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生物选择性必修3 生物技术与工程一 目的基因的获得多媒体教学ppt课件
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这是一份生物选择性必修3 生物技术与工程一 目的基因的获得多媒体教学ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了内容索引，自主预习·新知导学，表达载体的构成，方法步骤，合作探究·释疑解惑，图Z3-3-1，图Z3-3-2，图Z3-3-3，图Z3-3-4，课堂小结等内容，欢迎下载使用。
一、目的基因的获得1.从基因组文库中分离目的基因(1)适用条件:在基因序列未知时。(2)DNA提取流程
(3)“鸟枪法”分离目的基因的主要步骤①提取基因组DNA。②建立基因组文库
2.从cDNA文库中获得目的基因(1)利用mRNA筛选目的基因需要建立cDNA文库以某一生物特定发育阶段所转录的所有mRNA为模板↓在反转录酶的作用下合成互补的单链DNA,即单链cDNA↓以单链cDNA为模板合成双链cDNA↓经限制性内切核酸酶酶切,在DNA连接酶的作用下将大小不同的cDNA片段与适当的载体连接,导入受体细胞↓根据载体的特性进行筛选、扩增,即可得到cDNA文库
(2)cDNA文库的特点及应用①特点:可反映某种生物特定发育阶段、特定组织中的编码基因,因此cDNA具有组织特异性。②应用:在研究特定发育阶段、特定组织或细胞中基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定等方面具有独特的优势,从而在研究个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老及死亡等生命现象时具有更为广泛的应用价值。3.利用化学反应合成目的基因(1)适用条件:在已知目的基因序列或已知蛋白质氨基酸排列顺序可以反推出基因序列时。(2)常用方法:固相磷酸三酯合成法。
(3)过程①首先将一个核苷酸的5'-羟基用保护基团保护起来,连接到固相材料上。②然后脱掉保护基团,使第一个核苷酸的5'-羟基和第二个核苷酸的3'-端发生缩合反应。③接着将第二个核苷酸的5'-羟基用保护基团保护起来,通过氧化作用,使第一个和第二个核苷酸稳定连接在一起。④继续脱掉第二个核苷酸5'-羟基的保护基团,和第三个核苷酸的3'-端发生缩合反应。⑤重复上述步骤,直到所要求的核苷酸一个一个被连接上。(4)目前,人们已经根据化学法合成DNA的原理,设计生产了DNA自动合成仪。
4.利用PCR快速扩增目的基因(1)PCR的原理:类似于生物体内的DNA双链复制过程,在特制的PCR仪上进行。(2)所需成分:作为模板的DNA,人工合成的引物,Taq DNA聚合酶,4种三磷酸脱氧核糖核苷。
(3)过程①变性:加热使模板双链DNA在高温(94 ℃)下变性,解链成为单链DNA。②复性:反应体系降温至合适温度(引物和模板结合的温度),模板与引物按照碱基互补配对原则结合,形成模板-引物复合物。③延伸:反应体系温度回升到72 ℃并维持一段时间,耐热的Taq DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的指导下,利用4种dNTP ,按照5'到3'的方向复制合成互补的DNA。 (4)优点:操作简便、灵敏度高、特异性强、对原始材料的质量要求低。
5.DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测(1)目的要求①熟练运用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测技术。②阐明PCR体外扩增目的基因的原理。(2)实验原理①PCR扩增的原理:PCR是在模板DNA、引物和4种dNTP的存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成。为了实现目的基因的大量扩增,以上述反应为一个周期,循环进行20~50个周期后,目的基因可以增加上百万倍。
②琼脂糖凝胶电泳检测的原理:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便的快速分离、纯化、鉴定DNA的方法。琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子大小,因此,大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。核酸染料与核酸结合后能产生很强的荧光信号,在紫外光透射下可清晰呈现。(3)材料用具:(略)
(4)方法步骤①DNA片段的PCR扩增a.在冰浴的0.2 mL离心管中加入PCR反应体系所需的各种成分,混匀。b.将离心管放入PCR仪,输入并运行反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,50 ℃复性30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃终延伸10 min;降至4 ℃保温。②扩增产物的电泳检测a.配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶溶液,制成胶板。在PCR扩增的DNA样品中加入适量的上样缓冲液,混匀后,取适量加入胶孔,100 V稳压电泳0.5 h。b.电泳结束后,将胶板放在凝胶成像仪上,观察、扫描图像。
二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的原因(1)外源的DNA片段导入另一种生物细胞后,往往会被该细胞分泌的酶分解消化掉,不能进行表达。(2)如果将目的基因连接到载体上,目的基因就可能逃过受体细胞的防御系统,免遭破坏。
2.目的基因表达载体的构建过程(以质粒载体为例)
3.基因工程载体的种类(1)根据用途的不同①克隆载体:将目的基因和载体连接导入受体细胞后,目的基因会在受体细胞内大量复制,但不一定表达的载体。②表达载体:使目的基因在受体细胞内表达翻译蛋白质的载体。(2)根据载体来源的不同,表达载体分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。
三、大肠杆菌质粒DNA的提取和鉴定1.目的要求(1)尝试从大肠杆菌中提取质粒DNA并鉴定。(2)阐明质粒DNA提取和鉴定的原理。(3)了解用质粒DNA构建表达载体的方法。
2.实验原理用碱裂解法释放质粒DNA和基因组DNA,释放出来的DNA遇到强碱环境会变性。用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,而大分子的线性基因组DNA不能复性。离心后,质粒DNA在上清液中,而基因组DNA与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定。3.材料用具:(略)
注溶液Ⅰ为质量分数为1%的葡萄糖,50 mml/L EDTA,25 mml/L Tris-HCl pH 8.0;溶液Ⅱ为质量分数为1%的SDS,0.2 mml/L NaOH;溶液Ⅲ为5 ml/L乙酸钾,pH 4.8。
【预习检测】 1.判断正误。(1)Taq酶是用PCR仪扩增DNA分子过程中常用的一种耐热的DNA连接酶。( )(2)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。( ) (3)利用化学反应人工合成目的基因常用固相磷酸三酯合成法。( )(4)基因组文库与cDNA文库的区别之一是cDNA文库中的基因数量少。( )
(5)琼脂糖凝胶电泳依据的原理之一是带有大量正电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以向负极泳动。( )(6)标记基因是基因表达载体的必要组分。( ) (7)基因表达载体只包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。( )(8)大肠杆菌质粒DNA的提取利用了质粒DNA和基因组DNA在pH呈中性的溶液中复性程度不同的特点。( )
2.下列哪项不是PCR所必需的?( )A.DNA聚合酶 B.引物C.解旋酶 D.4种三磷酸脱氧核糖核苷答案:C解析:DNA在体外复制时需要DNA母链作为模板,DNA聚合酶催化子链延伸,4种三磷酸脱氧核糖核苷作为原料。DNA在细胞外解旋时不用解旋酶而是利用温度。
3.(不定项选择题)下列关于DNA片段体外扩增的叙述,正确的是( )。A.需要向离心管中加入引物、dNTP、模板、DNA聚合酶等B.DNA聚合酶需要耐热,在DNA聚合酶的作用下按3'到5'的方向合成DNAC.扩增DNA的反应程序是变性—延伸—复性D.可以使用琼脂糖凝胶电泳检测技术对PCR结果进行分析答案:AD4.下列哪项不是基因表达载体的组成成分?( ) A.启动子 B.终止密码子C.标记基因 D.复制原点答案:B
5.在基因表达载体的构建中,所需要的酶是( )。 ①限制酶 ②DNA连接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶A.①② B.①②③C.①②④ D.①②③④答案:A6.下列不属于目的基因与载体结合过程的是( )。 A.用一定的限制酶切割质粒,露出黏性末端B.用同种限制酶切割目的基因,露出黏性末端C.将切下的目的基因与切割后的质粒DNA连接在一起D.利用PCR快速扩增目的基因答案:D
【问题引领】围绕转基因抗虫棉的培育这个案例,阅读教科书第91~95页的内容,思考并讨论下列问题。(1)在该项目中,目的基因是什么?最初获得这种目的基因的方法属于哪种?提示:培育转基因抗虫棉的目的基因是来自苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫基因,简称Bt基因。最初获得Bt抗虫基因的方法属于从基因组文库中分离目的基因。
(2)在PCR技术中,为什么不直接加入解旋酶对DNA进行解旋?为什么要求所加入的DNA聚合酶具有耐热的特性?子链的合成为什么需要引物?提示:DNA解旋酶既可以打开双链模板DNA,又可以打开模板DNA与引物结合的部分,会导致复制与解旋不断地重复而达不到扩增效果。因此PCR反应中利用高温条件代替解旋酶使DNA解旋。PCR反应需要高温变性,因此需要耐热的DNA聚合酶。DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上,因此需要一段已知序列的DNA作为引物。(3)PCR扩增目的基因是获得目的基因的唯一方法吗?请说明理由。提示:不是。还可以从基因组文库、cDNA文库以及利用化学反应获得目的基因。
【归纳提升】1.几种目的基因获得方法的比较
2.PCR的相关知识(1)原理:类似于生物体内的DNA双链复制过程。(2)过程PCR包括20~50个不等的重复扩增循环,每个循环由变性—复性—延伸三个基本步骤组成。(3)条件:PCR缓冲液、模板DNA溶液、DNA引物、dNTP溶液、Taq DNA聚合酶等。
(1)Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶,能在高温条件下催化DNA复制。(2)引物是依据目的基因的已知序列合成的两段单链DNA,在复性的时候与相应模板链结合。两条子链在引物的基础上延伸,方向相反。目的基因的两条链碱基序列不同,因此需要合成两种引物。
3.细胞内DNA复制与PCR体外扩增DNA的比较
【典型例题】图Z3-3-1为形成cDNA和PCR扩增过程的示意图。据图分析,下列说法正确的是( )。
A.催化①过程的酶是DNA聚合酶B.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合C.催化②⑤过程的酶都必须能耐高温D.③过程需要解旋酶答案:B
解析:题图为形成cDNA和PCR扩增过程的示意图,其中①是由RNA形成单链DNA的过程,为反转录过程,不需要DNA聚合酶,A项错误。④是复性,此过程中模板与引物按照碱基互补配对原则结合,B项正确。②是以单链DNA合成双链DNA的过程,是DNA分子复制过程,此过程不需要高温,C项错误。③④⑤是PCR扩增DNA片段的过程,其中③是加热使DNA变性的过程,不需要解旋酶,D项错误。
【变式训练】 1.PCR技术是体外扩增DNA的技术,需经20~50个循环才能获得足够的目的DNA片段。有人把模板DNA用15N标记,引物用32P标记,以研究PCR的扩增过程。下列有关PCR技术的叙述,正确的是( )。 A.每增加一次循环,产物中含15N标记的DNA都增加一定数量B.每增加一次循环,产物中含32P标记的DNA都增加一定数量C.反应需要的DNA聚合酶必须不断加入D.反应需要的DNA连接酶必须不断加入答案:B
解析:作为模板的DNA只需在最初加入即可,随后的反应会以第一次反应的产物作为模板,A项错误。每次合成开始前,都需要引物来指导DNA互补链的形成,而旧引物已经在上一次合成中被消耗,因此需要不断加入引物,B项正确。PCR中使用的DNA聚合酶是耐热的Taq DNA聚合酶,可以重复使用,C项错误。PCR技术不需要DNA连接酶,D项错误。
2.利用PCR技术可获得目的基因,下列相关叙述正确的是( )。A.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似B.PCR反应体系中需添加磷酸、脱氧核糖和含氮的碱基作为原料C.PCR反应体系中需要添加从受体细胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶D.在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应答案:A解析:在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,A项正确。PCR反应体系中需添加三磷酸脱氧核糖核苷作为原料,B项错误。PCR是通过高温使DNA变性解链的,不需要加入解旋酶,需要加入耐热的Taq DNA聚合酶,C项错误。在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA变性、复性、延伸,而不是为了使DNA聚合酶催化不同的反应,D项错误。
【问题引领】1.为什么要构建基因表达载体?提示:外源的DNA片段导入另一种生物细胞后,往往会被该细胞分泌的酶分解消化掉,不能进行表达。如果将目的基因连接到载体上,目的基因就可能逃过受体细胞的防御系统,免遭破坏。2.基因表达载体中的启动子、复制原点、标记基因各有什么作用?提示:启动子是转录时RNA聚合酶结合的位点。复制原点是DNA复制的起点,发挥带动目的基因复制的功能。标记基因一般为抗生素抗性基因,当受体细胞为微生物时可用于筛选含有目的基因的受体细胞,如果受体细胞为植物细胞或动物细胞,则标记基因不是表达载体的必要组分。
3.怎样构建基因表达载体?提示:构建表达载体是在多种酶的作用下完成的。以质粒载体为例,首先要用限制性内切核酸酶切割质粒,露出DNA末端,然后用同样的限制性内切核酸酶切割目的基因,使目的基因产生相同的DNA末端。这样,在DNA连接酶的作用下,切割后的质粒与切割后的目的基因就能连接在一起,形成一个含有目的基因的新环状质粒——DNA分子表达载体。
【归纳提升】1.目的基因表达载体的构建过程
2.注意事项(1)载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。(2)用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。(3)启动子、终止子对于目的基因的表达必不可少。(4)目的基因不能单独进入受体细胞,必须以表达载体的方式携带进去。
(5)切割载体的限制酶与切割目的基因的限制酶必须产生相同的黏性末端,以便DNA连接酶将其连接,可以用同一种限制酶,也可以用不同的限制酶。(6)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。目的基因的插入不能破坏标记基因。(7)将切开的载体与切开的目的基因混合,加入DNA连接酶后,会出现多种连接方式,如载体与载体连接、目的基因与目的基因连接、载体与目的基因连接等。
【典型例题】图Z3-3-2中的三个DNA片段上依次表示出了EcR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图Z3-3-3为某种表达载体的示意图(载体上的EcR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识,回答下列问题。(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。 (2)若某人利用图Z3-3-3所示的表达载体获得了图Z3-3-4所示的甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。
答案:(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录解析:(1)由题图Z3-3-2可知,尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不相同,但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图Z3-3-3中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用,甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游,故这两个载体上的目的基因都不能被转录和翻译。
【变式训练】 1.下列有关基因工程中载体的说法,错误的是( )。 A.基因工程的关键是基因表达载体的构建B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别C.启动子是RNA聚合酶结合的位点D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因答案:B
2.(不定项选择题)下列关于基因表达载体构建的相关叙述,正确的是( )。A.需要限制酶和DNA连接酶B.抗生素抗性基因可作为标记基因C.复制原点是DNA复制的起点D.启动子是启动翻译的一段DNA答案:ABC解析:构建基因表达载体过程中需要用限制酶切割目的基因和载体,最后用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来,A项正确。抗生素抗性基因可以用作标记基因,B项正确。基因表达载体的构建需要启动子、目的基因、复制原点、标记基因和终止子等,启动子是转录时RNA聚合酶结合的位点,复制原点是DNA复制的起点,C项正确,D项错误。
【问题引领】实验中溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用分别是什么?提示:(1)溶液Ⅰ(质量分数为1%的葡萄糖,50 mml/L EDTA,25 mml/L Tris-HCl pH 8.0)的作用:使细菌悬浮,EDTA中螯合金属离子使DNA酶等核酸酶失活,防止DNA的降解(核酸酶需要Mg2+等金属离子作为激活剂)。(2)溶液Ⅱ(质量分数为1%的SDS,0.2 mml/L NaOH)的作用:细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时,NaOH造成强碱性环境使DNA发生变性,SDS与蛋白质结合,使蛋白质发生变性。(3)溶液Ⅲ(5 ml/L 乙酸钾,pH 4.8)的作用:用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,留在上清液,而大分子的线性基因组DNA不能复性,与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀,从而将质粒DNA从细菌中提取出来。
【归纳提升】1.实验原理分析(1)DNA变性:用碱裂解法释放质粒DNA和基因组DNA,释放出来的DNA遇到强碱环境会变性。(2)质粒DNA复性溶解:用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,而大分子的线性基因组DNA不能复性。离心后,质粒DNA在上清液中,而基因组DNA与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀。(3)检测DNA:利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定。
2.一些实验试剂的作用(1)溶液Ⅰ:质量分数为1%的葡萄糖,50 mml/L EDTA,25 mml/L Tris-HCl pH 8.0 作用:葡萄糖可以增加溶液的黏度,防止DNA受机械剪切力作用而降解; EDTA中螯合金属离子使DNA酶等核酸酶失活,防止DNA的降解(核酸酶需要Mg2+等金属离子作为激活剂);25 mml/L Tris-HCl作为缓冲溶液。(2)溶液Ⅱ:质量分数为1%的SDS,0.2 mml/L NaOH作用:细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时,NaOH造成强碱性环境使DNA发生变性,SDS与蛋白质结合,使蛋白质发生变性。
(3)溶液 Ⅲ:5 ml/L 乙酸钾,pH 4.8作用:用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,留在上清液,而大分子的线性基因组DNA不能复性,与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀,从而将质粒DNA从细菌中提取出来。(4)无水乙醇:DNA不溶于预冷的无水乙醇中,可用于沉淀质粒DNA。3.溶液Ⅱ现配现用且需放置在常温下溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应而变质,导致溶液ⅡpH下降,无法达到很好的裂解效果;溶液中SDS成分在温度较低的环境下会由于溶解度下降而析出,使溶液失去效果。
【典型例题】基因工程的关键是基因表达载体的构建,常用的载体是质粒,提取合适的质粒对于构建基因表达载体非常关键。下列有关提取大肠杆菌质粒的叙述,错误的是( )。A.用碱裂解法释放质粒DNA和基因组DNA并使之变性B.用酸性乙酸钾溶液可以使质粒DNA快速复性溶解,基因组DNA和一些蛋白质离心后则进入沉淀物C.利用无水乙醇可以析出DNA,与DNA在无水乙醇中的溶解度有关D.提取的质粒DNA需要用二苯胺鉴定,二苯胺遇质粒DNA变蓝,遇基因组DNA不变蓝答案:D
解析:提取大肠杆菌质粒DNA常用碱裂解法,细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时释放出质粒DNA和基因组DNA,并迅速变性,A项正确。变性的质粒DNA在中性环境下可以复性溶解,而大分子的基因组DNA不易复性,加入酸性乙酸钾溶液就是中和原溶液的pH使其呈中性,B项正确。利用无水乙醇可以沉淀质粒DNA,是由于DNA在预冷的无水乙醇中的溶解度较低,C项正确。提取的质粒DNA需要鉴定,鉴定用的试剂是二苯胺,二苯胺在沸水浴条件下遇DNA变蓝,不是只遇质粒DNA变蓝,D项错误。
【变式训练】 1.提取大肠杆菌质粒DNA需经三次离心,每次离心的目的不同。下列有关叙述正确的是( )。A.第一次离心是为了获得大肠杆菌菌体,它存在于上清液中B.第二次离心,是为了获得质粒DNA,它存在于上清液中C.第三次离心,是为了去除基因组DNA,它存在于沉淀物中D.三次离心的转速相同,说明目的产物的密度相同答案:B
2.在大肠杆菌质粒DNA的提取过程中用到多种试剂。下列有关这些试剂的叙述,错误的是( )。A.利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定B.溶液Ⅱ中NaOH和SDS溶液必须提前配制放置一段时间后再混合均匀C.EDTA使DNA酶等核酸酶失活,防止DNA被降解D.溶液Ⅲ使质粒DNA复性,加入溶液Ⅲ后离心管中会出现白色絮状沉淀答案:B
一、目的基因的获得1.从基因组文库中分离目的基因(1)适用条件:在基因序列未知时。(2)DNA提取流程
(3)“鸟枪法”分离目的基因的主要步骤①提取基因组DNA。②建立基因组文库
2.从cDNA文库中获得目的基因(1)利用mRNA筛选目的基因需要建立cDNA文库以某一生物特定发育阶段所转录的所有mRNA为模板↓在反转录酶的作用下合成互补的单链DNA,即单链cDNA↓以单链cDNA为模板合成双链cDNA↓经限制性内切核酸酶酶切,在DNA连接酶的作用下将大小不同的cDNA片段与适当的载体连接,导入受体细胞↓根据载体的特性进行筛选、扩增,即可得到cDNA文库
(2)cDNA文库的特点及应用①特点:可反映某种生物特定发育阶段、特定组织中的编码基因,因此cDNA具有组织特异性。②应用:在研究特定发育阶段、特定组织或细胞中基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定等方面具有独特的优势,从而在研究个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老及死亡等生命现象时具有更为广泛的应用价值。3.利用化学反应合成目的基因(1)适用条件:在已知目的基因序列或已知蛋白质氨基酸排列顺序可以反推出基因序列时。(2)常用方法:固相磷酸三酯合成法。
(3)过程①首先将一个核苷酸的5'-羟基用保护基团保护起来,连接到固相材料上。②然后脱掉保护基团,使第一个核苷酸的5'-羟基和第二个核苷酸的3'-端发生缩合反应。③接着将第二个核苷酸的5'-羟基用保护基团保护起来,通过氧化作用,使第一个和第二个核苷酸稳定连接在一起。④继续脱掉第二个核苷酸5'-羟基的保护基团,和第三个核苷酸的3'-端发生缩合反应。⑤重复上述步骤,直到所要求的核苷酸一个一个被连接上。(4)目前,人们已经根据化学法合成DNA的原理,设计生产了DNA自动合成仪。
4.利用PCR快速扩增目的基因(1)PCR的原理:类似于生物体内的DNA双链复制过程,在特制的PCR仪上进行。(2)所需成分:作为模板的DNA,人工合成的引物,Taq DNA聚合酶,4种三磷酸脱氧核糖核苷。
(3)过程①变性:加热使模板双链DNA在高温(94 ℃)下变性,解链成为单链DNA。②复性:反应体系降温至合适温度(引物和模板结合的温度),模板与引物按照碱基互补配对原则结合,形成模板-引物复合物。③延伸:反应体系温度回升到72 ℃并维持一段时间,耐热的Taq DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的指导下,利用4种dNTP ,按照5'到3'的方向复制合成互补的DNA。 (4)优点:操作简便、灵敏度高、特异性强、对原始材料的质量要求低。
5.DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测(1)目的要求①熟练运用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测技术。②阐明PCR体外扩增目的基因的原理。(2)实验原理①PCR扩增的原理:PCR是在模板DNA、引物和4种dNTP的存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成。为了实现目的基因的大量扩增,以上述反应为一个周期,循环进行20~50个周期后,目的基因可以增加上百万倍。
②琼脂糖凝胶电泳检测的原理:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便的快速分离、纯化、鉴定DNA的方法。琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子大小,因此,大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。核酸染料与核酸结合后能产生很强的荧光信号,在紫外光透射下可清晰呈现。(3)材料用具:(略)
(4)方法步骤①DNA片段的PCR扩增a.在冰浴的0.2 mL离心管中加入PCR反应体系所需的各种成分,混匀。b.将离心管放入PCR仪,输入并运行反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,50 ℃复性30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃终延伸10 min;降至4 ℃保温。②扩增产物的电泳检测a.配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶溶液,制成胶板。在PCR扩增的DNA样品中加入适量的上样缓冲液,混匀后,取适量加入胶孔,100 V稳压电泳0.5 h。b.电泳结束后,将胶板放在凝胶成像仪上,观察、扫描图像。
二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的原因(1)外源的DNA片段导入另一种生物细胞后,往往会被该细胞分泌的酶分解消化掉,不能进行表达。(2)如果将目的基因连接到载体上,目的基因就可能逃过受体细胞的防御系统,免遭破坏。
2.目的基因表达载体的构建过程(以质粒载体为例)
3.基因工程载体的种类(1)根据用途的不同①克隆载体:将目的基因和载体连接导入受体细胞后,目的基因会在受体细胞内大量复制,但不一定表达的载体。②表达载体:使目的基因在受体细胞内表达翻译蛋白质的载体。(2)根据载体来源的不同,表达载体分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。
三、大肠杆菌质粒DNA的提取和鉴定1.目的要求(1)尝试从大肠杆菌中提取质粒DNA并鉴定。(2)阐明质粒DNA提取和鉴定的原理。(3)了解用质粒DNA构建表达载体的方法。
2.实验原理用碱裂解法释放质粒DNA和基因组DNA,释放出来的DNA遇到强碱环境会变性。用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,而大分子的线性基因组DNA不能复性。离心后,质粒DNA在上清液中,而基因组DNA与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定。3.材料用具:(略)
注溶液Ⅰ为质量分数为1%的葡萄糖,50 mml/L EDTA,25 mml/L Tris-HCl pH 8.0;溶液Ⅱ为质量分数为1%的SDS,0.2 mml/L NaOH;溶液Ⅲ为5 ml/L乙酸钾,pH 4.8。
【预习检测】 1.判断正误。(1)Taq酶是用PCR仪扩增DNA分子过程中常用的一种耐热的DNA连接酶。( )(2)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。( ) (3)利用化学反应人工合成目的基因常用固相磷酸三酯合成法。( )(4)基因组文库与cDNA文库的区别之一是cDNA文库中的基因数量少。( )
(5)琼脂糖凝胶电泳依据的原理之一是带有大量正电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以向负极泳动。( )(6)标记基因是基因表达载体的必要组分。( ) (7)基因表达载体只包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。( )(8)大肠杆菌质粒DNA的提取利用了质粒DNA和基因组DNA在pH呈中性的溶液中复性程度不同的特点。( )
2.下列哪项不是PCR所必需的?( )A.DNA聚合酶 B.引物C.解旋酶 D.4种三磷酸脱氧核糖核苷答案:C解析:DNA在体外复制时需要DNA母链作为模板,DNA聚合酶催化子链延伸,4种三磷酸脱氧核糖核苷作为原料。DNA在细胞外解旋时不用解旋酶而是利用温度。
3.(不定项选择题)下列关于DNA片段体外扩增的叙述,正确的是( )。A.需要向离心管中加入引物、dNTP、模板、DNA聚合酶等B.DNA聚合酶需要耐热,在DNA聚合酶的作用下按3'到5'的方向合成DNAC.扩增DNA的反应程序是变性—延伸—复性D.可以使用琼脂糖凝胶电泳检测技术对PCR结果进行分析答案:AD4.下列哪项不是基因表达载体的组成成分?( ) A.启动子 B.终止密码子C.标记基因 D.复制原点答案:B
5.在基因表达载体的构建中,所需要的酶是( )。 ①限制酶 ②DNA连接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶A.①② B.①②③C.①②④ D.①②③④答案:A6.下列不属于目的基因与载体结合过程的是( )。 A.用一定的限制酶切割质粒,露出黏性末端B.用同种限制酶切割目的基因,露出黏性末端C.将切下的目的基因与切割后的质粒DNA连接在一起D.利用PCR快速扩增目的基因答案:D
【问题引领】围绕转基因抗虫棉的培育这个案例,阅读教科书第91~95页的内容,思考并讨论下列问题。(1)在该项目中,目的基因是什么?最初获得这种目的基因的方法属于哪种?提示:培育转基因抗虫棉的目的基因是来自苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫基因,简称Bt基因。最初获得Bt抗虫基因的方法属于从基因组文库中分离目的基因。
(2)在PCR技术中,为什么不直接加入解旋酶对DNA进行解旋?为什么要求所加入的DNA聚合酶具有耐热的特性?子链的合成为什么需要引物?提示:DNA解旋酶既可以打开双链模板DNA,又可以打开模板DNA与引物结合的部分,会导致复制与解旋不断地重复而达不到扩增效果。因此PCR反应中利用高温条件代替解旋酶使DNA解旋。PCR反应需要高温变性,因此需要耐热的DNA聚合酶。DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上,因此需要一段已知序列的DNA作为引物。(3)PCR扩增目的基因是获得目的基因的唯一方法吗?请说明理由。提示:不是。还可以从基因组文库、cDNA文库以及利用化学反应获得目的基因。
【归纳提升】1.几种目的基因获得方法的比较
2.PCR的相关知识(1)原理:类似于生物体内的DNA双链复制过程。(2)过程PCR包括20~50个不等的重复扩增循环,每个循环由变性—复性—延伸三个基本步骤组成。(3)条件:PCR缓冲液、模板DNA溶液、DNA引物、dNTP溶液、Taq DNA聚合酶等。
(1)Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶,能在高温条件下催化DNA复制。(2)引物是依据目的基因的已知序列合成的两段单链DNA,在复性的时候与相应模板链结合。两条子链在引物的基础上延伸,方向相反。目的基因的两条链碱基序列不同,因此需要合成两种引物。
3.细胞内DNA复制与PCR体外扩增DNA的比较
【典型例题】图Z3-3-1为形成cDNA和PCR扩增过程的示意图。据图分析,下列说法正确的是( )。
A.催化①过程的酶是DNA聚合酶B.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合C.催化②⑤过程的酶都必须能耐高温D.③过程需要解旋酶答案:B
解析:题图为形成cDNA和PCR扩增过程的示意图,其中①是由RNA形成单链DNA的过程,为反转录过程,不需要DNA聚合酶,A项错误。④是复性,此过程中模板与引物按照碱基互补配对原则结合,B项正确。②是以单链DNA合成双链DNA的过程,是DNA分子复制过程,此过程不需要高温,C项错误。③④⑤是PCR扩增DNA片段的过程,其中③是加热使DNA变性的过程,不需要解旋酶,D项错误。
【变式训练】 1.PCR技术是体外扩增DNA的技术,需经20~50个循环才能获得足够的目的DNA片段。有人把模板DNA用15N标记,引物用32P标记,以研究PCR的扩增过程。下列有关PCR技术的叙述,正确的是( )。 A.每增加一次循环,产物中含15N标记的DNA都增加一定数量B.每增加一次循环,产物中含32P标记的DNA都增加一定数量C.反应需要的DNA聚合酶必须不断加入D.反应需要的DNA连接酶必须不断加入答案:B
解析:作为模板的DNA只需在最初加入即可,随后的反应会以第一次反应的产物作为模板,A项错误。每次合成开始前,都需要引物来指导DNA互补链的形成,而旧引物已经在上一次合成中被消耗,因此需要不断加入引物,B项正确。PCR中使用的DNA聚合酶是耐热的Taq DNA聚合酶,可以重复使用,C项错误。PCR技术不需要DNA连接酶,D项错误。
2.利用PCR技术可获得目的基因,下列相关叙述正确的是( )。A.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似B.PCR反应体系中需添加磷酸、脱氧核糖和含氮的碱基作为原料C.PCR反应体系中需要添加从受体细胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶D.在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应答案:A解析:在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,A项正确。PCR反应体系中需添加三磷酸脱氧核糖核苷作为原料,B项错误。PCR是通过高温使DNA变性解链的,不需要加入解旋酶,需要加入耐热的Taq DNA聚合酶,C项错误。在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA变性、复性、延伸,而不是为了使DNA聚合酶催化不同的反应,D项错误。
【问题引领】1.为什么要构建基因表达载体?提示:外源的DNA片段导入另一种生物细胞后,往往会被该细胞分泌的酶分解消化掉,不能进行表达。如果将目的基因连接到载体上,目的基因就可能逃过受体细胞的防御系统,免遭破坏。2.基因表达载体中的启动子、复制原点、标记基因各有什么作用?提示:启动子是转录时RNA聚合酶结合的位点。复制原点是DNA复制的起点,发挥带动目的基因复制的功能。标记基因一般为抗生素抗性基因,当受体细胞为微生物时可用于筛选含有目的基因的受体细胞,如果受体细胞为植物细胞或动物细胞,则标记基因不是表达载体的必要组分。
3.怎样构建基因表达载体?提示:构建表达载体是在多种酶的作用下完成的。以质粒载体为例,首先要用限制性内切核酸酶切割质粒,露出DNA末端,然后用同样的限制性内切核酸酶切割目的基因,使目的基因产生相同的DNA末端。这样,在DNA连接酶的作用下,切割后的质粒与切割后的目的基因就能连接在一起,形成一个含有目的基因的新环状质粒——DNA分子表达载体。
【归纳提升】1.目的基因表达载体的构建过程
2.注意事项(1)载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。(2)用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。(3)启动子、终止子对于目的基因的表达必不可少。(4)目的基因不能单独进入受体细胞,必须以表达载体的方式携带进去。
(5)切割载体的限制酶与切割目的基因的限制酶必须产生相同的黏性末端,以便DNA连接酶将其连接,可以用同一种限制酶,也可以用不同的限制酶。(6)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。目的基因的插入不能破坏标记基因。(7)将切开的载体与切开的目的基因混合,加入DNA连接酶后,会出现多种连接方式,如载体与载体连接、目的基因与目的基因连接、载体与目的基因连接等。
【典型例题】图Z3-3-2中的三个DNA片段上依次表示出了EcR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图Z3-3-3为某种表达载体的示意图(载体上的EcR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识,回答下列问题。(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。 (2)若某人利用图Z3-3-3所示的表达载体获得了图Z3-3-4所示的甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。
答案:(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录解析:(1)由题图Z3-3-2可知,尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不相同,但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图Z3-3-3中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用,甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游,故这两个载体上的目的基因都不能被转录和翻译。
【变式训练】 1.下列有关基因工程中载体的说法,错误的是( )。 A.基因工程的关键是基因表达载体的构建B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别C.启动子是RNA聚合酶结合的位点D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因答案:B
2.(不定项选择题)下列关于基因表达载体构建的相关叙述,正确的是( )。A.需要限制酶和DNA连接酶B.抗生素抗性基因可作为标记基因C.复制原点是DNA复制的起点D.启动子是启动翻译的一段DNA答案:ABC解析:构建基因表达载体过程中需要用限制酶切割目的基因和载体,最后用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来,A项正确。抗生素抗性基因可以用作标记基因,B项正确。基因表达载体的构建需要启动子、目的基因、复制原点、标记基因和终止子等,启动子是转录时RNA聚合酶结合的位点,复制原点是DNA复制的起点,C项正确,D项错误。
【问题引领】实验中溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用分别是什么?提示:(1)溶液Ⅰ(质量分数为1%的葡萄糖,50 mml/L EDTA,25 mml/L Tris-HCl pH 8.0)的作用:使细菌悬浮,EDTA中螯合金属离子使DNA酶等核酸酶失活,防止DNA的降解(核酸酶需要Mg2+等金属离子作为激活剂)。(2)溶液Ⅱ(质量分数为1%的SDS,0.2 mml/L NaOH)的作用:细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时,NaOH造成强碱性环境使DNA发生变性,SDS与蛋白质结合,使蛋白质发生变性。(3)溶液Ⅲ(5 ml/L 乙酸钾,pH 4.8)的作用:用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,留在上清液,而大分子的线性基因组DNA不能复性,与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀,从而将质粒DNA从细菌中提取出来。
【归纳提升】1.实验原理分析(1)DNA变性:用碱裂解法释放质粒DNA和基因组DNA,释放出来的DNA遇到强碱环境会变性。(2)质粒DNA复性溶解:用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,而大分子的线性基因组DNA不能复性。离心后,质粒DNA在上清液中,而基因组DNA与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀。(3)检测DNA:利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定。
2.一些实验试剂的作用(1)溶液Ⅰ:质量分数为1%的葡萄糖,50 mml/L EDTA,25 mml/L Tris-HCl pH 8.0 作用:葡萄糖可以增加溶液的黏度,防止DNA受机械剪切力作用而降解; EDTA中螯合金属离子使DNA酶等核酸酶失活,防止DNA的降解(核酸酶需要Mg2+等金属离子作为激活剂);25 mml/L Tris-HCl作为缓冲溶液。(2)溶液Ⅱ:质量分数为1%的SDS,0.2 mml/L NaOH作用:细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时,NaOH造成强碱性环境使DNA发生变性,SDS与蛋白质结合,使蛋白质发生变性。
(3)溶液 Ⅲ:5 ml/L 乙酸钾,pH 4.8作用:用酸性乙酸钾溶液中和混合液使其呈中性,小分子的质粒DNA快速复性溶解,留在上清液,而大分子的线性基因组DNA不能复性,与细胞碎片、蛋白质等一起沉淀,从而将质粒DNA从细菌中提取出来。(4)无水乙醇:DNA不溶于预冷的无水乙醇中,可用于沉淀质粒DNA。3.溶液Ⅱ现配现用且需放置在常温下溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应而变质,导致溶液ⅡpH下降,无法达到很好的裂解效果;溶液中SDS成分在温度较低的环境下会由于溶解度下降而析出,使溶液失去效果。
【典型例题】基因工程的关键是基因表达载体的构建,常用的载体是质粒,提取合适的质粒对于构建基因表达载体非常关键。下列有关提取大肠杆菌质粒的叙述,错误的是( )。A.用碱裂解法释放质粒DNA和基因组DNA并使之变性B.用酸性乙酸钾溶液可以使质粒DNA快速复性溶解,基因组DNA和一些蛋白质离心后则进入沉淀物C.利用无水乙醇可以析出DNA,与DNA在无水乙醇中的溶解度有关D.提取的质粒DNA需要用二苯胺鉴定,二苯胺遇质粒DNA变蓝,遇基因组DNA不变蓝答案:D
解析:提取大肠杆菌质粒DNA常用碱裂解法,细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时释放出质粒DNA和基因组DNA,并迅速变性,A项正确。变性的质粒DNA在中性环境下可以复性溶解,而大分子的基因组DNA不易复性,加入酸性乙酸钾溶液就是中和原溶液的pH使其呈中性,B项正确。利用无水乙醇可以沉淀质粒DNA,是由于DNA在预冷的无水乙醇中的溶解度较低,C项正确。提取的质粒DNA需要鉴定,鉴定用的试剂是二苯胺,二苯胺在沸水浴条件下遇DNA变蓝,不是只遇质粒DNA变蓝,D项错误。
【变式训练】 1.提取大肠杆菌质粒DNA需经三次离心,每次离心的目的不同。下列有关叙述正确的是( )。A.第一次离心是为了获得大肠杆菌菌体,它存在于上清液中B.第二次离心,是为了获得质粒DNA,它存在于上清液中C.第三次离心,是为了去除基因组DNA,它存在于沉淀物中D.三次离心的转速相同,说明目的产物的密度相同答案:B
2.在大肠杆菌质粒DNA的提取过程中用到多种试剂。下列有关这些试剂的叙述,错误的是( )。A.利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定B.溶液Ⅱ中NaOH和SDS溶液必须提前配制放置一段时间后再混合均匀C.EDTA使DNA酶等核酸酶失活,防止DNA被降解D.溶液Ⅲ使质粒DNA复性,加入溶液Ⅲ后离心管中会出现白色絮状沉淀答案:B
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