.基因文库的构建过程
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
部分基因文库（主要是cDNA文库）
（1）基因组文库的构建
每个受体菌含有一段不同的DNA片段
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
双链cDNA(cDNA)
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，cDNA文库中的基因不含以上结构。
13.下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是( )A.cDNA文库中只含有某种生物的部分基因， 基因组文库中含有某种生物的全部基因B.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因 与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同， 则这两个基因的结构也完全相同C.cDNA文库中的基因没有启动子D.一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种
通过DNA合成仪直接合成
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
单链DNA (cDNA）
双链DNA(即目的基因)
根据已知的氨基酸序列合成DNA
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR——聚合酶链式反应
2.体内DNA复制所需的基本条件
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
子链的延伸方向是5 ′→3 ′
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端
引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
引物是决定PCR特异性的关键。
3.体外DNA复制所需的基本条件
耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
激活DNA聚合酶的活性
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
每一次循环后目的基因的量可以增加_____， 即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性：加热至90℃以上，___________________; 复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行 互补链的合成。如此重复循环多次。
DNA聚合酶只能特异性地复制处于 之间的DNA序列,使其成指数倍增加。
比较细胞内DNA的复制与PCR技术
DNA在高温下变性解旋全部解旋后再复制
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
控制温度，需在不同温度下进行
扩增特定的DNA片段或基因
14.用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
15.延伸时需要加入两种引物，原因是:
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
16.两种引物的要求：
①引物自身不能环化；
②两种引物之间不能互补配对；
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合。
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
中长链-短链DNA____个
短链-短链DNA______个
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：①子代DNA分子数为：___个②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个③子代含有的目的基因数目：_____个④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个⑤复制过程中共需引物_______个⑥第n次复制需要引物___个
17.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有( )
A.8个 B.6个 C.4个 D.2个
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
2.基因表达载体的构建
（1）基因表达载体的作用
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代;
②使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。
（2）基因表达载体的组成
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
同种限制酶或同尾酶或两种酶
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
①基因工程中的基因表达载体≠载体： 基因表达载体与载体相比增加了 。
②目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
激活或抑制目的基因表达
18.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( )A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的比较
mRNA上三个相邻碱基
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
花粉管通道法、农杆菌转化法
Ca2+处理法(感受态细胞法)
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
3.将目的基因导入受体细胞——植物细胞
我国科学家独创的一种方法。
①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进 入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的 DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株 的全套人工培养过程。
①农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为_______
含目的基因的重组Ti质粒
含重组Ti质粒的农杆菌
将目的基因插入染色体DNA中
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体 细胞染色体的DNA上。
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
3.将目的基因导入受体细胞——动物细胞
将含有目的基因的表达裁体提纯→显微注射入动物的受精卵→受精卵发育→获得具有新性状的动物
19.为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？
受精卵具有全能性且体积大，易操作；而动物体细胞的全能性受限。
如果做转基因植物的话，受体细胞可以采用植物的体细胞，因为植物可以组培，即便一个体细胞也可以让他发育成一个完整的植株，但是如果做转基因动物，那就不能用体细胞作为受体细胞，因为要保证全身上下的细胞都带有目的基因，如果已经是一个成熟的个体，只往它身上的某个部位比如肝脏细胞导入基因，就不能保证身体所有细胞都带上，所以唯一的受体细胞就是受精卵。
3.将目的基因导入受体细胞——微生物细胞
原核生物的作为受体细胞的优点
使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
用原核生物生产胰岛素示意图
注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
①检测目的基因是否导入受体细胞
②检测目的基因是否转录
③检测目的基因是否翻译
方法2： DNA分子杂交技术
带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
a.首先取出转基因生物的基因组DNA。
b.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化剂）等作标记，以此做探针。
c.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带， 表明目的基因已插入染色体DNA中。
基因探针： 一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
方法1： RT-PCR扩增
RNA分子杂交(Nrthern Blt)流程图
方法：抗原— 抗体杂交技术
放射性检测 （杂交带）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
检测目的基因是否表现出相应的性状。
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等
饲喂害虫（抗虫接种实验）
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
1.目的基因的筛选和获取-前提DNA合成仪合成基因文库获取利用PCR获取和扩增2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物)4.目的基因的检测与鉴定-保证分子水平：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
20.实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交
用模板DNA和目的基因相关引物扩增
用待测DNA和相关引物扩增
有扩增产物则含有目的基因
无扩增产物则不含目的基因
可在引物中或引物的5`端引入突变序列
21.SRY—PCR是对移植前的胚胎进行性别鉴定的技术。以Y染色体上SRY基因（性别决定基因）的一段序列作引物，用被测胚胎DNA作_____进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20～24个核苷酸，其不宜过短的原因主要是__________________。两种引物中G＋C的含量相差不宜过大，原因主要是________________________________。
一、DNA的粗提取与鉴定
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、研磨液、体积分数为95％的酒精、2 ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
①研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中②研磨时间不宜太长：防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶： 研磨效果好（有利于充分研磨）④研磨不宜太用力
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布
可能含有核蛋白、多糖等杂质
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
（3）冷却酒精析出DNA
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2ml/L氯化钠溶液
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
4.实验结果不明显的可能原因
①材料中的核物质没有充分释放出来， 如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14ml/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2ml/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。
加2ml/L的NaCl溶液的目的
溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。
除低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。
方法一：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定
① PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温 度的仪器。
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
② PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。 一次PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
① DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
② PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
①无菌水、琼脂糖；②电泳缓冲液（TAE或TBE）；③凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；④核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
① PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
注意：加不同样品时，需要更换枪头
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子， 以形成加样孔。
（4） 配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
凝胶载样缓冲液类似层析液
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
（5）PCR扩增不能随意加大试剂用量。
21.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述， 正确的是（ ）A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡， 观察颜色变化
22.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是（ ）A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前 必须进行高压蒸汽灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须更换
23.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ）A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
1.在农牧业方面的应用
污染环境，损害人类健康，增加生产成本。
从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，导入作物，使其具有抗虫性，是目前防治作物虫害的一种发展趋势。
减少化学农药的使用，降低生产成本，提高产量。
植物病害是多种多样的，从根茎叶到花和果实都有病害发生。
许多栽培作物自身缺少抗病基因。
将某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物。
（3）转基因抗除草剂植物
杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。
杂草对除草剂产生抗性，残留除草剂对人体有危害。
将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。
在喷洒除草剂时，田间杂草会被杀死而作物不会受到损伤。
随着生活水平的提高，人们越来越关注植物的营养价值、观赏价值等。
利用转基因技术改良植物的营养价值、观赏价值等。
①使食品的营养成分均衡。
②丰富花品颜色，提高观赏价值。
①使食品的营养成分均衡
将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物，或改变这种氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。
将富含氨基酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量提高30%。
将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色。
（5）提高动物的生长速率
外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得很快。
将外源生长激素基因导入动物体内，以提高动物生长速率。
我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼，在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%～115%。
（6）改善畜产品的品质
有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。
我国约有⅓的成年人对乳糖不耐受。
将乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。
优点：避免食物过敏、腹泻、恶心等不适。
2.在医药卫生领域的应用
在传统的蛋白质类药物生产中，是直接从生物的组织、细胞或血液中提取而来的，因为受到原料来源的限制，产量低，价格贵，远不能满足患者的需求。
如：传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取， 每300L血液只能提取出1mg干扰素。
是人体或动物受到病毒侵染后产生的一种细胞因子，是一种具有干扰病毒复制作用的 ，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。
（1） 基因工程改造微生物或动植物的细胞生产药物
传统生产方法：从人血液中的白细胞提取。
大量可以生产干扰素的大肠杆菌或酵母菌
1993年我国批准生产重组人干扰素α-1b，它是我国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等。
抗生素≠干扰素①抗生素：抗细菌药物②干扰素：抗病毒药物
（2）利用转基因哺乳动物批量生产药物——乳腺生物反应器
乳腺中特异表达的基因的启动子
1.乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？
让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达
不是，乳腺生物反应器指的就是这个转基因生物
2.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等 调控元件重组在一起？
3.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？
A.动物泌乳期有间隔B.有些蛋白不能在乳腺里表达C.某些蛋白在乳腺中的修饰可能与天然状态不同
A.适合于表达高等动物体内的复杂蛋白B.制备乳腺反应器的方法成熟C.乳腺是天然的高效合成蛋白质的器官D.乳汁中重组蛋白的提取和纯化相对容易
（2）利用转基因哺乳动物批量生产药物——膀胱生物反应器
①可以从动物一出生就收集产物， 不论动物的性别和是否处于生殖期。②从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。
（3）用转基因动物作为器官移植的供体
人体移植器官短缺是世界性难题
寻求可替代的移植器官，如利用基因工程对猪的器官进行改造，来解决人类器官移植的来源问题。
①猪的内脏构造、大小、血管分布与人相似；
②猪体内隐藏的致病基因远远少于灵长类动物。
②设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会 引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
①在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定 基因的表达；
3.在食品工业方面的应用
基因工程构建基因工程菌
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。
杀死未断奶的小牛，将其第四胃的黏膜取出来提取。
将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品用到的脂酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高，生产成本显著降低，生产效率较高。
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别（在生产人的药物蛋白方面）
哺乳动物基因的结构与人类结构基本相同。
细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异。
与天然蛋白质完全相同。
细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性。
Ca2+处理法（感受态细胞法）
不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大。
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件。
从动物乳汁中提取，相对简单。
（一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂。
利用经过基因改造的微生物生产清洁能源
培育可以降解多种污染物的“超级细菌”治理环境污染
1.蛋白质工程崛起的缘由
基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质(天然蛋白质)
天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要
需要对天然蛋白进行改造产生更符合人类需要的蛋白质
352位的苏氨酸变成异亮氨酸
104位的天冬酰胺变成异亮氨酸
指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
（1）改造蛋白质的方法
（2）蛋白质工程的基础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
4.对天然的蛋白质进行改造，为什么不是直接对蛋白质分子进行 操作，还是通过对基因的操作来实现的？
①基因决定蛋白质的合成，改造基因即为改造蛋白质；②改造基因可以遗传，改造蛋白质无法遗传；③改造基因比改造蛋白质更容易操作。
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
①实例1：研发速效胰岛素类似物
天然胰岛素易形成二聚体或六聚体
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
改变B链第20～29位氨基酸组成
②实例2：延长干扰素体外保存时间
天然干扰素（体外保存困难）
改造后的干扰素（-70℃可保存半年）
③实例3：制备人鼠嵌合抗体
医学问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应， 从而导致治疗效果大大降低。
解决办法：通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域 （即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区） 上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就 会减低很多。
枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。
广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶
利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。
①改造某些参与调控光合作用的酶
科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。
还有科学家将蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
②改造微生物蛋白质结构，防治害虫
三、蛋白质工程与基因工程的区别和联系
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的新的生物类型和生物产品
创造出自然界不存在的蛋白质
生产出自然界已有的蛋白质
①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶可以通过蛋白质工程进行修饰、改造
如何确定一个操作过程是基因工程技术还是蛋白质工程技术？
是否对原有基因进行改造
5.胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述错误的是（ ）A.新的胰岛素的预期功能是构建新胰岛素模型的主要依据B.新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则C.若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2＋处理大肠杆菌D.新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构
一、转基因产品的安全性
①自然原因：当人们面对原本是自然造就的生命形式被人为改造后具有了全新特征的现实时，出现激烈的争论是正常的。
②社会原因：人们所生活的国家或社会、政治制度、意识形态、宗教信仰、经济发展水平、历史背景、传统文化和伦理道德观念等的差异，决定了人们具有不同的价值观取向。
指转基因农作物中只要某些重要成分没有发生改变，就可以认为与天然品种没有差别。
2.转基因产品的优缺点
外源基因通过转基因作物或家养动物扩散到其他栽培作物或自然野生物种中，并成为后者基因的一部分，在环境生物学中称为基因污染。基因污染主要是由基因重组引起的。
①转基因植物的相关基因通过花粉传播而进入附近的野生植物或 邻近的非转基因农作物。
②转基因作物在自然条件下存活并发育成为野生的、杂草化的 转基因植物。
③土壤微生物或动物肠道微生物吸收转基因作物后获得外源基因。
（2）防止基因污染的方法
①基因工程中，若将目的基因导入并整合到受体细胞的染色体DNA上，减数分裂形成的花粉中可能含有目的基因，通过传粉，可能造成基因污染；
花粉即为植物的精子，有细胞结构，所含的细胞器：线粒体、内质网、中心体、高尔基体、核糖体等，但没有叶绿体。 可以把目的基因导入细胞质的叶绿体DNA上，避免基因污染。
植物和微生物的生长和繁殖可能使基因污染成为一种蔓延性的灾难，而更为可怕的是，基因污染是不可逆的。
②我国科学家将来自于玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉 ，因而可以防止转基因花粉的传播。
【问题】生产上常将转基因抗虫棉与普通棉花混合播种， 其目的是？
降低害虫种群中抗虫基因频率的增长速率，延缓害虫抗性的产生和发展。
1.下列关于转基因生物与安全性的叙述，正确的是( )A.转基因培育的植物，理论上目的基因只存在于特定的组织中B.转基因技术与植物体细胞杂交技术均可打破生殖隔离， 实现远缘杂交育种，培育出杂种新物种C.种植转基因抗虫棉时，常间行种植普通棉花以供害虫取食， 其主要目的是保护物种多样性D.转基因花粉中若有毒蛋白或过敏蛋白，则它有通过食物链传递 而引发人类食品安全问题的可能
1.生殖性克隆和治疗性克隆的比较
产生新个体或新组织，遗传信息主要与供体相同
①生殖性克隆人的生殖方式是无性生殖， 其遗传不遵循孟德尔遗传规律。②生殖性克隆人依据的原理是动物细胞核的全能性。
2.关于生殖性克隆人的争论
3.我国对待生殖性克隆人的态度
不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
4.我国政府对治疗性克隆的态度
我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
第 1 代试管婴儿技术
通过常规的体外受精和胚胎移植技术直到临床妊娠分娩。此技术主要适用于因女方因素引起的不孕症患者。
第 2 代试管婴儿技术
通过显微人工受精技术, 帮助精子通过透明带或穿过卵细胞膜, 直至临床妊娠分娩主要适用于男方因素引起的不孕症患者, 也适用于上述女方因素引起的不孕。
第 3 代试管婴儿技术
第3代“试管婴儿”是 指胚胎着床前进行遗传学诊断。剔除带有疾病遗传物质的胚胎。通过此技术可以提高出生试管婴儿的质量。
20世纪90年代中期，有一名19岁的始娘患了白血病，需要进行骨髓移植。然而，她唯一的哥哥的骨髓配型并不适合她，在骨髓库中也找不到合适配型的骨髓。她的父母通过“设计试管婴儿”（植入前对胚胎进行遗传学诊断）生下了一个配型适合她的婴儿。
克隆、试管婴儿与设计试管婴儿的辨析
1.克隆动物的早期胚胎是通过细胞核移植，形成重组细胞后培养得到的，该过程中没有减数分裂和受精作用，属于无性生殖。2.试管婴儿培育过程中有受精作用，属于典型的有性生殖，只是受精过程和早期胚胎发育前期发生在体外。3.设计试管婴儿技术重在“设计”，“设计”是指在胚胎移植之前进行遗传学诊断。
2.“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的精子和卵细胞取出，在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育到如图所示的时期，再将胚胎植入女性子宫内发育成胎儿，该技术使一部分不能生育的夫妇重新获得了生育的机会。下列叙述正确的是（ ）A.“试管婴儿”技术在生物学上所依据的原理是无性生殖B.如图所示时期是胚胎发育的囊胚期，①代表内细胞团，②代表囊胚腔，③代表滋养层C.“试管婴儿”的形成用到的技术有人工授精、体内培养、核移植D.“试管婴儿”技术诞生后，继而出现了“设计试管婴儿”技术，二者对人类的作用是相同的
生物战剂及施放它的武器、器材总称。
生物战剂：指在军事行动中用以杀死人、畜和破坏农作物的微生物、毒素和其他生物活性物质的统称。
波特淋菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌
天花病毒、SARS病毒
肉毒杆菌毒素、河豚毒素、黄曲霉毒素
少量使用即可使人患病。在缺乏防护、人员密集、平时卫生条件差的地区，因其所致的疾病极易传播、蔓延。
直接喷洒的生物气溶胶，可随风飘到较远的地区，杀伤范围可达数百至数千平方公里。
生物战剂分散成微小的粒子悬浮在空气中，这种微粒和空气的混合体叫气溶胶。
可通过气溶胶、牲畜、植物、昆虫、信件等多种不同形式释放传播。
④传播方法简单、使用方便
生物武器可以随身携带。使用时不需要其他相关设备和装置，使用后一般不会留下痕迹。
多数生物武器传播的是传染病，传染病一般具有潜伏期，早期不易被发现，所以更容易大面积爆发。
有人将生物武器形容为“穷国家的核武器"。
5. 《禁止生物武器公约》
彻底销毁生物武器是全世界爱好和平的人民的共同期望。1972年4月，苏联、美国、英国分别在其首都签署了《禁止发展、生产、储存细菌（生物）及毒素武器和销毁此种武器公约》（简称《禁止生物武器公约》），该公约于1975年3月生效。1984年11月，我国也加入了这一公约。
在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
3.新冠肺炎使我们对病毒的威力有深刻感受，所以生物武器更是人类要严格禁止的。下列关于生物武器的说法，错误的是（ ）A.生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类等B.利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性极强、致死率极高的特点C.中美两国发布联合声明，重申在一般情况下不发展、不生产、不储存生物武器D.彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识
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