2023届高考生物二轮复习生物工程课件

这是一份2023届高考生物二轮复习生物工程课件，共60页。PPT课件主要包含了梳理核心知识，微专题1，微专题2，专题强化练等内容，欢迎下载使用。
专题十　生物工程
(1)植物组织培养和植物体细胞杂交技术。　　　(8)DNA的粗提取和鉴定。(2)动物细胞培养及干细胞的应用。　　　　　　(9)DNA片段的扩增及电泳鉴定。(3)动物细胞融合技术和单克隆抗体的制备。　　(10)基因工程的应用。(4)动物体细胞核移植技术。　　　　　　　　　(11)蛋白质工程。(5)胚胎工程的理论基础及应用。　　　　　　　(12)转基因产品的安全性。(6)重组DNA技术的基本工具。　　　　　　(13)关注生殖性克隆与治疗性克隆。(7)基因工程的基本操作程序。　　　　　　 (14)生物武器及其对人类的危害。　　
梳理核心知识
微专题1
微专题2
1
2
3
专题强化练
4
梳理核心知识
1
细胞的全能性、细胞膜的流动性
细胞增殖
动物细胞核的全能性
细胞膜的流动性　
产生专一抗
体的杂交瘤细胞
早期胚胎在相同生理环境
条件下空间位置的转移
桑葚
胚或囊胚
DNA连接酶
基因表达载体的构建
基因
1.判断有关细胞工程和胚胎工程说法的正误 (1)在脱分化过程中，增大细胞分裂素与生长素含量的比值，可利于根的分化生长。( ) (2)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。( ) (3)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。( ) (4)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。( ) (5)杂交瘤细胞制备过程中，可用灭活的病毒诱导细胞融合。( )
×
√
×
×
√
(6)植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。( )(7)重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。( )(8)使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎产生免疫排斥反应。( )(9)牛胚胎移植时可用囊胚期滋养层细胞进行性别鉴定。( )(10)胚胎移植中，供体和受体相当于双亲中的父本和母本。( )
×
√
×
√
×
2.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误 (1)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。( ) (2)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。( ) (3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。( ) (4)将胰岛素基因表达载体导入受体细胞借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来。( ) (5)转基因抗虫棉植株的抗虫效果必须通过分子检测进行鉴定。( )
×
√
×
√
×
(6)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。( )(7)蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。( )(8)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( )
√
√
√
以便清除代谢物，
防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
胚胎细胞
分化程度低，表现全能性相对容易
鼠源单克隆抗体对人而言可能是异种抗原，经人源化后能保留抗
体的特异性，降低其异源性
对靶细胞具有较高的转化效率；在宿主细胞中不会引起
免疫排斥反应
延伸
两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合
一种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术
耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大
肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　。
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
耐高温的DNA
聚合
B、C
PMI基因位于此片段的中间部位，耐高温DNA聚合酶只能从5′→3′端延
伸子链
抗盐基
因(或目的基因)　
将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植
株的生长状态
不受
年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效
D
1.(2021·江苏卷，5)植物组织培养技术常用于商业化生产：其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。下列相关叙述错误的是(　　) A.为获得无菌培养物，外植体要消毒处理后才可接种培养 B.组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构 C.提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根 D.用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异
解析　植物组织培养过程中应注意无菌操作，为获得无菌培养物，外植体要经过表面消毒处理后，才能进行培养，所用的培养基必须彻底灭菌，A正确；组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构，胚状体若包裹上人工种皮，可制作成人工种子，B正确；生长素和细胞分裂素的比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成，因此提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根，C正确；用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗会出现变异，如在愈伤组织的培养过程中可能发生基因突变等变异，D错误。
2.(2021·江苏卷，11)下列关于哺乳动物胚胎工程和细胞工程的叙述，错误的是(　　) A.细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需要添加血清等物质 B.早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体 C.猴的核移植细胞通过胚胎工程已成功地培育出了克隆猴 D.将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D
解析　细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需添加血清等物质，A正确；早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体，B正确；我国利用核移植技术成功培养出克隆猴“中中”和“华华”，C正确；将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导融合后的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等，D错误。
3.(多选)(2020·江苏卷，23)小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞，制备流程如图所示。下列叙述错误的是(　　 )
ABC
A.为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子B.细胞a和细胞b内含有的核基因不同，所以全能性高低不同C.用胰蛋白酶将细胞a的膜蛋白消化后可获得分散的胚胎干细胞D.胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
解析　限制获得更多早期胚胎的最大的问题是没有足够的卵母细胞，所以应该通过注射促性腺激素促进雌鼠超数排卵，A错误；细胞a和细胞b是由同一个受精卵分裂分化形成的，所以两细胞的核基因应该是相同的，由于基因的选择性表达，囊胚期细胞b已经分化形成了滋养层细胞，所以全能性降低，B错误；用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织一段时间，消化了细胞间的蛋白质，从而获得分散的胚胎干细胞，C错误；动物细胞培养所需气体主要有氧气和二氧化碳，一般将动物细胞置于含95%空气加5%二氧化碳的混合气体的培养箱中进行培养，D正确。
4.(2021·江苏卷，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增①提取真菌细胞________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______________________。(2)重组质粒的构建①将Sma Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成质粒的环化。
RNA
蛋白M上不含tag标签
黏性末端碱基互补配对
DNA连接
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ的酶切位点可能在_______________________________。(3)融合蛋白的表达①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是_________________________________________________________________________________________。
基因m的连接处、基因m的内部
受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明__________________________________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
融合基因表达(或融合基因正确解码)
解析　(1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
(2)①从图上看，载体A只有一个Sma Ⅰ的酶切位点，故被Sma Ⅰ切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被Sma Ⅰ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ的酶切位点可能在基因m的连接处、基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或融合基因正确解码)。
微专题1　细胞工程与胚胎工程
2
练·高考重点
讲·核心要点
1.植物组织培养的过程
原理：植物细胞的全能性
细胞分裂素
①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。②脱分化阶段不需光，再分化阶段需光。③生长素/细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。④体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，基因的表达具有选择性。
2.植物体细胞杂交技术
原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
①与再生细胞壁密切相关的细胞器是高尔基体。②原生质体融合后有多种结果需要筛选。③从变异角度看，植物体细胞杂交技术属于染色体数目变异，杂种植株的基因型、染色体和染色体组数目均为原两植物直接相加。
3.动物细胞培养
原理：细胞增殖
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理组织，使其分散成单个细胞。第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。②避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
4.单克隆抗体的制备　
原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5.动物体细胞(核移植技术)克隆技术
原理：动物细胞核的全能性
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起表型改变。(2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
6.准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程
7.胚胎移植的操作流程
超数排卵
妊娠
8.胚胎分割　
无性繁殖或克隆
桑葚胚或囊胚
内细胞团
滋养层
1.下列有关细胞工程的叙述正确的有______。①将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(2021·江苏卷，11D)②植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。(2021·江苏卷，5D)③经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防。(2021·辽宁卷，3D)
③⑤
④动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。(2021·浙江1月，18B)⑤胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养。(2020·江苏卷，23D)
2.下列有关胚胎工程的叙述正确的有______。 ①早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体。(2021·江苏卷，11B) ②体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理。(2020·山东卷，14B) ③胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。 (2020·山东卷，14C) ④胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。(2018·江苏卷，10C) ⑤利用胚胎分割技术，同卵多胎较同卵双胎成功率更高。(2018·江苏卷，10D)
①②
1.(2021·福建卷，11)科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术流程示意图如下。
D
下列叙述正确的是(　　)A.愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的B.获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状C.可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生D.用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体
解析　愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞脱分化形成的，A错误；由于基因的选择性表达和基因间的互作效应，获得的杂种植株不一定能够表现双亲的优良性状，B错误；可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合，但不能诱导细胞壁的再生，C错误；由于植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，故可以用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体，D正确。
D
2.(2019·江苏卷，20)为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究小组的实验过程如图。下列叙述正确的是(　　)
A.过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中B.过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化C.过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生D.原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性
解析　过程①获得的原生质体不能悬浮在30%的蔗糖溶液中，30%的蔗糖溶液可导致原生质体失水皱缩甚至死亡，A错误；过程②为再分化过程，需提高细胞分裂素的比例以促进芽的分化，B错误；③可以表示诱导根的分化形成幼苗，此时细胞壁已经形成，秋水仙素的主要作用是抑制纺锤体的形成，使细胞中的染色体数目加倍，C错误；原生质体虽无细胞壁，但含有细胞核等结构，即含有全部的遗传信息，原生质体仍保持细胞的全能性，D正确。
C
3.(2022·江苏扬州月考)2019年1月24日，我国科学家宣布世界首批疾病克隆猴——5只生物节律紊乱体细胞克隆猴在中国诞生，开启了克隆猴模型应用于生命科学研究的“春天”。科学家采集了一只一岁半的、睡眠紊乱最明显的BMAL1(生物节律基因)敲除猴A6的体细胞，通过体细胞核移植技术，获得了5只克隆猴——这是国际上首次成功构建的一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型。下列相关叙述错误的是(　　)
A.体细胞核移植技术的基础是动物细胞培养B.5只克隆猴细胞的核基因型与核供体细胞的完全一致C.取自新鲜卵巢的卵母细胞可以直接作为受体细胞使用D.该研究可以弥补实验猕猴繁殖周期长、单胎数量少的不足
解析　动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础，A正确；克隆猴细胞核基因型与核供体细胞完全一致，细胞质基因来源于受体细胞，B正确；体细胞核移植需用取自新鲜卵巢的卵母细胞培养到减数第二次分裂的中期，再做受体细胞，C错误；克隆动物可大量繁殖，可弥补实验猕猴繁殖周期长、单胎数量少的不足，D正确。
4.(2022·河北衡水金卷)胚胎干细胞在揭示人与动物的发育机制、药学研究、细胞替代治疗及基因治疗中有着广阔的应用前景。不同物种、不同胚胎之间存在较大的差异，不同物种胚胎干细胞的建系方法和培养条件也各不相同，研究人员对阿尔巴斯白绒绵羊胚胎干细胞的培养条件开展了相关研究。回答下列问题： (1)通过体内受精获得胚胎干细胞的过程中，应对处于发情期的阿尔巴斯白绒母绵羊注射促性腺激素，目的是______________________________________ ___________________。 选用优质公羊与其交配48～80 h后，从母绵羊的________(部位)冲卵回收得到早期胚胎。
促进母绵羊排出更多卵细胞(超数排卵)，以
便获得多枚胚胎
输卵管
(2)培养羊早期胚胎前先取小鼠的成纤维细胞制备饲养层细胞，在小鼠的成纤维细胞培养液中加入__________________________可将其从培养瓶的瓶壁上分离下来形成单细胞悬液。将羊早期胚胎置于饲养层细胞上培养的目的是_____________________________，羊胚胎干细胞在形态上表现为____________________________。(3)研究人员配制A、B两种胚胎干细胞的培养液时，均添加了100 IU/mL青霉素和0.05 mg/mL链霉素，加入青霉素和链霉素的目的是___________________________________________________。
胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)
维持胚胎干细胞处于不分化状态
体积小、细胞核大、核仁明显
抑制微生物的生长繁殖，避免培养过程中出现杂菌污染
(4)若探究机械法(用口吸管将内细胞团切割成小块)、酶消化法、培养液A、培养液B对胚胎干细胞传代培养的影响，请补充完整实验组的处理：实验组1：机械法获取胚胎干细胞＋培养液A，实验组2：________________________________。实验组3：机械法获取胚胎干细胞＋培养液B；实验组4：_________________________________。
酶消化法获取胚胎干细胞＋培养液A　
酶消化法获取胚胎干
细胞＋培养液B
微专题2　基因工程(含PCR技术)
3
练·高考重点
讲·核心要点
1.基因工程的基本工具
磷酸二酯
黏性　
①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。
2.基因工程的四个操作步骤 (1)目的基因的筛选与获取
①目的基因主要是指编码蛋白质的基因。②在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。③当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
①启动子、终止子a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子连接到一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。
(3)将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化
花粉管通道
显微注射
受精卵
辨析农杆菌转化法中的“两个两次”①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的T­DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T­DNA导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定
3.PCR技术及应用 (1)PCR技术原理与条件
DNA半保留复制　
引物
(2)PCR技术的过程
可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
复性
72 ℃
耐高温的DNA聚
合酶
4.蛋白质工程
基因合成
新的
蛋白质
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列
A
1.(2021·辽宁卷，4)下列有关细胞内的DNA及其复制过程的叙述，正确的是(　　) A.子链延伸时游离的脱氧核苷酸添加到3′端 B.子链的合成过程不需要引物参与 C.DNA每条链的5′端是羟基末端 D.DNA聚合酶的作用是打开DNA双链
解析　细胞内DNA复制时，子链延伸方向为5′→3′，故游离的脱氧核苷酸添加到3′端，A正确；子链的合成过程需要引物参与，B错误；DNA每条链的5′端是磷酸基团末端，3′端是羟基末端，C错误；解旋酶的作用是打开DNA双链，D错误。
2.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
D
解析　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
D
3.(2021·江苏卷，13)下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是(　　)
A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列B.该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上C.若要获得剔除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
解析　农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体的DNA上，A正确；该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了四种类型细胞，其中包括目的基因与标记基因都不含的、只含目的基因的、只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确；获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。
4.(2020·江苏卷，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种______________________酶，它通过识别特定的____________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化________________________________。(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
限制性内切核酸(或限制)
核苷酸序列
磷酸二酯键
DNA单链
以DNA为模板的DNA链的延伸
②④
B
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
解析　(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，TaqDNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为－AATT，3′端序列应为－TTAA，B正确。
5.(2019·江苏卷，33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
平
(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为__________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________、__________________。
胸腺嘧啶(T)
DNA连接
B
A菌落含有P0
C类菌落未转入质粒
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是__________________________。
乙、丙
目的基因反向连接
解析　(1)EcoR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的载体质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的
重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P2质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P2质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P2质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
专题强化练
4
（时间：30分钟）
微专题1　细胞工程与胚胎工程1.(2022·江苏扬州月考)下列关于细胞工程和胚胎工程的叙述，不正确的是(　　) A.给动物注射一定量的促性腺激素能促使其超数排卵 B.PEG能促进动物细胞融合，形成的杂交细胞经动物细胞培养后能得到新品种个体 C.产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制现象 D.胚胎发育至囊胚时，细胞开始发生分化
B
解析　促性腺激素化学本质为蛋白质，不能口服，只能注射，其作用是促进超数排卵，A正确；由于动物细胞的全能性受到限制，动物细胞融合形成的杂交细胞不能培育成动物个体，B错误；由于杂交瘤细胞既保留了骨髓瘤细胞无限增殖的特点，又有浆细胞产生特异性抗体的作用，所以产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象，C正确；胚胎发育至囊胚时即已开始了细胞分化，细胞分化是基因选择性表达的结果，D正确。
2.(2022·江苏南京六校联合体期初)紫杉醇是一种高效抗癌的药物。国内某团队研究光照条件对红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响，实验结果如下表：
下列叙述正确的是(　　)A.愈伤组织生长的原理是植物细胞具有全能性B.愈伤组织培养过程要在无菌条件下进行C.光照能促进愈伤组织的生长并提高紫杉醇含量D.培养基中的有机物仅能为愈伤组织提供能量
B
解析　植物组织培养过程中，愈伤组织主要进行细胞生长和分裂，不能体现植物细胞的全能性，A错误；愈伤组织培养过程要在无菌条件下进行，以避免微生物的污染，B正确；根据题干信息和表格信息分析，该实验研究光照条件对红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响，自变量是光照的有无，因变量是愈伤组织生长和紫杉醇含量，表格数据显示，两组接种干重相似，但光照条件下收获的愈伤组织干重和紫杉醇含量均低于黑暗条件，C错误；植物组织培养过程中，有机物可以为植物细胞提供必需的营养物质和能量，此外还可以调节渗透压，D错误。
3.(2022·江苏盐城调研)马铃薯四倍体栽培种没有青枯病的抗性基因，少数马铃薯野生种存在青枯病的抗性基因。由于核型等差异，野生种难以与四倍体马铃薯栽培种直接杂交繁育，为获得具有抗青枯病的马铃薯栽培种，研究人员进行了植物体细胞杂交的实验研究，过程如下图所示。下列有关叙述正确的是(　　)
B
A.在低渗溶液中，用纤维素酶和果胶酶处理A和B以获得两种原生质体B.培育成的马铃薯新品种与野生型或四倍体栽培种之间存在核型差异C.过程②的培养基中需添加等量的生长素类和赤霉素类植物生长调节剂D.③为再分化过程，可用 DNA 分子杂交技术鉴定植株的抗病性状
解析　酶解法可用于去除细胞壁获得原生质体，但不能在低渗溶液中进行，否则原生质体会吸水涨破，A错误；培育成的马铃薯新品种是细胞融合的结果，其为六倍体，与野生型(二倍体)或四倍体栽培种之间存在核型差异，B正确；过程②是植物组织培养的脱分化过程，其培养基中需添加等量的生长素类和细胞分裂素类植物生长调节剂，C错误；③为再分化过程，植株的抗病性状是由蛋白质表现出来的，采用抗原－抗体杂交的方法，D错误。
4.(多选)(2022·江苏如皋期末)下图是一种单克隆抗体应用于肿瘤治疗的作用原理图。阿霉素是一种抗肿瘤药，只有被碱性磷酸酶活化后才能抑制DNA和RNA的合成。下列说法正确的是(　 　)
ACD
A.单克隆抗体的制备需要用到动物细胞融合技术B.制备单克隆抗体时，需将碱性磷酸酶注射到小鼠体内C.该技术能减轻阿霉素对正常细胞的伤害D.活化阿霉素能抑制细胞中的DNA复制和转录过程
解析　单克隆抗体的制备其中一个环节是骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，这个过程需要用到动物细胞融合技术，A正确；制备单克隆抗体时，需将抗原注射到小鼠体内，B错误；阿霉素对正常细胞也有一定毒性，而单克隆抗体的定位导向作用将药物带到癌细胞所在的位置，从而减轻阿霉素对正常细胞的伤害，C正确；由题干可知，阿霉素“只有被碱性磷酸酶活化后才能抑制DNA和RNA的合成”，D正确。
5.(多选)(2022·江苏海门期末，17)亨廷顿舞蹈病是一种由于亨廷顿蛋白(HTT)基因突变所导致的疾病。我国科学家利用基因编辑技术(CRISPR/Cas9)成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病的基因“敲入”猪模型，操作过程如下图所示。下列说法正确的是(　 　)
ACD
A.上述操作过程的原理有基因重组、动物细胞核全能性等B.过程②为动物细胞融合技术，通常采用灭活病毒诱导C.过程④为胚胎分割，该技术关键是将内细胞团均等分割D.基因“敲入”猪模型所携带的人突变HTT基因可遗传给后代
解析　分析题干信息可知，上述操作中基因编辑技术的原理是基因重组，过程①②是将含有目的基因的成纤维细胞的细胞核移入去核的卵细胞中，所利用的生物技术是细胞核移植技术，过程③④是重组细胞发育成早期胚胎的过程，体现的生物学原理是动物细胞核的全能性，A正确；过程②是将细胞核移入去核的卵细胞中，所利用的生物技术是细胞核移植技术，B错误；过程④为胚胎分割，该技术关键是将内细胞团均等分割，否则影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，C正确；基因“敲入”猪模型所携带的人突变HTT基因属于基因重组，可遗传给后代，D正确。
微专题2　基因工程6.(多选)(2022·江苏盐城检测)热启动PCR可提高扩增效率，其基本方法是：进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，而是将样品加热，待温度升到70度以上时，再将上述试剂加入，开始PCR反应，下列叙述正确的有(　　) A.TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为50～60 ℃ B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C.两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸 D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性
BC
解析　TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为70 ℃以上，即延伸时的温度，A错误；分析题意可知，热启动PCR进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，故可减少反应起始时引物错配形成的产物，B正确；DNA分子两条链反向平行，PCR扩增时引物加到3′端，复制时子链只能是从5′端向到3′端延伸，C正确；PCR产物DNA碱基序列的特异性是碱基互补配对的结果，不能体现TaqDNA聚合酶的特异性，D错误。
7.(多选)(2022·江苏南通第一次质检)下图1表示大肠杆菌pBR322质粒，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述正确的是(　　 )
ABC
A.图1质粒中含有多个限制酶的酶切位点，不含游离的磷酸基团B.构建重组质粒时若选用 BamHⅠ会破坏两个标记基因，不便于后续的筛选C.构建重组质粒时同时用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ，利于防止目的基因反向连接D.将重组质粒直接转入处于感受态的酵母菌细胞，可实现其快速扩增
解析　分析题图，图1为质粒，含有四个限制酶切割位点、两个标记基因和启动子；图2为目的基因，其两侧含有三个限制酶切割位点。由于质粒是环状的，所以其不含游离的磷酸基团，A正确；目的基因的右侧只有一个限制酶切割位点，而左侧的两个限制酶中，若用 BamHⅠ切割，则会破坏质粒上的两个标记基因，因此只能用限制酶Hind Ⅲ和Bcl Ⅰ切割目的基因和质粒，且有利于防止目的基因的反向连接，B、C正确；应该将重组质粒转入处于感受态的大肠杆菌细胞，实现其快速扩增，D错误。
8.(多选)(2022·江苏百校大联考)RNA经逆转录后再进行PCR扩增的技术称为RT－PCR，过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　　 )
BCD
A.过程①需要RNA、逆转录酶、引物、核糖核苷酸等条件B.真核细胞的mRNA经过程①②获得的DNA无内含子片段C.过程③PCR扩增时引物中的CG含量会影响复性温度D.RT－PCR技术可应用于新冠病毒(RNA病毒)的核酸检测
解析　过程①是由mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，需要RNA、逆转录酶、引物、脱氧核苷酸等条件，A错误；真核细胞中DNA的外显子部分转录的RNA拼接形成mRNA，因此真核细胞的mRNA经过程①②逆转录过程获得的DNA无内含子片段，B正确；CG含量越高，氢键越多，结构越稳定，因此过程③PCR扩增时引物中的CG含量会影响复性温度，C正确；新冠病毒遗传物质是RNA，RT－PCR技术可应用于新冠病毒的核酸检测，D正确。
9.(多选)(2022·江苏南师附中期初)载体是基因工程中携带外源 DNA 片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正确的是(　　)
AB
A.重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体B.载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因C.必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间D.培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
解析　重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；作为载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D错误。
10.(多选)(2022·江苏苏州期末)人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①～④表示相关的操作，EcoR Ⅰ 、BamHⅠ为限制酶，它们的识别序列及切割位点如下表所示。下列有关叙述错误的是(　　)
BC
A.过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作B.构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制C.过程③利用的是T－DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中D.过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化
解析　结合图示可知，PCR的产物用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ来酶切，因此在基因的引物两侧加上酶切位点G↓AATTC和G↓GATCC，A正确；启动子负责与RNA聚合酶结合启动转录，终止子负责终止转录，因此构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行转录，B错误；过程③是利用T－DNA的特性将目的基因导入到农杆菌中，根瘤农杆菌是原核生物，无染色体，C错误；整个过程最终需要利用愈伤组织细胞生成干扰素，因此应控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化，D正确。
11.(多选)(2022·江苏南京调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当 TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。相关叙述错误的是(　　)
BC
A.引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则B. TaqDNA聚合酶催化子链从3′端向5′端延伸，需dNTP作为原料C.若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入6个荧光探针D.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
解析　引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；根据图示中引物延伸的方向可以确定，Taq酶可以催化子链沿着5′→3′方向延伸，需dNTP作为原料，B错误；TaqDNA聚合酶荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′－3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，若某次PCR反应共产生52个等长的DNA，则至少扩增六次，其余为不等长的DNA，根据每扩增一条链就有一个荧光分子生成，则需加入26＝64个荧光探针，C错误；题干中提出“加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，且加入的原料具有荧光标记，故“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D正确。
12.(2022·江苏盐城伍佑中学调研)随着夏天临近，小龙虾将成为我们餐桌上不可或缺的美味，美中不足的是，小龙虾体内的某些蛋白分子或小分子多肽能使部分人产生过敏反应。已知基因表达时，双链DNA的一条链是编码链，另一条链是模板链，虾过敏基因的编码链如图1。四种限制酶和三种质粒如图2、图3，箭头表示限制酶的切割位点。研究人员拟按照图4操作步骤研发一种虾过敏疫苗。请回答下列问题：
图1
图2
图3
图4
(1)过敏基因转录时，RNA聚合酶的结合位点和终止密码的编码序列分别位于图1中的__________、________区段；转录产生的mRNA碱基序列为__________________________________________________(方向为5′→3′)。若通过PCR技术大量扩增过敏基因的编码区段，则需要设计的一对引物序列分别是______________________、__________________(方向为5′→3′，只要写出5′端8个核苷酸序列)。(2)据图1、2、3分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是____________，最适合用作载体的质粒是________。(3)图4中，筛选含过敏基因的受体细胞时，按照上述选择的载体，培养基中需添加的抗生素是________。
非编码区1
编码区
5′CUCGAGAUGCUGCAG……GGAUCCUCUAGA 3′　
5′—TCTAGAGG－3′
5′ CTCGAGAT－3′　
XhoⅠ、XbaⅠ
质粒Y　
氯霉素
(4)能否用S型肺炎链球菌替代R型菌？______，理由是____________________________________________。若在小鼠细胞中过敏基因得到表达，该蛋白质是一种________(填“抗原”或“抗体”)，经提取分离后，制备疫苗。
不能
S型肺炎链球菌使小鼠死亡，影响疫苗的制备
抗原
解析　(1)在真核细胞的基因结构中，包括编码区和非编码区，其中编码区又分为外显子和内含子，基因的非编码区存在启动子和终止子，用于调控基因的表达。过敏基因转录时，RNA聚合酶的结合位点启动子位于图1中的非编码区1；终止密码是由编码区转录的，非编码区不进行转录，终止密码的编码序列位于图1中的编码区。根据碱基互补配对的原则，转录的mRNA上的顺序是5′CUCGAGAUGCUGCAG……GGAUCCUCUAGA 3′。利用PCR技术扩增过敏基因的编码区段时，设计引物序列的主要依据是过敏基因编码区两端的部分核苷酸序列，按照碱基互补配对原则，与已知链对应的应为5′－TCTAGAGG－3′，与互补链对应的为5′－CTCGAGAT－3′。
(2)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等，选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，且不破坏目的基因和标记基因。图3中质粒X上有BamH Ⅰ的酶切位点位于启动子的上游，Pst Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点会破坏抗性基因，Xba Ⅰ酶切后的黏性末端与BamH Ⅰ酶切后的黏性末端相同，可能使质粒中的启动子丢失，因此质粒X不适合做载体的质粒。质粒Y上有2个BamH Ⅰ的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，Pst Ⅰ的酶切位点会破坏抗性基因，Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切后的黏性末端不同，可避免质粒的自身环化和随意连接，故适合做载体的质粒，用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切割。质粒Z上Pst Ⅰ的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启
动子丢失，Xho Ⅰ和Xba Ⅰ的酶切位点会破坏抗性基因，BamH Ⅰ酶(单一酶)切后可导致质粒的自身环化和随意连接，故不适合做载体的质粒。(3)图4中，筛选含过敏基因的受体细胞时，按照上述分析选择的载体是质粒Y，抗性基因为氯霉素基因，故培养基中需添加的抗生素是氯霉素。(4)S型肺炎链球菌有荚膜且具有毒性，能使小鼠患败血症死亡，影响疫苗的研制，R型菌无荚膜也无毒性，所以不能用S型肺炎链球菌代替R型菌做受体细胞。若在小鼠细胞中过敏基因得到表达，该蛋白质作为抗原，经提取分离后制成疫苗，能刺激机体产生抗体和记忆细胞。
13.(2022·江苏南京市学情调研)研究发现人溶菌酶(hLZ)是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取)，过程如图所示。其中编号①～⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成来影响亮氨酸的合成(亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸)，基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：
(1)物质A控制溶菌酶的合成包括转录和翻译两个阶段，涉及的场所主要有____________________。
(2)过程①通过PCR技术扩增物质A,需要的酶是___________________；过程②需要的限制酶是________________；过程③需要的酶是限制酶和_________________________。
细胞核和核糖体
耐高温的DNA聚合酶
BamHⅠ、Hind Ⅲ
DNA连接酶
(3)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，质粒S中用作标记基因的是________和____________________________。为达到筛选目的，培养基的营养成分中应不含有________。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出________(填“显示”或“不显示”)绿色荧光的细胞用于过程⑤。(4)过程④常用__________法，过程⑨为_________。图中早期胚胎的__________ (填结构)将发育成转基因羊。
基因Leu
基因GFP(两空答案顺序可颠倒)
亮氨酸
不显示
显微注射
胚胎移植
内细胞团
解析　(2)(3)由图中物质B的黏性末端及表中限制酶的识别序列和切割位点可知，过程②需要的限制酶是BamH Ⅰ、Hind Ⅲ。分析题图可知质粒S中的标记基因有基因GFP和基因Leu。若用限制酶BamHⅠ和Hind Ⅲ切割质粒S，则构建的重组质粒T中基因GFP被破坏，而基因Leu结构完整。若要筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，培养基的营养成分中应不含亮氨酸，则在培养基上能够生存并显示绿色荧光的成纤维细胞导入了质粒S；在培养基上能够生存且不显示绿色荧光的成纤维细胞含重组质粒T；在培养基中不能生存的成纤维细胞没有导入质粒。
14.(2022·江苏泰州月考)Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。请回答下列问题：
(1)loxP具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是________(填序号)。(2)Cre酶能催化如图2所示的反应，随机识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列并在图1的②中特定位点切断DNA双链，切口被重新连接后，保留片段_____，从而实现目标基因的敲除。若经Cre酶作用使得2个loxP位点间的序列发生反转，其原因可能是__________________________________________。
(3)Cre/loxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因________(填“上游”或“下游”)插入一个带有loxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因________(填“表达”或“不表达”)。
②
2
两个loxP序列方向相反　
上游
表达
(4)抗虫烟草的制备过程中，通常用____________法将重组质粒导入烟草细胞，导入成功后，标记基因如抗除草剂基因可用Cre/loxP重组酶系统将其________，其继续留在烟草体内可能会将抗除草剂基因转移到杂草中，造成基因污染。(5)GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物，GFP基因会产生绿色荧光蛋白，配合Cre/loxP重组酶系统来研究发育生物学的问题。
图3
农杆菌转化
敲除
①构建基因表达载体时，可用__________________酶将loxP序列、GUS基因及GFP基因连接，接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区(如图3所示)，这是由于________基因自身无启动子而无法表达。②Cre基因经38 ℃热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区，据此分析绿色荧光区形成的原因是___________________________________________________________，采用__________________等手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。
GFP
Cre重组酶能(特异性识别并)切割loxP序
列，使GFP基因得以表达　
延长热处理时间
限制酶和DNA连接
解析　(1)①和③的碱基序列两条链之间不具有方向性，②中的序列具有方向，因此决定方向的是序列②。(2)Cre酶识别两个相同的LoxP序列，进行切除，片段1自身环化且带有待敲除基因，因此保留片段2，从而实现目标基因的敲除，如果两个loxP位点位于同一条DNA上且方向相反，Cre酶会使loxP间的序列反转。(3)Cre/loxP重组酶系统调控基因的表达，在目的基因上游插入带有loxP位点的编码终止密码子的序列，Cre酶会对loxP位点进行切开，终止密码子不发挥作用，因此目的基因表达。(4)将目的菌导入植物细胞通常采用农杆菌转化法，转入后将标记基因敲除，继续留在烟草体内可能转移到杂草中，造成基因污染。
(5)①构建基因表达载体时，可用限制酶和DNA连接酶处理相关基因，使loxP序列、GUS基因及GFP基因连接，接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区，是因为GFP基因无启动子不能表达。②Cre基因经过热处理后激活表达，Cre重组酶切割了loxP序列，使GFP基因得以表达，最终出现绿色荧光区，延长热处理的时间使Cre基因充分表达，可以扩大绿色荧光面积。