统考版2024高考生物二轮专题复习专题七现代生物科技专题第1讲基因工程和细胞工程课件

这是一份统考版2024高考生物二轮专题复习专题七现代生物科技专题第1讲基因工程和细胞工程课件，共60页。PPT课件主要包含了基础自查·明晰考位，整合考点20，限制酶，DNA连接酶，基因表达载体的构建，目的基因的检测和鉴定，自然界中没有，细胞的全能性，植物体细胞杂交，细胞增殖等内容，欢迎下载使用。
聚焦新课标4.1植物细胞工程包括植物组织培养和植物体细胞杂交等技术；4.2动物细胞工程包括动物细胞培养、动物体细胞核移植、动物细胞融合和干细胞的应用等技术；5.1基因工程是一种重组DNA技术；5.2蛋白质工程是基因工程的延伸。
纵 引 横 连————建网络
边 角 扫 描————全面清提醒：判断正误并找到课本原话1．基因工程的相关判断(1)携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测(　　)(2)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测(　　)(3)一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列(　　)(4)用限制性核酸内切酶可以切割烟草花叶病毒的核酸(　　)(5)每个重组质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别位点(　　)
(6)自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程(　　)(7)转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加(　　)(8)重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子中脱氧核糖和磷酸交替连接(　　)(9)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达(　　)(10)动物的生长激素基因转入植物后不能表达(　　)
2．细胞工程的相关判断(1)产生抗人白细胞介素­8抗体的杂交瘤细胞的筛选必须通过分子检测(　　)(2)21三体综合征的诊断必须通过分子检测(　　)(3)培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是组织培养(　　)(4)去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理(　　)(5)乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养(　　)
(6)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　　)(7)动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体体现了细胞的全能性(　　)(8)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体(　　)(9)单克隆抗体技术可用于治疗老年痴呆症(　　)(10)细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行(　　)
整合考点20　基因工程和细胞工程
1.理清基因工程的3种操作工具
质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等
能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因
(1)一般用同种限制酶切割载体和目的基因，不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。(2)双酶法可以使目的基因与载体定向连接，防止目的基因和载体的自身环化以及二者反向连接。
2．掌握基因工程的操作步骤
1．澄清基因工程的4个“≠”(1)DNA连接酶≠DNA聚合酶：DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。(2)限制酶≠DNA酶≠解旋酶：限制酶切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶可将DNA水解为其基本组成单位；解旋酶将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止；启动子和终止子位于DNA上，分别控制转录的启动和终止。
(4)基因治疗≠基因诊断①基因治疗：将正常基因导入有基因缺陷的细胞中，使该基因的表达产物发挥功能，以达到治疗的目的——其原理为基因重组及基因表达。②基因诊断：制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况——其原理为DNA分子杂交。
2．辨析农杆菌转化法中的“两个两次”(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的T－DNA 被拼接到受体细胞染色体的DNA上。(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
3.图解记忆蛋白质工程
4．理清植物细胞工程两大技术
细胞膜的流动性和植物细胞全能性
5．比较并把握细胞工程的几个流程图
6.动物细胞培养的特殊条件归纳(1)胰蛋白酶或胶原蛋白酶的使用：首先用________处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；培养过程中发生________时，同样需要用胰蛋白酶再次使细胞分散开。(2)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理；加入一定量的________；定期更换培养液。(3)特殊的营养条件：①__________培养基；②加入动物血清或血浆等；③通入________以满足代谢的需要；④通入________以维持培养液的pH。
7．澄清容易混淆的三种细胞——杂种细胞、重组细胞和杂交细胞(1)杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去掉________之后形成的原生质体融合，融合的原生质体出现新的________之后形成的细胞叫杂种细胞。(2)重组细胞：体细胞的________移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。(3)杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。
8．单克隆抗体制备的过程
单克隆抗体制备过程中两次筛选的原因及方法
类研真题 明考向类型1　全国卷真题体验寻趋势1.[2023·全国甲卷]接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是___________________________________________。
重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
解析：重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是_________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是___________。(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取____________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是____________________________。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。___________________________________________________________。
被标记的目的基因的单链DNA片段
通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
解析：(2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。RNA聚合酶能识别启动子并驱动目的基因转录。(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，可采用DNA分子杂交技术，即将酵母细胞中的基因组DNA提取出来，在含有乙肝病毒表面抗原基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，应从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
2.[2021·全国甲卷]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________(用数字序号表示)。(2)操作③中使用的酶是_______________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、_______三步，其中复性的结果是_________________________________。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与___________特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指__________________________________ ____________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
两种引物分别与两条单链DNA模板结合
一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能在短时间内大量扩增目的基因
解析：(1)用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。(2)利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是Taq酶。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。(3)要扩增病原菌DNA，设计的引物就应该能和病原菌DNA特异性结合。(4)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。
类型2　地方卷真题体验寻共性3.[2023·山东卷]科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是__________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________ (答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物____________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_______ (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白_______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
F2和R1或F1与R2
解析：(1)基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；
考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
4.[2023·浙江6月]赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于__________。根据这种调节方式，在培养基中添加____________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
一定浓度的赖氨酸类似物
解析：负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加一定浓度的赖氨酸类似物。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索_________获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生_______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为_________。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了_________重组细胞发育的作用。
解析：①从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物的许多基因片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。当需要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数分裂Ⅱ中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至_________，植入代孕母牛子宫内，直至小牛出生。⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以________________________为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行________处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为__________，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？___________________________________________________________。
含有目的基因的牛耳组织细胞
构建的基因表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达
解析：④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到早期囊胚阶段；植入代孕母牛子宫内，直至小牛出生。⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验，目的是排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因，应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的基因表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
5.[2023·海南卷]基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut－Dip－Budding，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于_________；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和__________，该过程还需要光照，其作用是__________________________________________ _____。(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的__________。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注__________。(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_____________________________________________ ____________________________。
诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的
Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
解析：(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是________________________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是_________________________，依据是______________________________________________________ ________________。(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是_______________________________________________________(答出2点即可)。
荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根
观察幼苗是否表现出白化特征
PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短
解析：(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
长句专练 强素养1.事实概述类(1)[全国卷Ⅱ]蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和___________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。(2)[全国卷Ⅰ]从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是___________________。(3)[全国卷Ⅰ]在培育某些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是___________________________________。
可感染植物，将目的基因转移到受体细胞中
(4)[全国卷]质粒运载体用EcR Ⅰ切割后产生的片段如下：为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是______________________________________________。(5)在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，其操作步骤分别是______________________________________________________________________________________________。
切割产生的DNA片段末端与EcR Ⅰ切割产生的末端相同
第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基)；第二次是进一步筛选出能产生人们所需抗体的杂交瘤细胞(用抗原—抗体结合法)
2．原因分析类(1)[全国卷Ⅰ]若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是____________________________。(2)[全国卷]若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________________________________________。(3)与从基因组文库获取目的基因相比，用cDNA方法获得的目的基因在受体菌中更容易表达，原因是______________________________________________________________________________________。
噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
cDNA中不含内含子，转录出的RNA不需要经过加工，可直接作为合成蛋白质的模板
(4)在进行植物组织培养的实验时，要严格控制杂菌污染的原因是___________________________________________________________。(5)若想利用植物体细胞杂交技术培养出马铃薯—草莓杂种植物以提高土地的利用率，________(填“能”或“不能”)把两物种的细胞直接融合，理由是____________________________________________。(6)动物体细胞进行体外培养时，________(填“需要”或“不需要”)脱分化过程，原因是__________________________________________ ________________________________________________________。
杂菌可以在培养基上生长并争夺营养，杂菌产生的物质影响植物组织的生长
植物细胞外面有一层细胞壁，阻碍了细胞间的杂交(融合)
高度分化的动物细胞分化的潜能变窄，失去发育成完整个体的能力
3．实践应用类(1)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_____________________作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者的具体操作过程是______________________________ ______________________。(2)20世纪九十年代开始，松嫩平原草地出现大面积盐碱化，羊草数量锐减，严重影响了当地畜牧业的发展，生态环境持续恶化。生物途径治盐碱就是在严重盐碱化的草地或盐碱斑上施加枯草或种植耐盐碱的虎尾草，以改善土壤条件，使羊草可以生长发育。该生态恢复的目标就是重建松嫩平原植物和动物群落，使松嫩平原恢复到(或接近)受干扰前的状态。从现代生物技术的角度给出加速盐碱地恢复羊草种植的建议：____________________________________________________。
抗盐基因(或目的基因)
将培育的烟草幼苗栽培于含盐土壤中，观察该烟草植株的生长状态
以虎尾草耐盐碱基因为目的基因，通过转基因技术培育耐盐碱的羊草
题组预测一　聚焦基因工程1.[2023·河北衡水中学校考一模]研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒为载体，图2为含W基因的DNA片段。
(1)采用_________技术可以快速、大量获得W基因。利用该技术扩增目的基因时，要有__________________________，以便合成引物，该技术需要______________________________等作为原料和直接能源物质。(2)启动子是____________识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图1质粒中插入W基因，其上游启动子应选择_________ (填写字母)。A．枯草芽孢杆菌启动子B．乳酸杆菌启动子C．农杆菌启动子(3)根据图1和图2，应使用限制酶________________切割图2中含W基因的DNA片段，导入质粒以获得能正确表达W基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含___________的培养基筛选，以得到转入W基因的乳酸杆菌。
目的基因两端的已知核苷酸序列
dATP、dGTP、dCTP、dTTP(或dNTP)
解析：(1)为快速、大量获得W基因，可采用PCR技术。利用该技术扩增目的基因时，要知道目的基因两端的核苷酸序列，以便合成引物，需要dATP、dGTP、dCTP、dTTP(或dNTP)等作为原料和直接能源物质。(2)启动子是基因中识别和结合RNA聚合酶的部位。结合题意可知，该基因工程是将枯草芽孢杆菌的W基因导入乳酸杆菌，让W基因在乳酸杆菌中成功表达，所以应当选择乳酸杆菌启动子，故选B。(3)选择限制酶时应当注意：不能破坏目的基因，质粒要确保至少含有一个完整的标记基因，目的基因和质粒切割后形成的黏性末端还要能互补配对，最好选择两种以上限制酶切割，经综合分析，BamHⅠ会切割到启动子，MfeⅠ会破坏目的基因，所以应该使用EcRⅠ和HindⅢ切割质粒和含W基因的DNA片段。因为构建的基因表达载体只含有标记基因氨苄青霉素抗性基因，所以应使用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。
(4)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力，研究人员用液体培养基分别培养下表所示菌种。取部分菌液上清液测定酶活力，实验方案及测定结果如下表所示。表中的X应为___________________。
解析：本实验的目的是“为了确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力”，所以不光有空白对照，还要排除质粒自身的影响，所以X应为导入空质粒的乳酸菌。
2.[2023·河北保定统考二模]番茄在低温下运输、储存的过程中，容易出现冻伤，影响番茄的品质。科学家利用基因工程技术将AFPs抗冻基因转入番茄植株，培育抗冻番茄。下图1表示构建重组质粒时所用载体，三种限制酶及酶切位点分别为：①BamHⅠ　②BglⅡ—③EcRⅠ。请回答下列问题：
(1)构建重组质粒时一般需要选用两种不同的限制酶切割，目的是________________________________________________。用限制酶切割质粒后，可以使用________酶催化DNA片段上的磷酸二酯键的形成。(2)在重组质粒中，目的基因首端的启动子能够与__________结合，驱动目的基因的转录。本实验应选用_____________作为标记基因。(3)若目的基因用BamHⅠ和BglⅡ剪切，质粒用BamHⅠ剪切，剪切后的目的基因和质粒能连接在一起，原因是______________________________________。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用______________酶对两种重组质粒进行剪切，通过凝胶电泳分析产物大小进行区分(如图2所示)，图中_______ (填“样品1”或“样品2”)为所需基因表达载体。
防止目的基因和质粒自身环化，以及目的基因和质粒反向连接
BamHⅠ和BglⅡ切割DNA后产生相同的黏性末端
解析：(1)构建重组质粒时一般需要选用两种不同的限制酶切割，这样切割目的基因和质粒后，片段两侧形成的黏性末端不同，这样可以防止载体、目的基因自身环化及目的基因反向连接。用限制酶切割质粒后，可以使用DNA连接酶催化具有相同黏性末端的DNA片段上的磷酸二酯键的形成，进而构建目的基因表达载体。(2)启动子是位于基因首端的一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶的结合位点，驱动基因的转录过程，因此，在重组质粒中，目的基因首端的启动子能够与RNA聚合酶结合，驱动目的基因的转录形成mRNA。由图可知，由于T－DNA有转移作用，可将目的基因和四环素抗性基因整合到受体细胞染色体DNA上，所以本实验应选用四环素抗性基因作为标记基因。
(3)据图可知，BamHⅠ切割得到的黏性末端为—GATC，BglⅡ切割得到的黏性末端为—GATC，其黏性末端相同，故剪切后的目的基因能与质粒连接在一起；重组质粒形成后，在重组质粒上，质粒上的切割位点会有EcRⅠ－BamHⅠ－BglⅡ和EcRⅠ－BglⅡ－BamHⅠ两种顺序，而目的基因的编码顺序是从BamHⅠ到BglⅡ，故要用EcRⅠ和BamHⅠ将EcRⅠ－BglⅡ－BamHⅠ这种反向连接的重组质粒剪切去除；正向连接的重组质粒会被切去20 kb长度的片段，反向连接的重组质粒会被切去45 kb长度的片段，电泳凝胶中，DNA分子量越大，在凝胶中收到的阻力越大，迁移距离越短，说明样品2是所需的基因表达载体。
3.[2023·海南统考模拟]研究发现，大豆的耐高温性与其含有的ClS基因有关，已知大豆中存在6种ClS基因，科研人员对其中一种ClS基因——GmClS1基因进行扩增，并利用农杆菌转化法将其导入烟草细胞中，培育出转基因烟草。请回答下列相关问题：(1)科研人员利用PCR技术对GmClS1基因进行扩增时，通过设计引物可在GmClS1基因的两端分别添加能切出不同黏性末端的限制酶NdeⅠ和EcRⅠ的酶切位点，这样做可避免______________________ _____________________________。(2)利用质粒和扩增得到的GmClS1基因构建基因表达载体时，除限制酶NdeⅠ和EcRⅠ外，还需要使用__________酶。在基因表达载体中，启动子和终止子作为调控元件调控的是GmClS1基因的________过程。构建基因表达载体的目的是______________________________ ____________________________________________________________。
目的基因的反向连接和自我
环化(或目的基因与质粒的随意连接)
使GmClS1基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使GmGlS1基因能够表达和发挥作用
解析：(1)通过设计引物可在GmClS1基因的两端分别添加能切出不同黏性末端的限制酶NdeⅠ和EcRⅠ的酶切位点，这样做可避免GmClS1基因和运载体的自身连接成环和反向连接。(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心，限制酶和DNA连接酶是构建基因表达载体的工具酶。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段，终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。因此，在基因表达载体中，启动子和终止子作为调控元件调控的是GmClS1基因的转录过程。基因表达载体的构建是基因工程的核心，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞时，首先将基因表达载体导入经______________处理的农杆菌中，然后使其侵染野生型烟草细胞，利用______________________________的特性筛选出导入了GmClS1基因的受体细胞，将受体细胞培养成烟草植株需要用到____________技术。为确定转基因烟草是否具有耐高温特性，可采用的方法是_________________________________________。
钙离子(或CaCl2)
基因表达载体上标记基因(或标记基因)
在高温条件下培养转基因烟草，观察植株的生长状态
解析：利用农杆菌转化法将基因表达载体导入受体细胞，为了提高转化率，首先用Ca2＋处理细胞，使农杆菌成为处于一种能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。质粒中的抗生素抗性基因属于标记基因，标记基因能鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。因此利用基因表达载体上标记基因的特性筛选出导入了GmClS1基因的受体细胞，将受体细胞培养成烟草植株需要用到植物组织培养技术，为确定转基因烟草是否具有耐高温特性，可将转基因烟草种植在高温环境中看能否正常生长。
题组预测二　聚焦细胞工程4.[2023·海南华侨中学校考一模]花椰菜(2n＝18)种植时容易遭受病菌侵害形成病斑，紫罗兰(2n＝14)具有一定的抗病性。科研人员利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜新品种。请回答下列问题：
(1)科研人员分别取紫罗兰叶肉细胞和黑暗处发芽的花椰菜胚轴细胞，过程①经______________酶处理后，得到两种原生质体。过程②用______________试剂诱导两种原生质体融合，显微镜下选择特征为___________________的细胞，通过____________技术形成试管苗。进一步选择叶片形态特征介于二者之间的植株作为待测植株。
解析：植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，所以要获得原生质体需要用纤维素酶和果胶酶处理；诱导原生质体融合可以用PEG试剂。因此过程①经纤维素酶和果胶酶处理后，得到两种原生质体。过程②用PEG(或聚乙二醇)试剂诱导两种原生质体融合，实验选择的材料是紫罗兰的叶肉细胞，所以显微镜下选择特征为含有叶绿体且形态较大的细胞，经过植物组织培养技术形成试管苗。进一步选择叶片形态特征介于二者之间的植株作为待测植株。
(2)通过蛋白质电泳技术分析了亲本及待测植株中某些特异性蛋白，结果如图2所示。据图2判断，________号为杂种植株。(3)科研人员将病菌悬浮液均匀喷施于杂种植株叶片上，一段时间后，测定___________________的百分比，以筛选抗病性强的杂种植株。(4)植物体细胞杂交技术的意义是______________________________ ______________。
能打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，