2023届高考生物二轮复习基因工程学案（多项选择版）

这是一份2023届高考生物二轮复习基因工程学案（多项选择版），共16页。
考点3　基因工程  基因工程的操作对象是DNA分子，利用限制酶、DNA连接酶、载体等进行基因工程的操作，基因工程在农牧业、医药卫生、食品工业等方面有广泛的应用，在基因工程的基础上，崛起了第二代基因工程—蛋白质工程。 (对照课本回顾主干知识)  重要概念1　基因工程是一种重组DNA技术[例1]　(2020·北京等级考)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　)A．①＋③  B．①＋②C．③＋②  D．③＋④答案　B解析　PCR扩增时，由于子链延伸方向为5′端到3′端，因此应在模板DNA两条链的3′端分别设计一个引物，A错误；为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者扩增获得的DNA片段只要既包含外源高效启动子序列又包含HMA3基因的序列，便可在检测是否有HMA3基因的同时，又可排除内源HMA3基因的干扰，若用③＋②或③＋④引物组合进行PCR扩增，扩增获得的HMA3基因不包含外源高效启动子序列，C、D错误；若用①＋②或①＋④引物组合进行PCR扩增，获得的DNA片段符合要求，B正确。[例2]　(2022·北京海淀期末)乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，由乳酸脱氢酶催化产生，影响白酒品质和风格。科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L－PG)，可获得乳酸乙酯高产菌株，该过程如图所示。下列关于该过程的分析不合理的是(　　)A．转入的L－PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性B．可以利用PCR技术筛选含有L－PG基因的受体细胞C．通过同源重组实现酵母菌的PD基因被替换为L－PG基因D．标记基因Amp′可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株答案　D解析　酿酒酵母质粒上的PD基因替换为L－PG基因前后，标记基因Amp′均正常，故标记基因Amp′不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株。[例3]　(多选)下列关于生物工程中常见的叙述，正确的是(　　)A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNAB．限制性内切核酸酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子C．在进行基因工程操作中，天然质粒需经过人工改造后才能作为载体D．利用酶解法处理植物细胞获得原生质体，便于进行植物杂交育种答案　BC解析　DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端或平末端的磷酸二酯键黏合，形成重组DNA，A错误；限制性内切核酸酶将一个DNA分子片段切成两个片段，即断裂两个磷酸二酯键，因此需消耗两个水分子，B正确；在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，C正确；用酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物细胞融合，属于植物体细胞杂交技术，植物杂交育种一般是通过杂交的方式获得所需的子代，D错误。[例4]　(2021·全国乙卷改编)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中______________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________。答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯键(3)自我复制　一至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶连接，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)用T4 DNA连接酶连接。[例5]　(2021·广东选择考适应性测试)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，对该研究有突出贡献的科学家被授予2020年诺贝尔化学奖。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术，将人的亨廷顿舞蹈病致病基因(HTT基因)第1外显子(其中含150个CAG三核苷酸重复序列)“敲入”猪基因组内，获得了人—猪“镶嵌”HTT基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列问题：(1)PCR技术是获得人HTT基因常用的方法，制备PCR反应体系时，向缓冲溶液中分别加入人HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸及________________________________等，最后补足H2O。(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列，由此可见，Cas9在功能上属于________酶。与CRISPR/Cas9相比，限制酶的特性决定了其具有__________________________的局限性。(3)在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人—猪“镶嵌”HTT基因，常用的检测手段包括PCR技术及____________________。(4)含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂，数量不断增加，当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为________。贴满瓶壁的细胞常用________进行消化处理，以便进行传代培养。(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为________________。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内，最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。答案　(1)引物、耐高温的DNA聚合酶(2)水解　只能识别并切割特定核苷酸序列(3)DNA分子杂交技术(4)接触抑制　胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)(5)动物体细胞核移植解析　(2)第一个空为水解酶，原因为后面一个空：该酶与限制酶相比，限制酶具有某种局限性，则反证该酶不是限制酶，没该局限性，因此该空不应该填“限制酶”，应该是水解酶。[例6]　(2021·湖南适应性考试)p53基因是一种抑癌基因，在恶性肿瘤患者中突变率达50%以上。与人相比，大象体内含有多对p53基因，推测是其很少患肿瘤的主要原因。设计实验探究人p53基因在乳腺肿瘤细胞中的作用。回答下列问题：(1)利用PCR技术扩增p53基因。首先根据p53基因的核苷酸序列，设计并合成________，其能与变性p53基因单链结合，在________________催化作用下延伸，如此循环多次。(2)p53基因表达载体的构建。如图所示，表达载体上除了标注的DNA片段外，在p53基因上游还必须拥有的DNA片段(箭头所示)是________，其作用机理是____________________________。外源p53基因插入载体中至少需要两种工具酶，包括准确切割DNA的限制性内切核酸酶和将双链DNA片段“缝合”起来的________。(3)乳腺肿瘤细胞培养。完成伦理学审查和病人知情同意书签署后，将患者乳腺肿瘤组织块剪碎，制成细胞悬液在适宜的条件下培养。培养环境中所需的主要气体包括细胞代谢必需的________和维持培养液pH值的________。保持培养环境处于无菌无毒条件的操作包括________________________________(答出两点即可)。(4)检测p53基因表达对乳腺肿瘤细胞增殖的影响。分别将空载体和p53表达载体转入肿瘤细胞培养，采用特殊方法检测细胞增殖情况，并从培养的肿瘤细胞中提取蛋白质，用相应的________进行杂交，检测p53基因翻译成蛋白质的情况，探索杂交带强度与细胞增殖率相关性。答案　(1)引物　耐高温的DNA聚合酶(2)启动子　RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录　DNA连接酶(3)O2　CO2　对培养液和培养器具进行灭菌以及在无菌环境下进行操作，定期更换培养液等(4)抗体[例7]　(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是____________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是________。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________________。(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)，为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________ _______________________________________________________________。答案　(1)逆转录酶(反转录酶)(2)特异性核苷酸序列　复性(3)曾感染新冠病毒，已康复　已感染新冠病毒，是患者(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定[练]　培育转基因抗虫棉主要有四个步骤，请在每一个步骤各写出一个有联系的不重复的名词。答案　1.Bt蛋白基因、PCR、琼脂糖凝胶电泳等；2.启动子、基因表达载体、标记基因、重组DNA等；3.受体细胞、转化、花粉管通道法等；4.检测、鉴定、抗原—抗体杂交。重要概念2　蛋白质工程是基因工程的延伸[例8]　科学家为提高玉米中赖氨酸的含量，计划将天冬氨酸激酶第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬氨酸变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸含量分别提高5倍和2倍。此操作过程是(　　)A．直接改造上述两种蛋白质的空间结构B．直接改造上述两种酶相应的mRNAC．直接改造上述两种酶相应的基因D．重新合成新的基因答案　C重要概念3　生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全与伦理问题[例9]　CCR5是HIV入侵人体辅助性T细胞的主要辅助受体之一。有科学家为了使婴儿一出生就具有抵抗艾滋病的能力，通过基因编辑破坏了受精卵中的CCR5基因，该做法引起了民众普遍的担忧。下列各项不属于担忧依据的是(　　)A．CCR5基因可能还参与了其他生理过程的调控B．基因编辑技术有可能因编辑对象错误(脱靶)造成不可预知的后果C．被编辑个体受其他疾病感染的风险可能会提高D．该技术虽然符合人类伦理道德，但可能存在潜在的安全风险答案　D解析　该技术不符合人类伦理道德，D符合题意。[例10]　“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的精子和卵细胞取出，在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育到如图所示的时期，再将胚胎植入女性子宫内发育成胎儿，该技术使一部分不能生育的夫妇重新获得了生育的机会。下列叙述正确的是(　　)A．“试管婴儿”技术在生物学上所依据的原理是无性生殖B．如图所示时期是胚胎发育的囊胚期，①代表内细胞团，②代表囊胚腔，③代表滋养层C．“试管婴儿”的形成用到的技术有人工授精、体内培养、核移植D．“试管婴儿”技术诞生后，继而出现了“设计试管婴儿”技术，二者对人类的作用是相同的答案　B[例11]　(多选)下列关于生物武器及其使用的叙述，正确的是(　　)A．生物武器传播途径包括空气传播、食物传播、生活必需品传播等B．利用转基因技术制造的新型致病菌可能具有超强的传染性和致病性C．天花病毒能作为危害极强的生物武器是因为现在的年轻人对其无特异性免疫能力D．《禁止生物武器公约》中明确提出在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器答案　ABD解析　天花病毒能作为危害极强的生物武器是因为现在的年轻人从未接触过该病毒，可以让大批感染者突然发病，引起严重后果，而不是对其无特异性免疫能力。[练]　“基因编辑婴儿”事件被人们广泛关注，请谈谈你的看法。答案　不支持；违背伦理、违反法律。  例　(2020·山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了____________________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是____________________________。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(WxmRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经__________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是______________________________。(4)各品系WxmRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是__________________________________________________。第(4)题为分析原因类试题，为高考常考类型，这类题的解题方法是：首先理清题干、题图中已知条件与结果之间的逻辑关系，同时将所学的生物学的基本概念和原理与之联系，找到解决这类问题的知识载体。答案　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子(3)逆转录(或反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(4)品系3　品系3的WxmRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强解析　(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接。(2)启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之识别和结合，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中的编码区，编码区中不包括启动子序列，因此3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列不发生改变。[练1－1]　(2022·河南郑州模拟)为了研究低温诱导对某基因的启动子P活性的影响，科研人员进行了启动子P的PCR提取、特定表达载体的构建和转基因烟草的功能鉴定。该基因及其启动子P的结构及相应限制酶的切割位点如下图所示，图中灰色区域碱基序列是已知的，启动子P(图中黑色区域)及上游碱基序列未知，片段Ⅰ和片段Ⅱ中的字母A～F均表示引物。请回答下列问题。(1)不能直接根据片段Ⅰ扩增启动子P的原因是__________________________________________________。(2)为了能扩增正常启动子P，科研人员先用______________酶处理上图中的片段Ⅰ，使片段Ⅰ成为环状DNA；再将环状DNA用________(填“酶1”或“酶2”)处理得到了片段Ⅱ，如下图所示。根据片段Ⅱ能不能扩增出启动子P？若能，请写出可选用的引物组合(用C、D、E、F表示)，若不能请说明理由。____________________________________。(3)已知卡那霉素可抑制烟草细胞的生长，基因M可在烟草的根部正常表达，其表达产物可将X-Gluc水解生成蓝色物质。将启动子P和基因M结合并与含有卡那霉素抗性基因的Ti－质粒重组构建基因表达载体。将表达载体转入农杆菌，通过农杆菌的转化作用将启动子P和基因M导入烟草细胞，用含有__________________的培养基筛选出所需的烟草细胞，然后经过________获得转基因烟草植株。(4)将上述转基因烟草植株分为A、B两组，A组在常温(25 ℃，对照组)下培养，B组在低温(4 ℃，实验组)下培养，一段时间后取A、B的幼根，浸入适量________溶液中，观察烟草细胞中基因M的表达情况(表达强度越大，细胞表现的蓝色越深)。若A、B组的结果分别为__________________，则说明低温抑制启动子P的功能。答案　(1)启动子P及上游碱基序列未知，无法合成PCR所需要的引物(2)酶1和DNA连接　酶2　能，可选用的引物组合是D和E(3)卡那霉素和X-Gluc　组织培养(4)X-Gluc　A蓝色较深、B蓝色较浅解析　(2)图中的片段Ⅰ在启动子P的左右两端各有一个酶1的切割位点，酶1可切割片段Ⅰ的左右两端产生相同的末端，再用DNA连接酶连接可形成环状DNA；片段Ⅱ的首尾两端都有灰色区域，结合题图分析可知，片段Ⅱ是用酶2切割处理环状DNA产生的。子链合成方向是从子链的5′－3′，所以可以用引物D和E扩增出启动子P。(3)烟草细胞在卡那霉素中能存活说明转入了质粒，能将X-Gluc水解成蓝色说明获得了基因M的表达产物，因此用含有卡那霉素和X-Gluc的培养基可以筛选出成功转入目的基因的烟草细胞。筛选出的烟草细胞经过植物组织培养可获得转基因植株。(4)由题意可知，基因M可在烟草的根部正常表达，其表达产物可将X-Gluc水解生成蓝色物质，故可用适量X-Gluc溶液检测A、B的幼根细胞中基因M的表达情况，表达强度越大，细胞表现的蓝色越深。若A组蓝色深而B组蓝色较浅，则说明B组低温使启动子P受抑制，表达的产物少。[练1－2]　(2022·北京东城高三模拟)中国甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因(PDC)密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。(1)启动子位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的位点，同时启动子区域还存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响了基因的________。(2)为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。①PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在____________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据________和PDC基因编码序列设计引物进行PCR，利用质粒A(图1)构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。注：金担子素是一种抗真菌药物。②质粒G(图2)上的AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，因此需获得待测蛋白与AD蛋白的融合蛋白用于后续筛选。科研人员从中国甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点________(填序号1～5)作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。③重组酵母Y187与Y1H能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图3阐述作出该推测的理由________________________________________________________________。答案　(1)转录水平(2)①DNA连接酶　接头片段　尿嘧啶　②4③接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，如果待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，它就能与PDC基因启动子特定区域结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性解析　(1)启动子与调控蛋白对基因的转录与否起调控作用，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，直接决定转录起始，后者为间接作用，对DNA的转录起到调控作用。(2)①已知接头片段连接在PDC基因的上游，且已知序列信息，则可以按照PDC基因启动子上游的接头片段与PDC基因编码序列设计引物进行PCR扩增；由质粒A的示意图可知带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无启动子无法转录，所以选择尿嘧啶合成基因作为标记基因，则在选择培养基配制时不加尿嘧啶。②cDNA片段需要插入启动子之后，且不能破坏其他蛋白质基因的表达，因此选择4作为cDNA的插入位点。③依据题干，重组酵母Y187与Y1H接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒；质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，若质粒A、G正常执行功能，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性。[练1－3]　(2021·天津等级考)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为______________________。(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑__________________和__________________。②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有______________________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列________(填“能”或“不能”)在大肠杆菌中高效表达。③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是________(单选)。A．进一步优化发酵条件B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种答案　(1)细胞质基质(2)①包含BamHⅠ的识别序列　将GTG改为ATG　②原核生物复制原点　不能　③缺失尿嘧啶(3)B解析　(1)酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。(2)①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHⅠ的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。(3)进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸的产生，可以提高其乳酸产量，A正确；由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸的高产菌株，D正确。