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高考生物一轮复习重难点专项 专题54 微生物的筛选和计数
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这是一份高考生物一轮复习重难点专项 专题54 微生物的筛选和计数，文件包含专题54微生物的筛选和计数教师版docx、专题54微生物的筛选和计数学生版docx等2份试卷配套教学资源，其中试卷共102页， 欢迎下载使用。
高考一轮生物复习策略
1、落实考点。
一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。
2、注重理论联系实际，高三生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。
不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。
3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。
这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。
4、学而不思则罔，思而不学则殆。
这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
专题54 微生物的筛选和计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。
①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300_的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数_。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度_。
特别提醒 用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
知识链接：用显微镜直接计数法计数：血细胞计数板法
①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有两个计数室，每个计数室上刻有9个大方格，其中只有中间的大方格为计数室，大方格的长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为0.1 mm3；大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格，即大方格是由400个小方格组成。
②操作：将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的菌液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，充满计数室。
③计数：在显微镜下计数4～5个中方格内的菌体数，求出每个小方格所含有的细菌的平均数，按照以下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每小格平均细菌数×400×104×原液被稀释倍数。
2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
②作用
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
解题技巧
两种微生物筛选方法的比较
项目
土壤中分解尿素的
细菌的分离
分解纤维素的
微生物的分离
方法
使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养
利用富含纤维素的选择培养基进行培养
原理
土壤中不能分解尿素的微生物因缺乏脲酶而不能正常生长，能够分解尿素的微生物能利用尿素为氮源正常生长，从而起到选择作用
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
特有
代表
过程
CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3
纤维素
纤维二糖葡萄糖
一、单选题
1．用106倍稀释液以稀释涂布平板法（涂布量为0.1ml）测定某土壤样品中的细菌数，作如下操作，正确的是（ ）
A．涂布1个平板，统计菌落数是230，计算出菌落总数为2.3×109个/ml
B．涂布2个平板，统计菌落数是303和287，计算出菌落总数为2.95×109个/ml
C．涂布3个平板，统计菌落数是21、212和256，计算出菌落总数为1.63×109个/ml
D．涂布3个平板，统计菌落数是210、240和250，计算出菌落总数为2.33×109个/ml
【答案】D
【分析】
稀释涂布平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
【详解】
在进行该实验时，一定要至少涂布3个平板，作为重复组，减少误差，且每个平板上菌落数量为30-300个才算有效，计算方法：每克样品中的菌落数=平板上菌落数的平均值÷体积×稀释倍数。
故选D。
2．测定土壤中细菌数量一般用104、105、106倍的稀释液进行培养，而测定真菌的数量一般用102、103、104倍稀释，其原因是（ ）
A．细菌在土壤中比真菌多
B．细菌易稀释、真菌不易稀释
C．细菌个体小、真菌个体大
D．真菌在土壤中比细菌多
【答案】A
【分析】
土壤中的微生物大多是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于平板计数。
【详解】
在稀释涂布平板法的实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于平板计数。土壤中的微生物中真菌的数量要比细菌少，所以测定的稀释倍数也小，A正确。
故选A。
3．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是（ ）
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1．7×1010个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
【答案】B
【分析】
从土壤中分离尿素分解菌的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。图中5支试管为梯度稀释，最后经稀释涂布平板法接种培养后进行计数。统计菌落数在30~300的平板，取其平均值，进行计数。计数公式为（C÷V）×M。（C为平均菌落数，V为涂布液体积，M为稀释倍数）
【详解】
A、据图可知，3号试管的稀释倍数为104倍，A错误；
B、4号试管中稀释液进行平板培养，由于4号稀释倍数比5号的低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍，B正确；
C、5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）÷3÷0.1×106=1.7×109个，C错误；
D、稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
故选B。
4．限量补充培养法可用于营养缺陷型菌株的检出（如图）。将诱变后的菌株接种在基本培养基上，野生型菌株迅速形成较大菌落，营养缺陷型菌株生长缓慢，不出现菌落或形成微小菌落。基本培养基中补充精氨酸后，营养缺陷型菌株快速生长。下列叙述正确的是（ ）
A．用紫外线照射可诱导野生型菌株发生定向突变
B．精氨酸缺陷型菌株缺乏吸收利用精氨酸的能力
C．③步骤加入精氨酸后抑制了野生型菌株的生长
D．选择图乙中菌落B分离精氨酸营养缺陷型菌株
【答案】D
【分析】
结合题图分析，A表示野生型菌株形成的菌落，B表示营养缺陷型菌株形成的菌落。
【详解】
A、用紫外线照射诱导野生型菌株发生的变异是基因突变，是不定向的，A错误；
B、精氨酸缺陷型菌株缺乏将其他物质转化为精氨酸的能力，B错误；
C、图中A表示野生型菌株形成的菌落，将图乙与图甲对比可知，③步骤加入精氨酸后促进了野生型菌株的生长，C错误；
D、对比甲和乙可知，③步骤加入精氨酸后才出现的B是精氨酸营养缺陷型菌株，所以可以选择B分离获得精氨酸营养缺陷型菌株，D正确。
故选D。
5．油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到金龙鱼油产生的油烟污染的土壤中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如下图所示，下列叙述错误的是（ ）
A．图中①～③的过程为梯度稀释
B．在④中加入金龙鱼油，其作用是为微生物提供碳源和能源
C．要判断④是否起到选择作用，应设计牛肉膏蛋白胨培养基作对照
D．分离得到的降解菌可采用甘油管藏的方法长期保存
【答案】A
【分析】
1、培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、图中①②③不断经过选择培养，提高目的菌株的浓度。
【详解】
A、图中①～③的过程称为选择培养，A错误；
B、在④中的固体培养基加入金龙鱼油，其作用是为微生物提供碳源和能源，B正确；
C、若要判断④固体培养基是否起到了选择的作用，应设计一个牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）作对照，C正确；
D、长期保存菌种应该采用甘油管藏法，D正确。
故选A。
6．欲想探究1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，需要用科学的方法测定微生物数量。下列相关叙述正确的是（ ）
A．利用以尿素作为唯一氮源的培养基，可从土壤中分离出分解尿素的细菌
B．平板划线法能将单个微生物分散到培养基上，可用来测定样品中的活菌数
C．样品的稀释度直接影响平板上的菌落数目，因此稀释度越大越好
D．利用显微镜进行直接计数，可快速直观地测定样品中的活菌数
【答案】A
【分析】
选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。设计选择培养基时，主要考虑某些微生物的特殊营养需求或它们对某些化学物质具有的抗性。例如，教材中所述的以尿素为唯一氮源的选择培养基，能选择出可以合成脲酶、分解尿素的微生物。下表列出了几种选择培养基的设计。
显微镜直接计数法是利用显微镜、血细胞计数板等工具对纯培养悬浮液直接计数来检测样本中的细胞数目。该方法能直观、快速地检测出单细胞状态下的微生物或丝状微生物所产生的孢子的数目，但是不能区分死细胞和活细胞，不适合细胞密度低的样品。
释涂布平板法常常需要先将样品进行一系列的稀释，然后吸取适量稀释样品涂布在平板上，在稀释度适宜的情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的，从而通过统计平板上的菌落数来推算活菌数。该方法能灵敏地检测出样品中的活菌数，但实验过程手续繁、耗时长、影响因素较多。
显微镜直接计数法由于不能区分死菌和活菌，因此计数结果往往比实际活菌数偏高。为避免把死菌计数在内，可用台盼蓝染色: 被染成蓝色的为死菌，反之为活菌。稀释涂布平板法测定活菌数目的时候，由于相邻两个或多个细胞连在一起，可能形成一个菌落，因此测定值比实际值小。
【详解】
A、以尿素作为唯一氮源的培养基为选择培养基，可从土壤中分离出分解尿素的细菌，A正确；
B、平板划线法能将单个微生物分散到培养基上，但是不可以用来测定样品中的活菌数，稀释涂布平板法可以计数，B错误；
C、样品的稀释度太大，会导致微生物数量太少，一般要求稀释后平板上的菌落数在30 到300之间比较合适，C错误；
D、利用显微镜进行直接计数，可快速直观地测定样品中的活菌数和死菌数，D错误。
故选A。
7．研究者从热泉中筛选出耐高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。相关说法错误的是（ ）
A．①过程需要用无菌水对嗜热菌菌液进行稀释
B．②过程中用涂布器在选择培养基上连续划线
C．接种后的培养皿倒置放在恒温培养箱中培养
D．所获菌株还需要在高温下对酶活性进行测定
【答案】B
【分析】
1、据图分析：①过程是梯度稀释，②过程是稀释涂布平板法接种，目的是筛选单菌落。
2、采用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法；常用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌和干热灭菌。
【详解】
A、①过程是梯度稀释，为避免杂菌污染，该过程需要用无菌水对嗜热菌菌液进行稀释，A正确；
B、进行平板划线法操作时，需要用接种环进行划线；涂布器适用于稀释涂布平板法操作，B错误；
C、在培养时，需将接种后的培养皿倒置并放在恒温培养箱中，培养皿需用记号笔在皿底做好标记，C正确；
D、本操作目的是选出能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，故所获菌株还需要在高温下对酶活性进行测定，D正确。
故选B。
8．下列关于微生物培养和计数的叙述，不正确的是（ ）
A．接种操作中，充分稀释和连续划线的目的都是为了获得单菌落
B．一种培养基和培养条件不能符合全部微生物的生长需求
C．利用显微镜直接计数微生物前需要对菌液进行适当稀释
D．利用显微镜直接计数能逐一对细胞进行统计，比平板计数更精确
【答案】D
【分析】
培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
【详解】
A、接种操作中，充分稀释和连续划线的目的都是为了获得单菌落，A正确；
B、不同微生物的营养需求不一定相同，故一种培养基和培养条件不能符合全部微生物的生长需求，B正确；
C、利用显微镜直接计数微生物前需要对菌液进行适当稀释，便于计数单个微生物，C正确；
D、显微直接计数不能区分死菌和活菌，所以其精确度不会比平板计数法高，D错误。
故选D。
9．分离纤维素分解菌的实验操作有误的是（ ）
A．经选择培养后将样品即可涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少
C．可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶的产量
D．对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到完全培养基上
【答案】A
【分析】
分离分解纤维素的微生物的实验流程：土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
【详解】
A、经选择培养后，再经适度梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上，A错误；
B、选择培养即富集培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌可能会少，B正确；
C、纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定，C正确；
D、实验组和对照组遵循单一变量原则，对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到不含纤维素的培养基上，实验组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到纤维素为唯一碳源的培养基上，通过设置对照能证明经“浓缩”培养的确得到了欲分离的微生物，D正确。
故选A。
10．从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，正确的是（ ）
A．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→挑选菌落
B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落
C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落
D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落
【答案】B
【分析】
从土壤中分离纤维素分解菌的一般步骤是：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养和筛选菌株．筛选纤维素分解菌需要用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，纤维素分解菌可以用刚果红染液进行鉴别，在培养基中加入刚果红染液，在其菌落周围会出现透明圈。
【详解】
从从土壤中分离纤维素分解菌的一般步骤是：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养和筛选菌株。
故选B。
11．为纯化菌种，在鉴别培养基上接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，说明接种前菌液稀释度太低
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落分布不均，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】B
【分析】
分析平板结果可知，采用的接种方法为平板划线法，且划线顺序是Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区，可以看到Ⅲ区中出现了单菌落。
【详解】
A、图中采用的接种方法为平板划线法，在划线的开始，微生物连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后形成单菌落，Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，但不能说明接种前菌液稀释度太低，A错误；
B、Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；
C、培养基中已经出现单菌落，说明达到了菌种纯化的目的，C错误；
D、刚果红是一种染料，可以与纤维素形成红色复合物，纤维素被降解后，红色复合物无法形成，培养基上出现透明圈， D错误。
故选B。
12．纸片扩散法药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有不同种类抗生素的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，从而得岀受试菌株药物敏感性的结论。某次实验结果如下图，下列有关叙述正确的是（ ）
A．接种细菌时应选用稀释涂布平板法
B．未出现抑菌圈说明细菌在接触抗生素后发生了基因突变
C．抑菌圈越小，说明细菌对该种抗生素越敏感
D．不同抗生素在培养基中的扩散速率不影响实验结果
【答案】A
【分析】
由题图信息分析可知，不同的抑菌药物的抑菌圈直径不同，是因为受药物在琼脂中扩散速度的影响，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度。抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。透明圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系。
【详解】
A、图中需要比较不同种类抗生素的纸片周围的抑菌圈，则要求培养基的菌落分布比较均匀，故在图示培养基上的接种方法为稀释涂布平板法，A正确；
B、基因突变是在接触抗生素之前产生的，而不是细菌在接触抗生素后发生的，B错误；
C、抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，由此推测形成的抑菌圈越小，说明细菌对该种抗生素抗性越强，对抗生素越不敏感，C错误；
D、在平板上扩散速度慢的抗生素，形成的透明圈可能会比实际结果偏小，因此，不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响，D错误。
故选A。
13．下列关于刚果红染色法的说法中，正确的是（ ）
A．纤维素分解菌菌落周围出现刚果红
B．倒平板时就加入刚果红，可在培养皿中先加入CR溶液后再加入培养基
C．倒平板时就加入刚果红，长期培养有可能被其他微生物分解形成透明圈
D．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，不需用氯化钠溶液洗去浮色
【答案】C
【分析】
刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理：刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
【详解】
A、纤维素分解菌菌落周围出现透明圈，A错误；
B、倒平板时就加入刚果红，可在培养皿中先加入10mg/mLCR溶液，灭菌后按照每200mL培养基加入1ml的比例加入CR溶液，B错误；
C、倒平板时就加入刚果红，长期培养刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈，C正确；
D、先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，需用氯化钠溶液洗去浮色，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则不需要用氯化钠溶液洗去浮色，D错误。
故选C。
14．显微镜直接计数是测定微生物数量的常用方法之一，欲检测某培养液中纤维素分解菌的数量，某同学将其稀释100倍，在显微镜下进行计数，下图是计数某一小方格时的活菌分布情况。下列相关叙述错误的是（ ）
A．稀释培养液时，使用无菌水，可以避免杂菌的干扰
B．制作装片时，先将盖玻片放在计数室上，再用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让培养液自行渗入
C．为排除死菌的干扰，计数时最好用刚果红染色剂进行染色处理
D．若计数室容积为0.1mm3，则1mL培养液中纤维素分解菌为3.2×109个
【答案】C
【分析】
分析题图：计数时，应该将方格内的纤维素分解菌计数在内，对于边界线上的纤维素分解菌应该计数相邻两边及其夹角中的个体，则图中纤维素分解菌数量为8个。
【详解】
A、稀释培养液时，使用无菌水，可以避免杂菌的干扰，A正确；
B、制作装片时，先将盖玻片放在计数室上，再用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让培养液自行渗入，多余培养液渗入（凹）槽内，B正确；
C、为排除死菌的干扰，可利用活细胞的细胞膜具有选择透过性的原理，计数时用台盼蓝染色法来区分死菌和活菌，C错误；
D、若计数室容积为0.1mm3，由以上分析可知，每个小方格平均有8个酵母菌，那1mL培养液中酵母细胞个数=平均每个小方格的酵母菌数×400×104×稀释倍数=8×400×104×100=3.2×109个，D正确。
故选C。
15．研究人员从土壤中筛选得到酵母菌纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素的条件进行了研究。据图分析正确的是（ ）
A．筛选该高产菌株需要在纤维素为唯一碳源的培养基中培养
B．探究最适温度时应尽可能将发酵液的pH控制在12左右
C．该酵母菌高产菌株产生纤维素酶的最适温度是35 ℃
D．利用该高产菌株降解纤维素时需严格保持厌氧环境
【答案】A
【分析】
分析图1：随着pH的升高，纤维素酶活性逐渐增高，pH=9为其最适pH，超过9，其活性下降；分析图2：随着温度的升高，纤维素酶活性逐渐增高，但图中不能看出其最适温度。
【详解】
A、要筛酵母菌纤维素酶高产菌株应在纤维素为唯一碳源的培养基培养，A正确；
B、探究该酶的最适温度时，pH为无关变量，应控制在最适pH，即将发酵液的pH控制在9左右，B错误；
C、由于图中随着温度的升高，纤维素酶活性逐渐增高，还没有到达顶点，故35℃不一定是其最适温度，C错误；
D、酵母菌属于兼性厌氧型生物，既能进行有氧呼吸，也能进行无氧呼吸，故利用该高产菌株降解纤维素时不需严格保持厌氧环境，D错误。
故选A。
16．幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请选择下列叙述错误的一项（ ）
A．在倒平板后和培养时，需将培养皿倒置
B．在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落变黑
C．临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的尿素分解为氨和14CO2
D．步骤X表示接种，在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液稀释的目的是为了获得单菌落
【答案】B
【分析】
幽门螺杆菌含有脲酶，能分解尿素为菌体提供氮源，因此在配制培养基时要加入尿素；加入酚红指示剂的目的是检验是否有Hp存在，若有Hp存在会分解尿素，培养基pH会升高，酚红指示剂将变红；用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，据此分析。
【详解】
A、在倒平板后，平板冷凝皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在培养时，也需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，将导致无法形成单菌落，A正确；
B、在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则会产生脲酶，将尿素分解为氨，pH升高，遇酚红指示剂变红色，B错误；
C、临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是幽门螺杆菌含有脲酶，能分解尿素为菌体提供氮源，故Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，C正确；
D、步骤X表示在培养基上接种Hp，在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液稀释的目的是为了获得单菌落，以便分离到单一菌种，D正确。
故选B。
17．某科研人员欲从被石油污染的土壤中分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株X，为消除石油污染提供微生物资源。下列叙述错误的是（ ）
A．若上图中A~C以“多环芳烃菲”为唯一碳源的选择培养基进行培养，可提高降解菌的浓度
B．本实验用到的固体培养基在接种前是不透明的，周围有透明圈的菌落即为目的菌落
C．在接种前，可将灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格
D．可用平板划线法或稀释涂布平板法对分离出的菌种进行纯化并计数
【答案】D
【分析】
分析题图：图示表示科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解多环芳烃菲菌株X的主要步骤。其中步骤A→B的培养过程中，培养液中加入多环芳烃菲作为唯一碳源，目的是筛选出菌株X；该过程还需将锥形瓶放在摇床上振荡，目的有两个，一方面使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；另一方面能增加培养液中的溶氧量。
【详解】
A、步骤A～C应为选择培养，分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株X，培养液中加入多环芳烃菲作为唯一碳源，，可提高降解菌的浓度，A正确；
B、固体培养基接种前是不透明的，原因是培养基中含“多环芳烃菲”，当“多环芳烃菲”被降解后，培养基会变透明，所以其中有透明圈菌落即为目的菌落，B正确；
C、在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格，若灭菌后的空白平板培养一段时间后没有菌落生长，说明培养基平板灭菌合格，C正确；
D、平板划线法不能对微生物计数，D错误。
故选D。
18．为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
C．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑选单菌落
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】C
【分析】
微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
A、倒平板时需左三圈，右三圈的轻轻晃动，以保证表面平整，A错误；
B、该实验的Ⅲ区已经出现由单个细菌繁殖而形成的菌落，因此已经达到菌种纯化的目的，B错误；
C、据图分析可知，图中Ⅰ、Ⅱ区的菌落连在一起，细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落，C正确；
D、刚果红可以与纤维素形成红色复合物，纤维素分解菌产生的纤维素酶可以水解纤维素而使菌落周围出现透明圈，D错误。
故选C。
19．下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关的叙述中不正确的是（ ）
A．实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B．图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释
C．统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D．在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型
【答案】B
【分析】
选择培养基可用于筛选具有特定代谢特点的微生物，从土壤中筛选出能降解对羟基苯甲酸的微生物，需要对羟基苯甲酸应为唯一碳源的选择培养基。根据所学知识，结合图示可知，该实验全过程包括筛选→扩大培养→纯化→鉴定。
【详解】
A、从混合物中分离某种微生物要用选择培养基，需要在培养基中加入特定的物质，如羟基苯甲酸，在该培养基中所需要的微生物能大量繁殖，实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基，目的是筛选能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物，A正确；
B、图中Ⅰ、Ⅱ过程的目的是增大降解对羟基苯甲酸的微生物的比例，B错误；
C、稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。由于当两个或多个菌体连在一起生长时，培养基上统计到的是一个菌落，所以统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数，C正确；
D、在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型，原因是微生物所利用的唯一碳源是对羟基苯甲酸是有机物，D正确。
故选B。
20．下列关于分解尿素的细菌的分离与计数、分解纤维素的微生物的分离的叙述，不正确的是（ ）
A．纤维素酶包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，均能催化纤维素分解成葡萄糖
B．分解尿素的细菌能合成脲酶将尿素分解为氨和CO2
C．尿素是一种重要的农业氮肥，农作物不能直接吸收利用
D．采用稀释涂布平板法进行活菌计数，其结果可能会偏小
【答案】A
【分析】
1.筛选目的微生物时应该使用只有目的微生物能够生存，而其他微生物不能生存的选择培养基。选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
2.纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。但刚果红可以与纤维素形成红色复合物，并不和水解后的产物发生这种反应。
【详解】
A、纤维素酶包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和CX酶能使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖，A错误；
B、分解尿素的细菌能合成脲酶，在脲酶的催化下将尿素分解为氨和CO2，被农作物利用，B正确；
C、尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用，C正确；
D、采用稀释涂布平板法进行活菌计数，有的菌落有可能是由多个细菌形成的，所以其结果可能会偏小，D正确。
故选A。
21．解磷菌是土壤中的一类功能微生物，包括细菌、真菌和放线菌。筛选出土壤中的高效解磷菌并制成生物菌剂，可以提高难溶性磷的利用率。下表为“分离出土壤中具有解磷功能的细菌实验”的培养基配方，下列说法正确的是（ ）
物质
葡萄糖
(NH4)2SO4
NaCl
KCl
CaCO3
磷酸三钙
琼脂
质量/g
10
0.5
3
0.3
5
20
15
A．培养基中的琼脂除凝固作用外还可作为解磷菌的碳源
B．该培养基是以磷酸三钙为唯一磷源的选择培养基
C．用平板划线法纯化解磷菌可以计数其活菌的数量
D．可根据培养基中透明圈的大小确定菌株的解磷能力
【答案】B
【分析】
微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
A、固体培养基中的琼脂的作用是凝固，一般不会被微生物所利用，A错误；
B、该培养基是以磷酸三钙为唯一磷源的选择培养基，B正确；
C、用稀释涂布平板法纯化解磷菌可以计数其活菌的数量，C错误；
D、可根据透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物解磷能力大小，D错误。
故选B。
二、多选题
22．科学家将营养缺陷型菌株A、B在缺乏A、B所需的某些特定营养物质的培养基上培养，结果如下图。下列叙述正确的是（ ）
A．各组实验所用的培养基均需灭菌处理
B．菌株A、B混合后能在上述培养基上生长
C．U型管实验证明菌株A、B释放的代谢产物形成了互补
D．推测菌株A、B通过接触发生了遗传物质重新组合
【答案】ABD
【分析】
菌株A、B单独培养都不能生长，用U型管也不能生长，说明菌株A、B释放的代谢产物没有形成互补；但混合培养长成了菌落，可能是菌株A、B通过接触发生了遗传物质重新组合。
【详解】
A、微生物培养需要给培养基灭菌，A正确；
B、如图可知菌株A、B混合后能在.上述培养基上长成菌落，B正确；
C、代谢产物可以通过滤板，但在U型管不能生长，说明菌株A、B释放的代谢产物没有形成互补，C错误；
D、混合培养长成了菌落，但在U型管不能生长，说明可能是菌株A、B通过接触发生了遗传物质重新组合，D正确。
故选ABD。
三、综合题
23．塑料袋造成的“白色污染”早已成为地球公害，塑料袋的自然分解需要20-1000年不等。2008年7月3日加拿大媒体报道：16岁的高中生丹尼尔-伯德从土壤中找到了一类假单胞杆菌，能将聚乙烯塑料的自然降解过程缩短至3个月，而且分解产物只有水和二氧化碳。伯德也因此被誉为“塑料袋的克星”。以下是伯德寻找到聚乙烯降解菌的大致过程。请回答：
（l）根据你的生活经验推测，伯德这项研究的“土壤样品”最可能取自于_____________。
（2）图中“…”表示对土壤悬浮液进行一系列的____________________，目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在Ⅰ号培养基表面形成单个_____________。
（3）Ⅰ号培养基属于______培养基，其作用是使目的菌能“脱颖而出”。如图采用的接种方法为____________。使用Ⅱ号培养基的目的是使目的菌数目增多，培养基中必须包含水、无机盐、___________等基本营养成分，从物理性质来看，Ⅱ号培养基中不能添加_______________。
（4）将1mL培养液稀释一定倍数，在3个平板上用涂布法分别接种0．1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，经计算得出1mL培养液的活菌数为3．8×104个，则稀释倍数为________。
【答案】垃圾场 梯度稀释 菌落 选择 稀释涂布平板法 碳源和氮源 凝固剂或琼脂 100
【分析】
微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）由题干信息分析可知，塑料袋造成的“白色污染”早已成为地球公害，根据生活经验推测，伯德这项研究的“土壤样品”最可能取自于垃圾场（含有大量的塑料）。
（2）图中“…”表示对土壤悬浮液进行一系列的梯度稀释，目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在Ⅰ号培养基表面形成单个菌落。
（3）本实验要筛选出聚乙烯降解菌，由图观察可知，Ⅰ号培养基是选择培养基，目的是筛选出目的菌株。图中采用的接种方法为稀释涂布平板法。使用Ⅱ号培养基的目的是使目的菌数目增多，培养基中必须包含水、无机盐、碳源、氮源等基本营养成分，从物理性质来看，Ⅱ号培养基属于液体培养基，其中不能添加凝固剂或琼脂。
（4）根据稀释涂布平板法的计算公式可知，（39+38+37）÷3÷0.1×稀释倍数=3.8×104，因此稀释倍数=100。
【点睛】
本题以筛选、分离聚乙烯降解菌为背景，考查了微生物实验中的无菌技术要求、接种方法和培养基的种类和功能等知识，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。
24．分解尿素的细菌广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的细菌 进行分离与计数，请回答下列问题：
（1）分解尿素的细菌含有的分解尿素的酶是_____________，为筛选出能分解尿素的细菌，配制 培养基时应以_____作为唯一氮源，这种允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基称为______培养基。
（2）本实验用来统计样品中活菌数目的接种微生物的方法是_________。此 种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目_________。这是因为_____________。 此外，分离纯化菌种常用的另外一种接种方法是_____________。
（3）该小组对分解尿素的细菌进行计数时，在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一 段时间，这样做的目的是______________。将 1 mL 样液稀释 104 倍，在 3 个 平板上分别涂布 0．1 mL 稀释液；经适当培养后，统计活菌数目，每隔一个“时间间隔”统计一 次菌落数目，最后选取_________作为结果。如果 3 个平板的菌落数分别为 48、52 和 53，据此可得出每毫升样液中活菌数为_____。
【答案】脲酶 尿素 选择 稀释涂布平板法 低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 平板划线法 检验平板灭菌是否彻底 菌落数目稳定时的记录 5.1×106个
【分析】
分解尿素的细菌的分离原理：在培养基中以尿素作为唯一的氮源，只有能分解尿素的微生物（能产生脲酶的微生物）才能利用其氮源，在其上生长。其他微生物不能分解尿素，不能利用氮源无法生长。由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，PH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，可在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，PH升高，指示剂变红。
【详解】
（1）分解尿素的微生物含有脲酶；培养基的成分一般包括水、无机盐、碳源、氮源，筛选出能分解尿素的细菌，在培养基中以尿素作为唯一的氮源，只有能分解尿素的微生物（能产生脲酶的微生物）才能利用其氮源，在其上生长，其他微生物不能分解尿素，不能利用氮源被抑制生长，这种培养基称为选择培养基。
（2）接种微生物的方法有两种：平板划线法和稀释涂布平板法。可以用来用来统计样品中活菌数目的是稀释涂布平板法，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（3）该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，用于检测培养基平板灭菌是否合格；每隔一个“时间间隔”统计一 次菌落数目，最后选菌落数目稳定时的记录作为结果，根据题干提供数据，可得出毎毫升样液中分解尿素的微生物活菌数=（48+52+53）÷3÷0.1×10000=5.1×106个。
【点睛】
本题考查了微生物的分离和培养的有关知识，要求考生掌握利用培养基对微生物进行选择的方法和原理，能结合所学的知识准确答题。
25．PCB是一种对人体有害的有机物，某科技小组欲从受PCB污染的土填中分离出能分解PCB的细菌，请回答问题：
（1）要从受PCB污染的土壤中分离出能分解PCB的细菌，应配制以PCB作为唯一的碳源的__________（选填“选择”或“鉴别”）培养基；配制培养基时用到的玻璃器皿常用_____________（填仪器名称）进行灭菌。
（2）分离前可通过选择培养以____________________________。
（3）用稀释涂布平板法统计PCB分解菌的浓度时，同时进行空白培养基的培养，这样做的目的是检测所用培养基____________________。若实验中发现空白培养基上生长有3个菌落，为准确测定样液中PCB分解菌的浓度，则需要_________________________。
（4）在纯化土境中的PCB分解菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是______________________________，怎样操作才可避免此种现象？_________________________。
【答案】选择 干热灭菌箱 增加PCB分解菌的浓度 灭菌是否彻底（或：是否被杂菌污染） 重新配制培养基进行实验 菌液浓度过高（或：菌液稀释倍数太小） 对菌液进行梯度稀释（或：加大菌液稀释倍数）
【分析】
自然界中目的菌株的筛选的依据是根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
【详解】
（1）分析题意可知，要从土壤中筛选出能分解PCB的细菌，应采用以PCB作为唯一的碳源的选择培养基；实验中的玻璃器皿一般采用干热灭菌法进行灭菌，使用的仪器是干热灭菌箱。
（2）分离前可通过选择培养增加土壤中PCB分解菌的浓度，目的是确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
（3）用稀释涂布平板法统计PCB分解菌的浓度时，为了检测所用培养基灭菌是否彻底，需要培养空白培养基作为对照。若实验中发现空白培养基上生长有3个菌落，说明培养基灭菌不彻底，为准确测定样液中PCB分解菌的浓度，则需要重新配制培养基进行实验。
（4）若PCB分解菌的菌落在培养基上连成一片，说明菌液浓度过高，稀释倍数太小，应该对菌液进行梯度稀释。
【点睛】
答题关键在于掌握微生物的分离与培养等有关知识，理解实验步骤及目的。
26．牛、羊等反刍动物具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解纤维素。科研人员按照如图所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基。
（注：①②③表示相应操作）
（1）从①开始分离筛选纤维素分解菌，甲培养基中除含有水、无机盐外还应有______、______成分，将瘤胃液先接种到培养基甲中进行培养，其目的是______。
（2）培养基乙与甲相比还需多添加的成分是______。在培养基表面均加入一层无菌的石蜡，其作用是______。
（3）刚果红是一种染料，可与纤维素等多糖形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。将刚果红加入培养基乙中，③应挑取______的菌落进行接种，多次筛选获得高效分解纤维素的菌株。
（4）随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵产生燃料酒精已取得很大成功，这对维护良好的生态环境有何积极作用？________________________
【答案】氮源 纤维素 筛选出纤维素分解菌并富集培养 琼脂 瘤胃中的厌氧微生物不能在有氧环境中生存、繁殖，用石蜡密封创设无氧环境 透明圈直径与菌落直径之比大 解决能源短缺问题、减少环境污染
【分析】
牛、羊等反刍动物具有特殊的瘤胃，在瘤胃中生活着多种厌氧微生物，其中许多微生物能分解纤维素。在筛选和分离降解纤维素的微生物时，确保能够分离得到目的微生物，一般先将样液进行选择培养，以增大样液中目的微生物的数量。然后用固体培养基培养，分离得到单个菌落。
刚果红是一种染色剂，可与纤维素等多糖形成红色复合物。如果培养基中唯一的碳源纤维素被降解了，那么菌落周边就会出现没有红色的透明圈。且透明圈越大，说明微生物降解纤维素的能力越强。
【详解】
（1）从①开始分离筛选纤维素分解菌，甲培养基为液体培养基，目的是增大样液中降解纤维素的微生物的数量，筛选出纤维素分解菌并富集培养，其营养成分中除含有水、无机盐外还应有纤维素唯一碳源、氮源。
（2）培养基乙为固体培养基，与甲相比还需多添加的成分是琼脂。在培养基表面均加入一层无菌的石蜡，其作用是隔绝空气，制造严格的无氧环境，因为瘤胃中的微生物为厌氧微生物。
（3）刚果红是一种染料，可与纤维素等多糖形成红色复合物，如果纤维素被分解了，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。透明圈越大代表降解能力越强，所以将刚果红加入培养基乙中，③应挑透明圈大的菌落进行接种，多次筛选获得高效分解纤维素的菌株。
（4）利用纤维废料发酵产生燃料酒精，对维护良好的生态环境有重要作用，例如减少环境污染，解决能源短缺的问题等。
【点睛】
本题考查筛选分离降解纤维素分解菌的实验。重点是理解使用液体培养基和固体培养基的目的。
27．纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，对于人类食物来源和能源开发有重要意义。请分析回答以下问题。
（1）地球上的纤维素40%-60%能被纤维素分解菌分解，原因是纤维素分解菌能产生纤维素酶，纤维素酶是一种复合酶，至少包含C1酶、Cx酶和_____酶。
（2）选择纤维素分解菌时，在以_____为唯一碳源的培养基中进行选择，在鉴别纤维素分解菌时，应该添加_____作指示剂，可以通过_____选出高效分解纤维素的菌株。
（3）在对纤维素分解菌计数时，通常选择菌落数为_____的平板计数，结果往往比实际值偏小，原因是_____。
（4）已知纤维素会被纤维素酶分解为葡萄糖，为检测纤维素酶的活性，可以用酶的反应速率来表示，即单位时间内_____。若要将这些酶固定，一般适合采用的方法有_____。
【答案】葡萄糖苷酶 纤维素 刚果红 透明圈大小（或填“菌落直径与透明圈直径之比”） 30-300 当两个或多个菌落连在一起，平板上观察到的只是单个菌落 葡萄糖的生产量或纤维素的减少量 物理吸附法和化学结合法
【分析】
纤维素的单体是葡萄糖，纤维素酶能够将纤维素水解为葡萄糖，纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶；纤维素分解菌可以用刚果红染液进行鉴别，能够产生透明圈的菌落就是纤维素分解菌。
【详解】
（1）纤维素酶是一种复合酶，至少包含C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。
（2）选择纤维素分解菌时，在以纤维素为唯一碳源的培养基中进行选择，在鉴别纤维素分解菌时，应该添加刚果红作指示剂，可以通过透明圈大小选出高效分解纤维素的菌株，菌落周围的降解圈最大，说明降解纤维素能力最强。
（3）在对纤维素分解菌计数时，通常选择菌落数为30-300的平板计数，由于当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，因此结果往往比实际值偏小。
（4）纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定，因此为检测纤维素酶的活性，可以用用单位时间内葡萄糖的生产量或纤维素的减少量来表示酶的反应速率。若要将这些酶固定，一般适合采用的方法有物理吸附法和化学结合法。
【点睛】
本题主要考查纤维素分解菌的相关知识，意在强化学生对纤维素分解菌的相关知识点的识记与理解。
28．利用农作物秸秆通过纤维素分解菌发酵来获取生产酒精的原料，是获取清洁再生能源的有效途径。研究者从牛的瘤胃中筛选出纤维素分解菌，其筛选过程如下图所示。刚果红能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。回答下列问题：
（1）从牛的瘤胃中筛选纤维素分解菌的原因是____________。
（2）培养基的配方中一般都含有____________，培养基通常采用____________灭菌。图中所示培养基是以____________为唯一碳源的培养基，这种培养基称为____________。Ⅰ号培养基中加入刚果红的目的是________________________________________________。
（3）Ⅰ号培养基中所采用的接种方法称作____________，操作中对接种工具的灭菌操作是____________。从Ⅰ号培养基中____________的菌落上挑取菌种通过连续划线的操作接种到Ⅱ号培养基，连续划线的目的是________________________________________________。
【答案】牛的瘤胃中含有较多的纤维素分解菌 水、无机盐、碳源、氮源 高压蒸汽（湿热） 纤维素 选择培养基 鉴别有纤维素分解菌存在 稀释涂布平板法 先浸在盛有酒精的烧杯里，再在酒精灯上灼烧 透明圈大的 将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面
【分析】
1、微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法:将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、培养基的种类
分类标准
培养基类型
配制特点
主要应用
物理性质
固体培养基
加入琼脂较多
菌种分离、鉴定、计数
半固体培养基
加入琼脂较少
菌种保存
液体培养基
不加入琼脂
工业生产，连续培养
化学组成
合成培养基
由已知成分配制而成，培养基成分明确
菌种分类、鉴定
天然培养基
由天然成分配制而成，培养基成分不明确
工业生产，降低成本
目的用途
鉴别培养基
添加某种指示剂或化学药剂
菌种的鉴别
选择培养基
添加(或缺少)某种化学成分
菌种的分离
【详解】
（1）从牛的瘤胃中筛选纤维素分解菌的原因是，牛以农作物的秸秆为食，它的瘤胃中含有较多的纤维素分解菌。（2）培养基的配方中一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等，同时还需要满足微生物生长对特殊营养物质、酸碱度以及氧气的要求。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的污染，培养基通常采用高压蒸汽（湿热）灭菌。实验的目的是筛选纤维素分解菌所以培养基是以纤维素为唯一碳源，这种培养基称为选择培养基。在以纤维素为唯一碳源的Ⅰ号培养基中加入刚果红，观察是否有透明圈的产生，可用来鉴定纤维素分解菌的有无。
（3）Ⅰ号培养基中所采用的接种方法称作稀释涂布平板法，在操作中对接种工具的灭菌操作是先浸在盛有酒精的烧杯里，再在酒精灯上灼烧；培养基中透明圈越大说明细菌分解纤维素的能力越强，所以从Ⅰ号培养基中的菌落上挑取透明圈大的菌种通过连续划线的操作接种到Ⅱ号培养基，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
【点睛】
本题着重考查了微生物的选择培养、培养基的成分和制备，常用接种方法和灭菌方法等有关知识，要求考生具有运用所学知识解决实际问题的能力。
29．联苯菊酯是农药中的重要成分，在土壤中难以降解。研究人员从农药废水中分离出联苯菊酯降解菌，并对培养液中的联苯菊酯降解菌进行计数。请回答下列问题：
（1）欲分离联苯菊酯降解菌应当以______作为唯一碳源。
（2）研究人员为了对联苯菊酯降解菌菌液中的目的菌数量进行计数，将菌液进行了梯度稀释，然后选择多个稀释倍数的菌液进行涂布，其目的是__________________。从稀释倍数为103的菌液中各取0.1mL涂布到三个平板，形成的菌落数分别为45、46和47个，则每毫升原菌液中降解菌的数量为______个。利用该方法统计的微生物的数量一般比实际数量偏______（填“大”“小”）。
（3）如图表示培养温度对联苯菊酯降解率的影响。降解菌降解联苯菊酯的最适温度是______，温度过高或过低都会导致降解率降低的原因是__________________。
【答案】联苯菊酯 获得菌落数在30~300之间适于计数的平板 4.6×105 小 30℃ 温度过低或过高都会影响降解酶的活性
【分析】
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
选择培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
【详解】
（1）分离联苯菊酯降解菌应当以联苯菊酯为唯一碳源。
（2）选择多个稀释倍数的菌液进行涂布，其目的是获得菌落数在30~300之间适于计数的平板，根据稀释涂布平板法的计算公式可以得出每毫升原菌液中降解菌的数量为（45+46+47）÷3÷0.1×103=4.6×105个，由于存在两个或者多个细菌形成一个菌落，所以测得数值一般偏小。
（3）从图中可以看出在30℃左右，联苯菊酯降解率最高，因此最适温度是30℃，温度过高或者过低都会影响降解酶的活性，从而导致降解率降低。
【点睛】
本题考查了微生物分离与纯化的有关知识，要求考生掌握选择培养的原理，根据题干信息确定该培养基的碳源，掌握稀释涂布平板法计数的方法和计算公式。
30．下表为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题：
KH2PO4
1．4g
Na2HPO4
2．1g
MgSO4·7H2O
0．2g
葡萄糖
10．0g
尿素
1．0g
琼脂
15．0g
用蒸馏水定容到1000mL
（1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_______。
（2）按物理性质划分该培养基属于_______培养基，理由是培养基中含有_____；该类培养基常用于微生物的_______等。
（3）由于_________________________________，所以该培养基只能用于能够合成______的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出_______的细菌。
（4）在微生物学中，将_______的培养基，称作选择培养基。
【答案】葡萄糖和尿素 固体 琼脂 纯化、分离、计数 培养基中只有尿素一种氮源 脲酶 分解尿素 允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类的微生物生长
【分析】
微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。一般固体培养基中会加入琼脂作为凝固剂。制备牛肉膏蛋白胨培养基的步骤为计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板。
【详解】
（1）在该培养基的配方中，葡萄糖为微生物的生长提供碳源，尿素提供氮源。
（2）培养基中含有琼脂凝固剂为固体培养基；固体培养基常用于菌种的纯化、分离、计数等。
（3）由于培养基中只有尿素一种氮源，所以该培养基只能用于能够合成脲酶的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出分解尿素的细菌。
（4）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基，称作选择培养基。
【点睛】
本题是基础考查题，考查了培养基的成分、各成分的作用、培养基的分类以及选择培养基的含义等知识，要求考生能够识记相关基础知识，能够结合所学知识准确答题。
31．下表为培养某种微生物的培养基配方，请回答有关问题：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
蒸馏水
1.4g
2.1g
0.2g
10.0g
1.0g
定容1000mL
（1）根据配方可知该培养基只允许分解_____的细菌生长，从功能上看，这种培养基被称作_____培养基。为防止杂菌污染，对培养基采用的灭菌方法是_____。
（2）若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，接种时应采用_____法。该方法接种培养后的菌落如下图，其中适合用于计数的平板是_____。
（3）某同学涂布平板时用0.lmL稀释液，稀释液的稀释倍数为105，平板中测得菌落数分别为17、156、179、451、175，则每1mL样品中的细菌数约是_____个。从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其作进一步的鉴定，可在上述培养基中加入_____。
【答案】尿素 选择 高压蒸汽灭菌 稀释涂布平板法 C 1.7×108 酚红指示剂
【分析】
1、选择培养基是在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。
2、稀释涂布平板法计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内．经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
【详解】
（1）该培养基以尿素为唯一氮源，只允许能产生脲酶分解尿素的细菌生长，故这种培养基称为选择培养基，该培养基会抑制其它种类微生物生长，其原因是该培养基以尿素为唯一的氮源，不能利用尿素的细菌不能在该培养基上生长。为防止杂菌污染，对该培养基采用高压蒸汽灭菌法。
（2）若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，接种时应采用稀释涂布平板法法。用稀释涂布平板法测定细菌数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的进行记数，因此图中C平板适合用于计数。
（3）某同学涂布平板时用0.1mL稀释液，稀释液的稀释倍数为105，一般选择30～300的培养基进行记数，则17和451应舍弃，156、179、175三平板中测得菌落数的平均值为170，则每1mL样品中的细菌数约=170÷0.1×105=1.7×108个，从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其作进一步的鉴定，可在上述培养基中加入酚红指示剂。
【点睛】
本题考查了微生物培养技术的相关知识，考生要明确选择培养基的选择作用，识记培养基为微生物提供的营养成分，识记常用的接种方法和具体操作过程，对于微生物培养技术的掌握及分解尿素的菌的分离和计数的掌握应用是解题的关键。
32．研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的细菌（目标菌），并对其进行研究。回答下列问题。
（1）微生物的生长需要营养物质，在实验室通常使用培养基培养微生物，培养基配制完成后需要立即进行灭菌，常用的灭菌方法为___________。
（2）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液进行系列梯度稀释，其原因是__________。
（3）倒平板时，等待平板冷却凝固后，需将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。这样放置的理由是____________________。
（4）从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落（如图所示）。如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，应该选择__________（填“A”“B”或“C”）菌落进一步纯化。说明选择的理由_____________________。
（5）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】高压蒸汽灭菌法 土壤菌数量较多，菌液浓度较大，如直接接种，菌落密集，在固体培养基表面无法形成单个菌落 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发 B 比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的分解能力强，淀粉酶活力高 灭菌
【分析】
实验室中微生物的筛选原理实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
【详解】
（1）对培养基常用的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。
（2）由于土壤菌数量较多，菌液浓度较大，如直接接种，菌落密集，在固体培养基表面无法形成单个菌落，故在筛选过程中，应将土壤样品稀释液进行系列梯度稀释。
（3）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，倒平板时，等待平板冷却凝固后，需将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，这样放置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。
（4）从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落。比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的分解能力强，淀粉酶活力高，图中B的分解圈最大，如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，故应该选择B菌落进一步纯化。
（5）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，以防止对环境造成污染。
【点睛】
本题考查分解纤维素的微生物分离的实验原理，要求考生识记相关知识，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。
33．鲜牛粪中的有些细菌能够降解污水中的氨，并准备从中筛选出除氨菌。回答下列有关问题：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
（1）先将10g新鲜的牛粪加入到某液体培养基中，振荡30min后恒温培养。该培养基中的NH4cl为唯一氮源，该培养基从功能上应属于________培养基。进行富集培养的目的是________________________。
（2）培养基在配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________，实验室中对培养基进行灭菌的方法是________________________。
（3）图中A和B的培养结果分别是通过________法进行接种得到的。用A接种方法培养了3个培养皿，菌落数分别为181个、179个、180个，则可以推测富集培养后的菌液中除氨菌的浓度为________个/ml，如果该方法测定的菌含量比实际值低，最可能的原因是________。
【答案】选择 增加除氨菌的数量 先调pH再灭菌 高压蒸汽灭菌 稀释涂布平板法，平板划线法 1．8×106 当两个或多个细胞聚集在一起就长出一个菌落
【分析】
1.富集培养可以使用液体培养基．选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
2.稀释涂布平板法计数：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
3.计算公式：每克样品中的菌株数=（c÷V）×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
【详解】
（1）富集培养主要增加微生物的数量，一般用液体培养基，故富集培养所用的培养基不需要加入琼脂，培养基中NH4Cl为唯一氮源。通过富集培养不仅可以增加除氨菌的数量，还可以对除氨菌进行初步筛选，因此该培养基为选择培养基。
（2）培养基在配制和灭菌时，应该先调节pH，而后再灭菌，这样可以避免调节pH过程中造成的杂菌污染，实验室中对培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
（3）根据菌落的分布状态可知，图中A和B对应的接种方法分别是稀释涂布平板法、平板划线法。图中经过三次稀释，故图中总的稀释倍数是103，若用A（稀释涂布平板法）对应的接种方法接种菌液到3个培养皿中，培养一段时间后，得到的菌落数分别为181、179、180个，则可以推测富集培养后的菌液中每毫升含除氨菌数为（181+179+180）÷3÷0.1×103=1.8×106个/ml。运用这种方法统计的结果往往比实际值低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
【点睛】
熟知微生物培养和分离以及计数方法是解答本题的关键，能正确分析图中的相关信息是解答本题的前提，本题重点考查学生利用所学的微生物知识解决生活问题的能力。
34．某种细茵能够产生一种脂肪酶，该酶可催化植物油与甲醇反应合成生物柴油。作为一种可再生清洁能源，生物柴油的使用可减少对化石燃料的消耗，对缓解温室效应具有重要的意义。回答下列问题：
（1）用于生产生物柴油的植物油不易挥发，不宜选用________（填“蒸馏法” 或“压榨法”或“萃取法”）从油料作物中提取。
（2）筛选产脂肪酶细菌时，配置的培养基应以______为唯一碳源， 从功能上看该培养基为_______________。 对细菌培养基进行灭菌，宜采用___________________法。为确定培养基灭菌是否彻底，需要设置对照组，将未经接种的灭菌培养基与接种后的培养基在相同且适宜的条件下培养一段时间，如果____________________则可说明所用培养基是无菌的。
（3）图示分离产脂肪酶细菌用的方法是__________，其中操作正确的是_____________________。
（4）从纯化培养得到的细菌中分离提取脂肪酶后，可与_________________混合，通过测定单位时间、单位体积中生物柴油的生成量，来确定该脂肪酶的活性。
【答案】蒸馏法 脂肪（或植物油） 选择培养基 高压蒸汽灭菌 未接种组不形成菌落 平板划线法 B 植物油与甲醇
【分析】
1、植物芳香油的提取方法：蒸馏法、压榨法和萃取等。
2、微生物常见的接种的方法（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；不能用于菌落计数。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落；可用于菌落计数。
【详解】
（1）根据题意，生产生物柴油的植物油不易挥发，所以不适合采用蒸馏法提取，应采用压榨法或萃取法从油料作物中提取。
（2）细菌的培养需要碳源、氮源、水和无机盐等物质，筛选产脂肪酶细菌时，配置的培养基应以为植物油唯一碳源，该培养基为选择培养基；对细菌培养基进行灭菌，因为培养基中含有水分，可利用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，为了确定培养基灭菌是否彻底，需要设置对照组，将未经接种的灭菌培养基与接种后的培养基在相同且适宜的条件下进行培养，若未接种组不形成菌落则灭菌彻底。
（3）图示分离产脂肪酶细菌用的接种方法是平板划线法，正确的划线分离操作应该多次划线，且从上一次划线的末端开始划线，因此B的划线分离操作最为合理，故选B。
（4）脂肪酶可催化植物油与甲醇反应合成生物柴油，从纯化培养得到的细菌中分离提取脂肪酶后，则可以将植物油和甲醇混合，通过测定单位时间、单位体积中生物柴油的生成量，来确定该脂肪酶的活性。
【点睛】
本题考查微生物的分离与培养和植物有效成分的提取，意在考查考生对基础知识的掌握和灵活运用基础知识的能力。
35．研究发现，土壤中某种微生物能降解石油。分离降解石油的菌株和探索其降解机制的实验过程如图所示。回答下列问题：
（1）微生物生长繁殖需要的营养物质除了水、无机盐外，还有______________，该实验所用的振荡培养的培养基只能以石油作为唯一碳源，其原因是______________________________________。
（2）振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高____________的利用率。
（3）若要测定培养液中活菌数量，应选择的接种方法是____________。利用该方法统计活菌数量的原理是________________________。
（4）为探究石油的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是________________________。该实验设计是否合理？为什么？___________________。
【答案】碳源、氮源 只有能利用石油的微生物能正常生长繁殖 溶解氧 营养物质 稀释涂布平板 当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌 目的菌株能分泌降解石油的蛋白质 不合理，缺少空白对照
【分析】
分析题图：图示是探索石油降解机制的实验过程，图甲中，首先用选择培养基从土壤中筛选菌种，再采用平板划线法分离出相应的菌种；图乙中：乙图用于测定石油降解率。
【详解】
（1）生物的各种培养基配方一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四类营养。选择培养基只允许特定种类的微生物生长，又要抑制或阻止其他种类微生物生长，因而要筛选能降解石油的微生物，应该用以石油为唯一碳源的培养基，在该培养基上只有能利用石油的微生物能正常生长繁殖。
（2）振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。
（3）接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可用于测定活菌数量，原理是当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（4）从图乙上清液中加入蛋白酶溶液可知是用于水解上清液中的某蛋白质的，由此可判定实验假设是目的菌株通过分泌某种蛋白质来降解石油。探究实验需要遵循对照原则和单一变量原则，该实验尚需设置不加入蛋白酶的对照组实（即缺少空白对照），否则没有说服力，因而不合理。
【点睛】
本题结合探究实验过程，考查微生物的培养和分离、探究实验等知识，要求考生识记培养基的成分、种类及作用；掌握分离微生物常用的两种方法及操作过程；掌握探究实验的原则，能结合图中信息知识答题。
36．生活污水和养殖废水直接影响人们的生活环境，为了解决传统污水处理存在的不足，科研人员利用小球藻进行了相关研究。
（1）从城市周边河流采集水样，进行富集培养。采用_____________法将其接种到不含碳源的平板上，筛选出小球藻单藻落，并进一步纯化得到X、Y、S、L和B五种藻株。
（2）研究人员对奶牛养殖废水沼液进行10倍和5倍稀释，以控制废水中污染物的浓度。将上述5种藻株扩大培养后，分别接种于不同稀释倍数的奶牛养殖废水沼液中，置于光照培养箱中培养，测定培养液中小球藻的数量，结果如下图。
①从培养液中随机取样加入到_____________上，然后在显微镜下观察、计数小球藻数量。在取样时为降低实验误差，正确的操作是______________。
②据实验结果推测藻株_____________可作为目标藻株，原因是_____________。
（3）进一步检测该目标藻株对稀释5倍奶牛养殖废水沼液中总氮、总磷和COD（有机物含量）的去除效果，结果如下表。
天数（d）
检测指标（mg·mL-1）
0
4
8
12
16
20
24
28
总氮
105
100
93
88
50
43
43
43
总磷
47
45
39
30
25
20
20
20
COD
520
520
500
420
420
300
270
270
①结果表明，该藻株在沼液中分别经历了适应期、正常生长期和生长停滞期，依据是_________________。目标藻株对沼液中______________的去除效果最好。
②解释实验中COD下降的原因__________________________。
（4）若要将该研究结果应用于养殖污水的处理，为提高处理效果，请提出一个需进一步研究的问题。______
【答案】稀释涂布平板法（或平板划线法） 血球计数板 充分摇匀后取样、多次取样计数 X X藻在10倍和5倍稀释的废水沼液中相对数量均最多，适应能力最强 总氮、总磷和COD的浓度在0~4d无显著变化，8~16d均明显下降，20~28d均在较低水平保持稳定 总氮、总磷 由于小球藻数量的增加，产生的大量氧气促进了分解者数量的增加，分解者利用分解有机物，使得COD下降 探究在处理污水时X藻和分解者的最佳配比；探究污水处理最好效果的X藻的投放量；探究环境条件对X藻处理污水效果的影响（合理即可得分）
【分析】
1微生物常用的接种方法是稀释涂布平板法或平板划线法，微生物的计数方法可以用稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
【详解】
（1）分离单个菌落的接种方法是稀释涂布平板法或平板划线法，所以采用稀释涂布平板法或平板划线法将富集培养的水样接种到不含碳源的平板上，筛选出小球藻单藻落，并进一步纯化得到X、Y、S、L和B五种藻株。
（2）①可用血细胞计数板对小球藻直接计数，即从培养液中随机取样加入到血球计数板上，然后在显微镜下观察、计数小球藻数量。在取样时为降低实验误差，正确的操作是需将培养液充分摇匀后取样，使小球藻分布均匀、多次取样计数。
②X藻在10倍和5倍稀释的废水沼液中相对数量均最多，适应能力最强，所以跟据该实验结果推测藻株X可作为目标藻株。
（3）①依据实验结果总氮、总磷和COD的浓度在0~4d无显著变化，8~16d均明显下降，20~28d均在较低水平保持稳定，结果表明，该藻株在沼液中分别经历了适应期、正常生长期和生长停滞期。根据题表信息可知，目标藻株对沼液中总氮、总磷的去除效果最好。
②解释实验中COD是有机物的量，下降的原因由于小球藻数量的增加，产生的大量氧气促进了分解者数量的增加，分解者利用分解有机物，使得COD下降。
（4）若要将该研究结果应用于养殖污水的处理，为提高处理效果，需进一步研究的问题是探究在处理污水时X藻和分解者的最佳配比；探究污水处理最好效果的X藻的投放量；探究环境条件对X藻处理污水效果的影响。
【点睛】
本题以生活污水和养殖废水为背景，主要考查微生物培养、计数的相关知识，要求考生能够从表格和图形中获取有效信息，综合分析解决实际问题。
37．土壤中含有大量的难溶性磷酸盐，为了从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为植物能吸收的可溶性磷的优良解磷菌株，以便将其添加到有机肥中，改善植物磷元素供应，科研人员进行如下实验：
实验原理：固体培养基中难溶性磷酸盐在微生物的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如图1），透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解磷的能力大小。
实验步骤：
步骤1 取某地区土样5 g制得土壤溶液后稀释，取稀释液1 mL接种到基础培养基A上，在适宜温度下培养72 h。
步骤2 在基础培养基A上用接种环挑取代表性菌落再次接种，培养3~4 d后观察菌落特征和透明圈的大小，初步筛选出三种优良解磷菌株（如表）。
菌株
透明圈直径（D）
菌落直径（d）
D/d
M-3-01
18．8
12．3
1．5
B3-5-6
20．7
8．0
2．6
T1-4-01
9．1
6．5
1．4
请据以上资料，回答下列问题：
（1）从物理形态上看，培养基A属于__________培养基，为了筛选出优良解磷菌株，培养基中加入的磷源是__________。
（2）步骤1中的接种方法是__________，应该在__________旁完成操作。根据表中的实验结果可以确定溶解磷能力最强的菌株是__________。
（3）为测定初步筛选的三种菌株实际溶解磷的能力，研究人员将它们接种到基础培养基B中，并在37℃、200 r·min-1摇床培养，定期取上清液，测定溶液中可溶性磷含量，得到如图2所示曲线，结果表明最优良的解磷菌株是__________。
（4）为进一步检测发酵过程中上述最优良菌的数量，实验者将1 mL该菌发酵液稀释1000倍后，分别取0．1 mL稀释菌液均匀涂布在5个平板上，经适当培养后，长出的菌落数分别为13、156、462、178和191，据此可得出每毫升发酵液中的活菌数为__________个。与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较__________。
【答案】固体 难溶性磷酸盐 稀释涂布平板法 酒精灯火焰 B3-5-6 M-3-01 1．75×106 少
【分析】
土壤是微生物的天然培养基。从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为植物能吸收的可溶性磷的优良解磷菌株必须使用以难溶性磷酸盐作为唯一磷源的选择培养基。表格中的透明圈越大，菌落直径越小，说明降解难溶性磷酸盐的能量越强。图1是表示固体培养基中难溶性磷酸盐在微生物的作用下溶解，在菌落周围形成透明圈，图2代表不同菌株实际溶解磷的能力，其中M-3-01菌株摇床培养后，溶液中可溶性磷含量最高，说明M-3-01实际溶解磷能力最强。
【详解】
（1）菌落在固体培养基上才能形成（培养过程中菌体不能运动），所以从物理形态上看，培养基A属于固体培养基。要筛选溶解难溶性磷能力强的菌株，必须以难溶性磷酸盐作为唯一磷源。
（2）步骤1的目的是从土壤微生物中筛选解磷微生物，由于土壤样液中微生物种类和数量多，需要稀释后再接种，故采用的是稀释涂布平板法进行接种，为了避免杂菌污染，应该在酒精灯火焰旁完成操作。根据实验原理中“透明圈直径与菌落直径比代表微生物溶解磷的能力大小”，结合表格数据可以确定解磷能力最强的菌株是B3-5-6，因为B3-5-6的D/d值最大。
（3）为测定初步筛选的三种菌株实际溶解磷的能力，研究人员对其进行摇床培养，根据根据实验曲线图，不难看出在一定时间区间里，M-3-01实际溶解磷能力最强。
（4）稀释涂布平板法计数，需要取菌落数在30-300之间的进行计数，故根据题意可知，每毫升发酵液中的活菌数为（156+178+191）/（3×0.1）×1000=1.75×106。与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较少，因为稀释涂布平板法在计算菌落时两个或多个细菌连接在一起，往往统计的是一个菌落。
【点睛】
本题结合实验表格结果考查了微生物培养和分离的有关知识，要求考生掌握微生物分离与纯化的方法，能够根据表格数据确定溶解磷能力最强的菌株，具备一定分析和计算的能力。
38．对某品牌的一次性口罩中的微生物进行检测，通过分析微生物的种类和数量来确定口罩的合格性。回答下列问题。
（1）准确称取10g（近似10mL）样品，剪碎后加入到90m无菌水中充分混匀，待样液自然沉降后取上清液进行菌落计数。计数前需先配置______培养基（按物理性质分类），使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌时，压力达到设定要求而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因待冷却后采用稀释涂布平板法分别接种0.1mL样液并放入恒温培养箱中培养，平板上长出的菌落数分别为37个、45个、19个、346个和44个，那么1g口罩样品中细菌数量为______个。根据《中华人民共和国医药行业标准》对一次性口罩的微生物指标要求细菌菌落总数≤100个/g，该研究小组检测的口罩______（填“符合”或“不符合”）标准。
（2）在微生物培养过程中配置的培养基除了提供水、碳源、氮源、无机盐等几种主要营养物质以外，培养基还需要满足微生物生长对pH、氧气以及______的要求。显微直接计数也是测定微生物数量的常用方法，该方法的主要缺点是______。为确定检测样液中大肠杆菌数目，需在培养基中加入用于______鉴别，统计培养基上深紫色菌落的数目。
（3）某些自养微生物能利用空气中的CO2作为碳源。生物兴趣小组从样品中分离出一种细菌X，请设计实验探究细菌X能否利用空气中的CO2作为碳源，写出实验思路并预期结果和结论。
实验思路：______。
预期结果和结论：______。
【答案】固体培养基 4200 不符合 特殊营养物质 不能区分死菌与活菌 伊红美蓝 将X细菌接种到无碳的培养基上，置于适宜的环境中培养一段时间后，观察有无菌落的形成 若有菌落形成，则X细菌能利用空气中的CO2作为碳源
【分析】
微生物常见的接种的方法：①平板划线法；②稀释涂布平板法。后者可用于微生物的计数，计数时，取菌落数在30～300的平板，计算平均菌落数。计算公式为：每克（ml）样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积，M代表稀释倍数。
【详解】
（1）按物理性质分类，培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基，该培养基属于固体培养基。据题干信息可知，符合计数要求的平板的菌落平均值=（37+45+44）÷3=42，故1g口罩样品中细菌数量=（C÷V）×M=（42÷0.1）×10=4200个。根据《中华人民共和国医药行业标准》对一次性口罩的微生物指标要求细菌菌落总数≤100个/g，该研究小组检测的口罩不符合标准。
（2）培养基的营养构成：①根据微生物生长繁殖的需要来确定；②主要营养物质有水、碳源、氮源、无机盐；③其他条件有pH、特殊营养物质以及氧气等。显微直接计数法是利用血细胞计数板，在显微镜下对微生物进行计数，该方法的缺点是不能区分死菌与活菌，使计数的结果偏大。不同微生物的菌落特征不同，大肠杆菌在加入伊红美蓝的固体培养基上，会形成黑色菌落，可用伊红美蓝培养基检测样液中大肠杆菌数目。
（3）要想证明该结论（X细菌能否利用空气中的CO2作为碳源），应将X细菌接种在无碳源的培养基进行培养，能利用空气中的CO2作为碳源的细菌就能在该培养基上形成菌落。
实验思路：将X细菌接种到无碳源的培养基上，置于适宜的环境中培养，一段时间后观察有无菌落的形成；预期结果：有大量菌落形成；结论：X细菌能够利用空气中的CO2作为碳源。
【点睛】
本题考查了微生物的分离和培养的有关知识，要求考生能够识记培养基的成分，掌握实验室常用的消毒和灭菌的方法；识记接种微生物常用的两种方法及计数微生物的方法，能结合所学的知识准确答题。
39．口臭是一种自口腔散发的令人不愉悦的气味，同时也是身体健康程度的重要表征。口臭的成因一般来自三方面：口腔卫生差，微生物利用食物残渣进行发酵；消化道菌群失调，尤其是胃部被幽门螺杆菌感染：机体代谢异常，特殊代谢废物经血液循环自肺部排出。幽门螺杆菌是栖息在胃黏膜的螺旋形的细菌（该菌对万古霉素、两性霉素B等抗生素不敏感，对青霉素高度敏感），感染后可引起胃炎、消化道溃疡等疾病。
（1）下列关于幽门螺杆菌的说法中，错误的是____。
A．具有核糖体，能独立合成蛋白质 B．幽门螺杆菌生命系统的边界是细胞壁
C．幽门螺杆菌以二分裂方式进行增殖 D．幽门螺杆菌可以在酸性条件下生存
（2）为研究培养幽门螺杆菌所需的气体条件，某研究小组利用半固体培养基（琼脂含量3．5g/L）对幽门螺杆菌进行培养。如图代表微生物可能出现的四种生长状态。
结果显示幽门螺杆菌的生长状态类似②号试管，则培养幽门螺杆菌的气体最适条件应为下列选项中的____。
A．纯氧 B．90%N、10%CO2 C．无菌空气 D．5%O2、85%N2、10%CO2
（3）为了从胃炎患者的胃黏膜提取稀释液中分离得到幽门螺杆菌，应将稀释液样品接种在以____为唯一氮源的____（填“固体”或“液体”）培养基上，以____（填方法）接种后置于培养箱中培养。若要鉴别是否是幽门螺杆菌，可向培养基中添加____指示剂，在培养过程中若出现红色环带的菌落，表明该菌落为幽门螺杆菌菌落。
（4）若要将得到的幽门螺杆菌进行扩大培养，可采用布氏肉汤基础培养液进行培养，培养液中需加入混合抗生素（包括万古霉素、两性霉素B等)，其目的是：________________。
（5）幽门螺杆菌能产生有较强活性的脲酶，该酶能催化热稳定性低的尿素分解为NH3，和CO2。体检时可通过14C尿素呼气试验来检测幽门螺杆菌感染情况。受试者口服14C标记的尿素胶囊后，定时收集受试者吹出的气体并测定其中是否含有14CO2以及量的多少，作为诊断指标。14C—尿素呼吸检测的原理是患者消化道细胞内____（填“有”或“无”）脲酶活性，若呼出的气体中含有14CO2，则为____的代谢产物。
【答案】B D 尿素 固体 稀释涂布平板法或平板划线法 酚红 抑制除幽门螺杆菌以外的其他杂菌的生长(抑制对万古霉素、两性毒素B敏感的微生物生长) 有 幽门螺杆菌
【分析】
微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）A、幽门螺杆菌是原核生物，具有核糖体，能独立合成蛋白质 ，A正确；
B、幽门螺杆菌生命系统的边界是细胞膜，B错误；
C、幽门螺杆菌是细菌，以二分裂方式进行增殖， C正确；
D、幽门螺杆菌可以生活在胃部强酸低氧的环境中，D正确。
故选B。
（2）由图可知，幽门螺杆菌在试管④中浓度最大，说明其繁殖需要较低的氧浓度，D正确。
故选D。
（3）由题意可知，幽门螺杆菌可以产生活性高的脲酶，利用尿素作为唯一氮源，因此利用以尿素作为唯一氮源的固体培养基可以进行有效筛选，同时酚红指示剂可以鉴别有无脲酶催化尿素分解。
（4）若要对幽门螺杆菌进行扩大化培养则要抑制其他杂菌生长，应使用万古毒素和两性毒素B。
（5）已知幽门螺杆菌能产生有较强活性的脲酶，该酶能催化热稳定性低的尿素分解为NH3和CO2，受试者口服14C标记的尿素胶囊后，患者消化道细胞内有脲酶活性，若呼出的气体中含有14CO2，则为幽门螺杆菌的代谢产物。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，要求考生识记培养基的种类及功能;识记接种微生物常用的两种方法，能结合所学的知识准确答题。
40．乳酸有L－乳酸、D－乳酸和DL－乳酸三类，人体只能代谢L－乳酸，而过多摄入D－乳酸会危害健康；传统酸菜发酵产物多为D－乳酸。为了从酸菜中筛选出高产L－乳酸的菌株，某科研小组进行如下实验。
实验材料和步骤：
①准备实验材料：酸菜汁、发酵培养基、MRS培养基（成分见下表，pH6.2~6.4）等。
有机物
牛肉膏10.0g
蛋白陈10.0g
酵母膏5.0g
葡萄糖20.0g
有机盐：乙酸钠2.0g、柠檬酸二铵2.0g
琼脂粉15.0g
无机物
K2HPO4 2.0g
MgSO4·7H2O 0.58g
MgSO4·4H20 0.25g
水1.0L
②筛选高产L－乳酸菌种：将酸菜汁稀释107倍，取0.1mL稀释液涂抹在MRS培养基中于32℃下培养2~4d获得单菌落，鉴定后将获得的L－乳酸菌种接种于MRS液体培养基中，在32℃下培养24h，检测L－乳酸的产量。
③发酵条件优化：分别探究发酵时间、温度等因素对发酵效果的影响。
实验结论：高产L－乳酸菌株的最佳发酵温度是2℃、发酵最佳时间是20h、发酵的初始pH是6.2。
请回答下列问题：
（1）在MRS培养基中添加葡萄糖的作用是________________，无机盐可能起到________ 的作用。MRS培养基常用________法灭菌，使用高压蒸汽灭菌锅时应注意________________。
（2）将用________稀释后的酸菜汁涂布在MRS培养基上，培养后可通过菌落的________________（答出两点）等特征将目的菌株鉴定出来；将获得的目的菌株接种于液体MRS培养基中可达到________的目的。
（3）如何确定发酵的最佳时间？__________。
【答案】为乳酸菌生长提供碳源和能源 调节细胞渗透压 高压蒸汽灭菌 要先向灭菌锅内倒入适量水，并加热煮沸，将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。 无菌水梯度 形状、大小、隆起程度和颜色 增加高产L－乳酸菌株数目 每隔相同时间，测定培养基中L－乳酸的含量，L－乳酸的含量最高的组对应的时间即为发酵的最佳时间
【分析】
（1）培养基的成分一般包括水、无机盐、碳源、氮源和生长因子；
（2）常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌和灼烧灭菌；
（3）接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法．接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体-菌落。
【详解】
（1）在MRS培养基中添加葡萄糖的作用是为乳酸菌生长提供碳源和能源。无机盐可能起到调节细胞渗透压的作用。MRS培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌，使用高压蒸汽灭菌锅时应注意要先向灭菌锅内倒入适量水，并加热煮沸，将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。
（2）将用无菌水梯度稀释菌液涂布在MRS培养基上，培养后可通过菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征将目的菌株鉴定出来；将高产L－乳酸菌株接种于液体MRS培养基中可达到增加高产L－乳酸菌株数目。
（3）通过每隔相同时间，测定培养基中L－乳酸的含量，L－乳酸的含量最高的组对应的时间即为发酵的最佳时间。
【点睛】
本题考查微生物的筛选相关知识，要求考生识记相关知识，意在考查考生的识记能力和从题干中获取有效信息的能力。
41．物质W是一种含氮有机物，会污染土壤，W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌），回答下列问题。
（1）若要从土壤中分离出目标菌，所用的培养基应为_____，使用前应用_____法进行严格灭菌；其中的氮源应该是_____。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择_____菌落进一步纯化，选择的依据是_____。
（3）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_____，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明_____；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_____。
【答案】选择培养基 高压蒸汽灭菌 W 乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W 缓冲液 缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
【分析】
选择培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或对某些化学、物理因素的抗性而设计的，能选择性地区分这种微生物的培养基。利用选择培养基，可使混合菌群中的目标菌种变成优势种群，从而提高该种微生物的筛选效率。
【详解】
（1）要从土壤中分离目标菌，需要在培养基中加入某种化学成分，使目标菌变成混合菌样中的优势菌，从而提高目标菌的筛选率，这样起到选择培养作用的培养基称为选择培养基。培养基使用前应用高压蒸汽灭菌进行严格灭菌，防止其他微生物污染。该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物，故可作筛选培养基中的氮源。
（2）研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙菌落的周围出现透明圈，说明乙菌落能够降解物质W ，故乙菌落为该小组的目标细菌，应该选择乙菌落进一步纯化。
（3）①C处作为空白对照，要排除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且保持滴加量相同。
②培养基中的透明圈表示物质W被降解的情况，若空白对照组C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降解物质W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即酶E与天然酶降解物质W的能力相近。
【点睛】
本题考查筛选培养基的配置和使用，针对不同要求的目标菌种，选择不同物质配制不同筛选作用的培养基。并且要求学生理解识别目标菌种筛选的现象，判断筛选结果。
42．研究人员为获得用于烟气脱硫的脱硫细菌，进行了如下操作。请回答：
（1）取样与筛选：在某热电厂烟囱周围区域采集土样，取样用的小铁铲和盛装土样的信封在使用前都需 要_____。为确保能够从土样中分离到目的菌，可以进行选择培养，目的是_____。
（2）驯化：将目的菌转移到含少量无菌水的锥形瓶中，边搅拌边持续通入 SO2 气体，驯化几分钟后接种到固 体培养基上，待长出菌落后再重复上述步骤，并逐步延长通 SO2 的时间，与此同时逐步降低培养基的 pH。由 此分化获得具有____________和_____________________能力的烟气脱硫细菌。
（3）培养与观察：培养一段时间后，当脱硫细菌_____稳定时，即可作为菌种用于继续研究与生产。
（4）培养大量的目的菌用于生产，研究人员需连续取样进行计数，计数方法一般有稀释涂布平板法和_____法。 当用前者进行计数时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的_____。统计平板上的 菌落数即可推测出样品中含有的活菌数目。通常情况下，用此计数方法统计的菌落数往往比活菌的实际数 目_____。原因是_____。
【答案】灭菌 增加（烟气）脱硫细菌的浓度 耐 （受）SO2 耐 酸 菌落特征 显微镜直接计数 一个活菌 少 两个或两个以上的细菌重叠在一起形成一个菌落
【分析】
根据实验目的可知，实验需要获得“烟气脱硫的脱硫细菌”，因此需要使用选择培养基将该菌筛选出，即题中的“驯化”；
菌落：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个单个菌落就是一个纯化的细菌菌落。
【详解】
（1）为了防止杂菌的污染，取样用的小铁铲和盛装土样的信封在使用前都需要灭菌；为确保能够从土样中分离到目的菌，增加脱硫细菌的浓度，可以进行选择培养.
（2）脱硫细菌能利用SO2，根据驯化过程可知，驯化过程中不断通入SO2，并且延长时间，与此同时逐步降低培养基的pH，因此分化获得具有耐受SO2和适应酸性环境能力的烟气脱硫细菌。
（3）一段时间后，将菌种转移到固体培养基上，当在培养基上观察到脱硫细菌的菌落特征稳定时，即可作为菌种用于继续研究与生产。
（4）培养大量的目的菌用于生产，计数方法一般有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法；稀释涂布平板法计数时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌；用稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于所产生的菌落可能是由两个或多个细胞形成的，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目偏低．
【点睛】
本题考查了微生物的分离与培养的有关知识，要求掌握微生物选择的方法，能够根据微生物的代谢特点确定培养基的成分以及理化性质，掌握微生物计数的一般方法，并比较两者各自的优缺点。
43．网络上有传言称“手机上的细菌比马桶多”。两个兴趣小组就此进行了相关实验，实验结果如下。请回答相关问题：
（1）该实验需制备__________（选填“固体”或“液体）培养基，培养基中一般含有______________________________________________等营养物质。
（2）据图，两兴趣小组均采用_________________法接种，接种前需要采用_________________法对培养基进行灭菌。
（3）通过观察菌落的_________________________________________（至少答出两点）等特征以初步盗定手机屏幕和马桶按钮上的生物类群。
（4）按图示操作取样面积，兴趣小组测定某手机屏幕的细菌数量，将10mL菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1L稀释倍数为100的样品液接种到三个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为99、101、100，则该手机屏幕的细菌数为________个/平方厘米。该实验是否需要设置对照实验？若需要，请简要写出对照实验的设计方案：若不需要，请说明理由。_______，___________________________________。
【答案】固体 碳源、氮源、水、无机盐（缺一不得分） 稀释涂布平板 高压蒸汽灭菌 形状、大小、隆起程度和颜色等（答出任意两点即可） 4×104 需要 取培养基涂布0.1mL无菌水进行培养
【分析】
1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物种和氧气的要求。
2、统计菌落数目的方法：（1）显微镜直接计数法：①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数；③缺点：不能区分死菌与活菌。（2）间接计数法（活菌计数法）： ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌．通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
【详解】
（1）该实验需分离纯化细菌，故需制备固体培养基，培养基一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等营养成分；
（2）两组均采用稀释涂布平板法接种，培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌；
（3）通过观察菌落的形态、大小、颜色、隆起程度等特征，可知手机屏幕和马桶按钮都存在多种微生物。两小组的实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同，可能是因为手机的取样和马桶的取样都不相同；
（4）按图操作取样面积，实验员测定某手机屏幕的细菌数量，将10mL菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1L稀释倍数为102的样品液接种到三个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为99、101、100，则该手机屏幕的细菌数=（99+101+100）÷3÷0.1÷（5×5）×102×10=4×104个/平方厘米。该实验对照组应取培养基涂布0.1mL无菌水放置于和实验组相同的条件下进行培养。
【点睛】
本题考查了微生物的分离与培养的有关知识，要求考生能够识记培养基的成分，掌握微生物分离和计数的方法，能够根据实验结果推测实验误差的原因等。
44．测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基（EMB培养基）上培养→统计菌落数目。如图甲为大肠杆菌含量检测操作简图，图乙为伊红美蓝培养基配方．回答下列相关问题：
（1）图甲中滤膜的孔径应______________（填“大于”或“小于”）大肠杆菌。
（2）配制图乙中的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入______________（一种营养成分），以及______________。待各成分都溶化后和分装前，要进行的是______________和灭菌。
（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在伊红美蓝培养基上，这属于微生物培养中的______________操作。伊红美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落呈现______________色，从功能上划分，该培养基属于______________培养基。
（4）对大肠杆菌杆菌进行培养时需要将平板倒置，其主要目的是______________。将接种后的培养基进行培养时，要将一个未接种的培养基也放入恒温箱中培养，目的是______________。
（5）某生物兴趣小组的某同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将10 mL待测水样加入到 90 mL 无菌水中，稀释后的菌液通过滤膜法测得伊红美蓝培养基上大肠杆菌菌落数平均为31，则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为______________个。
（6）该同学进一步思考，利用滤膜法也可用于测定待测水样中其他微生物的数目。他取了两份水样，一份待测水样来自变酸的果酒，从中检测到两种微生物，它们在结构上的主要区别是______________。另一份来自湖水，若要通过测量蓝藻的数目来研究水华，应更换上述过滤装置中的滤膜，为了减少细菌的干扰，应选择孔径______________ （填“更小”“不变”或“更大”）的滤膜，而培养基配方中则必须添加______________（从“水”“无机盐”“碳源”和“氮源”中选择）。
【答案】小于 氮源（或蛋白胨） 琼脂 调整pH 接种 黑色 鉴别 防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染 检验培养基是否灭菌合格 3100 酵母菌有（以核膜为界限的）细胞核，而醋酸菌没有 更大 水、无机盐、氮源
【分析】
滤膜法是检测水样中大肠细菌群的方法，将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠菌群菌落即可推测计算出水样中的大肠杆菌数；伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料，大肠杆菌在伊红美蓝培养基的菌落呈深紫色，并有金属光泽。
【详解】
（1）图甲中滤膜的孔径应小于大肠杆菌，才能将细菌截留在滤膜上。
（2）配制细菌的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入氮源（或蛋白胨），以及琼脂。待各成分都溶化后和分装前，要进行调整pH并灭菌。
（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在伊红美蓝培养基上，就是在培养基上接种过滤出来的大肠杆菌。伊红美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落呈现深紫色（黑色）带有金属光泽，从功能上划分，属于鉴别培养基。
（4）接种后的平板需倒置，以防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。将一个未接种的培养基也放入恒温箱中培养作为对照以检验培养基是否灭菌合格。
（5）根据题意，该100ml样本中有大操场杆菌31个，稀释倍数为10倍，31÷100×1000×10＝3100则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为3100个。
（6）变酸的果酒中可能有酵母菌和醋酸杆菌两种微生物，它们在结构上的主要区别是酵母菌有（以核膜为界限的）细胞核，而醋酸菌没有。蓝藻细胞较普通细菌为大，为了减少细菌的干扰，应选择孔径更大的滤膜，而作为自养型生物，可以不用在培养基中添加碳源，必须添加水、无机盐、氮源。
【点睛】
本题考查微生物的实验室培养，培养基配制等，是基础知识点的识记。
45．不同品牌的酸奶具有不同的口味。某研究小组利用含碳酸钙的固体培养基探究甲、乙两品牌酸奶中乳酸菌的类型是否相同(乳酸能够溶解碳酸钙，使培养基变得透明)。请回答下列问题：
（1）将甲、乙两品牌酸奶中的乳酸菌纯化，分别接种在含碳酸钙的固体培养基中培养，根据菌落周围透明圈的大小，可确定酸奶中乳酸菌的类型。不同乳酸菌菌落透明圈大小不同的原因是________________________________________________。
（2）家庭制作酸奶时，在纯牛奶中加入少量酸奶相当于微生物培养技术中_______的操作。纯牛奶变成酸奶，改变了口味但含有的能量减少，原因是 ____________。
（3）为长期保存纯化的优质乳酸菌，可将菌液与___________充分混匀，置于-20℃的冷冻箱中保存。
（4）该研究小组进一步探究甲品牌酸奶中乳酸菌数量，实验操作如下图。接种微生物的方法有很多，图中过程①②③所示的方法为______________，用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/ml)， 这里的n=______，用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个平板，目的是_______________。如果平板菌落数超过300，一般还需进一步__________。
【答案】（在相同时间内）不同类型的乳酸菌产生乳酸的量不同，不同量的乳酸能够溶解碳酸钙的量不同，形成的透明圈大小不同 接种 乳酸菌在发酵时使牛奶中的营养成分发生改变，乳酸菌细胞呼吸消耗部分有机物，从而使能量减少 灭菌的甘油 稀释涂布平板法 6 设置重复组，取平均值，使实验结果更加准确可靠 稀释
【分析】
本实验的原理是：由于乳酸菌分泌的乳酸能够溶解碳酸钙，使培养基变得透明，所以不同类型的乳酸菌分泌乳酸的量不同，分泌量多的产生的透明圈较大，而分泌量少的产生的透明圈则较小。因此可以根据菌落周围透明圈的大小，来探究甲，乙两品牌酸奶中乳酸菌的类型。
【详解】
（1）(在相同时间内)不同类型的乳酸菌产生乳酸的量不同，不同量的乳酸能够溶解碳酸钙量不同，所以不同乳酸菌菌落形成的透明圈大小不同。
（2）在纯牛奶中加入少量酸奶相当于微生物培养技术中的接种操作。纯牛奶变成酸奶，改变了口味但含有的能量减少，因为乳酸菌在发酵时使牛奶中的营养成分发生改变，乳酸菌细胞呼吸消耗部分有机物，从而使能量减少。
（3）为长期保存纯化的优质乳酸菌，可将菌液与灭菌的甘油充分混匀，置于-20℃的冷冻箱中保存。
（4）要对微生物计数可以采用活菌计数法或显微镜直接计数法，题目所给的图片信息是采用的活菌计数法，具体操作是通过稀释涂布平板法完成的。由①②的操作可知这时已对酸奶样品稀释了100倍， ②重复3次又稀释了1000倍，从中取出0.1ml样进行涂布，所用到的量是原来的10-6，因此这里的n=6，用稀释涂布平板法计数时，要至少涂布3个平板，目的是设置重复组，取平均值，使实验结果更加准确可靠。为了保证结果准确，一般选择菌落数中30～300的平板进行计数，如果平板菌落数超过300，说明稀释倍数不够，一般还需进一步稀释。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养相关知识，意在考查学生的识记能力和分析问题解决问题的能力。
46．绿水青山就是金山银山，污水治理是生态文明建设的一项重要任务，利用微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇（PVA）是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
成分
MgSO4
蛋白质
X物质
水
琼脂
用量
5g
10g
7g
1000 mL
20g
（1）表中是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，营养物质X最可能为__________。
（2）若图中污水取样是从聚乙烯醇（PVA）污染的水体中采集，通过图示过程分离出分解聚乙烯醇（PVA）的菌落，则进行过程1的作用是__________
（3）若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中有PVA分解菌__________个，该接种方法是__________方法，通过该方法测量的菌落数值与实际值相比一般会__________（填“偏大”“偏小”或“相等”）。
（4）要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入_______用于鉴别PVA分解菌。若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，请用简洁的语言写出设计思路：____________
【答案】聚乙烯醇（或PVA） 通过选择培养增加PVA分解菌的数量 1．6×109 稀释涂布平板法 偏小 碘 用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小（或直径）来确定不同菌株降解PVA能力的大小
【分析】
1、选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）表格是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，即该培养基属于选择培养基，该培养基的配制过程中应该以PVA为唯一碳源，因此表中X物质最可能为聚乙烯醇（PVA）。
（2）若图中污水取样是从聚乙烯醇（PVA）污染的水体中采集，通过图示过程分离出分解聚乙烯醇（PVA）的菌落，则进行的过程1为选择培养，其作用是通过增加PVA分解菌的数量。
（3）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用血细胞（血球）计数板直接计数。若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落（说明制备的平板合格，且实验操作可靠），则100mL原菌液中有PVA分解菌=160÷0.1×104×100=1.6×109个；这种接种方法为稀释涂布平板法，由于在涂布过程中会出现两个或多个细菌聚集在一起只能产生一个菌落的情况，则会导致该方法的测量值与实际值相比一般会偏小的情况。
（4）根据题意可知，“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”，因此要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中还需要加入碘与PVA作用形成蓝绿色复合物，若菌落周围出现白色透明斑，则该菌为PVA分解菌。若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，设计思路如下：用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小（或直径）来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
【点睛】
熟本题考查了微生物培养、分离和鉴别的原理和操作流程，考生能根据题目中的相关目的设计实验过程是解答本题的另一关键，能提取题干中的有用信息并能合理的利用是解答本题的必备能力，稀释涂布平板法的应用及其计数特点和相关的计算也是本题 的考查点。
47．尿素是一种重要的农业肥料，经微生物分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计实验并成功筛选到能高效分解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如下表所示。将表中物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL。实验过程如图所示，回答下列问题：
KH2PO4
1．4 g
Na2HPO4
2．1 g
MgSO4·7H2O
0．2 g
葡萄糖
10 g
尿素
1 g
琼脂
15 g
（1）该培养基能筛选出目的菌的原因是______________________。
（2）图中将细菌转到固体培养基上接种时，可采用的方法是_____________。初步筛选出来的 菌种还需要进一步的鉴定：在培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可说明该菌种能够分解尿素。
（3）在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是________，需要消毒的是________（填序号）。
①培养细菌的培养基与培养皿
②玻棒、试管、锥形瓶和吸管
③实验操作者的双手
（4）在进行分离分解尿素的细菌实验时，A同学从培养基上筛选出大约50个菌落，而其他同学只选择出大约20个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有________（填序号）。
①所取土样不同 ②培养基被污染
③接种操作错误 ④没有设置对照实验
【答案】尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长 平板划线法或稀释涂布平板法 酚红 红 ①和② ③ ①②③
【分析】
1、鉴别培养基依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计，在培养基中加入某种试剂或化学药品而制成。
2、灭菌分为灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，对接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等采用灭菌处理；消毒分为煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法，适用于操作空间、某些液体、双手等。
3、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）该培养基中不加其他氮素，只以尿素作为唯一氮源，在此培养基上只有能够产生脲酶将尿素分解的细菌（目的菌）才能获得氮源，而不能分解尿素的细菌将因缺少氮源无法生长繁殖，故能从众多微生物中筛选出能分解尿素的目的菌。
（2）题图中可采用稀释涂布平板法或平板划线法将细菌接种到固体培养基上，以便于获得单菌落继续培养。分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶能将尿素分解成NH3，NH3会使培养基的碱性增强，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
（3）微生物培养实验中，需要对培养细菌用的培养基与培养皿，玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管进行灭菌处理；对实验操作者的双手进行消毒。故需要灭菌的是①②，需要消毒的是③。
（4）该同学与其他同学获得的菌落数差异很大，可能的原因是采用的土样不同，培养基灭菌不彻底，培养基被污染；或者是实验过程中没有进行无菌操作，或者是接种操作错误。故选①②③。
【点睛】
对于微生物培养技术、选择培养基的选择作用、培养基为微生物提供的营养成分、植物组织培养的培养基的成分、常用的接种方法和具体操作过程的理解把握知识点间的内在联系是解题的关键。
48．氰化物是指含有CN基团的化合物，许多氰化物有剧毒，极少量就会使生物在短时间内中毒死亡。世界卫生组织《饮用水水质标准》规定，必须严格控制水中氰化物的含量，含有氰化物的废水要经过处理才能排放。采用生物法降解氰化物是减轻水中氰化物污染的有效途径之一。自然界中对氰化物有降解能力的微生物约有50种，它们能产生氰（腈）水合酶和氰（腈）水解酶等，最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3。
（1）欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物，首先应制备两种培养基，一种是牛肉膏蛋白胨培养基，另一种是以______作为唯一氮源的选择培养基。然后将两种培养基倒平板，设置如下表所示的对照组和实验组：
对照组
实验组
①______
②______
③已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板
④
对照组①、②分别为______。若对照组的平板上没有菌落生长，说明培养基在使用前未被杂菌污染；若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数，说明______。
（2）用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是______。计数时，同一个稀释浓度下应至少对______个平板进行重复计数。若某同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的菌液0.1mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原菌液中上述目的菌的数量约为______。经实验统计出的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是______。实验结束后，使用过的培养基应进行______处理才能倒掉，以防造成环境污染。
（3）脱除污水中氰化物的方法有多种，目前采用较多的是化学氧化法，但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。与化学氧化法相比，生物降解法具有更好的应用前景，原因是______。
【答案】氰化物 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板 选择培养基具有选择作用 平板上的一个菌落一般来源于稀释液中的一个活菌 3 1.6×109 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 灭菌 生物降解法能将氰化物彻底分解成CO2和NH3等产物，比化学方法更安全
【分析】
培养基的概念及营养构成
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
（2）营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求．例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。
【详解】
（1）欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物，首先应制备两种培养基，一种是牛肉膏蛋白胨培养基，另一种是以氰化物作为唯一氮源的选择培养基。然后将两种培养基倒平板，设置如下表所示的对照组和实验组，对照组的作用是为了说明培养基是否合格，因此，对照组①、②分别为 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板，若相同的时间内，对照组培养基上无菌落出现，则说明实验组的数据具有说服力，④的处理是接种 了等量菌种的选择培养基（以氰化物作为唯一氮源的选择培养基）；若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数，说明选择培养基具有选择作用。
（2）用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，因为当稀释倍数足够高时，就可以在平板上获得由一个活菌长成的菌落，因此，此时的菌落数可代表稀释液中的活菌数。计数时，同一个稀释浓度下应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值，这样可以减小实验误差。若某同学在4个平板培养基上分别接灭菌处理才能倒掉，这样可避免微生物对环境造成污染。
（3）脱除污水中氰化物的方法有多种，目前采用较多的是化学氧化法，但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。而对氰化物有降解能力的微生物能产生氰（腈）水合酶和氰（腈）水解酶等，在这些酶的催化下，最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3，CO2和NH3可被植物吸收利用，不会造成污染，因此，与化学氧化法相比，生物降解法具有更好的应用前景。
【点睛】
熟知微生物培养基的制备和培养基的种类是解答本题的关键，掌握两种接种方法是解答本题的前提，能根据实验目的设计相关的实验，并理解微生物在治理环境污染上的应用前景是解答本题的另一关键。
49．近年来，高氨氮废水的处理不当以及持续排放，导致了水体污染的日益严重。生物脱氮法相对于物化法来说，工艺简单、处理成本低、无二次污染，是较好的氨氮废水处理方法。某科研团队从湖底污泥中分离、筛选出能降解氨氮的菌株，并研究其降解氨氮的最适条件，包括培养温度、培养时间、起始的pH等，实验步骤如下。回答下列问题：
（1）步骤一：将1g水底污泥加入9 mL无菌水中制成悬液，接种至100mL液体培养基中，于30℃的温度条件下在摇床中培养7天。期间，每天向培养基中加入1mL浓度为5％的（NH4）2SO4溶液，这项操作的目的是______________________________。
（2）步骤二：将培养后的菌液用____________法涂布到分离培养基中，倒置于30℃的恒温培养箱中，培养至长出菌落。若平板中菌落过于密集，应进一步_______________________。反复分离纯化，至同一平板中只出现同种形态的菌落。
（3）步骤三：将筛选分离后的各菌株分别接种到氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）中，在30℃的温度条件下摇瓶培养24小时后，取培养液进行离心10分钟，取其上清液，_________________，从而计算出各个降解菌的氨氮降解率。
（4）步骤四：将筛选出的最优菌种于30℃的温度条件下在摇床中培养24小时。每隔2小时对培养基进行测定，研究降解氨氮的最佳培养时间。下图是某菌株的氨氮降解率曲线图，据图可以得到的结论有_______（写出两点）。
（5）步骤五：若要探究所分离纯化出的菌株对氨氮降解的最适培养温度，实验思路是：____________________________________________________________________________________________。
【答案】筛选出能降解并耐受高氨氮的菌株 稀释涂布平板法 稀释 测量上清液中氨氮的残余量 ①氨氮降解率达到一定值后则不再随培养时间的延长而增加，②培养4小时后，该菌株的氨氮降解率即可达到50%，培养14小时后，降解率可以达到90%。 设置一系列的温度梯度，其他条件相同且适宜，将分离纯化出的菌株和氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）分组编号，在各温度下分别保温，将相同温度条件下的菌株接种到培养基中，继续保温24小时，测定各组的降解菌的氨氮降解率。
【分析】
1、纯化微生物的方法：（1）通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
2、图是某菌株的氨氮降解率曲线图，据图可知，实验最初4小时，随着培养时间增加，氨氮降解率持续增加达到50%，在4~10小时，氨氮降解率略有增加几乎不变，10~14小时，氨氮降解率再次增加达到90%，14小时之后，氨氮降解率不再变化。
【详解】
（1）以（NH4）2SO4为唯一氮源的培养液属于选择培养基，只有能利用铵盐的微生物才能生存，且不断升高铵盐的浓度，故目的是筛选出能降解并耐受高氨氮的菌株。
（2）将培养后的菌液用稀释涂布平板法涂布到分离培养基中，倒置于30℃的恒温培养箱中，培养获得菌落。若平板中菌落过于密集，应进一步稀释，再涂布到分离培养基中，直到获得单菌落。
（3）将筛选分离后的各菌株分别接种到氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）中，在30℃的温度条件下摇瓶培养24小时后，取培养液进行离心10分钟，取其上清液，测量上清液中氨氮的残余量，进而计算出实验前后氨氮含量的减少量，从而计算出各个降解菌的氨氮降解率。
（4）图是某菌株的氨氮降解率曲线图，据图可知，实验最初4小时，随着培养时间增加，氨氮降解率持续增加达到50%，在4~10小时，氨氮降解率略有增加几乎不变，10~14小时，氨氮降解率再次增加达到90%，14小时之后，氨氮降解率不再变化，据此可知，①该菌降的氨氮降解率和培养时间并非线性关系，氨氮降解率达到一定值后则不再随培养时间的延长而增加，②培养4小时后，该菌株的氨氮降解率即可达到50%，培养14小时后，降解率可以达到90%。
（5）设置一系列的温度梯度，其他条件相同且适宜，将分离纯化出的菌株和氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）分组编号，在各温度下分别保温，将相同温度条件下的菌株接种到培养基中，继续保温24小时，测定各组的降解菌的氨氮降解率。
【点睛】
本题以筛选能降解氨氮的菌株为背景，考查微生物的培养、分离等相关知识，意在考查学生的实际应用能力和分析问题解决问题的能力。
50．营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。请回答下列问题：
（1）过程①的接种方法为___________。 从培养基成分分析，基本培养基与完全培养基存在差异的成分是_________________。
（2）进行②过程培养时，应先将丝绒布转印至基本培养基上，从____________培养基上获得相应的营养缺陷型菌株。
（3）统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致________，或培养时间太长导致_________________。
（4）为了进一步完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定，实验人员进行了如下操作：
①用接种针挑取__________（填“菌落A”或“菌落B”）接种于盛有完全培养液的离心管中，28 ℃振荡培养1~2天后，离心，取沉淀物用无菌水洗涤3次，并制成菌悬液。
②吸取1 mL菌悬液加入无菌培养皿中，倾注15 mL融化并冷却至50 ℃左右的基本培养基，待其冷凝后用记号笔在_______________（填“ 皿盖”或“皿底”）划分五个区域，标记A、B、C、D、E。
③在划分的五个区域上放入少量分组的氨基酸粉末（如下表所示） ，经培养后，观察生长圈出现的区域，从而确定属于何种氨基酸缺陷型。
组别
A
组氨酸
苏氨酸
谷氨酸
天冬氨酸
亮氨酸
B
精氨酸
苏氨酸
赖氨酸
甲硫氨酸
苯丙氨酸
C
酪氨酸
谷氨酸
赖氨酸
色氨酸
丙氨酸
D
甘氨酸
天冬氨酸
甲硫氨酸
色氨酸
丝氨酸
E
半胱氨酸
亮氨酸
苯丙氨酸
丙氨酸
丝氨酸
在上述鉴定实验中，发现在培养基A、D区域出现生长圈，说明该营养缺陷型菌株属于______。
【答案】稀释涂布平板法 氨基酸 完全 遗漏菌落的种类和数目 菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败菌落特征不易观察 菌落A 皿底 天冬氨酸缺陷型
【分析】
分析题图：图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用“影印法”将菌种接种到两种培养基中：基本培养基、完全培养基。在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长；而在完全培养基中能够生长，据此可以选择出氨基酸缺陷型菌株。
【详解】
（1）根据过程①所得培养基中菌落的分布结可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法，图示为利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程，据此可知，与基本培养基（只含碳源、无机盐、水）相比，完全培养基中的特有的成分为氨基酸。
（2）为了防止将特定营养成分带入培养基，进行②过程培养时，应先将丝绒布转印至基本培养基上。在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全养基中能够生长，因此从完全培养基上可获得相应的营养缺陷型菌株。
（3）统计菌落种类和数量时要每隔2h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止因为培养时间不足遗漏菌落的种类和数目，或培养时间太长导致菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败菌落特征不易观察。
（4）①在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，因此图中菌落A应该为氨基酸缺陷型菌祩，则用接种针挑取菌落A接种于盛有完全培养液的离心管中，28℃振荡培养1～2天后，离心，取沉淀物用无菌水洗涤3次，并制成菌悬液；
②吸取1mL菌悬液加入无菌培养皿中，倾注15mL融化并冷却至45～50℃的基本培养基，待其冷凝后用记号笔在皿底划分五个区城，标记A、B、C、D、E；
③根据表中信息显示：A、D区城含有、其他区域不含有的氨基酸是天冬氨酸，而实验结果只有A、D区城出现生长图，说明该营养缺陷型菌株属于天冬氨酸缺陷型。
【点睛】
本题以图文结合的形式综合考查学生对微生物的实验室培养、微生物的分离与计数等相关知识的识记和理解能力，解答本题需熟记并理解相应的基础知识并形成清晰的知识网络。
51．丙烯腈（结构式为）是一种重要的化工原料，会对环境造成较大污染。丙烯腈水解酶产生菌能将丙烯腈转化为丙烯酸，在工业生产和环境治理上具有重要的作用。下图为实验室中筛选丙烯腈水解酶产生菌的过程。
（1）②号试管中微生物的种类少于①号，原因是②号试管中的培养基以______为唯一氮源，对微生物具有______作用。
（2）Ⅱ号培养基采用的接种方法是_______________，进行该操作的目的是__________。
（3）溴甲酚紫乙醇溶液是一种酸碱指示剂，变色范围为pH5.2（黄色）~6.8（紫色），可用于丙烯腈水解酶产生菌菌落的筛选。在Ⅰ号培养基中加入溴甲酚紫乙醇溶液，培养一段时间后，应挑选黄色透明圈直径______（填“大”或“小”）的菌落继绫培养。在培养过程中会形成黄色透明圈的原因是____________________。
（4）将Ⅱ号培养基中挑出的菌落继续接种至液体培养基中进行扩大化培养，此过程中需要将培养装置置于摇床上培养，目的是____________________。
【答案】丙烯腈 选择（筛选） 平板划线法 在平板上得到由单个细胞形成的菌落 大 培养过程中丙烯腈水解酶产生菌产生的丙烯腈水解酶将丙烯腈分解为丙酸，使菌落周围的pH降低，使溴甲酚紫乙醇溶液变黄 增加培养液中氧气含量，有利于营养物质的充分利用
【分析】
分析图示可知，①②两个试管属于富集培养，I 号培养基为稀释涂布平板法接种，Ⅱ号培养基为平板划线法接种。
【详解】
（1）②号试管中微生物的种类少于①号，说明②号试管为选择培养基，丙烯腈水解酶产生菌能将丙烯腈转化为丙烯酸，所以②号试管中的培养基以丙烯腈为唯一氮源，不能以丙烯腈为氮源的微生物不能在此培养液中生长，故对微生物具有选择作用。
（2）据图可知，Ⅱ号培养基采用的接种方法是平板划线法，目的是在平板上得到由单个细胞形成的菌落。
（3）溴甲酚紫乙醇溶液是一种酸碱指示剂，变色范围为pH5.2（黄色）~6.8（紫色），可用于丙烯腈水解酶产生菌菌落的筛选。由于丙烯腈水解酶产生菌能将丙烯腈转化为丙烯酸，使菌落周围的pH降低，使溴甲酚紫乙醇溶液变黄，故在Ⅰ号培养基中加入溴甲酚紫乙醇溶液，培养一段时间后，应挑选黄色透明圈直径大的菌落继绫培养。
（4）将培养装置置于摇床上培养，目的是增加培养液中氧气含量，有利于营养物质的充分利用。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，意在考查考生对所学知识的应用能力。
52．PET全称为“聚对苯二甲酸乙二酯”，是以石油为原料制造的常见化工材料，广泛用于生产食品容器和电子产品，而PET塑料制品废弃后在自然界中极难降解，成为塑料“白色污染”的主要来源。为筛选出能高效分解PET塑料的微生物，某团队进行相关实验，回答下列问题：
（1）硏究人员在垃圾填埋场的PET塑料瓶残骸寻找目的菌株的原因是_____。
（2）在筛选所需微生物时，以PET颗粒和薄膜为唯一碳源的培养基进行培养，其中PET可以为微生物的生存提供_____和_____（从细胞呼吸意义的角度考虑）。对配制好的培养基用_____法进行灭菌，而对接种环用_____法灭菌。待长出菌落后，直接挑取菌落采用_____（接种方法）将菌落接种至PET颗粒（2g·L-1）无机盐固体培养基和无PET颗粒的无机盐培养基，最终筛选纯化得到能够对PET塑料具有降解作用的菌株。将菌落接种至无PET颗粒的无机盐培养基的目的是_____。
（3）已知含有PET颗粒的培养基具有不透明的特点，微生物将PET颗粒分解后，培养基呈现出透明圈。据图判断，应该选择_____（填“A”、“B”、“C”、“D”、“E”）为选择的菌种，判断的理由是_____。
【答案】该环境下淘汰了绝大多数微生物，而能高效分解PET塑料的细菌含量较高 生命活动所需的能量 合成其他有机物所需的原料 高压蒸汽 灼烧 平板划线法 作为（阴性）对照（，排除为自养型微生物） E 透明圈直径与菌落直径的比值与微生物对PEP的分解能力成正相关，而菌落E的两者比值最大
【分析】
１、微生物的接种方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线的操作是将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红，然后在在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞，将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液，将试管口通过火焰，塞上棉塞。
２、分析题意，PET为含碳有机物，可为微生物的生存提供碳源；PEP降解后形成的透明圈越大，说明被降解的越多，菌落面积的大小，说明微生物数目的多少。
【详解】
（1）在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，因此研究人员在垃圾填埋场的PET塑料瓶残骸寻找目的菌株的原因是该环境下淘汰了绝大多数微生物，而PET细菌含量较高。
（2）以PET颗粒和薄膜为唯一碳源的培养基进行培养，其中PET可以为微生物的生存提供生命活动提供能量和为其他有机物的合成提供原料。对培养基进行灭菌时，多采取高压蒸汽灭菌法，而对接种环用灼烧灭菌。待长出菌落后，采用平板划线法（该方法简单）将菌落接种至PET颗粒（2g·L-1）无机盐固体培养基和无PET颗粒的无机盐培养基，最终筛选纯化得到能够对PET塑料具有降解作用的菌株。将菌落接种至无PET颗粒的无机盐培养基的目的是作为阴性对照，排除为自养型微生物。
（3）透明圈是由于PEP降解后形成的，透明圈越大，说明被降解的越多，菌落面积的大小，说明微生物数目的多少，因此透明圈直径与菌落直径的比值与微生物对PEP的分解能力成正相关，应选择菌落E作为菌种。
【点睛】
本题以塑料分解菌的筛选为情境，考查的必备知识是微生物的培养、筛选；考查的关键能力是实验探究能力。
53．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：
（1）培养基中加入化合物A的目的是筛选________，这种培养基属于________培养基。
（2）转为固体培养基时，常采用________和稀释涂布平板法进行接种，在前一种方法接种过程中所用的接种工具是________，这种工具在操作时采用的灭菌方法是________。
（3）某同学计划统计污水池中目的菌的总数，他选用104、105、106稀释液进行涂布平板，每种稀释液都设置3个重复组，各吸取0．1 mL稀释液涂布平板，在适宜条件下培养一段时间后，对平板的菌落数进行统计，结果如下：
稀释度/倍
104
105
106
平板
1
2
3
1
2
3
1
2
3
平板菌落数/个
432
421
445
78
67
74
9
6
8
为了保证结果准确，应选择上述稀释________倍的平板菌落数作为统计结果，计算出每毫升样品中目的菌菌株数为______个。
（4）测定微生物的数量常采用_______法，其统计的数值往往比实际数目低，原因是_________________。
【答案】目的菌 选择 平板划线法 接种环 灼烧灭菌 105 7．3×107 稀释涂布平板 两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落
【分析】
1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。
2、微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）由题干信息可知，本实验的目的是筛选到能高效降解化合物A的细菌，故该培养基中加入化合物A的目的是为分解化合物A的微生物（目的菌）提供碳源和氮源，分离出能分解化合物A的微生物，不能分解化合物A的微生物不能在此培养基上生长，所以该培养基为选择培养基。
（2）转为固体培养基时，常采用平板划线法和稀释涂布平板法进行接种，平板划线法接种过程中所用的接种工具是接种环，接种环需要灼烧灭菌。
（3）菌体计数时需要选择菌落数在30～300之间的稀释倍数，根据表格数据可知，应选择上述稀释105倍的平板菌落数作为统计结果，每毫升样品中目的菌菌株数为（78+67+74）÷3÷0．1×105=7．3×107个。
（4）测定微生物的数量常采用稀释涂布平板法，由于平板上两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落，故用该方法统计的数值往往比实际数目低。
【点睛】
本题考查微生物的培养与计数的相关知识，意在考查考生微生物培养与选择的实验，包括理解实验目的、原理、方法和操作步骤，掌握相关的操作技能，并能将这些实验涉及的方法和技能进行综合运用的能力。
54．大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌，回答下列问题：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即_________。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以_________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于_________培养基。
（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是_________。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是_________。
（3）纤维素分解菌的筛选用的是_________染色法。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_________，理由是_________。
菌株
秸秆总重（g）
秸秆残重（g）
秸秆失重（%）
纤维素降解率（%）
A
2．00
1．51
24．50
16．14
B
2．00
1．53
23．50
14．92
C
2．00
1．42
29．00
23．32
【答案】C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 纤维素 选择 为杀死培养基中所有的微生物（杀死微生物、芽孢、孢子） 不接种培养（或空白培养） 刚果红 C 接种C菌株后，秸秆失重最大，纤维素的降解率也最大
【分析】
分解纤维素的微生物分离的实验原理：（1）土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖被微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。（2）在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
【详解】
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。
（2）配制的培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌，即将培养基置于压力100kPa、温度121℃条件下维持15～30分钟，目的是为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
（3）刚果红可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌，所以纤维素分解菌的筛选用的是刚果红染色法。
（4）测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
【点睛】
本题考查微生物的实验室培养，要求考生识记培养基的种类及功能；掌握纤维素分解分离和鉴别的原理，能结合所学的知识准确答题。
高考一轮生物复习策略
1、落实考点。
一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。
2、注重理论联系实际，高三生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。
不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。
3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。
这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。
4、学而不思则罔，思而不学则殆。
这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
专题54 微生物的筛选和计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。
①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300_的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数_。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度_。
特别提醒 用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
知识链接：用显微镜直接计数法计数：血细胞计数板法
①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有两个计数室，每个计数室上刻有9个大方格，其中只有中间的大方格为计数室，大方格的长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为0.1 mm3；大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格，即大方格是由400个小方格组成。
②操作：将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的菌液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，充满计数室。
③计数：在显微镜下计数4～5个中方格内的菌体数，求出每个小方格所含有的细菌的平均数，按照以下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每小格平均细菌数×400×104×原液被稀释倍数。
2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
②作用
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
解题技巧
两种微生物筛选方法的比较
项目
土壤中分解尿素的
细菌的分离
分解纤维素的
微生物的分离
方法
使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养
利用富含纤维素的选择培养基进行培养
原理
土壤中不能分解尿素的微生物因缺乏脲酶而不能正常生长，能够分解尿素的微生物能利用尿素为氮源正常生长，从而起到选择作用
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
特有
代表
过程
CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3
纤维素
纤维二糖葡萄糖
一、单选题
1．用106倍稀释液以稀释涂布平板法（涂布量为0.1ml）测定某土壤样品中的细菌数，作如下操作，正确的是（ ）
A．涂布1个平板，统计菌落数是230，计算出菌落总数为2.3×109个/ml
B．涂布2个平板，统计菌落数是303和287，计算出菌落总数为2.95×109个/ml
C．涂布3个平板，统计菌落数是21、212和256，计算出菌落总数为1.63×109个/ml
D．涂布3个平板，统计菌落数是210、240和250，计算出菌落总数为2.33×109个/ml
【答案】D
【分析】
稀释涂布平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
【详解】
在进行该实验时，一定要至少涂布3个平板，作为重复组，减少误差，且每个平板上菌落数量为30-300个才算有效，计算方法：每克样品中的菌落数=平板上菌落数的平均值÷体积×稀释倍数。
故选D。
2．测定土壤中细菌数量一般用104、105、106倍的稀释液进行培养，而测定真菌的数量一般用102、103、104倍稀释，其原因是（ ）
A．细菌在土壤中比真菌多
B．细菌易稀释、真菌不易稀释
C．细菌个体小、真菌个体大
D．真菌在土壤中比细菌多
【答案】A
【分析】
土壤中的微生物大多是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于平板计数。
【详解】
在稀释涂布平板法的实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于平板计数。土壤中的微生物中真菌的数量要比细菌少，所以测定的稀释倍数也小，A正确。
故选A。
3．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是（ ）
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1．7×1010个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
【答案】B
【分析】
从土壤中分离尿素分解菌的一般步骤是：土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。图中5支试管为梯度稀释，最后经稀释涂布平板法接种培养后进行计数。统计菌落数在30~300的平板，取其平均值，进行计数。计数公式为（C÷V）×M。（C为平均菌落数，V为涂布液体积，M为稀释倍数）
【详解】
A、据图可知，3号试管的稀释倍数为104倍，A错误；
B、4号试管中稀释液进行平板培养，由于4号稀释倍数比5号的低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍，B正确；
C、5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）÷3÷0.1×106=1.7×109个，C错误；
D、稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。
故选B。
4．限量补充培养法可用于营养缺陷型菌株的检出（如图）。将诱变后的菌株接种在基本培养基上，野生型菌株迅速形成较大菌落，营养缺陷型菌株生长缓慢，不出现菌落或形成微小菌落。基本培养基中补充精氨酸后，营养缺陷型菌株快速生长。下列叙述正确的是（ ）
A．用紫外线照射可诱导野生型菌株发生定向突变
B．精氨酸缺陷型菌株缺乏吸收利用精氨酸的能力
C．③步骤加入精氨酸后抑制了野生型菌株的生长
D．选择图乙中菌落B分离精氨酸营养缺陷型菌株
【答案】D
【分析】
结合题图分析，A表示野生型菌株形成的菌落，B表示营养缺陷型菌株形成的菌落。
【详解】
A、用紫外线照射诱导野生型菌株发生的变异是基因突变，是不定向的，A错误；
B、精氨酸缺陷型菌株缺乏将其他物质转化为精氨酸的能力，B错误；
C、图中A表示野生型菌株形成的菌落，将图乙与图甲对比可知，③步骤加入精氨酸后促进了野生型菌株的生长，C错误；
D、对比甲和乙可知，③步骤加入精氨酸后才出现的B是精氨酸营养缺陷型菌株，所以可以选择B分离获得精氨酸营养缺陷型菌株，D正确。
故选D。
5．油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到金龙鱼油产生的油烟污染的土壤中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如下图所示，下列叙述错误的是（ ）
A．图中①～③的过程为梯度稀释
B．在④中加入金龙鱼油，其作用是为微生物提供碳源和能源
C．要判断④是否起到选择作用，应设计牛肉膏蛋白胨培养基作对照
D．分离得到的降解菌可采用甘油管藏的方法长期保存
【答案】A
【分析】
1、培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、图中①②③不断经过选择培养，提高目的菌株的浓度。
【详解】
A、图中①～③的过程称为选择培养，A错误；
B、在④中的固体培养基加入金龙鱼油，其作用是为微生物提供碳源和能源，B正确；
C、若要判断④固体培养基是否起到了选择的作用，应设计一个牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）作对照，C正确；
D、长期保存菌种应该采用甘油管藏法，D正确。
故选A。
6．欲想探究1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，需要用科学的方法测定微生物数量。下列相关叙述正确的是（ ）
A．利用以尿素作为唯一氮源的培养基，可从土壤中分离出分解尿素的细菌
B．平板划线法能将单个微生物分散到培养基上，可用来测定样品中的活菌数
C．样品的稀释度直接影响平板上的菌落数目，因此稀释度越大越好
D．利用显微镜进行直接计数，可快速直观地测定样品中的活菌数
【答案】A
【分析】
选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。设计选择培养基时，主要考虑某些微生物的特殊营养需求或它们对某些化学物质具有的抗性。例如，教材中所述的以尿素为唯一氮源的选择培养基，能选择出可以合成脲酶、分解尿素的微生物。下表列出了几种选择培养基的设计。
显微镜直接计数法是利用显微镜、血细胞计数板等工具对纯培养悬浮液直接计数来检测样本中的细胞数目。该方法能直观、快速地检测出单细胞状态下的微生物或丝状微生物所产生的孢子的数目，但是不能区分死细胞和活细胞，不适合细胞密度低的样品。
释涂布平板法常常需要先将样品进行一系列的稀释，然后吸取适量稀释样品涂布在平板上，在稀释度适宜的情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的，从而通过统计平板上的菌落数来推算活菌数。该方法能灵敏地检测出样品中的活菌数，但实验过程手续繁、耗时长、影响因素较多。
显微镜直接计数法由于不能区分死菌和活菌，因此计数结果往往比实际活菌数偏高。为避免把死菌计数在内，可用台盼蓝染色: 被染成蓝色的为死菌，反之为活菌。稀释涂布平板法测定活菌数目的时候，由于相邻两个或多个细胞连在一起，可能形成一个菌落，因此测定值比实际值小。
【详解】
A、以尿素作为唯一氮源的培养基为选择培养基，可从土壤中分离出分解尿素的细菌，A正确；
B、平板划线法能将单个微生物分散到培养基上，但是不可以用来测定样品中的活菌数，稀释涂布平板法可以计数，B错误；
C、样品的稀释度太大，会导致微生物数量太少，一般要求稀释后平板上的菌落数在30 到300之间比较合适，C错误；
D、利用显微镜进行直接计数，可快速直观地测定样品中的活菌数和死菌数，D错误。
故选A。
7．研究者从热泉中筛选出耐高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。相关说法错误的是（ ）
A．①过程需要用无菌水对嗜热菌菌液进行稀释
B．②过程中用涂布器在选择培养基上连续划线
C．接种后的培养皿倒置放在恒温培养箱中培养
D．所获菌株还需要在高温下对酶活性进行测定
【答案】B
【分析】
1、据图分析：①过程是梯度稀释，②过程是稀释涂布平板法接种，目的是筛选单菌落。
2、采用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法；常用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌和干热灭菌。
【详解】
A、①过程是梯度稀释，为避免杂菌污染，该过程需要用无菌水对嗜热菌菌液进行稀释，A正确；
B、进行平板划线法操作时，需要用接种环进行划线；涂布器适用于稀释涂布平板法操作，B错误；
C、在培养时，需将接种后的培养皿倒置并放在恒温培养箱中，培养皿需用记号笔在皿底做好标记，C正确；
D、本操作目的是选出能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，故所获菌株还需要在高温下对酶活性进行测定，D正确。
故选B。
8．下列关于微生物培养和计数的叙述，不正确的是（ ）
A．接种操作中，充分稀释和连续划线的目的都是为了获得单菌落
B．一种培养基和培养条件不能符合全部微生物的生长需求
C．利用显微镜直接计数微生物前需要对菌液进行适当稀释
D．利用显微镜直接计数能逐一对细胞进行统计，比平板计数更精确
【答案】D
【分析】
培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
【详解】
A、接种操作中，充分稀释和连续划线的目的都是为了获得单菌落，A正确；
B、不同微生物的营养需求不一定相同，故一种培养基和培养条件不能符合全部微生物的生长需求，B正确；
C、利用显微镜直接计数微生物前需要对菌液进行适当稀释，便于计数单个微生物，C正确；
D、显微直接计数不能区分死菌和活菌，所以其精确度不会比平板计数法高，D错误。
故选D。
9．分离纤维素分解菌的实验操作有误的是（ ）
A．经选择培养后将样品即可涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少
C．可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶的产量
D．对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到完全培养基上
【答案】A
【分析】
分离分解纤维素的微生物的实验流程：土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
【详解】
A、经选择培养后，再经适度梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上，A错误；
B、选择培养即富集培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌可能会少，B正确；
C、纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定，C正确；
D、实验组和对照组遵循单一变量原则，对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到不含纤维素的培养基上，实验组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到纤维素为唯一碳源的培养基上，通过设置对照能证明经“浓缩”培养的确得到了欲分离的微生物，D正确。
故选A。
10．从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，正确的是（ ）
A．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→挑选菌落
B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落
C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落
D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落
【答案】B
【分析】
从土壤中分离纤维素分解菌的一般步骤是：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养和筛选菌株．筛选纤维素分解菌需要用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，纤维素分解菌可以用刚果红染液进行鉴别，在培养基中加入刚果红染液，在其菌落周围会出现透明圈。
【详解】
从从土壤中分离纤维素分解菌的一般步骤是：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养和筛选菌株。
故选B。
11．为纯化菌种，在鉴别培养基上接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，说明接种前菌液稀释度太低
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落分布不均，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】B
【分析】
分析平板结果可知，采用的接种方法为平板划线法，且划线顺序是Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区，可以看到Ⅲ区中出现了单菌落。
【详解】
A、图中采用的接种方法为平板划线法，在划线的开始，微生物连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后形成单菌落，Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，但不能说明接种前菌液稀释度太低，A错误；
B、Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；
C、培养基中已经出现单菌落，说明达到了菌种纯化的目的，C错误；
D、刚果红是一种染料，可以与纤维素形成红色复合物，纤维素被降解后，红色复合物无法形成，培养基上出现透明圈， D错误。
故选B。
12．纸片扩散法药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有不同种类抗生素的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，从而得岀受试菌株药物敏感性的结论。某次实验结果如下图，下列有关叙述正确的是（ ）
A．接种细菌时应选用稀释涂布平板法
B．未出现抑菌圈说明细菌在接触抗生素后发生了基因突变
C．抑菌圈越小，说明细菌对该种抗生素越敏感
D．不同抗生素在培养基中的扩散速率不影响实验结果
【答案】A
【分析】
由题图信息分析可知，不同的抑菌药物的抑菌圈直径不同，是因为受药物在琼脂中扩散速度的影响，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度。抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。透明圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系。
【详解】
A、图中需要比较不同种类抗生素的纸片周围的抑菌圈，则要求培养基的菌落分布比较均匀，故在图示培养基上的接种方法为稀释涂布平板法，A正确；
B、基因突变是在接触抗生素之前产生的，而不是细菌在接触抗生素后发生的，B错误；
C、抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，由此推测形成的抑菌圈越小，说明细菌对该种抗生素抗性越强，对抗生素越不敏感，C错误；
D、在平板上扩散速度慢的抗生素，形成的透明圈可能会比实际结果偏小，因此，不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响，D错误。
故选A。
13．下列关于刚果红染色法的说法中，正确的是（ ）
A．纤维素分解菌菌落周围出现刚果红
B．倒平板时就加入刚果红，可在培养皿中先加入CR溶液后再加入培养基
C．倒平板时就加入刚果红，长期培养有可能被其他微生物分解形成透明圈
D．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，不需用氯化钠溶液洗去浮色
【答案】C
【分析】
刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理：刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
【详解】
A、纤维素分解菌菌落周围出现透明圈，A错误；
B、倒平板时就加入刚果红，可在培养皿中先加入10mg/mLCR溶液，灭菌后按照每200mL培养基加入1ml的比例加入CR溶液，B错误；
C、倒平板时就加入刚果红，长期培养刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈，C正确；
D、先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，需用氯化钠溶液洗去浮色，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则不需要用氯化钠溶液洗去浮色，D错误。
故选C。
14．显微镜直接计数是测定微生物数量的常用方法之一，欲检测某培养液中纤维素分解菌的数量，某同学将其稀释100倍，在显微镜下进行计数，下图是计数某一小方格时的活菌分布情况。下列相关叙述错误的是（ ）
A．稀释培养液时，使用无菌水，可以避免杂菌的干扰
B．制作装片时，先将盖玻片放在计数室上，再用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让培养液自行渗入
C．为排除死菌的干扰，计数时最好用刚果红染色剂进行染色处理
D．若计数室容积为0.1mm3，则1mL培养液中纤维素分解菌为3.2×109个
【答案】C
【分析】
分析题图：计数时，应该将方格内的纤维素分解菌计数在内，对于边界线上的纤维素分解菌应该计数相邻两边及其夹角中的个体，则图中纤维素分解菌数量为8个。
【详解】
A、稀释培养液时，使用无菌水，可以避免杂菌的干扰，A正确；
B、制作装片时，先将盖玻片放在计数室上，再用吸管吸取稀释后的培养液滴于其边缘，让培养液自行渗入，多余培养液渗入（凹）槽内，B正确；
C、为排除死菌的干扰，可利用活细胞的细胞膜具有选择透过性的原理，计数时用台盼蓝染色法来区分死菌和活菌，C错误；
D、若计数室容积为0.1mm3，由以上分析可知，每个小方格平均有8个酵母菌，那1mL培养液中酵母细胞个数=平均每个小方格的酵母菌数×400×104×稀释倍数=8×400×104×100=3.2×109个，D正确。
故选C。
15．研究人员从土壤中筛选得到酵母菌纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素的条件进行了研究。据图分析正确的是（ ）
A．筛选该高产菌株需要在纤维素为唯一碳源的培养基中培养
B．探究最适温度时应尽可能将发酵液的pH控制在12左右
C．该酵母菌高产菌株产生纤维素酶的最适温度是35 ℃
D．利用该高产菌株降解纤维素时需严格保持厌氧环境
【答案】A
【分析】
分析图1：随着pH的升高，纤维素酶活性逐渐增高，pH=9为其最适pH，超过9，其活性下降；分析图2：随着温度的升高，纤维素酶活性逐渐增高，但图中不能看出其最适温度。
【详解】
A、要筛酵母菌纤维素酶高产菌株应在纤维素为唯一碳源的培养基培养，A正确；
B、探究该酶的最适温度时，pH为无关变量，应控制在最适pH，即将发酵液的pH控制在9左右，B错误；
C、由于图中随着温度的升高，纤维素酶活性逐渐增高，还没有到达顶点，故35℃不一定是其最适温度，C错误；
D、酵母菌属于兼性厌氧型生物，既能进行有氧呼吸，也能进行无氧呼吸，故利用该高产菌株降解纤维素时不需严格保持厌氧环境，D错误。
故选A。
16．幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请选择下列叙述错误的一项（ ）
A．在倒平板后和培养时，需将培养皿倒置
B．在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落变黑
C．临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的尿素分解为氨和14CO2
D．步骤X表示接种，在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液稀释的目的是为了获得单菌落
【答案】B
【分析】
幽门螺杆菌含有脲酶，能分解尿素为菌体提供氮源，因此在配制培养基时要加入尿素；加入酚红指示剂的目的是检验是否有Hp存在，若有Hp存在会分解尿素，培养基pH会升高，酚红指示剂将变红；用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，据此分析。
【详解】
A、在倒平板后，平板冷凝皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在培养时，也需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，将导致无法形成单菌落，A正确；
B、在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则会产生脲酶，将尿素分解为氨，pH升高，遇酚红指示剂变红色，B错误；
C、临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是幽门螺杆菌含有脲酶，能分解尿素为菌体提供氮源，故Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，C正确；
D、步骤X表示在培养基上接种Hp，在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上，菌液稀释的目的是为了获得单菌落，以便分离到单一菌种，D正确。
故选B。
17．某科研人员欲从被石油污染的土壤中分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株X，为消除石油污染提供微生物资源。下列叙述错误的是（ ）
A．若上图中A~C以“多环芳烃菲”为唯一碳源的选择培养基进行培养，可提高降解菌的浓度
B．本实验用到的固体培养基在接种前是不透明的，周围有透明圈的菌落即为目的菌落
C．在接种前，可将灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格
D．可用平板划线法或稀释涂布平板法对分离出的菌种进行纯化并计数
【答案】D
【分析】
分析题图：图示表示科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解多环芳烃菲菌株X的主要步骤。其中步骤A→B的培养过程中，培养液中加入多环芳烃菲作为唯一碳源，目的是筛选出菌株X；该过程还需将锥形瓶放在摇床上振荡，目的有两个，一方面使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；另一方面能增加培养液中的溶氧量。
【详解】
A、步骤A～C应为选择培养，分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株X，培养液中加入多环芳烃菲作为唯一碳源，，可提高降解菌的浓度，A正确；
B、固体培养基接种前是不透明的，原因是培养基中含“多环芳烃菲”，当“多环芳烃菲”被降解后，培养基会变透明，所以其中有透明圈菌落即为目的菌落，B正确；
C、在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格，若灭菌后的空白平板培养一段时间后没有菌落生长，说明培养基平板灭菌合格，C正确；
D、平板划线法不能对微生物计数，D错误。
故选D。
18．为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
C．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑选单菌落
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】C
【分析】
微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
A、倒平板时需左三圈，右三圈的轻轻晃动，以保证表面平整，A错误；
B、该实验的Ⅲ区已经出现由单个细菌繁殖而形成的菌落，因此已经达到菌种纯化的目的，B错误；
C、据图分析可知，图中Ⅰ、Ⅱ区的菌落连在一起，细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落，C正确；
D、刚果红可以与纤维素形成红色复合物，纤维素分解菌产生的纤维素酶可以水解纤维素而使菌落周围出现透明圈，D错误。
故选C。
19．下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关的叙述中不正确的是（ ）
A．实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B．图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释
C．统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D．在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型
【答案】B
【分析】
选择培养基可用于筛选具有特定代谢特点的微生物，从土壤中筛选出能降解对羟基苯甲酸的微生物，需要对羟基苯甲酸应为唯一碳源的选择培养基。根据所学知识，结合图示可知，该实验全过程包括筛选→扩大培养→纯化→鉴定。
【详解】
A、从混合物中分离某种微生物要用选择培养基，需要在培养基中加入特定的物质，如羟基苯甲酸，在该培养基中所需要的微生物能大量繁殖，实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基，目的是筛选能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物，A正确；
B、图中Ⅰ、Ⅱ过程的目的是增大降解对羟基苯甲酸的微生物的比例，B错误；
C、稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。由于当两个或多个菌体连在一起生长时，培养基上统计到的是一个菌落，所以统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数，C正确；
D、在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型，原因是微生物所利用的唯一碳源是对羟基苯甲酸是有机物，D正确。
故选B。
20．下列关于分解尿素的细菌的分离与计数、分解纤维素的微生物的分离的叙述，不正确的是（ ）
A．纤维素酶包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，均能催化纤维素分解成葡萄糖
B．分解尿素的细菌能合成脲酶将尿素分解为氨和CO2
C．尿素是一种重要的农业氮肥，农作物不能直接吸收利用
D．采用稀释涂布平板法进行活菌计数，其结果可能会偏小
【答案】A
【分析】
1.筛选目的微生物时应该使用只有目的微生物能够生存，而其他微生物不能生存的选择培养基。选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
2.纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。但刚果红可以与纤维素形成红色复合物，并不和水解后的产物发生这种反应。
【详解】
A、纤维素酶包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和CX酶能使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖，A错误；
B、分解尿素的细菌能合成脲酶，在脲酶的催化下将尿素分解为氨和CO2，被农作物利用，B正确；
C、尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用，C正确；
D、采用稀释涂布平板法进行活菌计数，有的菌落有可能是由多个细菌形成的，所以其结果可能会偏小，D正确。
故选A。
21．解磷菌是土壤中的一类功能微生物，包括细菌、真菌和放线菌。筛选出土壤中的高效解磷菌并制成生物菌剂，可以提高难溶性磷的利用率。下表为“分离出土壤中具有解磷功能的细菌实验”的培养基配方，下列说法正确的是（ ）
物质
葡萄糖
(NH4)2SO4
NaCl
KCl
CaCO3
磷酸三钙
琼脂
质量/g
10
0.5
3
0.3
5
20
15
A．培养基中的琼脂除凝固作用外还可作为解磷菌的碳源
B．该培养基是以磷酸三钙为唯一磷源的选择培养基
C．用平板划线法纯化解磷菌可以计数其活菌的数量
D．可根据培养基中透明圈的大小确定菌株的解磷能力
【答案】B
【分析】
微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
A、固体培养基中的琼脂的作用是凝固，一般不会被微生物所利用，A错误；
B、该培养基是以磷酸三钙为唯一磷源的选择培养基，B正确；
C、用稀释涂布平板法纯化解磷菌可以计数其活菌的数量，C错误；
D、可根据透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物解磷能力大小，D错误。
故选B。
二、多选题
22．科学家将营养缺陷型菌株A、B在缺乏A、B所需的某些特定营养物质的培养基上培养，结果如下图。下列叙述正确的是（ ）
A．各组实验所用的培养基均需灭菌处理
B．菌株A、B混合后能在上述培养基上生长
C．U型管实验证明菌株A、B释放的代谢产物形成了互补
D．推测菌株A、B通过接触发生了遗传物质重新组合
【答案】ABD
【分析】
菌株A、B单独培养都不能生长，用U型管也不能生长，说明菌株A、B释放的代谢产物没有形成互补；但混合培养长成了菌落，可能是菌株A、B通过接触发生了遗传物质重新组合。
【详解】
A、微生物培养需要给培养基灭菌，A正确；
B、如图可知菌株A、B混合后能在.上述培养基上长成菌落，B正确；
C、代谢产物可以通过滤板，但在U型管不能生长，说明菌株A、B释放的代谢产物没有形成互补，C错误；
D、混合培养长成了菌落，但在U型管不能生长，说明可能是菌株A、B通过接触发生了遗传物质重新组合，D正确。
故选ABD。
三、综合题
23．塑料袋造成的“白色污染”早已成为地球公害，塑料袋的自然分解需要20-1000年不等。2008年7月3日加拿大媒体报道：16岁的高中生丹尼尔-伯德从土壤中找到了一类假单胞杆菌，能将聚乙烯塑料的自然降解过程缩短至3个月，而且分解产物只有水和二氧化碳。伯德也因此被誉为“塑料袋的克星”。以下是伯德寻找到聚乙烯降解菌的大致过程。请回答：
（l）根据你的生活经验推测，伯德这项研究的“土壤样品”最可能取自于_____________。
（2）图中“…”表示对土壤悬浮液进行一系列的____________________，目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在Ⅰ号培养基表面形成单个_____________。
（3）Ⅰ号培养基属于______培养基，其作用是使目的菌能“脱颖而出”。如图采用的接种方法为____________。使用Ⅱ号培养基的目的是使目的菌数目增多，培养基中必须包含水、无机盐、___________等基本营养成分，从物理性质来看，Ⅱ号培养基中不能添加_______________。
（4）将1mL培养液稀释一定倍数，在3个平板上用涂布法分别接种0．1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，经计算得出1mL培养液的活菌数为3．8×104个，则稀释倍数为________。
【答案】垃圾场 梯度稀释 菌落 选择 稀释涂布平板法 碳源和氮源 凝固剂或琼脂 100
【分析】
微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）由题干信息分析可知，塑料袋造成的“白色污染”早已成为地球公害，根据生活经验推测，伯德这项研究的“土壤样品”最可能取自于垃圾场（含有大量的塑料）。
（2）图中“…”表示对土壤悬浮液进行一系列的梯度稀释，目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在Ⅰ号培养基表面形成单个菌落。
（3）本实验要筛选出聚乙烯降解菌，由图观察可知，Ⅰ号培养基是选择培养基，目的是筛选出目的菌株。图中采用的接种方法为稀释涂布平板法。使用Ⅱ号培养基的目的是使目的菌数目增多，培养基中必须包含水、无机盐、碳源、氮源等基本营养成分，从物理性质来看，Ⅱ号培养基属于液体培养基，其中不能添加凝固剂或琼脂。
（4）根据稀释涂布平板法的计算公式可知，（39+38+37）÷3÷0.1×稀释倍数=3.8×104，因此稀释倍数=100。
【点睛】
本题以筛选、分离聚乙烯降解菌为背景，考查了微生物实验中的无菌技术要求、接种方法和培养基的种类和功能等知识，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。
24．分解尿素的细菌广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的细菌 进行分离与计数，请回答下列问题：
（1）分解尿素的细菌含有的分解尿素的酶是_____________，为筛选出能分解尿素的细菌，配制 培养基时应以_____作为唯一氮源，这种允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基称为______培养基。
（2）本实验用来统计样品中活菌数目的接种微生物的方法是_________。此 种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目_________。这是因为_____________。 此外，分离纯化菌种常用的另外一种接种方法是_____________。
（3）该小组对分解尿素的细菌进行计数时，在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一 段时间，这样做的目的是______________。将 1 mL 样液稀释 104 倍，在 3 个 平板上分别涂布 0．1 mL 稀释液；经适当培养后，统计活菌数目，每隔一个“时间间隔”统计一 次菌落数目，最后选取_________作为结果。如果 3 个平板的菌落数分别为 48、52 和 53，据此可得出每毫升样液中活菌数为_____。
【答案】脲酶 尿素 选择 稀释涂布平板法 低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 平板划线法 检验平板灭菌是否彻底 菌落数目稳定时的记录 5.1×106个
【分析】
分解尿素的细菌的分离原理：在培养基中以尿素作为唯一的氮源，只有能分解尿素的微生物（能产生脲酶的微生物）才能利用其氮源，在其上生长。其他微生物不能分解尿素，不能利用氮源无法生长。由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，PH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，可在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后产生氨，PH升高，指示剂变红。
【详解】
（1）分解尿素的微生物含有脲酶；培养基的成分一般包括水、无机盐、碳源、氮源，筛选出能分解尿素的细菌，在培养基中以尿素作为唯一的氮源，只有能分解尿素的微生物（能产生脲酶的微生物）才能利用其氮源，在其上生长，其他微生物不能分解尿素，不能利用氮源被抑制生长，这种培养基称为选择培养基。
（2）接种微生物的方法有两种：平板划线法和稀释涂布平板法。可以用来用来统计样品中活菌数目的是稀释涂布平板法，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（3）该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，用于检测培养基平板灭菌是否合格；每隔一个“时间间隔”统计一 次菌落数目，最后选菌落数目稳定时的记录作为结果，根据题干提供数据，可得出毎毫升样液中分解尿素的微生物活菌数=（48+52+53）÷3÷0.1×10000=5.1×106个。
【点睛】
本题考查了微生物的分离和培养的有关知识，要求考生掌握利用培养基对微生物进行选择的方法和原理，能结合所学的知识准确答题。
25．PCB是一种对人体有害的有机物，某科技小组欲从受PCB污染的土填中分离出能分解PCB的细菌，请回答问题：
（1）要从受PCB污染的土壤中分离出能分解PCB的细菌，应配制以PCB作为唯一的碳源的__________（选填“选择”或“鉴别”）培养基；配制培养基时用到的玻璃器皿常用_____________（填仪器名称）进行灭菌。
（2）分离前可通过选择培养以____________________________。
（3）用稀释涂布平板法统计PCB分解菌的浓度时，同时进行空白培养基的培养，这样做的目的是检测所用培养基____________________。若实验中发现空白培养基上生长有3个菌落，为准确测定样液中PCB分解菌的浓度，则需要_________________________。
（4）在纯化土境中的PCB分解菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是______________________________，怎样操作才可避免此种现象？_________________________。
【答案】选择 干热灭菌箱 增加PCB分解菌的浓度 灭菌是否彻底（或：是否被杂菌污染） 重新配制培养基进行实验 菌液浓度过高（或：菌液稀释倍数太小） 对菌液进行梯度稀释（或：加大菌液稀释倍数）
【分析】
自然界中目的菌株的筛选的依据是根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
【详解】
（1）分析题意可知，要从土壤中筛选出能分解PCB的细菌，应采用以PCB作为唯一的碳源的选择培养基；实验中的玻璃器皿一般采用干热灭菌法进行灭菌，使用的仪器是干热灭菌箱。
（2）分离前可通过选择培养增加土壤中PCB分解菌的浓度，目的是确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
（3）用稀释涂布平板法统计PCB分解菌的浓度时，为了检测所用培养基灭菌是否彻底，需要培养空白培养基作为对照。若实验中发现空白培养基上生长有3个菌落，说明培养基灭菌不彻底，为准确测定样液中PCB分解菌的浓度，则需要重新配制培养基进行实验。
（4）若PCB分解菌的菌落在培养基上连成一片，说明菌液浓度过高，稀释倍数太小，应该对菌液进行梯度稀释。
【点睛】
答题关键在于掌握微生物的分离与培养等有关知识，理解实验步骤及目的。
26．牛、羊等反刍动物具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解纤维素。科研人员按照如图所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基。
（注：①②③表示相应操作）
（1）从①开始分离筛选纤维素分解菌，甲培养基中除含有水、无机盐外还应有______、______成分，将瘤胃液先接种到培养基甲中进行培养，其目的是______。
（2）培养基乙与甲相比还需多添加的成分是______。在培养基表面均加入一层无菌的石蜡，其作用是______。
（3）刚果红是一种染料，可与纤维素等多糖形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。将刚果红加入培养基乙中，③应挑取______的菌落进行接种，多次筛选获得高效分解纤维素的菌株。
（4）随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵产生燃料酒精已取得很大成功，这对维护良好的生态环境有何积极作用？________________________
【答案】氮源 纤维素 筛选出纤维素分解菌并富集培养 琼脂 瘤胃中的厌氧微生物不能在有氧环境中生存、繁殖，用石蜡密封创设无氧环境 透明圈直径与菌落直径之比大 解决能源短缺问题、减少环境污染
【分析】
牛、羊等反刍动物具有特殊的瘤胃，在瘤胃中生活着多种厌氧微生物，其中许多微生物能分解纤维素。在筛选和分离降解纤维素的微生物时，确保能够分离得到目的微生物，一般先将样液进行选择培养，以增大样液中目的微生物的数量。然后用固体培养基培养，分离得到单个菌落。
刚果红是一种染色剂，可与纤维素等多糖形成红色复合物。如果培养基中唯一的碳源纤维素被降解了，那么菌落周边就会出现没有红色的透明圈。且透明圈越大，说明微生物降解纤维素的能力越强。
【详解】
（1）从①开始分离筛选纤维素分解菌，甲培养基为液体培养基，目的是增大样液中降解纤维素的微生物的数量，筛选出纤维素分解菌并富集培养，其营养成分中除含有水、无机盐外还应有纤维素唯一碳源、氮源。
（2）培养基乙为固体培养基，与甲相比还需多添加的成分是琼脂。在培养基表面均加入一层无菌的石蜡，其作用是隔绝空气，制造严格的无氧环境，因为瘤胃中的微生物为厌氧微生物。
（3）刚果红是一种染料，可与纤维素等多糖形成红色复合物，如果纤维素被分解了，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。透明圈越大代表降解能力越强，所以将刚果红加入培养基乙中，③应挑透明圈大的菌落进行接种，多次筛选获得高效分解纤维素的菌株。
（4）利用纤维废料发酵产生燃料酒精，对维护良好的生态环境有重要作用，例如减少环境污染，解决能源短缺的问题等。
【点睛】
本题考查筛选分离降解纤维素分解菌的实验。重点是理解使用液体培养基和固体培养基的目的。
27．纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，对于人类食物来源和能源开发有重要意义。请分析回答以下问题。
（1）地球上的纤维素40%-60%能被纤维素分解菌分解，原因是纤维素分解菌能产生纤维素酶，纤维素酶是一种复合酶，至少包含C1酶、Cx酶和_____酶。
（2）选择纤维素分解菌时，在以_____为唯一碳源的培养基中进行选择，在鉴别纤维素分解菌时，应该添加_____作指示剂，可以通过_____选出高效分解纤维素的菌株。
（3）在对纤维素分解菌计数时，通常选择菌落数为_____的平板计数，结果往往比实际值偏小，原因是_____。
（4）已知纤维素会被纤维素酶分解为葡萄糖，为检测纤维素酶的活性，可以用酶的反应速率来表示，即单位时间内_____。若要将这些酶固定，一般适合采用的方法有_____。
【答案】葡萄糖苷酶 纤维素 刚果红 透明圈大小（或填“菌落直径与透明圈直径之比”） 30-300 当两个或多个菌落连在一起，平板上观察到的只是单个菌落 葡萄糖的生产量或纤维素的减少量 物理吸附法和化学结合法
【分析】
纤维素的单体是葡萄糖，纤维素酶能够将纤维素水解为葡萄糖，纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶；纤维素分解菌可以用刚果红染液进行鉴别，能够产生透明圈的菌落就是纤维素分解菌。
【详解】
（1）纤维素酶是一种复合酶，至少包含C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。
（2）选择纤维素分解菌时，在以纤维素为唯一碳源的培养基中进行选择，在鉴别纤维素分解菌时，应该添加刚果红作指示剂，可以通过透明圈大小选出高效分解纤维素的菌株，菌落周围的降解圈最大，说明降解纤维素能力最强。
（3）在对纤维素分解菌计数时，通常选择菌落数为30-300的平板计数，由于当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，因此结果往往比实际值偏小。
（4）纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定，因此为检测纤维素酶的活性，可以用用单位时间内葡萄糖的生产量或纤维素的减少量来表示酶的反应速率。若要将这些酶固定，一般适合采用的方法有物理吸附法和化学结合法。
【点睛】
本题主要考查纤维素分解菌的相关知识，意在强化学生对纤维素分解菌的相关知识点的识记与理解。
28．利用农作物秸秆通过纤维素分解菌发酵来获取生产酒精的原料，是获取清洁再生能源的有效途径。研究者从牛的瘤胃中筛选出纤维素分解菌，其筛选过程如下图所示。刚果红能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。回答下列问题：
（1）从牛的瘤胃中筛选纤维素分解菌的原因是____________。
（2）培养基的配方中一般都含有____________，培养基通常采用____________灭菌。图中所示培养基是以____________为唯一碳源的培养基，这种培养基称为____________。Ⅰ号培养基中加入刚果红的目的是________________________________________________。
（3）Ⅰ号培养基中所采用的接种方法称作____________，操作中对接种工具的灭菌操作是____________。从Ⅰ号培养基中____________的菌落上挑取菌种通过连续划线的操作接种到Ⅱ号培养基，连续划线的目的是________________________________________________。
【答案】牛的瘤胃中含有较多的纤维素分解菌 水、无机盐、碳源、氮源 高压蒸汽（湿热） 纤维素 选择培养基 鉴别有纤维素分解菌存在 稀释涂布平板法 先浸在盛有酒精的烧杯里，再在酒精灯上灼烧 透明圈大的 将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面
【分析】
1、微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法:将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、培养基的种类
分类标准
培养基类型
配制特点
主要应用
物理性质
固体培养基
加入琼脂较多
菌种分离、鉴定、计数
半固体培养基
加入琼脂较少
菌种保存
液体培养基
不加入琼脂
工业生产，连续培养
化学组成
合成培养基
由已知成分配制而成，培养基成分明确
菌种分类、鉴定
天然培养基
由天然成分配制而成，培养基成分不明确
工业生产，降低成本
目的用途
鉴别培养基
添加某种指示剂或化学药剂
菌种的鉴别
选择培养基
添加(或缺少)某种化学成分
菌种的分离
【详解】
（1）从牛的瘤胃中筛选纤维素分解菌的原因是，牛以农作物的秸秆为食，它的瘤胃中含有较多的纤维素分解菌。（2）培养基的配方中一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等，同时还需要满足微生物生长对特殊营养物质、酸碱度以及氧气的要求。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的污染，培养基通常采用高压蒸汽（湿热）灭菌。实验的目的是筛选纤维素分解菌所以培养基是以纤维素为唯一碳源，这种培养基称为选择培养基。在以纤维素为唯一碳源的Ⅰ号培养基中加入刚果红，观察是否有透明圈的产生，可用来鉴定纤维素分解菌的有无。
（3）Ⅰ号培养基中所采用的接种方法称作稀释涂布平板法，在操作中对接种工具的灭菌操作是先浸在盛有酒精的烧杯里，再在酒精灯上灼烧；培养基中透明圈越大说明细菌分解纤维素的能力越强，所以从Ⅰ号培养基中的菌落上挑取透明圈大的菌种通过连续划线的操作接种到Ⅱ号培养基，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
【点睛】
本题着重考查了微生物的选择培养、培养基的成分和制备，常用接种方法和灭菌方法等有关知识，要求考生具有运用所学知识解决实际问题的能力。
29．联苯菊酯是农药中的重要成分，在土壤中难以降解。研究人员从农药废水中分离出联苯菊酯降解菌，并对培养液中的联苯菊酯降解菌进行计数。请回答下列问题：
（1）欲分离联苯菊酯降解菌应当以______作为唯一碳源。
（2）研究人员为了对联苯菊酯降解菌菌液中的目的菌数量进行计数，将菌液进行了梯度稀释，然后选择多个稀释倍数的菌液进行涂布，其目的是__________________。从稀释倍数为103的菌液中各取0.1mL涂布到三个平板，形成的菌落数分别为45、46和47个，则每毫升原菌液中降解菌的数量为______个。利用该方法统计的微生物的数量一般比实际数量偏______（填“大”“小”）。
（3）如图表示培养温度对联苯菊酯降解率的影响。降解菌降解联苯菊酯的最适温度是______，温度过高或过低都会导致降解率降低的原因是__________________。
【答案】联苯菊酯 获得菌落数在30~300之间适于计数的平板 4.6×105 小 30℃ 温度过低或过高都会影响降解酶的活性
【分析】
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
选择培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
【详解】
（1）分离联苯菊酯降解菌应当以联苯菊酯为唯一碳源。
（2）选择多个稀释倍数的菌液进行涂布，其目的是获得菌落数在30~300之间适于计数的平板，根据稀释涂布平板法的计算公式可以得出每毫升原菌液中降解菌的数量为（45+46+47）÷3÷0.1×103=4.6×105个，由于存在两个或者多个细菌形成一个菌落，所以测得数值一般偏小。
（3）从图中可以看出在30℃左右，联苯菊酯降解率最高，因此最适温度是30℃，温度过高或者过低都会影响降解酶的活性，从而导致降解率降低。
【点睛】
本题考查了微生物分离与纯化的有关知识，要求考生掌握选择培养的原理，根据题干信息确定该培养基的碳源，掌握稀释涂布平板法计数的方法和计算公式。
30．下表为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题：
KH2PO4
1．4g
Na2HPO4
2．1g
MgSO4·7H2O
0．2g
葡萄糖
10．0g
尿素
1．0g
琼脂
15．0g
用蒸馏水定容到1000mL
（1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_______。
（2）按物理性质划分该培养基属于_______培养基，理由是培养基中含有_____；该类培养基常用于微生物的_______等。
（3）由于_________________________________，所以该培养基只能用于能够合成______的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出_______的细菌。
（4）在微生物学中，将_______的培养基，称作选择培养基。
【答案】葡萄糖和尿素 固体 琼脂 纯化、分离、计数 培养基中只有尿素一种氮源 脲酶 分解尿素 允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类的微生物生长
【分析】
微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。一般固体培养基中会加入琼脂作为凝固剂。制备牛肉膏蛋白胨培养基的步骤为计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板。
【详解】
（1）在该培养基的配方中，葡萄糖为微生物的生长提供碳源，尿素提供氮源。
（2）培养基中含有琼脂凝固剂为固体培养基；固体培养基常用于菌种的纯化、分离、计数等。
（3）由于培养基中只有尿素一种氮源，所以该培养基只能用于能够合成脲酶的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出分解尿素的细菌。
（4）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基，称作选择培养基。
【点睛】
本题是基础考查题，考查了培养基的成分、各成分的作用、培养基的分类以及选择培养基的含义等知识，要求考生能够识记相关基础知识，能够结合所学知识准确答题。
31．下表为培养某种微生物的培养基配方，请回答有关问题：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
蒸馏水
1.4g
2.1g
0.2g
10.0g
1.0g
定容1000mL
（1）根据配方可知该培养基只允许分解_____的细菌生长，从功能上看，这种培养基被称作_____培养基。为防止杂菌污染，对培养基采用的灭菌方法是_____。
（2）若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，接种时应采用_____法。该方法接种培养后的菌落如下图，其中适合用于计数的平板是_____。
（3）某同学涂布平板时用0.lmL稀释液，稀释液的稀释倍数为105，平板中测得菌落数分别为17、156、179、451、175，则每1mL样品中的细菌数约是_____个。从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其作进一步的鉴定，可在上述培养基中加入_____。
【答案】尿素 选择 高压蒸汽灭菌 稀释涂布平板法 C 1.7×108 酚红指示剂
【分析】
1、选择培养基是在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。
2、稀释涂布平板法计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内．经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
【详解】
（1）该培养基以尿素为唯一氮源，只允许能产生脲酶分解尿素的细菌生长，故这种培养基称为选择培养基，该培养基会抑制其它种类微生物生长，其原因是该培养基以尿素为唯一的氮源，不能利用尿素的细菌不能在该培养基上生长。为防止杂菌污染，对该培养基采用高压蒸汽灭菌法。
（2）若要通过统计培养基中菌落数来估计样品中的细菌数，接种时应采用稀释涂布平板法法。用稀释涂布平板法测定细菌数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的进行记数，因此图中C平板适合用于计数。
（3）某同学涂布平板时用0.1mL稀释液，稀释液的稀释倍数为105，一般选择30～300的培养基进行记数，则17和451应舍弃，156、179、175三平板中测得菌落数的平均值为170，则每1mL样品中的细菌数约=170÷0.1×105=1.7×108个，从土壤中分离出分解尿素的细菌后，要对其作进一步的鉴定，可在上述培养基中加入酚红指示剂。
【点睛】
本题考查了微生物培养技术的相关知识，考生要明确选择培养基的选择作用，识记培养基为微生物提供的营养成分，识记常用的接种方法和具体操作过程，对于微生物培养技术的掌握及分解尿素的菌的分离和计数的掌握应用是解题的关键。
32．研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的细菌（目标菌），并对其进行研究。回答下列问题。
（1）微生物的生长需要营养物质，在实验室通常使用培养基培养微生物，培养基配制完成后需要立即进行灭菌，常用的灭菌方法为___________。
（2）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液进行系列梯度稀释，其原因是__________。
（3）倒平板时，等待平板冷却凝固后，需将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。这样放置的理由是____________________。
（4）从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落（如图所示）。如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，应该选择__________（填“A”“B”或“C”）菌落进一步纯化。说明选择的理由_____________________。
（5）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】高压蒸汽灭菌法 土壤菌数量较多，菌液浓度较大，如直接接种，菌落密集，在固体培养基表面无法形成单个菌落 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发 B 比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的分解能力强，淀粉酶活力高 灭菌
【分析】
实验室中微生物的筛选原理实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
【详解】
（1）对培养基常用的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。
（2）由于土壤菌数量较多，菌液浓度较大，如直接接种，菌落密集，在固体培养基表面无法形成单个菌落，故在筛选过程中，应将土壤样品稀释液进行系列梯度稀释。
（3）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，倒平板时，等待平板冷却凝固后，需将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上，这样放置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。
（4）从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落。比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的分解能力强，淀粉酶活力高，图中B的分解圈最大，如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，故应该选择B菌落进一步纯化。
（5）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，以防止对环境造成污染。
【点睛】
本题考查分解纤维素的微生物分离的实验原理，要求考生识记相关知识，意在考查学生识记所学知识要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络的能力，同时获取题干信息准确答题。
33．鲜牛粪中的有些细菌能够降解污水中的氨，并准备从中筛选出除氨菌。回答下列有关问题：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
（1）先将10g新鲜的牛粪加入到某液体培养基中，振荡30min后恒温培养。该培养基中的NH4cl为唯一氮源，该培养基从功能上应属于________培养基。进行富集培养的目的是________________________。
（2）培养基在配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________，实验室中对培养基进行灭菌的方法是________________________。
（3）图中A和B的培养结果分别是通过________法进行接种得到的。用A接种方法培养了3个培养皿，菌落数分别为181个、179个、180个，则可以推测富集培养后的菌液中除氨菌的浓度为________个/ml，如果该方法测定的菌含量比实际值低，最可能的原因是________。
【答案】选择 增加除氨菌的数量 先调pH再灭菌 高压蒸汽灭菌 稀释涂布平板法，平板划线法 1．8×106 当两个或多个细胞聚集在一起就长出一个菌落
【分析】
1.富集培养可以使用液体培养基．选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
2.稀释涂布平板法计数：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
3.计算公式：每克样品中的菌株数=（c÷V）×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
【详解】
（1）富集培养主要增加微生物的数量，一般用液体培养基，故富集培养所用的培养基不需要加入琼脂，培养基中NH4Cl为唯一氮源。通过富集培养不仅可以增加除氨菌的数量，还可以对除氨菌进行初步筛选，因此该培养基为选择培养基。
（2）培养基在配制和灭菌时，应该先调节pH，而后再灭菌，这样可以避免调节pH过程中造成的杂菌污染，实验室中对培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
（3）根据菌落的分布状态可知，图中A和B对应的接种方法分别是稀释涂布平板法、平板划线法。图中经过三次稀释，故图中总的稀释倍数是103，若用A（稀释涂布平板法）对应的接种方法接种菌液到3个培养皿中，培养一段时间后，得到的菌落数分别为181、179、180个，则可以推测富集培养后的菌液中每毫升含除氨菌数为（181+179+180）÷3÷0.1×103=1.8×106个/ml。运用这种方法统计的结果往往比实际值低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
【点睛】
熟知微生物培养和分离以及计数方法是解答本题的关键，能正确分析图中的相关信息是解答本题的前提，本题重点考查学生利用所学的微生物知识解决生活问题的能力。
34．某种细茵能够产生一种脂肪酶，该酶可催化植物油与甲醇反应合成生物柴油。作为一种可再生清洁能源，生物柴油的使用可减少对化石燃料的消耗，对缓解温室效应具有重要的意义。回答下列问题：
（1）用于生产生物柴油的植物油不易挥发，不宜选用________（填“蒸馏法” 或“压榨法”或“萃取法”）从油料作物中提取。
（2）筛选产脂肪酶细菌时，配置的培养基应以______为唯一碳源， 从功能上看该培养基为_______________。 对细菌培养基进行灭菌，宜采用___________________法。为确定培养基灭菌是否彻底，需要设置对照组，将未经接种的灭菌培养基与接种后的培养基在相同且适宜的条件下培养一段时间，如果____________________则可说明所用培养基是无菌的。
（3）图示分离产脂肪酶细菌用的方法是__________，其中操作正确的是_____________________。
（4）从纯化培养得到的细菌中分离提取脂肪酶后，可与_________________混合，通过测定单位时间、单位体积中生物柴油的生成量，来确定该脂肪酶的活性。
【答案】蒸馏法 脂肪（或植物油） 选择培养基 高压蒸汽灭菌 未接种组不形成菌落 平板划线法 B 植物油与甲醇
【分析】
1、植物芳香油的提取方法：蒸馏法、压榨法和萃取等。
2、微生物常见的接种的方法（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；不能用于菌落计数。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落；可用于菌落计数。
【详解】
（1）根据题意，生产生物柴油的植物油不易挥发，所以不适合采用蒸馏法提取，应采用压榨法或萃取法从油料作物中提取。
（2）细菌的培养需要碳源、氮源、水和无机盐等物质，筛选产脂肪酶细菌时，配置的培养基应以为植物油唯一碳源，该培养基为选择培养基；对细菌培养基进行灭菌，因为培养基中含有水分，可利用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，为了确定培养基灭菌是否彻底，需要设置对照组，将未经接种的灭菌培养基与接种后的培养基在相同且适宜的条件下进行培养，若未接种组不形成菌落则灭菌彻底。
（3）图示分离产脂肪酶细菌用的接种方法是平板划线法，正确的划线分离操作应该多次划线，且从上一次划线的末端开始划线，因此B的划线分离操作最为合理，故选B。
（4）脂肪酶可催化植物油与甲醇反应合成生物柴油，从纯化培养得到的细菌中分离提取脂肪酶后，则可以将植物油和甲醇混合，通过测定单位时间、单位体积中生物柴油的生成量，来确定该脂肪酶的活性。
【点睛】
本题考查微生物的分离与培养和植物有效成分的提取，意在考查考生对基础知识的掌握和灵活运用基础知识的能力。
35．研究发现，土壤中某种微生物能降解石油。分离降解石油的菌株和探索其降解机制的实验过程如图所示。回答下列问题：
（1）微生物生长繁殖需要的营养物质除了水、无机盐外，还有______________，该实验所用的振荡培养的培养基只能以石油作为唯一碳源，其原因是______________________________________。
（2）振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高____________的利用率。
（3）若要测定培养液中活菌数量，应选择的接种方法是____________。利用该方法统计活菌数量的原理是________________________。
（4）为探究石油的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是________________________。该实验设计是否合理？为什么？___________________。
【答案】碳源、氮源 只有能利用石油的微生物能正常生长繁殖 溶解氧 营养物质 稀释涂布平板 当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌 目的菌株能分泌降解石油的蛋白质 不合理，缺少空白对照
【分析】
分析题图：图示是探索石油降解机制的实验过程，图甲中，首先用选择培养基从土壤中筛选菌种，再采用平板划线法分离出相应的菌种；图乙中：乙图用于测定石油降解率。
【详解】
（1）生物的各种培养基配方一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四类营养。选择培养基只允许特定种类的微生物生长，又要抑制或阻止其他种类微生物生长，因而要筛选能降解石油的微生物，应该用以石油为唯一碳源的培养基，在该培养基上只有能利用石油的微生物能正常生长繁殖。
（2）振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。
（3）接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可用于测定活菌数量，原理是当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（4）从图乙上清液中加入蛋白酶溶液可知是用于水解上清液中的某蛋白质的，由此可判定实验假设是目的菌株通过分泌某种蛋白质来降解石油。探究实验需要遵循对照原则和单一变量原则，该实验尚需设置不加入蛋白酶的对照组实（即缺少空白对照），否则没有说服力，因而不合理。
【点睛】
本题结合探究实验过程，考查微生物的培养和分离、探究实验等知识，要求考生识记培养基的成分、种类及作用；掌握分离微生物常用的两种方法及操作过程；掌握探究实验的原则，能结合图中信息知识答题。
36．生活污水和养殖废水直接影响人们的生活环境，为了解决传统污水处理存在的不足，科研人员利用小球藻进行了相关研究。
（1）从城市周边河流采集水样，进行富集培养。采用_____________法将其接种到不含碳源的平板上，筛选出小球藻单藻落，并进一步纯化得到X、Y、S、L和B五种藻株。
（2）研究人员对奶牛养殖废水沼液进行10倍和5倍稀释，以控制废水中污染物的浓度。将上述5种藻株扩大培养后，分别接种于不同稀释倍数的奶牛养殖废水沼液中，置于光照培养箱中培养，测定培养液中小球藻的数量，结果如下图。
①从培养液中随机取样加入到_____________上，然后在显微镜下观察、计数小球藻数量。在取样时为降低实验误差，正确的操作是______________。
②据实验结果推测藻株_____________可作为目标藻株，原因是_____________。
（3）进一步检测该目标藻株对稀释5倍奶牛养殖废水沼液中总氮、总磷和COD（有机物含量）的去除效果，结果如下表。
天数（d）
检测指标（mg·mL-1）
0
4
8
12
16
20
24
28
总氮
105
100
93
88
50
43
43
43
总磷
47
45
39
30
25
20
20
20
COD
520
520
500
420
420
300
270
270
①结果表明，该藻株在沼液中分别经历了适应期、正常生长期和生长停滞期，依据是_________________。目标藻株对沼液中______________的去除效果最好。
②解释实验中COD下降的原因__________________________。
（4）若要将该研究结果应用于养殖污水的处理，为提高处理效果，请提出一个需进一步研究的问题。______
【答案】稀释涂布平板法（或平板划线法） 血球计数板 充分摇匀后取样、多次取样计数 X X藻在10倍和5倍稀释的废水沼液中相对数量均最多，适应能力最强 总氮、总磷和COD的浓度在0~4d无显著变化，8~16d均明显下降，20~28d均在较低水平保持稳定 总氮、总磷 由于小球藻数量的增加，产生的大量氧气促进了分解者数量的增加，分解者利用分解有机物，使得COD下降 探究在处理污水时X藻和分解者的最佳配比；探究污水处理最好效果的X藻的投放量；探究环境条件对X藻处理污水效果的影响（合理即可得分）
【分析】
1微生物常用的接种方法是稀释涂布平板法或平板划线法，微生物的计数方法可以用稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
【详解】
（1）分离单个菌落的接种方法是稀释涂布平板法或平板划线法，所以采用稀释涂布平板法或平板划线法将富集培养的水样接种到不含碳源的平板上，筛选出小球藻单藻落，并进一步纯化得到X、Y、S、L和B五种藻株。
（2）①可用血细胞计数板对小球藻直接计数，即从培养液中随机取样加入到血球计数板上，然后在显微镜下观察、计数小球藻数量。在取样时为降低实验误差，正确的操作是需将培养液充分摇匀后取样，使小球藻分布均匀、多次取样计数。
②X藻在10倍和5倍稀释的废水沼液中相对数量均最多，适应能力最强，所以跟据该实验结果推测藻株X可作为目标藻株。
（3）①依据实验结果总氮、总磷和COD的浓度在0~4d无显著变化，8~16d均明显下降，20~28d均在较低水平保持稳定，结果表明，该藻株在沼液中分别经历了适应期、正常生长期和生长停滞期。根据题表信息可知，目标藻株对沼液中总氮、总磷的去除效果最好。
②解释实验中COD是有机物的量，下降的原因由于小球藻数量的增加，产生的大量氧气促进了分解者数量的增加，分解者利用分解有机物，使得COD下降。
（4）若要将该研究结果应用于养殖污水的处理，为提高处理效果，需进一步研究的问题是探究在处理污水时X藻和分解者的最佳配比；探究污水处理最好效果的X藻的投放量；探究环境条件对X藻处理污水效果的影响。
【点睛】
本题以生活污水和养殖废水为背景，主要考查微生物培养、计数的相关知识，要求考生能够从表格和图形中获取有效信息，综合分析解决实际问题。
37．土壤中含有大量的难溶性磷酸盐，为了从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为植物能吸收的可溶性磷的优良解磷菌株，以便将其添加到有机肥中，改善植物磷元素供应，科研人员进行如下实验：
实验原理：固体培养基中难溶性磷酸盐在微生物的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如图1），透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解磷的能力大小。
实验步骤：
步骤1 取某地区土样5 g制得土壤溶液后稀释，取稀释液1 mL接种到基础培养基A上，在适宜温度下培养72 h。
步骤2 在基础培养基A上用接种环挑取代表性菌落再次接种，培养3~4 d后观察菌落特征和透明圈的大小，初步筛选出三种优良解磷菌株（如表）。
菌株
透明圈直径（D）
菌落直径（d）
D/d
M-3-01
18．8
12．3
1．5
B3-5-6
20．7
8．0
2．6
T1-4-01
9．1
6．5
1．4
请据以上资料，回答下列问题：
（1）从物理形态上看，培养基A属于__________培养基，为了筛选出优良解磷菌株，培养基中加入的磷源是__________。
（2）步骤1中的接种方法是__________，应该在__________旁完成操作。根据表中的实验结果可以确定溶解磷能力最强的菌株是__________。
（3）为测定初步筛选的三种菌株实际溶解磷的能力，研究人员将它们接种到基础培养基B中，并在37℃、200 r·min-1摇床培养，定期取上清液，测定溶液中可溶性磷含量，得到如图2所示曲线，结果表明最优良的解磷菌株是__________。
（4）为进一步检测发酵过程中上述最优良菌的数量，实验者将1 mL该菌发酵液稀释1000倍后，分别取0．1 mL稀释菌液均匀涂布在5个平板上，经适当培养后，长出的菌落数分别为13、156、462、178和191，据此可得出每毫升发酵液中的活菌数为__________个。与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较__________。
【答案】固体 难溶性磷酸盐 稀释涂布平板法 酒精灯火焰 B3-5-6 M-3-01 1．75×106 少
【分析】
土壤是微生物的天然培养基。从土壤中筛选出能够将难溶性磷酸盐转化为植物能吸收的可溶性磷的优良解磷菌株必须使用以难溶性磷酸盐作为唯一磷源的选择培养基。表格中的透明圈越大，菌落直径越小，说明降解难溶性磷酸盐的能量越强。图1是表示固体培养基中难溶性磷酸盐在微生物的作用下溶解，在菌落周围形成透明圈，图2代表不同菌株实际溶解磷的能力，其中M-3-01菌株摇床培养后，溶液中可溶性磷含量最高，说明M-3-01实际溶解磷能力最强。
【详解】
（1）菌落在固体培养基上才能形成（培养过程中菌体不能运动），所以从物理形态上看，培养基A属于固体培养基。要筛选溶解难溶性磷能力强的菌株，必须以难溶性磷酸盐作为唯一磷源。
（2）步骤1的目的是从土壤微生物中筛选解磷微生物，由于土壤样液中微生物种类和数量多，需要稀释后再接种，故采用的是稀释涂布平板法进行接种，为了避免杂菌污染，应该在酒精灯火焰旁完成操作。根据实验原理中“透明圈直径与菌落直径比代表微生物溶解磷的能力大小”，结合表格数据可以确定解磷能力最强的菌株是B3-5-6，因为B3-5-6的D/d值最大。
（3）为测定初步筛选的三种菌株实际溶解磷的能力，研究人员对其进行摇床培养，根据根据实验曲线图，不难看出在一定时间区间里，M-3-01实际溶解磷能力最强。
（4）稀释涂布平板法计数，需要取菌落数在30-300之间的进行计数，故根据题意可知，每毫升发酵液中的活菌数为（156+178+191）/（3×0.1）×1000=1.75×106。与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较少，因为稀释涂布平板法在计算菌落时两个或多个细菌连接在一起，往往统计的是一个菌落。
【点睛】
本题结合实验表格结果考查了微生物培养和分离的有关知识，要求考生掌握微生物分离与纯化的方法，能够根据表格数据确定溶解磷能力最强的菌株，具备一定分析和计算的能力。
38．对某品牌的一次性口罩中的微生物进行检测，通过分析微生物的种类和数量来确定口罩的合格性。回答下列问题。
（1）准确称取10g（近似10mL）样品，剪碎后加入到90m无菌水中充分混匀，待样液自然沉降后取上清液进行菌落计数。计数前需先配置______培养基（按物理性质分类），使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌时，压力达到设定要求而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因待冷却后采用稀释涂布平板法分别接种0.1mL样液并放入恒温培养箱中培养，平板上长出的菌落数分别为37个、45个、19个、346个和44个，那么1g口罩样品中细菌数量为______个。根据《中华人民共和国医药行业标准》对一次性口罩的微生物指标要求细菌菌落总数≤100个/g，该研究小组检测的口罩______（填“符合”或“不符合”）标准。
（2）在微生物培养过程中配置的培养基除了提供水、碳源、氮源、无机盐等几种主要营养物质以外，培养基还需要满足微生物生长对pH、氧气以及______的要求。显微直接计数也是测定微生物数量的常用方法，该方法的主要缺点是______。为确定检测样液中大肠杆菌数目，需在培养基中加入用于______鉴别，统计培养基上深紫色菌落的数目。
（3）某些自养微生物能利用空气中的CO2作为碳源。生物兴趣小组从样品中分离出一种细菌X，请设计实验探究细菌X能否利用空气中的CO2作为碳源，写出实验思路并预期结果和结论。
实验思路：______。
预期结果和结论：______。
【答案】固体培养基 4200 不符合 特殊营养物质 不能区分死菌与活菌 伊红美蓝 将X细菌接种到无碳的培养基上，置于适宜的环境中培养一段时间后，观察有无菌落的形成 若有菌落形成，则X细菌能利用空气中的CO2作为碳源
【分析】
微生物常见的接种的方法：①平板划线法；②稀释涂布平板法。后者可用于微生物的计数，计数时，取菌落数在30～300的平板，计算平均菌落数。计算公式为：每克（ml）样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积，M代表稀释倍数。
【详解】
（1）按物理性质分类，培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基，该培养基属于固体培养基。据题干信息可知，符合计数要求的平板的菌落平均值=（37+45+44）÷3=42，故1g口罩样品中细菌数量=（C÷V）×M=（42÷0.1）×10=4200个。根据《中华人民共和国医药行业标准》对一次性口罩的微生物指标要求细菌菌落总数≤100个/g，该研究小组检测的口罩不符合标准。
（2）培养基的营养构成：①根据微生物生长繁殖的需要来确定；②主要营养物质有水、碳源、氮源、无机盐；③其他条件有pH、特殊营养物质以及氧气等。显微直接计数法是利用血细胞计数板，在显微镜下对微生物进行计数，该方法的缺点是不能区分死菌与活菌，使计数的结果偏大。不同微生物的菌落特征不同，大肠杆菌在加入伊红美蓝的固体培养基上，会形成黑色菌落，可用伊红美蓝培养基检测样液中大肠杆菌数目。
（3）要想证明该结论（X细菌能否利用空气中的CO2作为碳源），应将X细菌接种在无碳源的培养基进行培养，能利用空气中的CO2作为碳源的细菌就能在该培养基上形成菌落。
实验思路：将X细菌接种到无碳源的培养基上，置于适宜的环境中培养，一段时间后观察有无菌落的形成；预期结果：有大量菌落形成；结论：X细菌能够利用空气中的CO2作为碳源。
【点睛】
本题考查了微生物的分离和培养的有关知识，要求考生能够识记培养基的成分，掌握实验室常用的消毒和灭菌的方法；识记接种微生物常用的两种方法及计数微生物的方法，能结合所学的知识准确答题。
39．口臭是一种自口腔散发的令人不愉悦的气味，同时也是身体健康程度的重要表征。口臭的成因一般来自三方面：口腔卫生差，微生物利用食物残渣进行发酵；消化道菌群失调，尤其是胃部被幽门螺杆菌感染：机体代谢异常，特殊代谢废物经血液循环自肺部排出。幽门螺杆菌是栖息在胃黏膜的螺旋形的细菌（该菌对万古霉素、两性霉素B等抗生素不敏感，对青霉素高度敏感），感染后可引起胃炎、消化道溃疡等疾病。
（1）下列关于幽门螺杆菌的说法中，错误的是____。
A．具有核糖体，能独立合成蛋白质 B．幽门螺杆菌生命系统的边界是细胞壁
C．幽门螺杆菌以二分裂方式进行增殖 D．幽门螺杆菌可以在酸性条件下生存
（2）为研究培养幽门螺杆菌所需的气体条件，某研究小组利用半固体培养基（琼脂含量3．5g/L）对幽门螺杆菌进行培养。如图代表微生物可能出现的四种生长状态。
结果显示幽门螺杆菌的生长状态类似②号试管，则培养幽门螺杆菌的气体最适条件应为下列选项中的____。
A．纯氧 B．90%N、10%CO2 C．无菌空气 D．5%O2、85%N2、10%CO2
（3）为了从胃炎患者的胃黏膜提取稀释液中分离得到幽门螺杆菌，应将稀释液样品接种在以____为唯一氮源的____（填“固体”或“液体”）培养基上，以____（填方法）接种后置于培养箱中培养。若要鉴别是否是幽门螺杆菌，可向培养基中添加____指示剂，在培养过程中若出现红色环带的菌落，表明该菌落为幽门螺杆菌菌落。
（4）若要将得到的幽门螺杆菌进行扩大培养，可采用布氏肉汤基础培养液进行培养，培养液中需加入混合抗生素（包括万古霉素、两性霉素B等)，其目的是：________________。
（5）幽门螺杆菌能产生有较强活性的脲酶，该酶能催化热稳定性低的尿素分解为NH3，和CO2。体检时可通过14C尿素呼气试验来检测幽门螺杆菌感染情况。受试者口服14C标记的尿素胶囊后，定时收集受试者吹出的气体并测定其中是否含有14CO2以及量的多少，作为诊断指标。14C—尿素呼吸检测的原理是患者消化道细胞内____（填“有”或“无”）脲酶活性，若呼出的气体中含有14CO2，则为____的代谢产物。
【答案】B D 尿素 固体 稀释涂布平板法或平板划线法 酚红 抑制除幽门螺杆菌以外的其他杂菌的生长(抑制对万古霉素、两性毒素B敏感的微生物生长) 有 幽门螺杆菌
【分析】
微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）A、幽门螺杆菌是原核生物，具有核糖体，能独立合成蛋白质 ，A正确；
B、幽门螺杆菌生命系统的边界是细胞膜，B错误；
C、幽门螺杆菌是细菌，以二分裂方式进行增殖， C正确；
D、幽门螺杆菌可以生活在胃部强酸低氧的环境中，D正确。
故选B。
（2）由图可知，幽门螺杆菌在试管④中浓度最大，说明其繁殖需要较低的氧浓度，D正确。
故选D。
（3）由题意可知，幽门螺杆菌可以产生活性高的脲酶，利用尿素作为唯一氮源，因此利用以尿素作为唯一氮源的固体培养基可以进行有效筛选，同时酚红指示剂可以鉴别有无脲酶催化尿素分解。
（4）若要对幽门螺杆菌进行扩大化培养则要抑制其他杂菌生长，应使用万古毒素和两性毒素B。
（5）已知幽门螺杆菌能产生有较强活性的脲酶，该酶能催化热稳定性低的尿素分解为NH3和CO2，受试者口服14C标记的尿素胶囊后，患者消化道细胞内有脲酶活性，若呼出的气体中含有14CO2，则为幽门螺杆菌的代谢产物。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，要求考生识记培养基的种类及功能;识记接种微生物常用的两种方法，能结合所学的知识准确答题。
40．乳酸有L－乳酸、D－乳酸和DL－乳酸三类，人体只能代谢L－乳酸，而过多摄入D－乳酸会危害健康；传统酸菜发酵产物多为D－乳酸。为了从酸菜中筛选出高产L－乳酸的菌株，某科研小组进行如下实验。
实验材料和步骤：
①准备实验材料：酸菜汁、发酵培养基、MRS培养基（成分见下表，pH6.2~6.4）等。
有机物
牛肉膏10.0g
蛋白陈10.0g
酵母膏5.0g
葡萄糖20.0g
有机盐：乙酸钠2.0g、柠檬酸二铵2.0g
琼脂粉15.0g
无机物
K2HPO4 2.0g
MgSO4·7H2O 0.58g
MgSO4·4H20 0.25g
水1.0L
②筛选高产L－乳酸菌种：将酸菜汁稀释107倍，取0.1mL稀释液涂抹在MRS培养基中于32℃下培养2~4d获得单菌落，鉴定后将获得的L－乳酸菌种接种于MRS液体培养基中，在32℃下培养24h，检测L－乳酸的产量。
③发酵条件优化：分别探究发酵时间、温度等因素对发酵效果的影响。
实验结论：高产L－乳酸菌株的最佳发酵温度是2℃、发酵最佳时间是20h、发酵的初始pH是6.2。
请回答下列问题：
（1）在MRS培养基中添加葡萄糖的作用是________________，无机盐可能起到________ 的作用。MRS培养基常用________法灭菌，使用高压蒸汽灭菌锅时应注意________________。
（2）将用________稀释后的酸菜汁涂布在MRS培养基上，培养后可通过菌落的________________（答出两点）等特征将目的菌株鉴定出来；将获得的目的菌株接种于液体MRS培养基中可达到________的目的。
（3）如何确定发酵的最佳时间？__________。
【答案】为乳酸菌生长提供碳源和能源 调节细胞渗透压 高压蒸汽灭菌 要先向灭菌锅内倒入适量水，并加热煮沸，将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。 无菌水梯度 形状、大小、隆起程度和颜色 增加高产L－乳酸菌株数目 每隔相同时间，测定培养基中L－乳酸的含量，L－乳酸的含量最高的组对应的时间即为发酵的最佳时间
【分析】
（1）培养基的成分一般包括水、无机盐、碳源、氮源和生长因子；
（2）常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌和灼烧灭菌；
（3）接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法．接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体-菌落。
【详解】
（1）在MRS培养基中添加葡萄糖的作用是为乳酸菌生长提供碳源和能源。无机盐可能起到调节细胞渗透压的作用。MRS培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌，使用高压蒸汽灭菌锅时应注意要先向灭菌锅内倒入适量水，并加热煮沸，将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。
（2）将用无菌水梯度稀释菌液涂布在MRS培养基上，培养后可通过菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征将目的菌株鉴定出来；将高产L－乳酸菌株接种于液体MRS培养基中可达到增加高产L－乳酸菌株数目。
（3）通过每隔相同时间，测定培养基中L－乳酸的含量，L－乳酸的含量最高的组对应的时间即为发酵的最佳时间。
【点睛】
本题考查微生物的筛选相关知识，要求考生识记相关知识，意在考查考生的识记能力和从题干中获取有效信息的能力。
41．物质W是一种含氮有机物，会污染土壤，W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌），回答下列问题。
（1）若要从土壤中分离出目标菌，所用的培养基应为_____，使用前应用_____法进行严格灭菌；其中的氮源应该是_____。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择_____菌落进一步纯化，选择的依据是_____。
（3）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_____，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明_____；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_____。
【答案】选择培养基 高压蒸汽灭菌 W 乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W 缓冲液 缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
【分析】
选择培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或对某些化学、物理因素的抗性而设计的，能选择性地区分这种微生物的培养基。利用选择培养基，可使混合菌群中的目标菌种变成优势种群，从而提高该种微生物的筛选效率。
【详解】
（1）要从土壤中分离目标菌，需要在培养基中加入某种化学成分，使目标菌变成混合菌样中的优势菌，从而提高目标菌的筛选率，这样起到选择培养作用的培养基称为选择培养基。培养基使用前应用高压蒸汽灭菌进行严格灭菌，防止其他微生物污染。该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物，故可作筛选培养基中的氮源。
（2）研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙菌落的周围出现透明圈，说明乙菌落能够降解物质W ，故乙菌落为该小组的目标细菌，应该选择乙菌落进一步纯化。
（3）①C处作为空白对照，要排除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且保持滴加量相同。
②培养基中的透明圈表示物质W被降解的情况，若空白对照组C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降解物质W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即酶E与天然酶降解物质W的能力相近。
【点睛】
本题考查筛选培养基的配置和使用，针对不同要求的目标菌种，选择不同物质配制不同筛选作用的培养基。并且要求学生理解识别目标菌种筛选的现象，判断筛选结果。
42．研究人员为获得用于烟气脱硫的脱硫细菌，进行了如下操作。请回答：
（1）取样与筛选：在某热电厂烟囱周围区域采集土样，取样用的小铁铲和盛装土样的信封在使用前都需 要_____。为确保能够从土样中分离到目的菌，可以进行选择培养，目的是_____。
（2）驯化：将目的菌转移到含少量无菌水的锥形瓶中，边搅拌边持续通入 SO2 气体，驯化几分钟后接种到固 体培养基上，待长出菌落后再重复上述步骤，并逐步延长通 SO2 的时间，与此同时逐步降低培养基的 pH。由 此分化获得具有____________和_____________________能力的烟气脱硫细菌。
（3）培养与观察：培养一段时间后，当脱硫细菌_____稳定时，即可作为菌种用于继续研究与生产。
（4）培养大量的目的菌用于生产，研究人员需连续取样进行计数，计数方法一般有稀释涂布平板法和_____法。 当用前者进行计数时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的_____。统计平板上的 菌落数即可推测出样品中含有的活菌数目。通常情况下，用此计数方法统计的菌落数往往比活菌的实际数 目_____。原因是_____。
【答案】灭菌 增加（烟气）脱硫细菌的浓度 耐 （受）SO2 耐 酸 菌落特征 显微镜直接计数 一个活菌 少 两个或两个以上的细菌重叠在一起形成一个菌落
【分析】
根据实验目的可知，实验需要获得“烟气脱硫的脱硫细菌”，因此需要使用选择培养基将该菌筛选出，即题中的“驯化”；
菌落：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个单个菌落就是一个纯化的细菌菌落。
【详解】
（1）为了防止杂菌的污染，取样用的小铁铲和盛装土样的信封在使用前都需要灭菌；为确保能够从土样中分离到目的菌，增加脱硫细菌的浓度，可以进行选择培养.
（2）脱硫细菌能利用SO2，根据驯化过程可知，驯化过程中不断通入SO2，并且延长时间，与此同时逐步降低培养基的pH，因此分化获得具有耐受SO2和适应酸性环境能力的烟气脱硫细菌。
（3）一段时间后，将菌种转移到固体培养基上，当在培养基上观察到脱硫细菌的菌落特征稳定时，即可作为菌种用于继续研究与生产。
（4）培养大量的目的菌用于生产，计数方法一般有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法；稀释涂布平板法计数时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌；用稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于所产生的菌落可能是由两个或多个细胞形成的，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目偏低．
【点睛】
本题考查了微生物的分离与培养的有关知识，要求掌握微生物选择的方法，能够根据微生物的代谢特点确定培养基的成分以及理化性质，掌握微生物计数的一般方法，并比较两者各自的优缺点。
43．网络上有传言称“手机上的细菌比马桶多”。两个兴趣小组就此进行了相关实验，实验结果如下。请回答相关问题：
（1）该实验需制备__________（选填“固体”或“液体）培养基，培养基中一般含有______________________________________________等营养物质。
（2）据图，两兴趣小组均采用_________________法接种，接种前需要采用_________________法对培养基进行灭菌。
（3）通过观察菌落的_________________________________________（至少答出两点）等特征以初步盗定手机屏幕和马桶按钮上的生物类群。
（4）按图示操作取样面积，兴趣小组测定某手机屏幕的细菌数量，将10mL菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1L稀释倍数为100的样品液接种到三个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为99、101、100，则该手机屏幕的细菌数为________个/平方厘米。该实验是否需要设置对照实验？若需要，请简要写出对照实验的设计方案：若不需要，请说明理由。_______，___________________________________。
【答案】固体 碳源、氮源、水、无机盐（缺一不得分） 稀释涂布平板 高压蒸汽灭菌 形状、大小、隆起程度和颜色等（答出任意两点即可） 4×104 需要 取培养基涂布0.1mL无菌水进行培养
【分析】
1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物种和氧气的要求。
2、统计菌落数目的方法：（1）显微镜直接计数法：①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数；③缺点：不能区分死菌与活菌。（2）间接计数法（活菌计数法）： ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌．通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
【详解】
（1）该实验需分离纯化细菌，故需制备固体培养基，培养基一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等营养成分；
（2）两组均采用稀释涂布平板法接种，培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌；
（3）通过观察菌落的形态、大小、颜色、隆起程度等特征，可知手机屏幕和马桶按钮都存在多种微生物。两小组的实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同，可能是因为手机的取样和马桶的取样都不相同；
（4）按图操作取样面积，实验员测定某手机屏幕的细菌数量，将10mL菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1L稀释倍数为102的样品液接种到三个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为99、101、100，则该手机屏幕的细菌数=（99+101+100）÷3÷0.1÷（5×5）×102×10=4×104个/平方厘米。该实验对照组应取培养基涂布0.1mL无菌水放置于和实验组相同的条件下进行培养。
【点睛】
本题考查了微生物的分离与培养的有关知识，要求考生能够识记培养基的成分，掌握微生物分离和计数的方法，能够根据实验结果推测实验误差的原因等。
44．测定水样是否符合饮用水卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的数目。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到伊红美蓝的培养基（EMB培养基）上培养→统计菌落数目。如图甲为大肠杆菌含量检测操作简图，图乙为伊红美蓝培养基配方．回答下列相关问题：
（1）图甲中滤膜的孔径应______________（填“大于”或“小于”）大肠杆菌。
（2）配制图乙中的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入______________（一种营养成分），以及______________。待各成分都溶化后和分装前，要进行的是______________和灭菌。
（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在伊红美蓝培养基上，这属于微生物培养中的______________操作。伊红美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落呈现______________色，从功能上划分，该培养基属于______________培养基。
（4）对大肠杆菌杆菌进行培养时需要将平板倒置，其主要目的是______________。将接种后的培养基进行培养时，要将一个未接种的培养基也放入恒温箱中培养，目的是______________。
（5）某生物兴趣小组的某同学尝试按照上述方法进行测定，无菌操作下将10 mL待测水样加入到 90 mL 无菌水中，稀释后的菌液通过滤膜法测得伊红美蓝培养基上大肠杆菌菌落数平均为31，则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为______________个。
（6）该同学进一步思考，利用滤膜法也可用于测定待测水样中其他微生物的数目。他取了两份水样，一份待测水样来自变酸的果酒，从中检测到两种微生物，它们在结构上的主要区别是______________。另一份来自湖水，若要通过测量蓝藻的数目来研究水华，应更换上述过滤装置中的滤膜，为了减少细菌的干扰，应选择孔径______________ （填“更小”“不变”或“更大”）的滤膜，而培养基配方中则必须添加______________（从“水”“无机盐”“碳源”和“氮源”中选择）。
【答案】小于 氮源（或蛋白胨） 琼脂 调整pH 接种 黑色 鉴别 防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染 检验培养基是否灭菌合格 3100 酵母菌有（以核膜为界限的）细胞核，而醋酸菌没有 更大 水、无机盐、氮源
【分析】
滤膜法是检测水样中大肠细菌群的方法，将一定量水样注入已灭菌的微孔薄膜的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基上，经培养后计数和鉴定滤膜上生长的大肠菌群菌落即可推测计算出水样中的大肠杆菌数；伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料，大肠杆菌在伊红美蓝培养基的菌落呈深紫色，并有金属光泽。
【详解】
（1）图甲中滤膜的孔径应小于大肠杆菌，才能将细菌截留在滤膜上。
（2）配制细菌的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入氮源（或蛋白胨），以及琼脂。待各成分都溶化后和分装前，要进行调整pH并灭菌。
（3）将完成过滤之后的滤膜紧贴在伊红美蓝培养基上，就是在培养基上接种过滤出来的大肠杆菌。伊红美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落呈现深紫色（黑色）带有金属光泽，从功能上划分，属于鉴别培养基。
（4）接种后的平板需倒置，以防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。将一个未接种的培养基也放入恒温箱中培养作为对照以检验培养基是否灭菌合格。
（5）根据题意，该100ml样本中有大操场杆菌31个，稀释倍数为10倍，31÷100×1000×10＝3100则推测1升待测水样中的大肠杆菌数目为3100个。
（6）变酸的果酒中可能有酵母菌和醋酸杆菌两种微生物，它们在结构上的主要区别是酵母菌有（以核膜为界限的）细胞核，而醋酸菌没有。蓝藻细胞较普通细菌为大，为了减少细菌的干扰，应选择孔径更大的滤膜，而作为自养型生物，可以不用在培养基中添加碳源，必须添加水、无机盐、氮源。
【点睛】
本题考查微生物的实验室培养，培养基配制等，是基础知识点的识记。
45．不同品牌的酸奶具有不同的口味。某研究小组利用含碳酸钙的固体培养基探究甲、乙两品牌酸奶中乳酸菌的类型是否相同(乳酸能够溶解碳酸钙，使培养基变得透明)。请回答下列问题：
（1）将甲、乙两品牌酸奶中的乳酸菌纯化，分别接种在含碳酸钙的固体培养基中培养，根据菌落周围透明圈的大小，可确定酸奶中乳酸菌的类型。不同乳酸菌菌落透明圈大小不同的原因是________________________________________________。
（2）家庭制作酸奶时，在纯牛奶中加入少量酸奶相当于微生物培养技术中_______的操作。纯牛奶变成酸奶，改变了口味但含有的能量减少，原因是 ____________。
（3）为长期保存纯化的优质乳酸菌，可将菌液与___________充分混匀，置于-20℃的冷冻箱中保存。
（4）该研究小组进一步探究甲品牌酸奶中乳酸菌数量，实验操作如下图。接种微生物的方法有很多，图中过程①②③所示的方法为______________，用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/ml)， 这里的n=______，用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个平板，目的是_______________。如果平板菌落数超过300，一般还需进一步__________。
【答案】（在相同时间内）不同类型的乳酸菌产生乳酸的量不同，不同量的乳酸能够溶解碳酸钙的量不同，形成的透明圈大小不同 接种 乳酸菌在发酵时使牛奶中的营养成分发生改变，乳酸菌细胞呼吸消耗部分有机物，从而使能量减少 灭菌的甘油 稀释涂布平板法 6 设置重复组，取平均值，使实验结果更加准确可靠 稀释
【分析】
本实验的原理是：由于乳酸菌分泌的乳酸能够溶解碳酸钙，使培养基变得透明，所以不同类型的乳酸菌分泌乳酸的量不同，分泌量多的产生的透明圈较大，而分泌量少的产生的透明圈则较小。因此可以根据菌落周围透明圈的大小，来探究甲，乙两品牌酸奶中乳酸菌的类型。
【详解】
（1）(在相同时间内)不同类型的乳酸菌产生乳酸的量不同，不同量的乳酸能够溶解碳酸钙量不同，所以不同乳酸菌菌落形成的透明圈大小不同。
（2）在纯牛奶中加入少量酸奶相当于微生物培养技术中的接种操作。纯牛奶变成酸奶，改变了口味但含有的能量减少，因为乳酸菌在发酵时使牛奶中的营养成分发生改变，乳酸菌细胞呼吸消耗部分有机物，从而使能量减少。
（3）为长期保存纯化的优质乳酸菌，可将菌液与灭菌的甘油充分混匀，置于-20℃的冷冻箱中保存。
（4）要对微生物计数可以采用活菌计数法或显微镜直接计数法，题目所给的图片信息是采用的活菌计数法，具体操作是通过稀释涂布平板法完成的。由①②的操作可知这时已对酸奶样品稀释了100倍， ②重复3次又稀释了1000倍，从中取出0.1ml样进行涂布，所用到的量是原来的10-6，因此这里的n=6，用稀释涂布平板法计数时，要至少涂布3个平板，目的是设置重复组，取平均值，使实验结果更加准确可靠。为了保证结果准确，一般选择菌落数中30～300的平板进行计数，如果平板菌落数超过300，说明稀释倍数不够，一般还需进一步稀释。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养相关知识，意在考查学生的识记能力和分析问题解决问题的能力。
46．绿水青山就是金山银山，污水治理是生态文明建设的一项重要任务，利用微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇（PVA）是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
成分
MgSO4
蛋白质
X物质
水
琼脂
用量
5g
10g
7g
1000 mL
20g
（1）表中是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，营养物质X最可能为__________。
（2）若图中污水取样是从聚乙烯醇（PVA）污染的水体中采集，通过图示过程分离出分解聚乙烯醇（PVA）的菌落，则进行过程1的作用是__________
（3）若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中有PVA分解菌__________个，该接种方法是__________方法，通过该方法测量的菌落数值与实际值相比一般会__________（填“偏大”“偏小”或“相等”）。
（4）要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入_______用于鉴别PVA分解菌。若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，请用简洁的语言写出设计思路：____________
【答案】聚乙烯醇（或PVA） 通过选择培养增加PVA分解菌的数量 1．6×109 稀释涂布平板法 偏小 碘 用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小（或直径）来确定不同菌株降解PVA能力的大小
【分析】
1、选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）表格是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，即该培养基属于选择培养基，该培养基的配制过程中应该以PVA为唯一碳源，因此表中X物质最可能为聚乙烯醇（PVA）。
（2）若图中污水取样是从聚乙烯醇（PVA）污染的水体中采集，通过图示过程分离出分解聚乙烯醇（PVA）的菌落，则进行的过程1为选择培养，其作用是通过增加PVA分解菌的数量。
（3）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用血细胞（血球）计数板直接计数。若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落（说明制备的平板合格，且实验操作可靠），则100mL原菌液中有PVA分解菌=160÷0.1×104×100=1.6×109个；这种接种方法为稀释涂布平板法，由于在涂布过程中会出现两个或多个细菌聚集在一起只能产生一个菌落的情况，则会导致该方法的测量值与实际值相比一般会偏小的情况。
（4）根据题意可知，“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”，因此要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中还需要加入碘与PVA作用形成蓝绿色复合物，若菌落周围出现白色透明斑，则该菌为PVA分解菌。若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，设计思路如下：用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小（或直径）来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
【点睛】
熟本题考查了微生物培养、分离和鉴别的原理和操作流程，考生能根据题目中的相关目的设计实验过程是解答本题的另一关键，能提取题干中的有用信息并能合理的利用是解答本题的必备能力，稀释涂布平板法的应用及其计数特点和相关的计算也是本题 的考查点。
47．尿素是一种重要的农业肥料，经微生物分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计实验并成功筛选到能高效分解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如下表所示。将表中物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL。实验过程如图所示，回答下列问题：
KH2PO4
1．4 g
Na2HPO4
2．1 g
MgSO4·7H2O
0．2 g
葡萄糖
10 g
尿素
1 g
琼脂
15 g
（1）该培养基能筛选出目的菌的原因是______________________。
（2）图中将细菌转到固体培养基上接种时，可采用的方法是_____________。初步筛选出来的 菌种还需要进一步的鉴定：在培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可说明该菌种能够分解尿素。
（3）在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是________，需要消毒的是________（填序号）。
①培养细菌的培养基与培养皿
②玻棒、试管、锥形瓶和吸管
③实验操作者的双手
（4）在进行分离分解尿素的细菌实验时，A同学从培养基上筛选出大约50个菌落，而其他同学只选择出大约20个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有________（填序号）。
①所取土样不同 ②培养基被污染
③接种操作错误 ④没有设置对照实验
【答案】尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长 平板划线法或稀释涂布平板法 酚红 红 ①和② ③ ①②③
【分析】
1、鉴别培养基依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计，在培养基中加入某种试剂或化学药品而制成。
2、灭菌分为灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，对接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等采用灭菌处理；消毒分为煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法，适用于操作空间、某些液体、双手等。
3、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）该培养基中不加其他氮素，只以尿素作为唯一氮源，在此培养基上只有能够产生脲酶将尿素分解的细菌（目的菌）才能获得氮源，而不能分解尿素的细菌将因缺少氮源无法生长繁殖，故能从众多微生物中筛选出能分解尿素的目的菌。
（2）题图中可采用稀释涂布平板法或平板划线法将细菌接种到固体培养基上，以便于获得单菌落继续培养。分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶能将尿素分解成NH3，NH3会使培养基的碱性增强，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
（3）微生物培养实验中，需要对培养细菌用的培养基与培养皿，玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管进行灭菌处理；对实验操作者的双手进行消毒。故需要灭菌的是①②，需要消毒的是③。
（4）该同学与其他同学获得的菌落数差异很大，可能的原因是采用的土样不同，培养基灭菌不彻底，培养基被污染；或者是实验过程中没有进行无菌操作，或者是接种操作错误。故选①②③。
【点睛】
对于微生物培养技术、选择培养基的选择作用、培养基为微生物提供的营养成分、植物组织培养的培养基的成分、常用的接种方法和具体操作过程的理解把握知识点间的内在联系是解题的关键。
48．氰化物是指含有CN基团的化合物，许多氰化物有剧毒，极少量就会使生物在短时间内中毒死亡。世界卫生组织《饮用水水质标准》规定，必须严格控制水中氰化物的含量，含有氰化物的废水要经过处理才能排放。采用生物法降解氰化物是减轻水中氰化物污染的有效途径之一。自然界中对氰化物有降解能力的微生物约有50种，它们能产生氰（腈）水合酶和氰（腈）水解酶等，最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3。
（1）欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物，首先应制备两种培养基，一种是牛肉膏蛋白胨培养基，另一种是以______作为唯一氮源的选择培养基。然后将两种培养基倒平板，设置如下表所示的对照组和实验组：
对照组
实验组
①______
②______
③已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板
④
对照组①、②分别为______。若对照组的平板上没有菌落生长，说明培养基在使用前未被杂菌污染；若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数，说明______。
（2）用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是______。计数时，同一个稀释浓度下应至少对______个平板进行重复计数。若某同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的菌液0.1mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原菌液中上述目的菌的数量约为______。经实验统计出的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是______。实验结束后，使用过的培养基应进行______处理才能倒掉，以防造成环境污染。
（3）脱除污水中氰化物的方法有多种，目前采用较多的是化学氧化法，但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。与化学氧化法相比，生物降解法具有更好的应用前景，原因是______。
【答案】氰化物 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板 选择培养基具有选择作用 平板上的一个菌落一般来源于稀释液中的一个活菌 3 1.6×109 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 灭菌 生物降解法能将氰化物彻底分解成CO2和NH3等产物，比化学方法更安全
【分析】
培养基的概念及营养构成
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
（2）营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求．例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。
【详解】
（1）欲从水体中分离出能够降解氰化物的微生物，首先应制备两种培养基，一种是牛肉膏蛋白胨培养基，另一种是以氰化物作为唯一氮源的选择培养基。然后将两种培养基倒平板，设置如下表所示的对照组和实验组，对照组的作用是为了说明培养基是否合格，因此，对照组①、②分别为 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和未接种的选择培养基平板，若相同的时间内，对照组培养基上无菌落出现，则说明实验组的数据具有说服力，④的处理是接种 了等量菌种的选择培养基（以氰化物作为唯一氮源的选择培养基）；若实验组③平板上的菌落数显著多于同一稀释度的④平板上的菌落数，说明选择培养基具有选择作用。
（2）用稀释涂布平板法计数能够降解氰化物的微生物时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，因为当稀释倍数足够高时，就可以在平板上获得由一个活菌长成的菌落，因此，此时的菌落数可代表稀释液中的活菌数。计数时，同一个稀释浓度下应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值，这样可以减小实验误差。若某同学在4个平板培养基上分别接灭菌处理才能倒掉，这样可避免微生物对环境造成污染。
（3）脱除污水中氰化物的方法有多种，目前采用较多的是化学氧化法，但该处理过程中易产生毒性比HCN更大的挥发性气体CNCl。而对氰化物有降解能力的微生物能产生氰（腈）水合酶和氰（腈）水解酶等，在这些酶的催化下，最终将氰化物中的C和N转变为CO2和NH3，CO2和NH3可被植物吸收利用，不会造成污染，因此，与化学氧化法相比，生物降解法具有更好的应用前景。
【点睛】
熟知微生物培养基的制备和培养基的种类是解答本题的关键，掌握两种接种方法是解答本题的前提，能根据实验目的设计相关的实验，并理解微生物在治理环境污染上的应用前景是解答本题的另一关键。
49．近年来，高氨氮废水的处理不当以及持续排放，导致了水体污染的日益严重。生物脱氮法相对于物化法来说，工艺简单、处理成本低、无二次污染，是较好的氨氮废水处理方法。某科研团队从湖底污泥中分离、筛选出能降解氨氮的菌株，并研究其降解氨氮的最适条件，包括培养温度、培养时间、起始的pH等，实验步骤如下。回答下列问题：
（1）步骤一：将1g水底污泥加入9 mL无菌水中制成悬液，接种至100mL液体培养基中，于30℃的温度条件下在摇床中培养7天。期间，每天向培养基中加入1mL浓度为5％的（NH4）2SO4溶液，这项操作的目的是______________________________。
（2）步骤二：将培养后的菌液用____________法涂布到分离培养基中，倒置于30℃的恒温培养箱中，培养至长出菌落。若平板中菌落过于密集，应进一步_______________________。反复分离纯化，至同一平板中只出现同种形态的菌落。
（3）步骤三：将筛选分离后的各菌株分别接种到氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）中，在30℃的温度条件下摇瓶培养24小时后，取培养液进行离心10分钟，取其上清液，_________________，从而计算出各个降解菌的氨氮降解率。
（4）步骤四：将筛选出的最优菌种于30℃的温度条件下在摇床中培养24小时。每隔2小时对培养基进行测定，研究降解氨氮的最佳培养时间。下图是某菌株的氨氮降解率曲线图，据图可以得到的结论有_______（写出两点）。
（5）步骤五：若要探究所分离纯化出的菌株对氨氮降解的最适培养温度，实验思路是：____________________________________________________________________________________________。
【答案】筛选出能降解并耐受高氨氮的菌株 稀释涂布平板法 稀释 测量上清液中氨氮的残余量 ①氨氮降解率达到一定值后则不再随培养时间的延长而增加，②培养4小时后，该菌株的氨氮降解率即可达到50%，培养14小时后，降解率可以达到90%。 设置一系列的温度梯度，其他条件相同且适宜，将分离纯化出的菌株和氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）分组编号，在各温度下分别保温，将相同温度条件下的菌株接种到培养基中，继续保温24小时，测定各组的降解菌的氨氮降解率。
【分析】
1、纯化微生物的方法：（1）通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
2、图是某菌株的氨氮降解率曲线图，据图可知，实验最初4小时，随着培养时间增加，氨氮降解率持续增加达到50%，在4~10小时，氨氮降解率略有增加几乎不变，10~14小时，氨氮降解率再次增加达到90%，14小时之后，氨氮降解率不再变化。
【详解】
（1）以（NH4）2SO4为唯一氮源的培养液属于选择培养基，只有能利用铵盐的微生物才能生存，且不断升高铵盐的浓度，故目的是筛选出能降解并耐受高氨氮的菌株。
（2）将培养后的菌液用稀释涂布平板法涂布到分离培养基中，倒置于30℃的恒温培养箱中，培养获得菌落。若平板中菌落过于密集，应进一步稀释，再涂布到分离培养基中，直到获得单菌落。
（3）将筛选分离后的各菌株分别接种到氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）中，在30℃的温度条件下摇瓶培养24小时后，取培养液进行离心10分钟，取其上清液，测量上清液中氨氮的残余量，进而计算出实验前后氨氮含量的减少量，从而计算出各个降解菌的氨氮降解率。
（4）图是某菌株的氨氮降解率曲线图，据图可知，实验最初4小时，随着培养时间增加，氨氮降解率持续增加达到50%，在4~10小时，氨氮降解率略有增加几乎不变，10~14小时，氨氮降解率再次增加达到90%，14小时之后，氨氮降解率不再变化，据此可知，①该菌降的氨氮降解率和培养时间并非线性关系，氨氮降解率达到一定值后则不再随培养时间的延长而增加，②培养4小时后，该菌株的氨氮降解率即可达到50%，培养14小时后，降解率可以达到90%。
（5）设置一系列的温度梯度，其他条件相同且适宜，将分离纯化出的菌株和氨氮含量为120 mg·L﹣1的液体筛选培养基（模拟高浓度氨氮水样）分组编号，在各温度下分别保温，将相同温度条件下的菌株接种到培养基中，继续保温24小时，测定各组的降解菌的氨氮降解率。
【点睛】
本题以筛选能降解氨氮的菌株为背景，考查微生物的培养、分离等相关知识，意在考查学生的实际应用能力和分析问题解决问题的能力。
50．营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。请回答下列问题：
（1）过程①的接种方法为___________。 从培养基成分分析，基本培养基与完全培养基存在差异的成分是_________________。
（2）进行②过程培养时，应先将丝绒布转印至基本培养基上，从____________培养基上获得相应的营养缺陷型菌株。
（3）统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致________，或培养时间太长导致_________________。
（4）为了进一步完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定，实验人员进行了如下操作：
①用接种针挑取__________（填“菌落A”或“菌落B”）接种于盛有完全培养液的离心管中，28 ℃振荡培养1~2天后，离心，取沉淀物用无菌水洗涤3次，并制成菌悬液。
②吸取1 mL菌悬液加入无菌培养皿中，倾注15 mL融化并冷却至50 ℃左右的基本培养基，待其冷凝后用记号笔在_______________（填“ 皿盖”或“皿底”）划分五个区域，标记A、B、C、D、E。
③在划分的五个区域上放入少量分组的氨基酸粉末（如下表所示） ，经培养后，观察生长圈出现的区域，从而确定属于何种氨基酸缺陷型。
组别
A
组氨酸
苏氨酸
谷氨酸
天冬氨酸
亮氨酸
B
精氨酸
苏氨酸
赖氨酸
甲硫氨酸
苯丙氨酸
C
酪氨酸
谷氨酸
赖氨酸
色氨酸
丙氨酸
D
甘氨酸
天冬氨酸
甲硫氨酸
色氨酸
丝氨酸
E
半胱氨酸
亮氨酸
苯丙氨酸
丙氨酸
丝氨酸
在上述鉴定实验中，发现在培养基A、D区域出现生长圈，说明该营养缺陷型菌株属于______。
【答案】稀释涂布平板法 氨基酸 完全 遗漏菌落的种类和数目 菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败菌落特征不易观察 菌落A 皿底 天冬氨酸缺陷型
【分析】
分析题图：图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用“影印法”将菌种接种到两种培养基中：基本培养基、完全培养基。在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长；而在完全培养基中能够生长，据此可以选择出氨基酸缺陷型菌株。
【详解】
（1）根据过程①所得培养基中菌落的分布结可以判断，该过程所采用的接种方法为稀释涂布平板法，图示为利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程，据此可知，与基本培养基（只含碳源、无机盐、水）相比，完全培养基中的特有的成分为氨基酸。
（2）为了防止将特定营养成分带入培养基，进行②过程培养时，应先将丝绒布转印至基本培养基上。在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全养基中能够生长，因此从完全培养基上可获得相应的营养缺陷型菌株。
（3）统计菌落种类和数量时要每隔2h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止因为培养时间不足遗漏菌落的种类和数目，或培养时间太长导致菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败菌落特征不易观察。
（4）①在基本培养基中，氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，因此图中菌落A应该为氨基酸缺陷型菌祩，则用接种针挑取菌落A接种于盛有完全培养液的离心管中，28℃振荡培养1～2天后，离心，取沉淀物用无菌水洗涤3次，并制成菌悬液；
②吸取1mL菌悬液加入无菌培养皿中，倾注15mL融化并冷却至45～50℃的基本培养基，待其冷凝后用记号笔在皿底划分五个区城，标记A、B、C、D、E；
③根据表中信息显示：A、D区城含有、其他区域不含有的氨基酸是天冬氨酸，而实验结果只有A、D区城出现生长图，说明该营养缺陷型菌株属于天冬氨酸缺陷型。
【点睛】
本题以图文结合的形式综合考查学生对微生物的实验室培养、微生物的分离与计数等相关知识的识记和理解能力，解答本题需熟记并理解相应的基础知识并形成清晰的知识网络。
51．丙烯腈（结构式为）是一种重要的化工原料，会对环境造成较大污染。丙烯腈水解酶产生菌能将丙烯腈转化为丙烯酸，在工业生产和环境治理上具有重要的作用。下图为实验室中筛选丙烯腈水解酶产生菌的过程。
（1）②号试管中微生物的种类少于①号，原因是②号试管中的培养基以______为唯一氮源，对微生物具有______作用。
（2）Ⅱ号培养基采用的接种方法是_______________，进行该操作的目的是__________。
（3）溴甲酚紫乙醇溶液是一种酸碱指示剂，变色范围为pH5.2（黄色）~6.8（紫色），可用于丙烯腈水解酶产生菌菌落的筛选。在Ⅰ号培养基中加入溴甲酚紫乙醇溶液，培养一段时间后，应挑选黄色透明圈直径______（填“大”或“小”）的菌落继绫培养。在培养过程中会形成黄色透明圈的原因是____________________。
（4）将Ⅱ号培养基中挑出的菌落继续接种至液体培养基中进行扩大化培养，此过程中需要将培养装置置于摇床上培养，目的是____________________。
【答案】丙烯腈 选择（筛选） 平板划线法 在平板上得到由单个细胞形成的菌落 大 培养过程中丙烯腈水解酶产生菌产生的丙烯腈水解酶将丙烯腈分解为丙酸，使菌落周围的pH降低，使溴甲酚紫乙醇溶液变黄 增加培养液中氧气含量，有利于营养物质的充分利用
【分析】
分析图示可知，①②两个试管属于富集培养，I 号培养基为稀释涂布平板法接种，Ⅱ号培养基为平板划线法接种。
【详解】
（1）②号试管中微生物的种类少于①号，说明②号试管为选择培养基，丙烯腈水解酶产生菌能将丙烯腈转化为丙烯酸，所以②号试管中的培养基以丙烯腈为唯一氮源，不能以丙烯腈为氮源的微生物不能在此培养液中生长，故对微生物具有选择作用。
（2）据图可知，Ⅱ号培养基采用的接种方法是平板划线法，目的是在平板上得到由单个细胞形成的菌落。
（3）溴甲酚紫乙醇溶液是一种酸碱指示剂，变色范围为pH5.2（黄色）~6.8（紫色），可用于丙烯腈水解酶产生菌菌落的筛选。由于丙烯腈水解酶产生菌能将丙烯腈转化为丙烯酸，使菌落周围的pH降低，使溴甲酚紫乙醇溶液变黄，故在Ⅰ号培养基中加入溴甲酚紫乙醇溶液，培养一段时间后，应挑选黄色透明圈直径大的菌落继绫培养。
（4）将培养装置置于摇床上培养，目的是增加培养液中氧气含量，有利于营养物质的充分利用。
【点睛】
本题考查微生物的分离和培养，意在考查考生对所学知识的应用能力。
52．PET全称为“聚对苯二甲酸乙二酯”，是以石油为原料制造的常见化工材料，广泛用于生产食品容器和电子产品，而PET塑料制品废弃后在自然界中极难降解，成为塑料“白色污染”的主要来源。为筛选出能高效分解PET塑料的微生物，某团队进行相关实验，回答下列问题：
（1）硏究人员在垃圾填埋场的PET塑料瓶残骸寻找目的菌株的原因是_____。
（2）在筛选所需微生物时，以PET颗粒和薄膜为唯一碳源的培养基进行培养，其中PET可以为微生物的生存提供_____和_____（从细胞呼吸意义的角度考虑）。对配制好的培养基用_____法进行灭菌，而对接种环用_____法灭菌。待长出菌落后，直接挑取菌落采用_____（接种方法）将菌落接种至PET颗粒（2g·L-1）无机盐固体培养基和无PET颗粒的无机盐培养基，最终筛选纯化得到能够对PET塑料具有降解作用的菌株。将菌落接种至无PET颗粒的无机盐培养基的目的是_____。
（3）已知含有PET颗粒的培养基具有不透明的特点，微生物将PET颗粒分解后，培养基呈现出透明圈。据图判断，应该选择_____（填“A”、“B”、“C”、“D”、“E”）为选择的菌种，判断的理由是_____。
【答案】该环境下淘汰了绝大多数微生物，而能高效分解PET塑料的细菌含量较高 生命活动所需的能量 合成其他有机物所需的原料 高压蒸汽 灼烧 平板划线法 作为（阴性）对照（，排除为自养型微生物） E 透明圈直径与菌落直径的比值与微生物对PEP的分解能力成正相关，而菌落E的两者比值最大
【分析】
１、微生物的接种方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线的操作是将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红，然后在在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞，将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液，将试管口通过火焰，塞上棉塞。
２、分析题意，PET为含碳有机物，可为微生物的生存提供碳源；PEP降解后形成的透明圈越大，说明被降解的越多，菌落面积的大小，说明微生物数目的多少。
【详解】
（1）在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，因此研究人员在垃圾填埋场的PET塑料瓶残骸寻找目的菌株的原因是该环境下淘汰了绝大多数微生物，而PET细菌含量较高。
（2）以PET颗粒和薄膜为唯一碳源的培养基进行培养，其中PET可以为微生物的生存提供生命活动提供能量和为其他有机物的合成提供原料。对培养基进行灭菌时，多采取高压蒸汽灭菌法，而对接种环用灼烧灭菌。待长出菌落后，采用平板划线法（该方法简单）将菌落接种至PET颗粒（2g·L-1）无机盐固体培养基和无PET颗粒的无机盐培养基，最终筛选纯化得到能够对PET塑料具有降解作用的菌株。将菌落接种至无PET颗粒的无机盐培养基的目的是作为阴性对照，排除为自养型微生物。
（3）透明圈是由于PEP降解后形成的，透明圈越大，说明被降解的越多，菌落面积的大小，说明微生物数目的多少，因此透明圈直径与菌落直径的比值与微生物对PEP的分解能力成正相关，应选择菌落E作为菌种。
【点睛】
本题以塑料分解菌的筛选为情境，考查的必备知识是微生物的培养、筛选；考查的关键能力是实验探究能力。
53．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。请分析回答下列问题：
（1）培养基中加入化合物A的目的是筛选________，这种培养基属于________培养基。
（2）转为固体培养基时，常采用________和稀释涂布平板法进行接种，在前一种方法接种过程中所用的接种工具是________，这种工具在操作时采用的灭菌方法是________。
（3）某同学计划统计污水池中目的菌的总数，他选用104、105、106稀释液进行涂布平板，每种稀释液都设置3个重复组，各吸取0．1 mL稀释液涂布平板，在适宜条件下培养一段时间后，对平板的菌落数进行统计，结果如下：
稀释度/倍
104
105
106
平板
1
2
3
1
2
3
1
2
3
平板菌落数/个
432
421
445
78
67
74
9
6
8
为了保证结果准确，应选择上述稀释________倍的平板菌落数作为统计结果，计算出每毫升样品中目的菌菌株数为______个。
（4）测定微生物的数量常采用_______法，其统计的数值往往比实际数目低，原因是_________________。
【答案】目的菌 选择 平板划线法 接种环 灼烧灭菌 105 7．3×107 稀释涂布平板 两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落
【分析】
1、培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。
2、微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】
（1）由题干信息可知，本实验的目的是筛选到能高效降解化合物A的细菌，故该培养基中加入化合物A的目的是为分解化合物A的微生物（目的菌）提供碳源和氮源，分离出能分解化合物A的微生物，不能分解化合物A的微生物不能在此培养基上生长，所以该培养基为选择培养基。
（2）转为固体培养基时，常采用平板划线法和稀释涂布平板法进行接种，平板划线法接种过程中所用的接种工具是接种环，接种环需要灼烧灭菌。
（3）菌体计数时需要选择菌落数在30～300之间的稀释倍数，根据表格数据可知，应选择上述稀释105倍的平板菌落数作为统计结果，每毫升样品中目的菌菌株数为（78+67+74）÷3÷0．1×105=7．3×107个。
（4）测定微生物的数量常采用稀释涂布平板法，由于平板上两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落，故用该方法统计的数值往往比实际数目低。
【点睛】
本题考查微生物的培养与计数的相关知识，意在考查考生微生物培养与选择的实验，包括理解实验目的、原理、方法和操作步骤，掌握相关的操作技能，并能将这些实验涉及的方法和技能进行综合运用的能力。
54．大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌，回答下列问题：
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即_________。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以_________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于_________培养基。
（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是_________。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是_________。
（3）纤维素分解菌的筛选用的是_________染色法。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_________，理由是_________。
菌株
秸秆总重（g）
秸秆残重（g）
秸秆失重（%）
纤维素降解率（%）
A
2．00
1．51
24．50
16．14
B
2．00
1．53
23．50
14．92
C
2．00
1．42
29．00
23．32
【答案】C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 纤维素 选择 为杀死培养基中所有的微生物（杀死微生物、芽孢、孢子） 不接种培养（或空白培养） 刚果红 C 接种C菌株后，秸秆失重最大，纤维素的降解率也最大
【分析】
分解纤维素的微生物分离的实验原理：（1）土壤中存在着大量纤维素分解酶，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖被微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。（2）在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
【详解】
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养；培养基从功能上分类可分为选择培养基和鉴别培养基，故该培养基从功能上分类属于选择培养基。
（2）配制的培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌，即将培养基置于压力100kPa、温度121℃条件下维持15～30分钟，目的是为了杀死培养基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。为检测灭菌效果可对培养基进行空白培养，即将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。
（3）刚果红可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌，所以纤维素分解菌的筛选用的是刚果红染色法。
（4）测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
【点睛】
本题考查微生物的实验室培养，要求考生识记培养基的种类及功能；掌握纤维素分解分离和鉴别的原理，能结合所学的知识准确答题。
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