五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编92-生物技术与工程-基因工程的操作程序综合题（含解析）

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五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编92-生物技术与工程-基因工程的操作程序综合题（含解析）

一、单选题
1．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（    ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
2．（2020·北京·统考高考真题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。以下表述错误的是（    ）
A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测
B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术
C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合
D．可用抗原-抗体反应检测抗体基因表达产物

二、综合题
3．（2022·全国·统考高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是______。
4．（2022·湖北·统考高考真题）“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验；
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
杂交组合
F1表现型
F2表现型
甲×乙
不甜
1/4甜、3/4不甜
甲×丙
甜
3/4甜，1/4不甜
乙×丙
甜
13/16甜、3/16不甜

【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
(1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有_____种。品系乙基因型为_______。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为_____。
(2)下图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有___________。

(3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_____________酶切割S基因的cDNA和载体。

(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是________。
(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有___________（答出2点即可）。
5．（2021·湖南·统考高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：


（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_________断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_________。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________（答出两点即可），功能上具有_________。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_________。
6．（2021·天津·统考高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。

(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件 B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
7．（2021·福建·统考高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。

(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。

8．（2020·全国·统考高考真题）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。

（1）步骤①中需要使用的工具酶有________________。步骤②和③所代表的操作分别是________________和________________。步骤④称为________________。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的______________（答出2点即可）的限制。
（3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________（填相同或不同），原因是_________。
（4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有_____________（答出2点即可）。
9．（2020·浙江·统考高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。
（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。
10．（2020·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：
（1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。
（2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。
（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。

参考答案：
1．D
【分析】基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。
【详解】A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；
B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；
C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；
D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。
故选D。
2．A
【分析】基因工程基本操作顺序：目的基因获取（从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成），表达载体的构建（启动子+目的基因+标记基因+终止子），将目的基因导入受体细胞（植物细胞用农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，动物细胞用显微注射法，微生物细胞用感受态细胞法），目的基因的检测与鉴定（导入检测用DNA分子杂交技术，转录检测用分子杂交技术，翻译检测用抗原——抗体杂交法）。核酸检测是查找患者的呼吸道标本、血液或粪便中是否存在外来入侵的病毒的核酸，来确定是否被新冠病毒感染，一旦检测为核酸“阳性”，即可证明患者体内有病毒存在；抗体检测的物质是受病毒感染刺激而产生的特异性抗体，病毒进入人体一段时间后，才会刺激人体产生IgM（免疫球蛋白M）或IgG（免疫球蛋白G），检测抗体间接证明已感染新冠病毒。
【详解】A、由分析可知，该单抗不能直接用于新冠病毒的核酸检测，A错误；
B、由题“针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，制备出全人源单克隆抗体”可知，在该单抗制备过程中利用了基因工程技术，B正确；
C、针对新冠病毒表面抗原制备出的单抗，可与新冠病毒相应蛋白特异性结合，C正确；
D、抗体基因表达产物检测的方法是采用抗原——抗体杂交反应，若呈阳性，则说明已翻译出相应的蛋白质，D正确。
故选A。
3．(1)逆转录酶##反转录酶
(2)     特异性核苷酸序列     退火##复性
(3)     曾感染新冠病毒，已康复     已感染新冠病毒，是患者
(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）


【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。
（2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性（或退火）。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。

4．(1)     7     aabb     1∶5
(2)①③
(3)XbaⅠ、HindⅡ
(4)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞
(5)单倍体育种、诱变育种

【分析】农杆菌转化法：取Ti质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转入农杆菌、将农杆菌导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
杂交育种：杂交→自交→选优；诱变育种：物理或化学方法处理生物，诱导突变；单倍体育种：花药离体培养、秋水仙素加倍；多倍体育种：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗；基因工程育种：将一种生物的基因转移到另一种生物体内。
【详解】（1）甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙杂交的F2基因型有3×3=9种，假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，F2中表现为甜的植株基因型有7种。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中不甜比例=1/3+2/3×3/4=5/6，F3中甜∶不甜比例为1∶5。
（2）不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，只有A导致不甜，当A与B同时存在时，表现为甜，故选①③。
（3）为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅡ酶切割S基因的cDNA和载体。
（4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。
（5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有单倍体育种、诱变育种。
5．     限制性核酸内切酶（限制酶）     磷酸二酯键     清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养      动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难     细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答）     发育的全能性     B     取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、核移植：
（1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物；
（2）原理：动物细胞核的全能性；
（3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
【详解】（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。
【点睛】本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。
6．(1)细胞质基质
(2)     包含BamHI的识别序列     将GTG改为ATG     原核生物复制原点     不能     缺失尿嘧啶
(3)B

【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）
酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
（2）
①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。
②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
（3）
A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；
B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；
C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；
D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
故选B。
【点睛】本题以获得能产生乳酸的工程菌株为背景，考查基因工程的相关内容，重点考查基因表达载体的构建，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，识记PCR技术的原理和过程，能结合所学的知识准确答题。
7．(1)引物1和引物4
(2)     EcoRV     T4DNA     启动子     终止子     XhoI和PstI     钙
(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定

【分析】1、PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）
密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
（2）
①MT基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入Xho I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E·coli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoI和PstI酶，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
（3）
由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，解答本题的关键是分析题图，明确基因工程的工具，并根据限制酶的切割位点判断引物应该设计的碱基序列，结合题意明确检测基因表达载体的方法。
8．     限制性核酸内切酶、DNA连接酶     显微注射     早期胚胎培养     胚胎移植     性别、年龄     相同     两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵     体外受精、胚胎移植
【分析】1、膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易,不会对动物造成伤害。此外,该系统可从动物一出生就收集产物,不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
2、基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
3、分析题图可知，步骤①为将W基因与运载体结合，构建基因表达载体；步骤②为将重组表达载体导入受精卵，常用显微注射法；步骤③为早期胚胎培养；步骤④为胚胎移植。
【详解】（1）由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接黏性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为早期胚胎培养；步骤④为胚胎移植。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物,不受动物的性别和年龄的限制。
（3）在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。
（4）由分析可知，步骤③为早期胚胎培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。
【点睛】本题考查基因工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的基本工具和操作步骤，掌握胚胎工程各项技术的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查。
9．     果胶酶     细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质     喜好氧的     不耐酸的     稀释     涂布分离     酸碱指示剂     乙醇     过滤灭菌     染色法，渗透吸水或失水     化学合成     两种限制性核酸内切酶     扩增     细胞壁     胚胎发生
【分析】泡菜制作：
①菌种：假丝酵母和乳酸菌；②发酵原理：在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，还有亚硝酸。③亚硝酸盐的测定：亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。
【详解】（一）
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。
（二）
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。
（2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的黏性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。
【点睛】本题考查选修教材中的相关知识，在学习本部分内容时，要求考生对所学知识进行对比、归纳，然后建立知识间的联系，做到夯实基础，学会融会贯通。
10．     澄清度     95%乙醇     较小     抽滤     细菌悬液     灭菌     较小     粘性     抗性基因     全能性表达充分     显微注射     短     脱分化     生长素     根的分生组织     B
【分析】发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
【详解】（一）（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。
（2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。
（二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。
（2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。
【点睛】本题主要考查果胶的降解、基因工程及植物克隆知识，要求学生熟悉教材，并能将理论知识与实际应用相结合。