高考生物必背核心知识NO.7——选必3 第3章 基因工程

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高考生物核心必备知识背诵 NO.7选必3 第3章 基因工程   核心必备知识 课本P67—69，问题1.艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了什么？1.DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。2.科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了什么，至此基因工程问世？2.物种间的基因交流。3.基因工程的工具和工具酶分别是什么？3.工具：限制酶、DNA连接酶、载体          工具酶：限制酶、DNA连接酶4.由基因工程的概念分析：操作环境？操作水平？目的？原理？优势？其他名称？4.操作环境：体外      操作水平：DNA分子水平    目的：产生符合人们需要的新的生物类型和生物产品原理：基因重组     基因工程最大的优势：定向改造生物的遗传性状  其他名称：重组DNA技术、 转基因技术5.基因拼接的原理？外源基在受体细胞中表达的原理？5.目的基因和载体都是由脱氧核苷酸组成的，都是双螺旋结构        生物界共用一套遗传密码。6.启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的比较启动子≠起始密码；终止子≠终止密码，密码子是mRNA上的，参与翻译过程 第1节  重组DNA技术的基本工具1.限制酶的全称？主要来源？在原核生物中的作用？1.限制性内切核酸酶     来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。     切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的2.限制酶的作用特点？作用结果？   作用的化学键？2.作用特点：识别特定的核苷酸序列，切割特定部位的磷酸二酯键     结果：产生黏性末端或平末端   磷酸二酯键    3.限制酶不破坏自身DNA的原因是什么？3.①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列     ②甲基化酶对识别序列进行了修饰4. DNA连接酶的作用？分类及连接的末端？4.恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键①E.coliDNA连接酶：来源于大肠杆菌；  只能连接黏性末端    ②T4DNA连接酶：来源于T4噬菌体； 能连接黏性末端、平末端（效率较低）5.DNA聚合酶和DNA连接酶有什么区别？5.①DNA聚合酶催化单个核苷酸连接到已有的核酸片段3’端，形成磷酸二酯键；DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键  ②DNA聚合酶催化形成与模板链互补的DNA链；DNA连接酶催化DNA片段连接起来，不需要模板6.载体的种类？质粒的结构？6.质粒、噬菌体、动植物病毒        一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。7.作为载体必须具备的条件？7.①能在受体细胞中复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选   ④对受体细胞无害。8.（1）DNA粗提取与鉴定的原理？（2）不能选择哺乳动物成熟的红细胞的原因？（3）研磨后过滤的方案是？（4）①4℃冰箱放置几分钟的作用？②搅拌时应轻缓、并沿一个方向的原因？ （5）鉴定试剂 （6）提取和分离DNA用塑料离心管的原因是？ 8.（1）①DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L的NaCl溶液③鉴定原理：DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色     （2）哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA（3）①4℃冰箱静置后取上清液     ②直接将研磨液倒入塑料离心管中，离心后取上清液（4）①抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解   ②减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 （5）二苯胺（6）细胞破碎后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附；由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。 第2节  基因工程的基本操作程序1.基因工程的4步？1.目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定_2.目的基因是指？Bt基因来自于哪种菌？ Bt抗虫蛋白如何造成害虫死亡？Bt抗虫蛋白为何不会引起人畜死亡？2.用于改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因 ，主要是编码蛋白质的基因，也可以是调控因子  苏云金杆菌     当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡    Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，所以不会引起人畜死亡3.获取目的基因的方法？3.从基因文库中获取、利用PCR技术获取和扩增、人工合成4.基因文库构建的方法？从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，原因是？4.反转录法、直接分离法     基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A5. PCR的原理？条件？产物的鉴定方法     5.原理：DNA半保留复制。  条件：一定的缓冲液（需加入Mg2+）、2种引物、模板DNA、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸          鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳6.PCR的过程？用PCR可以扩增mRNA吗？ 反转录的过程？6.①变性：加热至90℃以上，双链DNA解聚为单链；②复性：冷却至50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：加热至72℃左右，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，溶液中的四种脱氧核苷酸加到引物的3’端，合成新的DNA链。      不可以，需要逆转录成cDNA再进行扩增      ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA7.基因工程的核心步骤？构建基因表达载体的目的？为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？7.基因表达载体的构建    目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。   提示：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。8.基因表达载体的组成及每部分的作用？8.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+复制原点       ①启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录  ②终止子：终止转录，使转录在所需要的地方停下来。  ③标记基因：用于重组DNA分子的筛选9.目的基因与载体结合用到的限制酶有什么要求？切割后两个DNA片段之间连接形成的产物？9.同种限制酶或者产生相同末端的限制酶（同尾酶）   目的基因-目的基因、目的基因-载体、载体-载体三种10. 使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶切割目的基因和质粒的目的是什么？10.可以防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接（或保证目的基因和质粒正确连接）11.在构建基因表达载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？11.不能    如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断，破坏目的基因。12.（1）转化的概念？（2）常用的转化方法？12.（1）指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）①将目的基因导入植物细胞： 农杆菌转化法，花粉管通道法。受体细胞多是体细胞。②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。③将目的基因导入微生物细胞：方法是：Ca2+  处理法。最常用的原核细胞是 大肠杆菌13.（1）T-DNA的作用？（2）原核生物作为受体细胞的优势是？（3）Ca2+  处理法的过程？（4）花粉管通道法的操作是？13.（1）将目的基因导入受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。（2）繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 （3）先用Ca2+处理细胞，使其成为容易吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组基因表达载体导入其中（4）可以用微量注射器将含目的基因的DNA直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。14.采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上? 目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析？14.由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上,而目的基因又插入到了T-DNA上,所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。      使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达①第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。  ②第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T­DNA导入受体细胞。15.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因的方法及原理是？核酸分子杂交的具体操作？15.方法是采用 PCR技术（DNA半保留复制）或核酸分子杂交技术（碱基互补配对）——注意，首填PCR，因为是课本正文出现的。      用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的染色体DNA进行杂交，如果显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中16.检测目的基因是否转录出了mRNA，方法及原理是？核酸分子杂交的具体操作？16.方法是采用PCR技术（DNA半保留复制）或核酸分子杂交技术（碱基互补配对）     用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的mRNA杂交， 如果显示出杂交带，表明目的基因已转录17. 检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法及原理是？17.方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。原理：抗体与抗原特异性结合18.个体生物学水平在是否具有抗性及抗性程度方面如何鉴定？18.①抗虫棉：采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫     ②耐盐水稻：用一定浓度的盐水浇灌水稻③抗除草剂植物：喷洒除草剂        ④抗病毒（菌）植物：病毒（菌）接种实验⑤转基因产品：提取转基因产品与天然产品的功能进行活性比较19.构建基本表达载体时，若目的基因插入到启动子的上游，则转基因动物无法产生相应的外源蛋白，原因是？     19.目的基因不能转录。20.经检测,抗旱基因已经导入到烟草细胞,但未检测出抗旱基因转录出的mRNA,从构建基因表达载体的角度推测,最可能的原因是？20.基因表达载体上目的基因首端未加入启动子21.制备乳腺生物反应器生产药物为什么要加乳腺蛋白质基因启动子？21.该启动子能够在乳腺组织中特异启动目的基因的表达（只有加上乳腺上皮细胞中特异性表达的启动子，才能保证药用蛋白基因在山羊的乳腺细胞中表达）22.构建基因表达载体时，科研人员选用了花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子修饰合成的微型人胰岛素基因，达到驱动微型人胰岛素基因表达的目的。试推测，修饰目的基因采用病毒启动子的原因可能是？22.病毒启动子驱动微型人胰岛素基因的表达不受核基因的调控23.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？23.识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可办能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来或缺目的基因。24.当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：①若无法获得该蛋白，原因可能是什么？①真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白②以上情况如何解决？②使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞③若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？③原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工④以上情况如何解决？④人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 第3、4节  基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程菌的概念？用大肠杆菌生产人胰岛素的流程是怎样的？目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？1.用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类称为基因工程菌      ①人胰岛素基因的筛选和获取：用RT-PCR（逆转录PCR）获取人胰岛素基因（cDNA）   ②人胰岛素基因表达载体的建构：用限制酶和DNA连接酶将人胰岛素基因（要添加启动子、终止子）与质粒拼接，构建基因表达载体；  ③将人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞：用Ca+处理大肠杆菌，将重组质粒导入大肠杆菌；  ④人胰岛素基因的检测与鉴定：检测筛选出成功转化的大肠杆菌   ⑤进行发酵培养（菌种扩大培养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）   大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，没有生物活性；酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工和修饰，有生物活性。2.获得乳腺生物反应器时，要将药用蛋白基因和哪些调控组件重组在一起？乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？2.乳腺中特异表达的基因的启动子等调控组件重组在一起     不一定 ①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁        不局限于性别与生长期（乳腺生物反应器必须是雌性，且泌乳期才会分泌）      将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组3.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？3.①猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似   ②与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多        在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。4.由蛋白质工程的概念分析：基础、手段和目的分别是什么？4.基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系     手段：改造或合成基因目的：改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求5.蛋白质工程的目标？直接操作对象？ 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ 为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？5.根据人们对蛋白质功能的“特定需要”，对蛋白质的结构进行分子设计改造    基因      确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因，或应用基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等进而改造基因①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大；②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质；③基因可以遗传，蛋白质无法遗传6.蛋白质工程的基本思路？6.从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质7.设计试管婴儿与试管婴儿有什么区别？7.植入前对胚胎进行遗传学诊断8.降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应的思路？   9.了解：人鼠嵌合抗体----蛋白质工程为了克服鼠源性单克隆抗体存在的问题，科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人一鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。嵌合抗体指的是鼠单克隆抗体的恒定区基因被人抗体的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码并在合适的宿主细胞中表达而产生的单克隆抗体。基本原理:抗体分子的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的，而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体，使其重链和轻链的可变区来自小鼠，恒定区来自人类。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性，又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体，在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除，从而降低治疗效果。 10.总结（一）PCR技术：（1）名称：多聚酶链式反应   （2）原理：DNA半保留复制（3）过程：PCR由变性—复性--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤①变性：加热至90℃以上，双链DNA解聚为单链；②复性：冷却至50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：加热至72℃左右，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，溶液中的四种脱氧核苷酸加到引物的3’端，合成新的DNA链。④重复循环变性—复性--延伸三过程就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。（4）PCR反应体系的成分DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA原料∶ dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），提供原料和能量酶∶ TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）引物∶与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补Mg2+：激活DNA聚合酶活性所必需PCR缓冲液∶维持pH，保护TaqDNA聚合酶（5）DNA在体内复制的条件       模板∶DNA分子的两条链原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP酶∶ 解旋酶、DNA聚合酶等引物∶RNA引物，温和的反应条件（6）与体内DNA分子复制的不同点：①酶不同；  ②引物不同   ③温度条件不同（7）PCR技术可用于基因工程四个基本步骤中的：目的基因的筛选与获取、目的基因的检测与鉴定（二）引物 （1）引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（2）需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此DNA的复制需要引物（3）设计两种引物的原因：基因的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用2种引物才能确保DNA两条链同时被扩增（4）需要大量引物的原因：子链是在引物的引导下合成的，引物随子链DNA数量的增多而被消耗需要引物的数量：（2n-1)×2，当扩增4次，共产生 16 个DNA时，消耗30 个引物。（5）PCR扩增的产物的特异性：由引物的特异性决定；引物是根据目的基因两端的核苷酸序列设计的（6）两引物间固定长度(等长)的DNA序列在PCR扩增3次后首先出现（7）复制方向:是沿子链5’→3’，从引物的3’端延伸子链（8）如果需要在引物上加限制酶的识别序列： 需要在引物的5’加（9）在引物的5’端设计两种限时酶识别序列的原因：便于目的基因和载体的定向正确连接了解：引物的5'端可修饰，引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入启动子序列等。引物的3'端不可修饰；引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。（10）如果引物中GC含量较高，可适当提高复性温度（11）设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得到目的产物（12）设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率（13）引物设计不能太短：防止非目的基因的获得（14）复性温度过高，得不到产物的原因：引物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）例：进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中____的设定与引物有关，____的设定与扩增片段的长度有关。   ①变性温度   ②复性温度   ③延伸温度  ④变性时间   ⑤退火时间   ⑥延伸时间答案：②      ⑥（15）目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____________。答案：TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活（16）为方便构建重组质粒，设计引物时需要增加适当的_________位点。设计引物时需要避免引物之间形成_______________________，而造成引物自连。(限制酶    碱基互补配对)（17）为便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_______端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是___________________________。（5'  使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连）（18）PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多（19）变性温度过低会导致双链不能充分解开；（20）退火温度过高会导致引物不能充分与模板链结合，导致目标产物的量减少（三）基因文库的构建           （四）基因的选择性表达生物体内所有细胞（除哺乳动物成熟红细胞外）均具有相同的基因，但是有的基因在所有细胞中都表达（如呼吸酶基因），但是有的基因只在特定细胞中选择性表达（如胰岛素基因在所有体细胞中均存在，所以所有细胞中的DNA均可与胰岛素基因探针形成杂交带。但是其仅在胰岛B细胞中表达，所以只在胰岛B细胞中能转录出相应的mRNA，因此只有胰岛B细胞中的mRNA与胰岛素基因探针形成杂交带。）（五）DNA片段的扩增及电泳鉴定              预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？1.可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。2.如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。3.留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物总结：1.不能出现扩增产物：（1）引物自身有碱基互补配对的序列，导致引物自连（2）复性温度过高，引物不能稳定的与模板结合（3）变性温度过低会导致双链不能充分解开；（4）酶的活性降低            （5）Mg2+浓度过低（6）模板DNA含有杂蛋白（抑制耐高温的DNA聚合酶活性的杂蛋白）2.出现非目的序列产物：（1）引物设计太短  （2）两引物之间碱基互补配对  （3）复性温度过低 选必3 第3章 基因工程    核心必备知识 达标验收课本P67—69，问题1.艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了什么？2.科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了什么，至此基因工程问世？3.基因工程的工具和工具酶分别是什么？4.由基因工程的概念分析：操作环境？操作水平？目的？原理？优势？其他名称？5.基因拼接的原理？外源基在受体细胞中表达的原理？6.启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的比较第1节  重组DNA技术的基本工具1.限制酶的全称？主要来源？在原核生物中的作用？2.限制酶的作用特点？作用结果？   作用的化学键？3.限制酶不破坏自身DNA的原因是什么？4. DNA连接酶的作用？分类及连接的末端？5.DNA聚合酶和DNA连接酶有什么区别？6.载体的种类？质粒的结构？7.作为载体必须具备的条件？8.（1）DNA粗提取与鉴定的原理？（2）不能选择哺乳动物成熟的红细胞的原因？（3）研磨后过滤的方案是？（4）①4℃冰箱放置几分钟的作用？②搅拌时应轻缓、并沿一个方向的原因？ （5）鉴定试剂 （6）提取和分离DNA用塑料离心管的原因是？ 第2节  基因工程的基本操作程序1.基因工程的4步？2.目的基因是指？Bt基因来自于哪种菌？ Bt抗虫蛋白如何造成害虫死亡？Bt抗虫蛋白为何不会引起人畜死亡？3.获取目的基因的方法？4.基因文库构建的方法？从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，原因是？5. PCR的原理？条件？产物的鉴定方法     6.PCR的过程？用PCR可以扩增mRNA吗？ 反转录的过程？7.基因工程的核心步骤？构建基因表达载体的目的？为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？8.基因表达载体的组成及每部分的作用？9.目的基因与载体结合用到的限制酶有什么要求？切割后两个DNA片段之间连接形成的产物？10. 使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶切割目的基因和质粒的目的是什么？11.在构建基因表达载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？12.（1）转化的概念？（2）常用的转化方法？13.（1）T-DNA的作用？（2）原核生物作为受体细胞的优势是？（3）Ca2+  处理法的过程？（4）花粉管通道法的操作是？14.采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上? 目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析？15.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因的方法及原理是？核酸分子杂交的具体操作？16.检测目的基因是否转录出了mRNA，方法及原理是？核酸分子杂交的具体操作？17. 检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法及原理是？18.个体生物学水平在是否具有抗性及抗性程度方面如何鉴定？19.构建基本表达载体时，若目的基因插入到启动子的上游，则转基因动物无法产生相应的外源蛋白，原因是？     20.经检测,抗旱基因已经导入到烟草细胞,但未检测出抗旱基因转录出的mRNA,从构建基因表达载体的角度推测,最可能的原因是？21.制备乳腺生物反应器生产药物为什么要加乳腺蛋白质基因启动子？22.构建基因表达载体时，科研人员选用了花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子修饰合成的微型人胰岛素基因，达到驱动微型人胰岛素基因表达的目的。试推测，修饰目的基因采用病毒启动子的原因可能是？23.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？24.当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：①若无法获得该蛋白，原因可能是什么？②以上情况如何解决？③若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？④以上情况如何解决？第3、4节  基因工程的应用及蛋白质工程1.基因工程菌的概念？用大肠杆菌生产人胰岛素的流程是怎样的？目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？2.获得乳腺生物反应器时，要将药用蛋白基因和哪些调控组件重组在一起？乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？3.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？4.由蛋白质工程的概念分析：基础、手段和目的分别是什么？5.蛋白质工程的目标？直接操作对象？ 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？ 为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？6.蛋白质工程的基本思路？7.设计试管婴儿与试管婴儿有什么区别？8.降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应的思路？