2022届高三生物一轮复习课件：基因工程的基本操作程序

这是一份2022届高三生物一轮复习课件：基因工程的基本操作程序，共42页。PPT课件主要包含了Contents，基因表达载体的构建，目的基因的检测与鉴定，目的基因的筛选与获取，TaqDNA聚合酶，DNA的两条链，DNA解链为单链，～60，DNA聚合酶，引物设计的相关问题等内容，欢迎下载使用。
5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤教学活动：利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
内容要求——基因工程的基本操作程序
将目的基因导入受体细胞
教学活动：DNA片段的扩增与电泳鉴定
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
（一）筛选合适的目的基因
获取目的基因的方法有多种。在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。
（二）利用PCR获取和扩增目的基因
酶：________________原料：_______________________________模板：________________能量：_______________________________引物（对）：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸（为什么？）温度与pH
四种脱氧核苷酸（或四种dNTP）
热能、dNTP水解释放的能量
PCR过程第一步：加热至90～95 ℃， ；第二步：冷却至 ℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75 ℃，热稳定 (Taq 酶)从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。
大肠杆菌细胞内 DNA复制示意图
PCR技术与细胞内DNA的复制
大肠杆菌细胞内 DNA复制过程具备了边解旋边复制的特点以及半保留复制的方式。而且其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的，于是就形成了冈崎片段。胞内RNA 引物完成延伸后，被RNA酶水解所形成的缺口再通过DNA连接酶连接起来。
胞内 DNA复制和PCR的异同
引物决定 PCR扩增产物的特异性和长度。引物设计的原则有∶① 引物序列设计要依据扩增目标DNA两端的部分序列，长度通常为20~30bp，尽量降低引物与非扩增区的同源性;②引物内部不能存在部分互补序列;③两个引物之间不能存在部分互补序列;④引物是从引物的5'向3'方向延伸的，所以引物的5'端可以修饰，但3'端不可以修饰，否则会阻碍向3'方向的延伸。
1.引物序列的合理性【例1】某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图2），请问原因分别是什么?
第一组引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而不能与目的基因上下游的特定序列结合而失效。第二组引物Ⅱ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
2.引物个数的问题（注意和探针个数的问题加以区别）【例2】一个目的基因通过PCR技术扩增n次时，总共需要多少个引物。扩增第n次时，又需要多少个引物。
分析这种题型可以借助于DNA的半保留复制模型，可知扩增n次，只有最初的DNA的两条模板链不需要引物，其他 DNA链均需要引物，所以扩增n次，共需要引物2nx2-2个，即（2n-1）对引物。而探针个数的问题，又不能简单的类比引物个数的问题，如例3。
【例3】TaqMan探针是qPCR技术中一种常用探针（图1），其5'末端连接荧光基团（R），3'末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在qPCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与 PCR 产物数量完全同步（图 2）。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为a，加入的目的基因为b个，请根据图示过程，试用数学公式表示反应体系中荧光信号强度（Rn）与扩增次数（n）之间的关系是什么。
3.定点突变技术与引物设计定点突变技术是指通过 PCR技术向目的基因片段中引入所需变化。比如，GFP（绿色荧光蛋白）的发光基团是第65~67位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸），该发光基团可利用定点突变技术使第 66 位酪氨酸换成组氨酸，即可成为蓝色荧光蛋白。
定点突变第一步得把突变位点设计在引物上，如图第66 位酪氨酸（UAC）换成组氨酸（CAC)，可以推导出相应的基因碱基序列由 ATG 突变为GTG。因此人工合成短 DNA 引物应包含的序列为AGAGTGCTC。由于突变位点的碱基不能够与模板链互不配对，所以突变位点一般设计在引物的中间位置，从而确保突变位点两侧的序列能够互不配对，同时还不妨碍3'的延伸，这样错配引物仍能引导完成DNA复制。最后，通过观察荧光蛋白是否发出蓝色光来检验该定点突变技术是否成功。
4.PCR结果与遗传题人类的甲型血友病为伴X隐性遗传疾病，致病基因用字母h表示;粘多糖病、葡萄糖-6磷酸脱氢酶缺乏症（俗称蚕豆黄）均为单基因遗传病，分别有A-a 基因及E-e 基因控制。图6为甲、乙家族通婚的遗传系谱图，通婚前，甲家族不具有粘多糖致病基因，乙家族不具有蚕豆黄致病基因，且I-2不具蚕豆黄致病基因。
【例4】 根据条件可以推知图谱中，图谱中蚕豆黄病为伴X染色体隐形遗传病，粘多糖病为常染色体隐性遗传病。为了探明Ⅳ-2的病因，医院对上述遗传系谱图中的Ⅲ、Ⅳ代成员的该等位基因片段进行了PCR扩增，然后对扩增产物进行凝胶电泳，电泳的结果如图所示。根据电泳结果与遗传系谱图，推论IV-2的无血友病XXY症的形成原因是什么。
5.PCR 异常结果的分析【例5】 电泳可以直观对比 DNA的完整性，分子大小不同的 DNA在凝胶上迁移速率不同，从而产生不同的条带。图是上述实验中提取到的总 DNA 凝胶电泳结果，其中 M是已知大小的不同DNA的混合物。实验结果显示A、B方法提取的总 DNA电泳结果只有一条带，而C方法有明显的"拖尾"现象。①只出现一条带的原因是什么?②）出现"拖尾"现象的原因是什么?
①甜菜细胞基因组DNA分子都比较大，不容易分离；②DNA发生断裂或降解，形成许多大小不等的DNA片段。
构建基因表达载体是培育转基因生物的核心工作。基因表达载体除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
启动子和终止子是基因表达时RNA聚合酶的识别位点。在体外构建基因表达载体时，启动子和终止子通常是已经安装在载体上，只需将目的基因的片段插入到载体中特定的启动子和终止子之间即可。启动子和终止子的选择直接影响目的基因在受体细胞中的表达效率。科研人员通常是根据目的基因受体细胞类型，如特定类型的细胞或特定发育阶段的细胞来确定。例如，CMV启动子是启动真核基因表达的强有力启动子，被广泛应用于构建真核表达载体;而构建原核表达载体常用的是T7启动子；若仅让目的基因在神经元中表达，则可选用神经元特异性启动子（NSE、SYN等）。除此之外，还可选择受体细胞中特定时空表达的基因启动子和终止子装入表达质粒中，从而实现目的基因的时空特异性表达。例如，将人的胰岛素基因先导入牛的受精卵中，欲让其在乳腺细胞中表达，则通常选择牛的乳腺蛋白基因的启动子和终止子装载到表达质粒中。
构建基因表达载体时，在目的基因前后加装的启动子和终止子是如何选择的?
例1.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是____________________________________________________________________。
基因自连和质粒自连，使DNA片段能定向插入表达载体
例2.(2021·山东,25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。
转化植物细胞花粉管通道法农杆菌转化法转化动物细胞显微注射法转化微生物细胞感受态法/Ca2+处理法
我国科学家采用他们独创的一种方法——花粉管通道法，将 Bt基因导入了棉花细胞。花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
农杆菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位会分泌酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，正是这些酚类物质诱导农杆菌Vir（毒性区）基因的启动表达，其产物将 Ti质粒上的T-DNA 切下，再由植物细胞染色体上的操纵子基因产物与T-DNA结合，形成复合物，最终完成T-DNA 的转移。
将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
感受态法/Ca2+处理法
包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应蛋白等。
可以根据目的基因的序列设计引物，通过PCR进行扩增，如果能够扩增出目的基因片段，说明该基因已经整合到了受体细胞中。通常提取受体细胞的总RNA，将其中的mRNA反转录成cDNA，进行PCR；或者直接进行RNA的分子杂交。从受体细胞中提取蛋白质后，进行电泳分离，然后利用目的蛋白的抗体进行检测。
（二）个体生物学水平的鉴定
例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础①PCR原理：利用了　　　　　　　原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　　　　的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　　　　　　等有关。
(2)PCR实验操作步骤