绿色荧光蛋白（GFP）的研究史

先看一道试题：

 GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。

（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。

（2）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。

答案：（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因

（2）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达

解析：有关密码子，考生可从以下几方面把握：

①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。

②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。

③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。

这是2023全国乙卷试题节选。以绿色荧光蛋白（GFP）为情景考查基因工程。

2019高中生物学必修二也提到了绿色荧光蛋白：

那么，什么是绿色荧光蛋白（GFP）？是如何发现的？

绿色荧光蛋白（GFP）是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。近些年其被广泛应用于实验研究等各个领域，因而，常在高中生物题目中看到有关绿色荧光蛋白（GFP）的信息，2023年全国高考乙卷理综考试38题就是以绿色荧光蛋白（GFP）为信息出了一道大题，让我们一块儿学习一下绿色荧光蛋白的研究历程，提高对绿色荧光蛋白（GFP）的认识，从中感受科学探究精神。

1956年，从长崎医科大学毕业的下村修仅用10个月从海洋荧光动物海蜇体内提纯和结晶了荧光素（是海蜇放出的让海水发出蓝光的发光物质），该项研究是海外科学家经过长年的尝试和研究都没有成功的难题。名古屋大学因其这项成果破例授予下村修博士学位，晋升他为助理教授。美国普林斯顿大学学者弗兰克·约翰逊也因这项成果注意到了下修村的研究能力，邀请他到美国去。

1959年，下村修和弗兰克·约翰逊投入到了一个新的研究课题中，该课题研究另一种海洋发光生物碗水母的发光机理。海蜇等大多数发光动物能发光是靠两种物质荧光素和荧光素酶合作产生的结果。碗水母受到外界惊扰时发出绿光，2位科学家提取不到荧光素酶，认为其发光机理与“荧光素——荧光素酶反应”不同。

1962年，下村修和弗兰克·约翰逊从约10万只的水母（这些水母几乎全由下修村和其家人自己采集）中纯化出发光蛋白，命名为水母发光蛋白，并阐明了它之所以发光的机理。他们发现水母发光蛋白存在于水母的发光器官中，它与细胞内的钙离子结合后分解变成脱辅水母发光蛋白和氧化荧光素，发出蓝色的光（特征峰波长是460nm）。但这却与水母自身发出的绿光颜色不同，一定还有别的物质与水母发光机理有关。经过几个月的研究，他们终于成功地分离提取出了绿色荧光蛋白质(GFP),原来是水母发光蛋白与GFP形成了复合体的缘故。

1974年，下村修和弗兰克·约翰逊经过研究，终于弄清楚碗水母的发光机理是这样的，水母发光蛋白吸收钙离子后发出蓝光，该蓝光激发GFP发出波长为508nm的绿色荧光。这个反应被称为“荧光共振能量转移”。但在当时，他们并没有想到GFP有什么应用价值。
    1987年—1992年，生物化学研究者道格拉斯·普蜡石对GFP发出绿色荧光这一特性很感兴趣，思考如果把GFP与其他的物质相结合，那它会不会就成了调查生物体内的组织和细胞举动的示踪物质呢？普蜡石潜心研究5年，在1992年成功解读了GFP遗传基因。可惜的是由于研究经费的问题，他没有完成最初设定的目标。

1992年—1994年，哥伦比亚大学的生物学家马丁·查尔菲通过普蜡石拿到了GFP遗传基因。查尔菲通过分子生物学的方法，将绿色荧光蛋白的cDNA导入到大肠杆菌、线虫等模式生物并成功使其得到表达，在紫外线的照射下，发出绿光。而且，这样处理后的生物并没有发生异常，证明了GFP的示踪物质作用。1994年，这个研究结果发表后，GFP一下子变得众所周知，关于它的研究也霎时成为时代的宠儿。

1994年，加利福尼亚大学圣地亚哥分校生物学药学部的钱永健教授通过改良GFP遗传基因而稍微改变了氨基酸的序列，开发出了光的波长虽然相同，还是在绿光的范围内，但光的强度却得以提高的改良型GFP。

1998年，钱永健教授又改良了氨基酸的序列，开发出了荧光波长变长或变短，能发出不同颜色的光的变异型GFP。这些变异型可以做到虽然在同一个细胞里，却可以根据发光颜色的不同来同时显示多个蛋白质的不同机能。

如果把到目前为止GFP发现、发展的过程比喻为电视技术的话，下村修发现，普蜡石和沙尔菲发展应用的绿色GFP相当于初期的黑白电视，而钱永健开发的多色荧光蛋白质就相当于彩色电视。

普通的蛋白质在植入了作为异物的荧光蛋白质之后，它本来的机能还能完全发挥出来么，有没有因此而引发异常的可能性呢，这些问题都还没有得到确认。

2008年，诺贝尔化学奖颁给了在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出突出贡献的三位科学家，他们分别是化学家下村修教授、哥伦比亚大学的马丁·查尔菲教授和美国的钱永健教授。