新高考生物一轮复习考点梳理讲义 第10单元　解惑练5　CRISPR Cas9技术（含解析）

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(1)CRISPR/Cas9是细菌的一种后天免疫防御机制——CRISPR序列示意图如下(其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列)，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。
(2)病毒或外源质粒上存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM(原间隔序列临近基序)。
(3)当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。
(4)当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。
2．CRISPR/Cas9技术的运用和发展
(1)具体运用如下图所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(指导RNA)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。
(2)CRISPR/Cas9基因魔剪：当研究人员要用基因魔剪来编辑一个基因组时，他们会人工构建一个指导RNA，它与将要被切割的DNA代码相匹配。魔剪蛋白Cas9与指导RNA形成复合物，将魔剪带到基因组中将要进行切割的地方。
(3)原始的CRISPR/Cas9会由于RNA定位偏差而出现脱靶效应，现在通过改进，可以大幅降低脱靶效应。同时还发现了一些新的系统，除了最开始的Cas9，后面又找到了Cas12的一系列酶，机理上有一定不同，但还是用以切割DNA；还有Cas13则用于切割RNA。基于Cas12和Cas13的开发以及机制研究，又发展出了新的工具用于快速检测病毒，效率可以达到几分钟检测一个样品，并且用到了现在的新冠病毒检测中。
跟踪训练
1．CRISPR/Cas9基因编辑技术源于细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后，细菌Cas2会随机切断入侵的噬菌体DNA双链，并将切下的一个DNA片段(原型间隔序列)插入CRISPR位点(由间隔序列和重复序列交替排列组成的基因序列)的重复序列中，构成新的间隔序列，形成“免疫记忆”。当同种噬菌体再次入侵时，由CRISPR位点的新的间隔序列转录产生的crRNA便会将另一种蛋白质(如Cas9)准确带入到入侵者的原间隔序列DNA处，并将之切断，即“免疫灭杀”。CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA(单向导RNA)是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列，CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，对DNA序列中的原型间隔序列相邻基序具有较高的编辑效率，如图所示。回答下列问题：
(1)细菌Cas2基因表达Cas2的过程需要细菌提供______________________等原料，Cas2和Cas9在功能上都属于__________酶，可催化____________键水解。
(2)CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与细菌体内的____________功能相同，都可以与相应靶基因序列发生碱基互补配对。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵，但是仍然会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌，原因可能是_________________
_______________________________________________________________________________。
(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18～20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA－DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路：________________________________________________________________________
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答案 (1)核糖核苷酸和氨基酸 限制性内切核酸(或限制) 磷酸二酯 (2)crRNA 噬菌体DNA中的原型间隔序列发生基因突变，导致CRISPR位点形成的crRNA无法对其进行识别 (3)设计Cas9酶，让其手指状结构远离DNA序列，从而在sgRNA和DNA错配时，不会用来稳定错配结构(合理即可)
解析 (1)基因表达包括转录和翻译两个过程，因此细菌Cas2基因表达Cas2的过程需要细菌提供核糖核苷酸和氨基酸等原料。由题意可知，Cas2和Cas9都能切割DNA，属于限制性内切核酸酶(或限制酶)。限制酶能切割DNA分子，催化磷酸二酯键水解。(2)分析题意可知，CRISPR/Cas9系统中的sgRNA能够与DNA杂交，其功能与细菌体内的crRNA相似。细菌“免疫记忆”能够切割噬菌体的DNA，若其功能失效，可能是细菌体内的crRNA不能正确识别噬菌体的DNA，即噬菌体的DNA中的原型间隔序列发生基因突变，导致CRISPR位点形成的crRNA无法对其进行识别，进而导致Cas9不能切割噬菌体的DNA。(3)由题意可知，sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别时，由于第18～20个碱基不匹配，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA－DNA双链，导致错误切割，故可设计Cas9酶，让其手指状结构远离DNA序列，从而在sgRNA和DNA错配时，不会用来稳定错配结构。
2．(2023·河南安阳高三模拟)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，从而达到基因定点敲除、敲入、突变的目的。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(如图所示)。请据图分析回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9借助向导RNA对目标DNA分子进行精准定位，依赖于________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；Cas9蛋白能对目标位点进行准确切割，是因为_____________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)在使用Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和__________(填“相同”或“不同”)的向导RNA进行基因编辑。在设计向导RNA识别序列时，若目标DNA的α链切点附近序列为…GAATCTCCA…，则向导RNA上识别序列为__________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)已知玉米中赖氨酸含量较低，原因是与赖氨酸合成过程中的两个关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度影响较大。当赖氨酸浓度达到一定量时就影响这两种酶的活性，从而使赖氨酸含量很难提高，不能满足需求。现使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶基因进行改造，首先需要构建由启动子、__________________________________(目的基因)、标记基因、终止子等组成的基因表达载体，然后使用____________法导入玉米细胞，完成转化后CRISPR/Cas9系统可在玉米体细胞中特定的基因位点改写遗传信息，再经______________________技术培育成赖氨酸高产的玉米植株。
答案 (1)向导RNA识别序列与目标DNA之间的碱基互补配对 Cas9蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点断开磷酸二酯键(Cas9蛋白具有专一性) (2)不同 …GAAUCUCCA… (3)Cas9蛋白基因和sgRNA基因 农杆菌转化 植物组织培养
解析 (1)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，能准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助向导RNA与目标DNA进行精确定位的原因在于向导RNA上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现向导RNA与目标DNA分子特定序列的特定识别，进而定位；对目标位点的切割则依赖于Cas9蛋白的专一识别，Cas9蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点剪切特定的碱基序列，使磷酸二酯键断裂。