高中生物高考第35讲　基因工程

这是一份高中生物高考第35讲　基因工程，共44页。
第35讲　基因工程
内容比较——知考向
核心素养——提考能
内容要求
1.概述基因工程的诞生
2.阐明基因工程的原理及技术(含PCR技术)
3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的应用
4.概述蛋白质工程的原理及应用
5.活动：DNA的粗提取与鉴定
6.活动：利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验
生命观念
基因结构决定其功能；掌握目的基因的筛选与获取方法；理解蛋白质工程的原理
科学思维
建立基因工程的操作流程模型，掌握目的基因的检测与鉴定方法
科学探究
探究基因工程在生产上的应用和蛋白质工程的应用，掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法
社会责任
基因工程和蛋白质工程在生产实践上的应用
与旧教
材对比
增：①DNA的粗提取与鉴定；②DNA片段的扩增及电泳鉴定；③基因工程在食品工业中的应用。
删：①基因文库的构建；②基因枪法；③基因治疗。
改：①PCR技术内容更充实；②DNA重组技术改为重组DNA技术；③限制性核酸内切酶改为限制性内切核酸酶。
淡化：①从基因文库中获取目的基因精减为一句话；②农杆菌转化法变为资料卡。
考点一　重组DNA技术的基本工具

1.基因工程的概念　原理是基因重组
(1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(3)水平：分子水平。
与杂交育种相比与诱变育种相比
(4)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2.基因工程的基本工具　3种工具，其中有2种工具酶
(1)限制性内切核酸酶　限制酶是一类酶，而不是一种酶

提醒　①限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列。
②判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180 °，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。
③限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。
④在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶

(3)载体

提醒　与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

(1)DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来(×)
(2)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(3)限制酶也可以识别和切割RNA(×)
(4)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(√)
(5)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)
(6)外源DNA必在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(×)

1.DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

提示　不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
2.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

提示　细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
3.天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？

提示　不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

1.基因工程的理论基础

2.限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。

(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
3.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：

4.与DNA有关的几种酶的比较


考向1　结合基因工程所需工具酶，考查科学实践中的探究能力
1.(2021·福建三明质检)限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓TTAAG—和—G↓AATTC—。如下图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)


答案　A
解析　用限制酶MunⅠ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体，A正确；质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体，B错误；C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后，标记基因会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体，C、D两项错误。
2.(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　，不能表达的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有　　　　　　　　和　　　　　　　　，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________________________________________________________________________。
答案　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶
解析　(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
考向2　结合载体的作用及特点，考查科学思维的能力
3.(2020·南昌高三一模节选)质粒A和质粒B各自有一个限制酶EcoR Ⅰ和限制酶BamH Ⅰ的识别位点，两种酶切割DNA产生的黏性末端不同。限制酶EcoR Ⅰ剪切位置旁边的数字表示其与限制酶BamH Ⅰ剪切部位之间的碱基对数(bp)。在含有质粒A和B的混合溶液中加入限制酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，令其反应充分；然后，向剪切产物中加入DNA连接酶进行反应，再将其产物导入大肠杆菌中。(实验中不考虑无ori的质粒、拥有两个或两个以上ori的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌、三个或三个以上DNA片段发生连接)请回答下列问题：

ori：质粒复制原点；tet：四环素抗性基因；amp：氨苄青霉素抗性基因；gfp：基因产物在紫外线照射下可发出绿色荧光；lac：基因控制合成的半乳糖苷酶可以水解乳糖
(1)只拥有质粒A的大肠杆菌　　　　(填“可以”或“不可以”)在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳元素来源的培养基中生存。说明理由：_____________________________________
________________________________________________________________________。
(2)DNA连接酶进行反应后，存在　　　　种大小不同的质粒，有　　　　种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存。
(3)绿色荧光蛋白基因是标记基因的一种，标记基因的功能是　　　　　　　　。
答案　(1)可以　质粒A含有氨苄青霉素抗性基因，使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素的培养基中生存，还含有半乳糖苷酶基因，使大肠杆菌合成半乳糖苷酶，并水解乳糖获得能量和碳源　(2)4　2　(3)供重组DNA的选择和鉴定
解析　由题图可知，质粒A含有氨苄青霉素抗性基因和半乳糖苷酶基因，用EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切后，形成2 000 bp(含amp)和1 000 bp(含lac)两段；质粒B含氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因和绿色荧光蛋白基因，用EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切后，形成3 000 bp(含amp、gfp)和2 500 bp(含tet)两段。由题干“两种酶切割DNA产生的黏性末端不同”可知，酶切后质粒自身两端不能连接。DNA连接酶进行反应后，由于实验中不考虑无ori的质粒、拥有两个或两个以上ori的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌及三个或三个以上DNA片段发生连接，因此可存在4种大小不同的质粒，即：①质粒A两个片段连接3 000 bp(2 000 bp＋1 000 bp)、②质粒A含ori的片段和质粒B不含ori的片段连接4 500 bp(2 000 bp＋2 500 bp)、③质粒A不含ori的片段和质粒B含ori的片段连接4 000 bp(1 000 bp＋3 000 bp)、④质粒B两个片段连接5 500 bp(3 000 bp＋2 500 bp)。有2种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存，即①③。
考点二　基因工程的基本操作程序

1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA半保留复制
②条件：
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用高温代替)
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
耐高温的DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
缓冲液
维持反应体系pH稳定
③过程：PCR过程包括变性、复性和延伸三步

结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)
提醒　①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成

提醒　启动子≠起始密码子　终止子≠终止密码子
①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。
②起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
(3)构建过程


3.将目的基因导入受体细胞
只有该步骤没涉及到碱基互补配对现象　


提醒　①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
②导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能集合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定


(1)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(√)
(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)
(3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)
(4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(√)
(5)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达(×)

1.PCR可以扩增mRNA吗？

提示　不可以，因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
2.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
选择性必修3 P83“到社会中去”拓展
提示　有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
3.为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？

提示　游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
4.你知道新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理吗？

提示　新型冠状病毒核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒的医疗检测用品，它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链式反应(RT－PCR)，通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染)，反之表明样本中没有病毒(未感染)。

1.PCR技术的过程

关于引物：
①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端；
②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
2.PCR技术和DNA复制的比较

3.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
(2)目的基因的获取方法
①利用PCR获取和扩增目的基因。
②人工合成目的基因
a.反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：

b．化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：

③从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA，以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。

考向1　结合PCR技术的应用，考查科学思维能力
1．（2021·北京东城区期末）PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。下图为PCR技术原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是(　　)

A.物质a：游离的脱氧核苷酸
B.过程①：氢键断裂
C.过程②：边解旋边复制
D.过程③：遵循碱基互补配对原则
答案　C
解析　PCR模拟了体内的DNA复制，所以a是DNA复制的原料——脱氧核苷酸，A正确；在94 ℃高温条件下，DNA分子双螺旋解开，形成单链，此时氢键断裂，B正确；体外模拟DNA的复制依据了DNA的热变性原理，该过程DNA分子不是边解旋边复制，C错误；DNA复制需要遵循碱基互补配对原则，D正确。
2.(2019·全国卷Ⅰ，38节选)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是　　　　。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是　　　　。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的　　　　。
(2)目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)解旋酶　加热至90 ℃以上　氢键
(2)耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析　(1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对中的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90 ℃以上，所以使用耐高温的DNA聚合酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
3.(2020·江苏卷，33改编)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：

请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种　　　　酶，它通过识别特定的　　　　切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成　　　　；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得　　　　；耐高温的DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　　(从引物①②③④中选择，填编号)。

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列

PCR
引物
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是　　　　。
A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′
B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′
C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′
D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，耐高温的DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT－，3′端序列应为－TTAA，B正确。
　获取目的基因方法的选择
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。
(3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过PCR技术扩增目的基因。
考向2　结合基因工程的操作程序，考查科学实践能力
4.(2018·全国卷Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的　　　　方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与　　　　组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的
噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是　　　　。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用　　　　的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加　　　　的抑制剂。
答案　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
解析　(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态细胞。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。
5.(2021·中原名校联盟)某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：

(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是　　　　；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为　　　　。该方法中农杆菌的作用是
________________________________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？　　　　(填“是”或“否”)。为什么？______________________________________________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。

答案　(1)Ti质粒　T­DNA　感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率
(3)否　含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)

　如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定

1.DNA的粗提取与鉴定
(1)原理

(2)方法步骤

提醒　①提取植物细胞的DNA时，加入的研磨液成分中含有洗涤剂和食盐(NaCl)，洗涤剂能瓦解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐的目的是溶解DNA。
②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
③本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
④鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加；加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)原理
①PCR原理：DNA热变性原理。

②电泳

(2)方法步骤
①PCR扩增

②鉴定PCR产物—琼脂糖凝胶电泳法—配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
提醒　①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

1.DNA的粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？
选择性必修3 P74“探究·实践”选择性必修3 P74“探究·实践”
提示　不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
2.DNA片段电泳鉴定的原理是什么？
选择性必修3 P84“探究·实践”
提示　DNA分子带负电，在电场力的驱动下，从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中蠕动；核酸染料带正电，在电场力的驱动下，从正极向负极运动，遇到DNA就嵌入其中完成染色，但这个颜色可见光下看不到，需要紫外光激发。
3.DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？
选择性必修3 P84“探究·实践”
提示　电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。
4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
选择性必修3 P85“探究·实践”
提示　多条条带。不止一条条带的原因：操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或还有其他DNA片段，以此为模板，进行了扩增。

考向1　结合DNA的粗提取，考查科学探究能力
1.(2020·江苏卷，17)生物学实验常呈现“五颜六色”的变化。下列实验中溶液颜色变化的叙述正确的是(　　)
A.在新鲜的梨汁中加入斐林试剂，混匀后在加热条件下由无色变成砖红色
B.在厌氧发酵的果汁中加入酸性重铬酸钾溶液，混匀后由蓝色变成灰绿色
C.在DNA溶液中加入二苯胺试剂，混匀后在沸水浴条件下逐渐变成蓝色
D.在氨基酸溶液中加入双缩脲试剂，混匀后逐渐变成紫色
答案　C
解析　斐林试剂为蓝色，在新鲜的梨汁中加入斐林试剂，混匀后在加热条件下由蓝色变成砖红色，A错误；厌氧发酵时果汁中有酒精生成，在厌氧发酵的果汁中加入酸性重铬酸钾溶液，混匀后由橙色变成灰绿色，B错误；在DNA溶液中加入二苯胺试剂，混匀后在沸水浴条件下逐渐变成蓝色，C正确；蛋白质和多肽中含有肽键，与双缩脲试剂可发生作用，产生紫色反应，但氨基酸中不含有肽键，不能与双缩脲试剂发生紫色反应，D错误。
2.(2021·贵州遵义联考)下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述正确的是(　　)

A.图1中溶液a是物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
B.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
答案　B
解析　图1中溶液a是NaCl溶液，其目的是溶解DNA，DNA在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，A错误；图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，C错误；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺出现蓝色，D错误。
考向2　围绕PCR技术，考查社会责任
3.(2021·天津南开中学期中)下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是(　　)
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案　C
解析　为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，A正确；PCR利用了DNA的热变性原理，B正确；缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，C错误；在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以免其他成分的污染，D正确。
4.(2020·北京海淀区二模)在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，不正确的是(　　)

A.该载体最可能为环状DNA分子
B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
答案　D
解析　当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
考点四　基因工程的应用及蛋白质工程

1.基因工程的应用
(1)食品工业方面
生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如，利用转基因技术大量生产凝乳酶

(2)医药卫生领域
①器官移植：用转基因动物作器官移植的供体，例如抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
②乳腺生物反应器：让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。

提醒　乳腺生物反应器与膀胱生物反应器
①乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，二者的优点是：产量高、质量好、成本低、易提取，且不必对动物造成伤害。
②乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。

2.蛋白质工程　第二代基因工程，可生产自然界中不存在的蛋白质
(1)概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)操作手段和结果

(3)基本思路
→→→
找到并改变相对应的脱氧核苷
酸序列(基因)或合成新的基因→

3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系


(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(√)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(√)
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(×)

1.基因工程培育的抗虫、抗病作物有哪些优点？

提示　减少环境污染，降低生产成本。
2.蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？

提示　①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。

1.(2021·河北定州期中)乙烯生物合成酶基因可以控制乙烯的合成，科学家将该基因的反义基因导入番茄细胞内，培育转基因延熟番茄，延长其储藏期。反义基因的作用机制如下图所示，下列说法错误的是(　　)

A.有意义mRNA和反义mRNA是通过相应基因转录而来的
B.乙烯生物合成酶基因的模板链的序列与反义基因的是互补的
C.乙烯是乙烯生物合成酶基因的表达产物，可促进果实成熟
D.因为mRNA形成双链后无法进行翻译，所以无乙烯生物合成酶生成
答案　C
解析　由题图可以看出，有意义mRNA和反义mRNA是通过相应基因转录而来的，A正确；反义mRNA能够与有意义mRNA进行杂交形成双链，并且有意义mRNA和反义mRNA是通过相应基因转录而来的，所以乙烯生物合成酶基因的模板链的序列与反义基因的模板链的序列是互补的，B正确；乙烯生物合成酶基因的表达产物可以控制乙烯的合成，乙烯不是其表达产物，C错误；翻译过程是以mRNA为模板合成蛋白质的过程，题图中两种mRNA杂交在一起进而阻断了乙烯生物合成酶基因的有意义mRNA的翻译过程，D正确。
2.(2021·安徽亳州联考)下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是(　　)

A.a、b过程分别是转录、翻译
B.蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
C.蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
D.蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
答案　C
解析　a过程是以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程，b过程是以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的多肽链的翻译过程，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作，B、D正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，C错误。
3.(2021·湖北华中师大一附中期中)中国T2DM(胰岛β细胞功能衰退型糖尿病)的发病率由1979年的1.00%上升到2019年的4.37%，补充胰岛素是控制和缓解病情的重要途径。胰岛素(由α、β两条多肽链组成)的生产由提取动物胰岛素发展到了利用基因工程生产重组人胰岛素。
(1)构建重组质粒时(如图所示)，为避免目的基因任意连接和载体的自身环化，应选用　　　　酶切处理目的基因和载体。构建完成的表达载体除了目的基因、标记基因以外，还必须有　　　　　　　　等调控组件。

(2)利用大肠杆菌生产重组人胰岛素时，构建表达载体的目的基因应从　　　　文库中获取，重组大肠杆菌合成的人胰岛素原没有活性，需用　　　　酶将其加工成含α、β两条多肽链的胰岛素。
(3)利用奶牛设计乳腺生物反应器生产人胰岛素，为使人胰岛素基因在奶牛乳腺中特异表达，构建表达载体时应将目的基因与　　　　　　　　的启动子等调控组件重组在一起，并选用　　　　为受体细胞。
(4)重组人胰岛素分子容易发生聚合而影响作用效果，可将胰岛素分子的氨基酸序列及结构进行局部调整，形成胰岛素类似物加以避免。请根据上述设想，补充完善其基本研发流程：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质的空间结构→推测氨基酸序列→　　　　　　　　　　　　→构建表达载体，转基因获得胰岛素类似物。
答案　(1)SmaⅠ、PstⅠ　启动子、终止子、复制原点
(2)cDNA　蛋白　(3)奶牛乳腺蛋白基因　受精卵　(4)找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)
解析　(1)外源DNA分子中含有限制酶SmaⅠ、PstⅠ、AluⅠ的识别序列和切割位点，其中限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用该酶进行切割；若只用PstⅠ切割会导致目的基因和载体自身环化或反向连接，因此构建重组质粒时，应选用限制酶SmaⅠ、PstⅠ处理目的基因和载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。(2)将真核基因导入原核生物时，一般从cDNA文库中获取目的基因；重组大肠杆菌合成的人胰岛素原没有活性，需用蛋白酶将其加工成含α、β两条多肽链的胰岛素。(3)利用奶牛设计乳腺生物反应器生产人胰岛素，为使人胰岛素基因在奶牛乳腺中特异表达，构建表达载体时应将目的基因与奶牛乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，并选用受精卵为受体细胞。(4)题述设想需要采用蛋白质工程技术，因此基本研发流程：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质的空间结构→推测氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→构建表达载体，转基因获得胰岛素类似物。
4.(2020·山西太原一模)Ⅰ.转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如图所示(①至④代表过程，A至C代表结构或细胞)。请据图回答：

(1)图中①过程用到的酶是　　　　，所形成的B叫　　　　　　　　。
(2)②过程常用　　　　处理农杆菌，使之成为　　　　细胞，以利于完成转化过程。
(3)图中③过程需要用到的激素有　。
Ⅱ.黄瓜花叶病毒(CMV)是能侵染多种植物的RNA病毒，可危害番茄的正常生长并造成减产，研究人员通过农杆菌介导将该病毒外壳蛋白的cDNA导入番茄植株，成功获得抗CMV的番茄植株。
(1)获得CMV的RNA后，需在　　　　的催化下才能合成CMV外壳蛋白的cDNA。
(2)获得cDNA后，需先通过一定方法将其插入农杆菌的　　　　　　　　片段中，然后将番茄子叶切段与该农杆菌共同培养，以实现番茄细胞的转化。
(3)将共同培养后的番茄外植体接种在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上培养一段时间，只有部分外植体生出愈伤组织。研究人员据此确定这些生出愈伤组织的外植体都已成功导入了cDNA，你认为他们作出以上判断的理由是________________________________________。
(4)要想确定转基因番茄已经成功表达出CMV外壳蛋白，需要进行　　　　　　　　实验。
(5)若要验证转基因番茄具有较好的抗CMV能力，请写出实验设计思路：　
_______________________________________。
转基因番茄自交，子代中抗性植株与敏感植株数量之比接近3∶1，由此可以得出的结论是_______________________________________(答出两点)。
答案　Ⅰ.(1)DNA连接酶　基因表达载体(或重组质粒)　(2)CaCl2溶液(或Ca2＋)　感受态　(3)生长素和细胞分裂素
Ⅱ.(1)逆转录酶　(2)Ti质粒的T－DNA　(3)重组表达载体同时含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功导入了重组质粒的外植体才能在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上生出愈伤组织　(4)抗原—抗体杂交　(5)用CMV分别感染转基因番茄与未转基因的番茄，一段时间后观察结果，分析两组番茄的抗性　目的基因已经整合到受体细胞的染色体上、获得的转基因亲本为杂合子
解析　Ⅰ.(1)①表示基因表达载体的构建过程，需用DNA连接酶将目的基因和运载体(质粒)连接形成重组质粒。B是基因表达载体，由启动子、终止子、目的基因和标记基因等部分构成。(2)②过程表示将目的基因导入微生物细胞，常用CaCl2溶液或Ca2＋处理微生物细胞(农杆菌)，使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞，以利于重组质粒进入微生物细胞(农杆菌)，完成转化过程。(3)图中③过程为脱分化，需要用到的激素有生长素和细胞分裂素。
Ⅱ.(1)以RNA为模板合成DNA的过程称为逆转录，该过程需要逆转录酶的催化。(2)农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此获得cDNA后，需先通过一定方法将其插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段中，然后将番茄子叶切段与该农杆菌共同培养，以实现番茄细胞的转化。(3)重组表达载体同时含有卡那霉素抗性基因和青霉素抗性基因，只有成功导入了重组质粒的外植体才能在含有卡那霉素和青霉素的选择培养基上生出愈伤组织，据此可知生出愈伤组织的外植体都已成功导入了cDNA。(4)检测目的基因是否表达产生相应的蛋白质，需要进行抗原—抗体杂交实验。(5)若要验证转基因番茄具有较好的抗CMV能力，可用CMV分别感染转基因番茄与未转基因的番茄，一段时间后观察结果，分析两组番茄的抗性。转基因番茄自交，子代中抗性植株与敏感植株数量之比接近3∶1，符合基因分离定律，由此可以得出的结论是目的基因已经整合到受体细胞的染色体上、获得的转基因亲本为杂合子。
重温真题　经典再现
1.(2018·高考北京卷，5改编)用Xho I和Sal I两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(　　)

A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用Sal I处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案　D
解析　不同的限制酶识别核苷酸的序列不同，A正确；限制酶切割的产物可用于构建重组DNA，B正确；泳道①显示四个条带，是Sal Ⅰ处理后的酶切产物的电泳结果，泳道②显示三个条带，是Xho Ⅰ处理后的酶切产物的电泳结果，C正确；限制酶的作用特点是识别特定DNA序列，并在DNA两条链特定部位切割产生黏性末端或平末端，D错误。
2.(2020·全国卷Ⅲ，38改编)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。

回答下列问题：
(1)步骤①中需要使用的工具酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　　。步骤②和③所代表的操作分别是　　　　和　　　　。步骤④称为　　　　。
(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的　　　　　　(答出2点即可)的限制。
(3)一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息　　　　(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________
________________________________________________________________________。
(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。
答案　(1)限制性内切核酸酶、DNA连接酶　显微注射　体外培养　胚胎移植　(2)性别、年龄　(3)相同　两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵
(4)体外受精、胚胎移植
解析　(1)步骤①是基因表达载体的构建过程，该过程需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶，用限制酶分别切割载体和目的基因，用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。步骤②和③所代表的操作分别是显微注射和体外培养。步骤④是将早期胚胎植入到代孕母体内，称为胚胎移植。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的性别和年龄的限制。(3)乳腺上皮细胞和膀胱上皮细胞都是体细胞。一般来说，在同一动物个体中，其体细胞都是由同一个受精卵分裂、分化而来的，细胞在分裂、分化过程中，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息一般是不变的，因此两种上皮细胞的染色体DNA所含的遗传信息相同。(4)据题述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技术有体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植等。
3.(2019·海南卷，31)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取　　　　作为模板，在　　　　催化下合成cDNA，再利用　　　　技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的　　　　中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_____________________________________________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)mRNA　逆转录酶　PCR　(2)T－DNA　整合到叶肉细胞染色体DNA上　(3)找到第6位氨基酸甲对应的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲对应的碱基替换为氨基酸乙的碱基
解析　(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)农杆菌转化法中，T－DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T－DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸甲对应的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲对应的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
课后·分层训练
(时间：35分钟)

1.(2021·山东枣庄测试)下列关于基因工程基本工具的描述，错误的是(　　)
A.只有用相同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒
B.不同的核苷酸序列被不同的限制酶识别也有可能切出相同的黏性末端
C.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
D.限制酶、DNA连接酶都是工具酶
答案　A
解析　用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，进而形成重组质粒，A错误，B正确；限制酶识别的序列越短，如序列CG//GC，在DNA中出现的概率就越大，C正确；重组DNA技术的基本工具有限制酶、DNA连接酶和载体，其中限制酶、DNA连接酶是工具酶，D正确。
2.(2021·合肥一六八中学测试)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断的以下说法中，正确的是(　　)
限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamH Ⅰ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcoRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅢ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列
B.限制酶切割后一定形成黏性末端
C.不同的限制酶可以切出相同的黏性末端
D.限制酶的切割位点都在识别序列内部
答案　C
解析　HindⅢ既能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，A错误；限制酶切割后可能形成黏性末端，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、Sau3AⅠ，也可能形成平末端，如HindⅢ、SmaⅠ，B错误；不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C正确；限制酶的切割位点可能在序列内部，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅢ、SmaⅠ，也可能在序列外部，如Sau3AⅠ，D错误。
3.(2021·天津南开中学联考)下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是(　　)

A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B.基因表达载体的构建并不一定相同
C.图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案　C
解析　由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
4.(2021·北京中央民族大学附中期末)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　)

A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
答案　A
解析　⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到棉花细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。
5.(2021·山东枣庄测试)以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是(　　)

A.催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
B.催化①过程的酶是RNA聚合酶
C.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
答案　C
解析　题图中②⑤过程均为DNA的复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75 ℃，因此催化该过程的DNA聚合酶要能耐高温，但催化②过程的酶不需要耐高温，A错误；①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，B错误；④为复性过程，该过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，C正确；DNA分子中不含碱基U，D错误。
6.(2021·北京海淀区期中)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如下图所示。据此作出的分析，不合理的是(　　)

A.PCR产物的分子大小为250～500 bp
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
答案　B
解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对实验结果的干扰，D正确。

7.(2020·山东潍坊模拟)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质的主要原因是(　　)
A.缺乏改造蛋白质所必需的工具酶
B.蛋白质中氨基酸的排列顺序千变万化，操作难度大
C.人类对大多数蛋白质的高级结构知之甚少
D.改造基因易于操作且改造后能够遗传
答案　D
解析　蛋白质工程应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造，原因是：(1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过后的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。
8.(2020·海南学业水平选择性考试，10)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A.羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B.提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D.在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
答案　A
解析　羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误；提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确；预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据蛋白质易溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确；在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，D正确。
9.(2021·江苏扬州中学期中)PCR技术是把某一DNA片段在酶的作用下，在体外合成许多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段；电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质进行亲子鉴定。下图是电泳装置及相应电泳结果。

(1)电泳和叶绿体色素分离采用的纸层析法比较，后者使用的介质是　　　　，叶绿体中的色素能够在滤纸条上彼此分离开的原因是_____________________________________
________________________________________________________________________。
(2)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是
________________________________________________________________________。
(3)图3是把含21个氨基酸的多肽进行水解，得到的氨基酸混合物进行电泳的结果，据图可推知该多肽由　　　　种氨基酸构成。(不同氨基酸电泳形成的条带不同)
(4)图4通过提取某小孩和其母亲以及待测定的四位男性的DNA，分别由酶处理后，生成含有若干DNA片段并进行扩增得到混合物，然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。请分析：F1～F4中，谁是该小孩真正生物学上的父亲？　　　　。为什么？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)层析液　各种色素随层析液在滤纸上的扩散速度不同　(2)DNA半保留复制　(3)6　(4)F2　该小孩有一半DNA与M相同，另一半与F2相同，故F2是小孩真正生物学上的父亲
解析　(1)纸层析法应用的是层析液。层析液能分离色素的原理是各种色素在层析液中的溶解度不同，随之在滤纸上的扩散速度不同。(2)PCR的原理是DNA半保留复制。(3)由题图可知出现了6种电泳条带，说明水解后形成了6种氨基酸，即该多肽应由6种氨基酸组成。(4)由题中的电泳图分析可知该小孩生物学上的父亲应是F2，因为从F1到F4中只有F2和该小孩有相同的DNA。
10.(2020·海南学业水平选择性考试，25)某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。

回答下列问题。
(1)通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是________________________________________________________________________
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(2)把桑葚胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY­PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计　　　　，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为　　　　；出现阴性反应者，胚胎为　　　　。
(3)若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是　　　　，检测的基本思路是________________________________________________________________________
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答案　(1)雄原核较大，更容易容纳外源DNA　(2)引物　雄性小鼠　雌性小鼠　(3)抗原—抗体杂交技术
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体(对抗体进行同位素标记)进行抗原—抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功
解析　(1)通常来自精子的雄原核较大，更容易容纳外源DNA，因此外源基因能够更容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
(2)目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY­PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因(即SRY基因)的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶(Taq酶)催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
(3)检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是抗原—抗体杂交技术。检测的基本思路如下：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体(对抗体进行同位素标记)进行抗原—抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已表达出蛋白质。
11.(2020·北京等级模考，17)淀粉酶在食品加工及轻工业生产中具有广泛用途。研究人员从细菌中克隆了一种淀粉酶基因，为了获得高产淀粉酶菌株，按下图所示流程进行基因工程操作。

(1)将淀粉酶基因与质粒载体重组时需要使用的酶包括
________________________________________________________________________。
(2)大肠杆菌经过　　　　　　处理后，可作为感受态细胞使用。
(3)为了初步筛选高产菌株，研究人员将得到的3个工程菌株接种到以淀粉为唯一碳源的培养基上，经过培养后用稀碘液处理，可观察到以菌落为中心的透明圈。测量不同菌株形成的菌落及透明圈直径，结果见下表。
工程菌
菌落直径(C，mm)
透明圈直径(H，mm)
H/C
菌株Ⅰ
8.1
13.0
1.6
菌株Ⅱ
5.1
11.2
2.2
菌株Ⅲ
9.5
17.1
1.8
①表中菌落直径(C)的大小反映了　　　　，透明圈直径(H)的大小反映了________________________________________________________________________。
②根据表中数据，可推断其中淀粉酶产量最高的菌株是
________________________________________________________________________。
(4)基因工程技术已成功应用于人类生产生活中的诸多方面。请从植物育种或人类疾病预防与治疗方面举一实例，并说明制备该转基因产品的基本技术流程。(限100字以内)　
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答案　(1)限制酶(限制性内切核酸酶)、DNA连接酶
(2)Ca2＋(或氯化钙)　(3)①细菌的增殖速度　细菌分解淀粉的能力　②菌株Ⅱ　(4)转基因抗虫棉花。从细菌中克隆Bt毒蛋白基因，构建重组载体，导入棉花细胞后进行组织培养。经对再生植株中目的基因的检测，获得转基因抗虫棉花。(或基因工程胰岛素。克隆人的胰岛素基因，构建重组载体，转入大肠杆菌后，检测目的基因，筛选高产菌株并进行培养，生产胰岛素。)
解析　(1)将淀粉酶基因与质粒载体重组构建基因表达载体需要用限制酶和DNA连接酶。(2)用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。(3)①菌落是由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，菌落直径的大小反映了细菌的增殖速度。工程菌株含有淀粉酶基因，能够产生淀粉酶，从而将菌落周围的淀粉水解而出现透明圈，因此透明圈直径的大小反映了细菌分解淀粉的能力。②分析表中数据，菌落直径越大说明该菌的增殖速度越快，即单位时间内产生的细菌数量越多，而透明圈直径越大说明细菌分解淀粉的能力越强，H/C的值越大，说明淀粉酶产量越高，图中菌株Ⅱ的该比值最大，故其淀粉酶产量最高。(4)基因工程技术可应用于植物育种方面，如培育转基因抗虫棉，即从细菌中克隆Bt毒蛋白基因，构建基因表达载体，导入棉花细胞，然后进行植物组织培养，最后对再生植株中的目的基因进行检测，获得转基因抗虫棉花。将基因工程技术应用于治疗人类疾病方面，如通过基因工程技术生产胰岛素，即克隆人的胰岛素基因，构建基因表达载体，转入大肠杆菌内，检测目的基因是否表达，筛选出高产胰岛素菌株进行培养，生产胰岛素。