近三年高考生物真题及模拟题分类汇编15现代生物科技专题含解析

这是一份近三年高考生物真题及模拟题分类汇编15现代生物科技专题含解析，共166页。试卷主要包含了单选题，选择题组，多选题，综合题，实验题等内容，欢迎下载使用。

 专题15 现代生物科技
一、单选题
1．（2021·浙江高考真题）下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是（　　）

A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行
B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离
C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理
D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化
【答案】C
【分析】
动物细胞培养过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。
【详解】
A、动物细胞培养过程需要无菌操作，故步骤①的操作需要在无菌环境中进行，A错误；
B、动物细胞培养过程需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物组织，分散成单个细胞，制成细胞悬液，B错误；
C、传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，使之分散成单个细胞，再分瓶培养，C正确；
D、步骤④为传代培养过程，该过程中部分细胞可能发生细胞转化，核型改变，D错误。
故选C。
2．（2020·海南高考真题）将人细胞与小鼠细胞融合得到的人-鼠杂种细胞进行长期培养，杂种细胞随机丢失一部分人的染色体后，染色体数目会保持稳定。选取三种杂种细胞，对编码人的芳烃羟化酶（AHH）和磷酸甘油酸激酶（PGK）的基因进行染色体定位研究，结果如表（“+”表示有，“-”表示无）。
杂种细胞
人的染色体
AHH
PGK
2号
11号
17号
X
甲
－
＋
－
＋
－
＋
乙
＋
＋
－
－
＋
－
丙
－
＋
＋
＋
－
＋
下列有关叙述错误的是（ ）
A．聚乙二醇可诱导人细胞与小鼠细胞融合
B．培养杂种细胞时，通常需在培养液中添加一定量的抗生素
C．编码AHH的基因在11号染色体上
D．编码PGK的基因在X染色体上
【答案】C
【分析】
1、动物细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。动物细胞融合的方法：物理法（离心、振动、电刺激等）、化学法（聚乙二醇（PEG））以及生物法（灭活病毒等）。动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性。
2、动物细胞培养最好采用幼龄动物的组织或器官，因为幼龄动物生命力旺盛，细胞分裂能力强，易于培养。剪碎动物组织块后，还要用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，制成细胞悬液，再进行细胞培养（原代培养和传代培养）。
【详解】
A、聚乙二醇是诱导动物细胞融合的常用化学试剂，A正确；
B、培养杂种细胞时，通常需在培养液中添加一定量的抗生素以防止杂菌污染，B正确；
CD、由表中信息可知，编码AHH的基因在2号染色体上，编码PGK的基因在X染色体上，C错误，D正确。
故选C。
3．（2020·北京高考真题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。以下表述错误的是（ ）
A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测
B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术
C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合
D．可用抗原-抗体反应检测抗体基因表达产物
【答案】A
【分析】
基因工程基本操作顺序：目的基因获取（从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成），表达载体的构建（启动子+目的基因+标记基因+终止子），将目的基因导入受体细胞（植物细胞用农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，动物细胞用显微注射法，微生物细胞用感受态细胞法），目的基因的检测与鉴定（导入检测用DNA分子杂交技术，转录检测用分子杂交技术，翻译检测用抗原——抗体杂交法）。核酸检测是查找患者的呼吸道标本、血液或粪便中是否存在外来入侵的病毒的核酸，来确定是否被新冠病毒感染，一旦检测为核酸“阳性”，即可证明患者体内有病毒存在；抗体检测的物质是受病毒感染刺激而产生的特异性抗体，病毒进入人体一段时间后，才会刺激人体产生IgM（免疫球蛋白M）或IgG（免疫球蛋白G），检测抗体间接证明已感染新冠病毒。
【详解】
A、由分析可知，该单抗不能直接用于新冠病毒的核酸检测，A错误；
B、由题“针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，制备出全人源单克隆抗体”可知，在该单抗制备过程中利用了基因工程技术，B正确；
C、针对新冠病毒表面抗原制备出的单抗，可与新冠病毒相应蛋白特异性结合，C正确；
D、抗体基因表达产物检测的方法是采用抗原——抗体杂交反应，若呈阳性，则说明已翻译出相应的蛋白质，D正确。
故选A。
4．（2020·北京高考真题）生物安全是国家安全体系的组成部分。新冠肺炎疫情蔓延对我国生物安全防御体系建设提出了新的要求，引起了全社会对生物安全形势的高度关注。以下选项中不会给我国带来生物安全风险的是（ ）
A．人类及动植物中可能爆发的重大疫病
B．保护沿海滩涂红树林中的生物多样性
C．全球气候变暖导致生态环境发生改变
D．收集我国公民及生物资源的遗传信息
【答案】B
【分析】
本题以“新冠肺炎疫情”为引，考查考生对生物安全的认识，涉及生态系统的稳定性、保护生态环境、生物技术的安全性等相关知识，要求考生掌握生物多样性在维持生态系统的稳定性中的作用、全球性生态环境问题对生物圈及人类的影响，以及生物技术可能带来的道德和伦理问题，然后分析选项进行判断。
【详解】
A、人类及动植物中可能爆发的重大疫病，会影响生态环境以及人类的生存和发展，会给我国带来生物安全风险，A不符合题意；
B、保护沿海滩涂红树林中的生物多样性，有利于保护生态系统的稳定性，不会给我国带来生物安全风险，B符合题意；
C、全球气候变暖导致生态环境发生改变，会影响生物多样性，对生物圈的稳态也会造成严重威胁，影响到人类的生存和发展，会给我国带来生物安全风险，C不符合题意；
D、收集我国公民的遗传信息，可能会造成基因歧视，带来许多不公平的社会问题，遗传信息的滥用还会导致社会和政治事件的发生，会给我国带来生物安全风险，D不符合题意。
故选B。
5．（2020·山东高考真题）经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。下列说法错误的是（ ）
A．用促性腺激素处理雌鼠可以获得更多的卵子
B．体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理
C．胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植
D．遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得
【答案】C
【分析】
1、胚胎移植的基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来（也叫冲卵）。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
2、体外受精主要包括：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
【详解】
A、促性腺激素可以使雌鼠超数排卵，获得更多的卵子，A正确；
B、精子只有获能后才能完成受精，故体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理，B正确；
C、胚胎移植通常选择囊胚期之前的阶段，如桑椹胚或囊胚阶段，C错误；
D、转基因技术可以定向改造小鼠的基因，所以遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得，D正确。
故选C。
【点睛】
本题考查胚胎工程的基本知识，考生需要识记基本操作，D项中需要结合基因工程的目的进行解答。
6．（2020·山东高考真题）两种远缘植物的细胞融合后会导致一方的染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）

A．过程①需使用纤维素酶和果胶酶处理细胞
B．过程②的目的是使中间偃麦草的染色体断裂
C．过程③中常用灭活的病毒诱导原生质体融合
D．耐盐小麦的染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段
【答案】C
【分析】
从图中看出①是去掉植物细胞壁，②是用紫外线诱导染色体变异，③融合形成杂种细胞。
【详解】
A、过程1是获得植物细胞的原生质体，需要用纤维素酶和果胶酶将细胞壁分解，A正确；
B、根据题干信息“将其中一个细胞的染色体在融合前断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，”故过程②通过紫外线照射是使中间偃麦草的染色体断裂，B正确；
C、灭活的病毒诱导是动物细胞融合特有的方法，诱导植物原生质体融合常用物理法、化学法，C错误；
D、实验最终将不抗盐的普通小麦和抗盐的偃麦草整合形成耐盐小麦，说明耐盐小麦染色体上整合了中间偃麦草的染色体片段，D正确。
故选C。
【点睛】
本题的难点是对过程②的分析，考生需要结合题干中的信息作答。
7．（2020·天津高考真题）在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的（ ）
A．卵原细胞
B．初级卵母细胞
C．次级卵母细胞
D．卵细胞
【答案】C
【分析】
体细胞核移植过程：

【详解】
在克隆哺乳动物过程中，通常选择减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞，即次级卵母细胞。
故选C。
8．（2020·浙江高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
【答案】D
【分析】
基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。
【详解】
A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；
B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；
C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；
D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。
故选D。
9．（2020·浙江高考真题）下列关于利用胚胎工程培育优质奶牛的叙述，正确的是
A．从雄性奶牛中采集到的成熟精子遇到卵子即可进入卵子内
B．在体外完成受精后的受精卵，将其植入子宫即可完成着床
C．随着卵裂的进行，卵裂球细胞的体积变小，卵裂球的体积和有机物总量显著增加
D．在含有经辐射处理的胚胎成纤维细胞的培养体系中，胚胎干细胞不易发生分化
【答案】D
【分析】
1、体外受精主要包括:卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
2、胚胎移植的基本程序主要包括：对供、受体的选择和处理(选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体。用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理)；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存(对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到椹或胚囊胚阶段)；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。
3、胚胎移植的生理学基础：
①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。
受体对移入子宫的外来胚胎不发生兔疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
【详解】
A、从雄性奶牛中采集到的成熟精子需要进行获能处理才能受精，A错误；
B、在体外完成受精后的受精卵，需要进行早期胚胎培养，才能将其植入子宫，B错误；
C、随着卵裂的进行，卵裂球细胞的体积变小，卵裂球的体积基本不变或略有减小，有机物总量减少，C错误；
D、在含有经辐射处理的胚胎成纤维细胞的培养体系中，由于胚胎成纤维细胞可以分泌一些能抑制细胞分化的物质，所以胚胎干细胞不易发生分化，D正确。
故选D。
10．（2019·上海高考真题）下图表示培养“落地生根”新植株的两种方法，则遗传信息相同的方法是（）

A．仅①② B．仅②③ C．仅①③ D．①②③
【答案】D
【分析】
1.扦插也称插条，是—种培育植物的常用繁殖方法，可以取某些植物的茎、叶、根、芽等(在园艺上称插穗)，或插入土中、沙中，或浸泡在水中，等到生根后就可移栽，使之成为独立的新植株，扦插是无性繁殖。
2.组织培养指的是在无菌的情况下，将植物体内的某一部分器官、组织或细孢，如茎尖、芽尖、形成层、根尖、胚芽和茎的髓组织等从植物体上分离下来，放在适宜培养基上培养，经过脱分化、再分化最后长成一个完整的植株的过程，植物组织培养利用了细胞的全能性，属于无性繁殖。
【详解】
根据以上分析可知，“落地生根”通常利用叶①上长出的不定芽繁殖得到新植株的过程是扦插，属于无性繁殖的方式；利用其叶片组织通过组织培养得到新植株③的方式为植物组织培养，属于无性繁殖的方式。无性繁殖可以保持亲本的优良性状，因此①②③的遗传信息都和最初亲代的体细胞相同。综上所述，D正确，A、B、C错误。
故选D。
11．（2019·江苏高考真题）为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究小组的实验过程如下图。下列叙述正确的是

A．过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中
B．过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化
C．过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生
D．原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性
【答案】D
【分析】
由图可知，①表示用纤维素酶和果胶酶处理得到原生质体的过程；②③均表示再分化过程。
【详解】
原生质体在30%的蔗糖溶液中会失水皱缩，A错误；②诱导芽分化时，需要提高细胞分裂素的比例，B错误；③可以表示诱导根的分化形成幼苗，此时细胞壁已经形成，C错误；原生质体无细胞壁，但由于含有一整套的遗传物质，故具有全能性，D正确。故选D。
【点睛】
植物组织培养时，生长素与细胞分裂素用量的比例影响植物细胞的发育方向：生长素与细胞分裂素比例适中时，有利于愈伤组织的形成；生长素/细胞分裂素比例较高时，利于根的分化；生长素/细胞分裂素比例较低时，利于芽的分化。
12．（2019·江苏高考真题）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
【答案】D
【分析】
转基因技术的原理是基因重组。基因重组和基因突变、染色体变异均属于可遗传的变异。
基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
【详解】
将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。故选D。
13．（2019·北京高考真题）甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种，以下对相关操作及结果的叙述，错误的是
A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
【答案】D
【分析】
由题意可知，同时抗甲、乙的植物新品种的培养过程为：把含抗甲的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗甲植株，同时把含抗乙的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗乙植株，通过杂交获得F1（二倍体植株），取F1的花粉经花药离体培养获得单倍体植株，用秋水仙素处理单倍体植株获得纯合的同时抗甲、乙的植物新品种（二倍体）。
【详解】
要获得转基因的抗甲或抗乙植株，需要构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点），再把基因表达载体导入受体细胞中，A正确；对转基因植株进行检测时，可以通过抗病接种实验进行个体水平的检测，B正确；对F1的花粉进行组织培养时，需要经过脱分化和再分化过程，其中生长素/细胞分裂素比例高时利于根的分化，比例低时利于芽的分化，C正确；经花粉离体培养获得的植株是单倍体，D错误。因此，本题答案选D。
14．（2021·山东烟台市·高三三模）科研人员在杂交瘤细胞的基础上，将两种杂交瘤细胞融合获得了双杂交瘤细胞，能够产生双特异性抗体，该抗体可同时结合α、β两种抗原。下列说法错误的是（ ）

A．制备双特异性抗体时需将抗原α、β分别注射到小鼠体内，获得免疫小鼠的脾脏细胞
B．用解离液处理免疫小鼠的脾脏细胞获得单细胞，再与小鼠的骨髓瘤细胞融合后可获得两种杂交瘤细胞
C．可用PEG试剂促进两种杂交瘤细胞的融合，成功融合后经过筛选可获得双杂交瘤细胞
D．在肿瘤治疗方面研制与肿瘤细胞和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，能特异性杀死肿瘤细胞
【答案】B
【详解】
略
15．（2021·辽宁抚顺市·高三一模）利用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵培育出转基因羊，但是人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。下列有关叙述错误的是（ ）
A．在该转基因羊中，人凝血因子基因一般存在于体细胞中
B．在该转基因羊中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞中
C．人凝血因子基因只在该转基因羊的乳腺细胞中选择性表达
D．人体细胞中凝血因子基因的碱基对数目是凝血因子氨基酸数目的3倍多
【答案】B
【详解】
略
16．（2021·山东泰安市·高三三模）中国科学院动物研究所进行了大熊猫的异种克隆，他们将大熊猫的体细胞核放入兔子的去核卵母细胞之中，并使其成功发育成囊胚，标志着异种核质相容的问题得到解决，异种克隆大熊猫迈过了第一道“坎”， 然后至关重要的是选择一种合适的“代孕母体”。下图是该研究的理论流程图，相关叙述正确的是（ ）

A．步骤甲和步骤乙中的供体和受体需要同期发情处理
B．重组细胞发育成早期胚胎所需营养主要来源于营养液
C．重组胚胎培养过程中为了避免杂菌污染，通常需要在培养液中加入抗生素
D．步骤乙表示胚胎移植，移植的早期胚胎应培养至囊胚或原肠胚
【答案】C
【分析】
题图分析：步骤甲为核移植，步骤乙为胚胎移植，其中诱导超数排卵用的是促性腺激素。
【详解】
A、步骤乙胚胎移植中的供体和受体需要同期发情处理，步骤甲中需要对兔子进行超数排卵处理，A错误；
B、重组细胞发育成早期胚胎所需营养主要来源于兔子的去核卵母细胞，B错误；
C、重组胚胎培养过程中通常需要在培养液中加入抗生素，避免杂菌污染，C正确；
D、步骤乙表示胚胎移植，移植的早期胚胎应培养至桑椹胚或囊胚，D错误。
故选C。
【点睛】

17．（2021·山东泰安市·高三三模）抗PD-L1单克隆抗体能与癌细胞膜表面的PD-L1特异性结合，因而具有治疗某些癌症的作用。如下图是制备抗PD-L1单克隆抗体的示意图，下列叙述错误的是（ ）

A．提取的脾B淋巴细胞有多种，是因为一种病原体可以诱导产生多种B淋巴细胞
B．多孔玻璃板中的细胞为B淋巴细胞和鼠瘤细胞的融合细胞
C．图中细胞集落a-d既能大量繁殖，又能产生抗体
D．图中细胞集落a可用于扩大化培养生产抗PD-L1单克隆抗体
【答案】B
【分析】
单克隆抗体的制备：
（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞。
（2）获得杂交瘤细胞：①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测。
（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。
【详解】
A、一种病原体上一般会有多个抗原位点，机体进行体液免疫时会产生多种B淋巴细胞，A正确；
B、多孔玻璃板中的细胞有三种融合细胞，即B淋巴细胞和鼠瘤细胞的融合细胞、B淋巴细胞和B淋巴细胞的融合细胞，鼠瘤细胞和鼠瘤细胞的融合细胞，B错误；
C、图中a-d是经过筛选的杂交瘤细胞，所以既能大量繁殖，又能产生抗体，C正确；
D、图中细胞集落a与PD-L1抗原反应呈阳性，说明能够产生特异性抗体，可以用于扩大化培养生产抗PD–L1单克隆抗体，D正确。
故选B。
18．（2021·山东泰安市·高三三模）核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。下图为针对某种RNA病毒抗原(S蛋白)研制DNA疫苗和RNA疫苗的思路：

下列相关叙述正确的是（ ）
A．该疫苗中核酸可作为抗原刺激人体产生体液免疫
B．步骤①中对S蛋白基因进行扩增，需要用到DNA聚合酶和解旋酶
C．步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，只需不破坏标记基因
D．核酸疫苗能在人体细胞中成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子
【答案】D
【分析】
核酸疫苗需要将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)导入动物体细胞内，此过程需要利用基因工程技术，基因工程的基本操作程序是：获取目的基因、构建基因表达载体，将目的基因导入到受体细胞，目的基因的检测和表达。
【详解】
A、该疫苗中核酸用来编码抗原蛋白，核酸本身不能作为抗原刺激人体产生体液免疫，A错误；
B、步骤①中对S蛋白基因进行扩增，利用的是PCR技术，该过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，B错误；
C、步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，不能破坏标记基因、启动子序列和终止子序列等，C错误；
D、核酸疫苗中的核酸源自病毒等病原体，其在人体细胞中能成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子，D正确。
故选D。
19．（2021·山东青岛市·高三三模）肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答，树突状细胞（DCs）与肿瘤细胞的融合细胞保持了DCs 和肿瘤细胞的特性，能高效地将肿瘤抗原呈递给免疫系统，激发机体的免疫应答，同时还可以维持较长时期的抗肿瘤免疫。这种方法在临床应用中有着非常诱人的前景。下列有关叙述错误的是（ ）
A．动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同
B．融合细胞主要激活B淋巴细胞产生免疫应答
C．树突状细胞可在体内起呈递肿瘤抗原的作用
D．体外培养动物细胞需要在培养液中添加适量抗生素
【答案】B
【分析】
1、植物的体细胞杂交是将不同植物的细胞通过细胞融合技术形成杂种细胞，进而利用植物的组织培养将杂种细胞培育成多倍体的杂种植株．在进行植物体细胞杂交时需要使用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁，使用化学方法（聚乙二醇）或物理方法诱导原生质体融合，不能用灭活的病毒诱导。可根据植物细胞的质壁分离和复原鉴定杂种细胞是否再生细胞壁，从而确定原生质体融合是否完成。
2、动物细胞融合的方法有：物理法（离心、振动）、化学法（聚乙二醇）、生物法（灭活的病毒）。
【详解】
A、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，都是膜的流动性，A正确；
B、清除肿瘤主要依赖细胞免疫，激活T淋巴细胞，融合细胞主要激活T淋巴细胞产生免疫应答，B错误；
C、树突状细胞能识别抗原，但无特异性，可在体内起呈递肿瘤抗原的作用，C正确；
D、体外培养动物细胞需要在培养液中添加适量抗生素，防止杂菌感染，D正确。
故选B。
20．（2021·山东青岛市·高三三模）精子载体法（SMGT）是将精子适当处理，使其携带外源基因，通过人工授精、体外受精等途径获得转基因动物的方法。该技术也是目前所报道的转基因效率最高的方法之一。下图是某研究所利用 SMGT法获得转基因鼠的示意图。下列相关叙述错误的是（ ）

A．完成过程①时需要将标记的外源基因与载体连接，以构建基因表达载体
B．将外源基因整合到精子的染色体上，是保证外源基因稳定遗传的关键
C．过程②为受精作用，必须在专用的受精溶液中才能顺利完成
D．进行过程④操作前，通常需要用一定的激素处理代孕母体
【答案】C
【分析】
1、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因．其中启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
2、胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理（选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体。用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理）；②配种或人工授精；③对胚胎的收集、检查、培养或保存（对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段）；④对胚胎进行移植；⑤移植后的检查。
3、胚胎移植的生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态．这就为胚胎的收集提供了可能。③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
【详解】
A、完成过程①时需要将标记的外源基因与载体连接，以构建基因表达载体，然后将基因表达载体通过显微注射的方法导入受体细胞中，A正确；
B、将外源基因整合到精子的染色体上，是外源基因可以随精子染色体的复制而复制，是保证外源基因稳定遗传的关键，B正确；
C、过程②为受精作用，受精在获能溶液或专用的受精溶液中完成，C错误；
D、进行过程④胚胎移植操作前，通常需要用一定的激素（促性腺激素）处理代孕母体，D正确。
故选C。
21．（2021·辽宁高三三模）ACC合成酶是乙烯合成的关键酶，乙烯的合成会影响番茄的储藏和运输。下图为科学家利用ACC合成酶基因的反向连接构建载体，通过基因工程设计的耐储转基因番茄流程图。


下列说法错误的是（ ）
A．引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键
B．反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，限制了细胞内乙烯的合成
C．可以在培养基中加入氨苄青霉素和四环素，存活下来的细胞内则含有携带目的基因的质粒
D．设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好的保证目的基因的反向连接
【答案】C
【分析】
分析题图，从番茄细胞中提取DNA后进行PCR，获得ACC合成酶基因，再将ACC合成酶基因反向连接构建基因表达载体，导入农杆菌，利用农杆菌转化法导入番茄组织，进行组织培养后获得耐储转基因番茄。
【详解】
A、引物能与ACC合成酶基因通过碱基互补配对结合定位ACC合成酶基因的位置，因此引物的特异性是能够从番茄DNA中获取ACC合成酶基因的关键，A正确；
B、反向连接的ACC合成酶基因合成的mRNA通过与正常的ACC合成酶基因的mRNA互补，使ACC合成酶基因不能正常表达，限制了细胞内乙烯的合成，B正确；
C、从题图中可知，基因表达载体中ACC合成酶基因破坏了四环素抗性基因，因此含有携带目的基因的质粒的细胞能在氨苄青霉素培养基中存活，但不能在四环素培养基中存活，C错误；
D、设计双酶切处理目的基因及载体是为了更好的保证目的基因的反向连接，D正确。
故选C。
【点睛】

22．（2021·天津和平区·高三三模）实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ）

A．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒
B．做RT-PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针
C．需要将样本中的RNA反转录为DNA后再进行扩增
D．病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原-抗体杂交
【答案】A
【分析】
根据题意，通过病毒的RNA进行逆转录产生cDNA，cDNA在PCR过程中解旋后可以和引物一起与模板结合，探针两侧有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，延申过程DNA酶破坏了探针使淬灭基团分离后发出荧光而检测到是否有cDNA来判断是否有病毒。
【详解】
A、若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者体内有该病毒RNA，即被检测者感染病毒，A错误；
B、PCR 需要根据目的基因的核苷酸序列合成引物，同时 RT-PCR 还需要探针与待测样本 DNA 混合，B正确；
C、PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA反转录为 DNA后再进行扩增，C正确；
D、RNA病毒的检测还可以通过特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体，原理是抗原-抗体杂交，D正确。
故选A。

【点睛】

23．（2021·山东济南市·高三二模）NRP—1是人体血管内皮生长因子的受体，在肿瘤新生血管形成与肿瘤细胞迁移、黏附、侵袭等方面起重要调控作用。为探究NRP—1MAb（NRP-l的单克隆抗体）对乳腺癌的治疗作用，研究人员以兔子为实验材料进行相关实验得到以下数据如图所示。下列叙述错误（ ）


A．据图推测，NRP—1MAb能够有效降低肿瘤的体积，中、髙剂量抗体的降低效果比低剂量的效果更显著
B．NRP—1MAb的制备过程中利用灭活的病毒诱导两细胞融合，其原理是利用了病毒表面的糖蛋白和相关酶与细胞膜表面的糖蛋白发生作用
C．将NRP—1反复给兔子注射，提取已免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合，再经选择性培养基筛选获得的杂交瘤细胞都能产生NRP—1MAb
D．治疗机理可能为NRP—1MAb．与NRP—1特异性结合，阻止了NRP—1与血管内皮生长因子的结合，从而抑制了肿瘤血管的生成和肿瘤细胞的分散转移
【答案】C
【分析】
曲线分析：根据实验结果可知，与对照组比较，NRP-1 MAb能够有效地降低肿瘤的体积，并且中、高剂量抗体的降低效果比低剂量的效果更显著。
【详解】
A、由曲线图可知，NRP—1MAb能够有效降低肿瘤的体积，中、高剂量抗体的降低效果比低剂量的效果更显著，A正确；
B、灭活病毒诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子中心排布，细胞膜打开，细胞发生融合，B正确；
C、进过选择培养基筛选的杂交瘤细胞并不能产生单一的抗体，还需要进行克隆化培养和抗体阳性检测最终筛选到能只产生NRP—1MAb的杂交瘤细胞，C错误；
D、根据题干信息“NRP—1是人体血管内皮生长因子的受体，在肿瘤新生血管形成与肿瘤细胞迁移、黏附、侵袭等方面起重要调控作用”，由此可推测，NRP—1MAb可能与NRP—1特异性结合，阻止了NRP—1与血管内皮生长因子的结合，从而抑制了肿瘤血管的生成和肿瘤细胞的分散转移，D正确。
故选C。
【点睛】

24．（2021·浙江衢州市·高三二模）夏洛来牛以其体型大，生长快，饲料转化率高而著名，科研工作者可以通过胚胎工程快速繁殖夏洛来牛。下列相关叙述正确的是（ ）
A．为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄牛产生更多的精子
B．对囊胚进行胚胎分割获得的后代个体基因型和表现型都完全相同
C．用胰蛋白酶将胚胎干细胞的膜蛋白消化后可获得分散的细胞
D．胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
【答案】D
【分析】
为了获得更多的子代，需要对雌性动物注射促性腺激素处理，使其超数排卵，其与获能的精子受精后可以形成受精卵。在受精卵发育到桑椹胚或囊胚时，可以对胚胎进行胚胎分割，以提高胚胎的利用率，此时要注意将囊胚的内细胞团均等分割。
【详解】
A、为获得更多的囊胚，一般采用给雌牛注射促性腺激素使其超数排卵，A错误；
B、胚胎分割是对同一个受精卵发育来的囊胚进行操作，因此形成的后代个体基因型应该相同，但表现型受基因型和环境的共同作用，因此后代个体表现型可能有差别，B错误；
C、胰蛋白酶可以将胚胎干细胞之间的蛋白质消化从而获得分散的细胞，不能将膜蛋白水解，C错误；
D、胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养，以提供细胞必须的气体环境，D正确。
故选D。
【点睛】

25．（2020·浙江衢州市·高三一模）下面是单克隆抗体制备过程示意图，1～6代表相关过程，a～e代表相关细胞，以下叙述错误的是（ ）

A．过程1是给小鼠注射特定抗原蛋白，以刺激小鼠产生相应抗体的B淋巴细胞
B．c细胞有三种种类，每种细胞染色体组数是相等的，e细胞是杂交瘤细胞
C．过程2的促融方法可以采用电融合技术，这种技术能击穿核膜促使核融合
D．过程3是抗体检测及克隆产生阳性细胞的过程，此过程要进行两次
【答案】C
【分析】
单克隆抗体技术是一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞进行细胞融合， 获得既能产生抗体， 又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
【详解】
A、过程1是给小鼠注射特定抗原蛋白，以刺激小鼠产生相应抗体的B淋巴细胞，以便后续的提取与单克隆抗体的制备，A正确；
B、c细胞有三种种类（B细胞-B细胞，B细胞-瘤细胞，瘤细胞-瘤细胞），每种细胞染色体组数是相等的，都是四个染色体组，e细胞是杂交瘤细胞，B正确；
C、过程2的促融方法可以采用电融合技术，这种技术能击穿细胞膜促使核融合，C错误；
D、过程3是抗体检测及克隆产生阳性细胞的过程，此过程要进行两次，第一次是检测获得杂交瘤细胞，第二次是收获能产生单抗的杂交瘤细胞，D正确。
故选C。
26．（2020·四川内江市·高三一模）2020年诺贝尔化学奖，颁给了两位基因编辑技术的女科学家，表彰她们开发了基因技术中最锐利的工具之一（ CRISPR/Cas9“基因剪刀”）。CRISPR/Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两个部分，向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑，其工作原理如图所示。下列说法错误的是（ ）

A．CRISPR/Cas9系统可应用于对人类遗传病的治疗
B．Cas9蛋白功能类似于基因工程中DNA连接酶的作用
C．向导RNA识别序列发生错配可能会导致基因被错误剪辑
D．向导RNA能通过碱基互补配对形成DNA- RNA 杂合双链
【答案】B
【分析】
根据题意分析可知：CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。
【详解】
A、据题干信息可知：CRISPR/Cas9系统最终能实现对靶基因序列的编辑，可利用该技术对因基因序列出错而导致的遗传病进行修正治疗，A正确；
B、由题干信息“向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA”，说明Cas9蛋白功能类似于基因工程中限制酶的作用，B错误；
C、CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成错误剪辑，其原因是其它DNA序列也含有与向导RNA互补的序列，造成向导RNA错误结合而出现错误剪辑，C正确；
D、据题干信息可知：向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，该序列之间通过碱基互补配对连接，会形成DNA- RNA 杂合双链，D正确。
故选B。
27．（2020·江苏泰州市·高三二模）研究人员常用饲养层细胞（与胚胎干细胞共同培养的失去分裂能力的细胞，用于支持胚胎干细胞的生长）分离培养胚胎干细胞，研究表明，胚胎干细胞高度未分化，具有形成畸胎瘤的可能性。下列有关叙述错误的是（　　）
A．体外培养胚胎干细胞可以不断增殖而不发生分化
B．胚胎干细胞可由早期胚胎或成熟性腺中分离得到
C．饲养层细胞可为胚胎干细胞提供各种细胞因子与贴附面
D．先将胚胎干细胞体外诱导分化为某特异组织再用于治疗，可防止形成畸胎瘤
【答案】B
【分析】
胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。
特点：具有胚胎细胞的特性，体积较小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物任何一种组织细胞。另一方面，在体外培养条件下，ES细胞可不断增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可以进行某些遗传改造。
【详解】
A、根据以上分析可知，胚胎干细胞在体外培养条件下，可不断增殖而不发生分化，A正确；
B、胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺，B错误；
C、胚胎干细胞培养时的饲养层细胞为胚胎干细胞提供营养与贴附面，C正确；
D、胚胎干细胞在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物任何一种组织细胞，因此将胚胎干细胞体外诱导分化为某特异组织再用于治疗，可防止形成畸胎瘤，D正确。
故选B。
28．（2020·天津高三一模）我国科学家成功将小鼠卵泡中卵母细胞周围的颗粒细胞转化为GV卵母细胞，进而恢复减数分裂并顺利培育出健康后代（如图）。下列叙述错误的是（ ）

A．过程①的实质是基因选择性表达，类似于脱分化过程
B．X细胞的遗传物质应与当初卵泡中卵母细胞的相同
C．X细胞受精后，会再释放出一个极体
D．过程③涉及体外受精、早期胚胎培养及胚胎移植等技术
【答案】B
【分析】
题图分析：①表示卵泡中的颗粒细胞经诱导，脱分化为多能干细胞，②表示GV卵母细胞减数分裂的过程，③表示受精作用产生后代过程。
【详解】
A、过程①卵泡中的颗粒细胞经诱导，脱分化为多能干细胞，其实质是基因选择性表达，A正确；
B、X细胞是卵泡中的颗粒细胞经由脱分化和减数分裂等过程形成的，故遗传物质与卵母细胞的不一定相同，B错误；
C、X细胞应处于减数第二次分裂中期才能与获能的精子受精，受精后继续进行减数分裂，故会再释放出一个极体，C正确；
D、过程③涉及体外受精，受精后要进行早期胚胎培养及胚胎移植，D正确。
故选B。
29．（2020·上海崇明区·高三二模）PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。图为PCR技术原理示意图，对于图中物质和过程说明错误的是（ ）


A．物质a：游离的dNTP
B．过程①：氢健断裂
C．过程②：边解旋边复制
D．过程③：遵循碱基互补配对原则
【答案】C
【分析】
1、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一--对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、-对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
2、DNA分子复制方式为半保留复制。
3、分析题图：①为变性，②为退火，③为延伸，a为游离的脱氧核苷酸。
【详解】
A、PCR模拟了体内的DNA复制，所以a是DNA复制的原料脱氧核苷酸，可由dNTP代替，A正确；
B、①为变性，在94°C高温条件下，DNA分子双螺旋解开，形成单链，此时氢键断裂，B正确；
C、体外模拟DNA的复制依据了DNA的热变性原理，该过程DNA分子不是边解旋边复制的过程，C错误；
D、DNA复制需要遵循碱基互补配对的原则，D正确。
故选C。
30．（2020·天津南开区·高三二模）下列与生物工程中有关的酶的说法，正确的是（ ）
A．胰蛋白酶和胃蛋白酶都能用于制备细胞悬液
B．限制性核酸内切酶和解旋酶都作用于氢键
C．逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板
D．DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成
【答案】D
【分析】
1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。其中限制酶和DNA连接酶的作用对象都是磷酸二酯键。
2、DNA连接酶和DNA聚合酶的区别：①DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键。
②DNA连接酶是同时连接双链的切口，而DNA聚合酶只是在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来。
③DNA连接酶不需要模板，而DNA聚合酶需要模板。
【详解】
A、胰蛋白酶可以使动物组织分散成单个细胞，可以用来制备细胞悬浮液，胃蛋白酶最适pH值接近于2，呈酸性，而细胞培养液的pH值接近于中性，所以不能用胃蛋白酶处理，A错误；
B、限制性核酸内切酶作用的是磷酸二酯键，B错误；
C、DNA连接酶是将两个DNA片段进行连接，其发挥作用时不需要模板，C错误；
D、DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成，D正确。
故选D。

二、选择题组
（2020·天津高考真题）阅读下列材料，回答下列小题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一：人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二：小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三：疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
31．目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是（ ）
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
32．在利用种间关系进行生物防治的措施中，下列分析错误的是（ ）
A．施用绿僵菌工程菌减少虫害，不改变绿僵菌与害虫之间存在寄生关系
B．引入Fhb7增强小麦的抗菌性，目的是调节真菌对植物的寄生能力
C．AS1工程菌分泌的多种表达产物不改变AS1与按蚊之间存在共生关系
D．使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是调节按蚊对人的寄生能力

【答案】
31．B
32．D
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、生物的种间关系包括竞争、捕食、互利共生和寄生。互利共生是指两种生物共居一起，彼此创造有利的生活条件，较之单独生活时更为有利；相互依赖，相互依存，一旦分离，双方都不能正常地生活。寄生是指一种生物生活在另一种生物的体内或体表，并从后者摄取营养以维持生活的种间关系。前者称寄生物，后者称寄主。大都为一方受益，一方受害，甚至引起寄主患病或死亡。
31．
A、目的基因可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或是人工合成，A错误；
B、资料一中神经毒素基因AalT导入绿僵菌中可以增强绿僵菌致死害虫的效应，资料二中Fhb7基因导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，资料三，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，因此上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B正确；
C、基因AalT导入绿僵菌中可用感受态细胞法，Fhb7基因导入小麦可用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中可用感受态细胞法，C错误；
D、要想达到生物防治的目的不一定要将目的基因导入防治对象，如资料一，可将目的基因导入能寄生在多种害虫体内的绿僵菌中，如资料三，可将目的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，这种方法同样可以达到生物防治的目的，D错误。
故选B。
32．
A、导入AalT基因的绿僵菌只是增强了致死害虫的效应，没有改变绿僵菌与害虫之间存在的寄生关系，A正确；
B、Fhb7基因导入小麦后，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，调节了真菌对植物的寄生能力，B正确；
C、AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，并不会改变AS1与按蚊之间存在的共生关系，C正确；
D、使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是阻断疟疾的传播，不会改变按蚊对人的寄生能力，D错误。
故选D。
（2021·福建三明市·高三三模）阅读下列材料回答下列小题
血友病是一种伴X染色体隐性遗传病，其中A型血友病是由于FⅧ基因（主要在肝脏中表达）发生基因突变导致丙的凝血因子Ⅷ含量降低或功能异常，已发现FⅧ基因突变类型达3000多种。
相关腺病毒载体（AAV）是A型血友病基因治疗常用载依，为单链DNA。FⅧ基因的结构域包括A1—A2—B—A3—C1—C2，改变A1结构中基因序列，使309位的丙氨酸替换为丝氨酸，可增加凝血因子Ⅷ的分泌，利用AAV为载体将编辑后的FⅧ基因插入到A型血友病猴肝细胞基因组后，成功高表达出了凝血因子Ⅷ，从而达到基因治疗的目的。
33．下列对材料分析，正确的是（ ）
A．改变FⅧ基因中的A1结构域属于基因突变
B．AAV碱基组成中嘌呤碱基数等于嘧啶碱基数
C．血友病女性患者的祖母与孙女也都是血友病患者
D．FⅧ基因突变类型达3000多种体现了基因突变的随机性
34．下列对材料分析，错误的是（ ）
A．选择肝细胞特异性的启动子可使FⅧ基因表达严格限于肝细胞
B．上述得到高表达凝血因子Ⅷ的操作过程属于蛋白质工程
C．质粒是基因工程常用的一种载体，在真核生物细胞中也有分布
D．将FⅧ基因插入到猴肝细胞基因组并成功表达属于体外基因治疗

【答案】
33．A
34．D
【分析】
1、基因突变：（1）DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。（2）基因突变的特点：普遍性、随机性、不定向性、多害少利性等。
2、基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗的靶细胞主要分为两大类:体细胞和生殖细胞。
【详解】
1.A、改变FⅧ基因中的A1结构域，使309位的丙氨酸替换为丝氨酸，即替换了FⅧ基因的碱基对，故属于基因突变，A正确；
B、AAV的遗传物质是单链DNA，碱基组成中嘌呤碱基数不一定等于嘧啶碱基数，B错误；
C、血友病是一种伴X染色体隐性遗传病，血友病女性患者的祖母与孙女不一定是血友病患者，但至少是携带者，C错误；
D、FⅧ基因突变类型达3000多种体现了基因突变的不定向性，D错误。
故选A。
2.A、选择肝细胞特异性的启动子，可使FⅧ基因表达严格限于肝细胞，A正确；
B、上述通过基因工程手段改造已有的编码蛋白质的基因得到高表达凝血因子Ⅷ的操作过程属于蛋白质工程，B正确；
C、质粒是基因工程常用的一种载体，在真核生物细胞中也有分布，C正确；
D、将FⅧ基因插入到猴肝细胞基因组并成功表达属于体内基因治疗，D错误。
故选D。
（2021·天津滨海新区·高三三模）阅读下列材料，回答下列小题：
材料一：2020年的诺贝尔化学奖授予了两位在基因组编辑技术（如CRISPR/Cas）领域作出杰出贡献的女科学家。这项技术的问世源自于人们在本世纪初对细菌抵御外来入侵者（如噬菌体）的机理研究（如图所示）：不少的细菌当第一次被特定的噬菌体感染后，细菌cas2基因开始表达出Cas2核酸内切酶（蛋白质），Cas2核酸内切酶会随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，并将切下的DNA片段插入CRISPR位点，形成“免疫记忆”。当细菌再次遭遇同种噬菌体时，由CRISPR位点转录产生的crRNA便会将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA处，并将之切断，即“免疫杀灭”。

材料二：在阐明CRISPR/Cas工作原理后不久，科学家们便据此发明了具有划时代意义的基因组编辑技术，其中最基本的形式便是基因的定点突变。在高等动植物细胞中，被切断的DNA会通过一种特殊的机制而连接在一起（即修复），但这个修复过程会导致碱基的随机缺失或增加，从而使基因发生突变。
35．对于细菌的免疫记忆和免疫杀灭过程的理解错误的是（ ）
A．核酸内切酶Cas2与基因工程的限制酶之间的区别主要表现在切割是否有序列特异性
B．细菌利用图所示的CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程，则相当于高等动物的非特异性免疫
C．核酸内切酶Cas9借助crRNA识别外来噬菌体身份可能是依靠碱基互补配对来实现
D．细菌中Cas2基因的表达需要噬菌体DNA的刺激
36．利用CRISPR/Cas工作原理，实现在高等动植物细胞中突变特定的基因，需要向细胞内导入的目的基因应是（ ）
A．cas2基因和crRNA编码基因 B．cas2基因和待突变基因
C．cas9基因和crRNA编码基因 D．cas2基因和cas9基因

【答案】
35．B
36．C
【分析】
切下的DNA片段插入CRISPR位点，相当于基因重组，CRISPR位点转录产生的crRNA将另一种核酸内切酶（如Cas9）准确带到入侵者DNA处，依赖于crRNA与入侵者DNA的碱基互补配对。
35．
A、核酸内切酶Cas2随机低效切断入侵的噬菌体DNA双链，与基因工程的限制酶之间的区别主要表现在切割是否有序列特异性，A正确；
B、高等动物的非特异性免疫包括皮肤、黏膜构成的第一道防线和体液中吞噬细胞和杀菌物质构成的第二道防线，针对所有病原体，细菌利用图所示的CRISPR/Cas分子装置剿灭入侵噬菌体的过程，具有特异性，B错误；
C、crRNA识别外来噬菌体身份，依赖于crRNA与入侵者DNA的碱基互补配对，C正确；
D、不少的细菌当第一次被特定的噬菌体感染后，细菌cas2基因开始表达出Cas2核酸内切酶（蛋白质），说明细菌中Cas2基因的表达需要噬菌体DNA的刺激，D正确。
故选B。
36．
利用CRISPR/Cas工作原理，实现在高等动植物细胞中突变特定的基因，需要有导向工具和切割工具，因此需要向细胞内导入的目的基因应是cas9基因和crRNA编码基因。ABD错误，C正确。
故选C。
【点睛】


三、多选题
37．（2020·江苏高考真题）小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞、制备流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）

A．为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子
B．细胞a和细胞b内含有的核基因不同，所以全能性高低不同
C．用胰蛋白酶将细胞a的膜蛋白消化后可获得分散的胚胎干细胞
D．胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养
【答案】ABC
【分析】
1、胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。
2、ES细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态．在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡机理提供了有效的手段。
【详解】
A、为了获得更多的囊胚，可以采用激素促进成熟雌性个体超数排卵，然后将卵细胞从母体内取出，在试管内与人工采集的精子进行体外受精，培育成胚胎，A错误；
B、细胞a和细胞b是由同一个受精卵经过有丝分裂形成的，故核基因相同，B错误；
C、运用细胞培养技术可以从哺乳动物的早期胚胎中获得胚胎干细胞，首先必须用胰蛋白酶处理内细胞团，分解细胞间的胶原蛋白等，使之分散成单个细胞，C错误；
D、动物细胞培养时需要在5% CO2的培养箱中进行培养，以维持培养液的pH，D正确。
故选ABC。
38．（2019·江苏高考真题）下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT-），在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述正确的是

A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合
B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长
C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产
D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础
【答案】ACD
【分析】
（1）动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性、细胞的增殖，诱导手段有电激、聚乙二醇、灭活的病毒等，结果产生杂交细胞，主要用于制备单克隆抗体。
（2）单克隆抗体制备的原理包括：①免疫理：B淋巴细胞能产生特异性抗体；②细胞融合原理：利用病毒对宿主细胞的穿透性使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合；③动物细胞培养技术：对杂交瘤细胞进行体内、体外培养。
（3）制备单克隆抗体过程中的几种细胞：①免疫B细胞（浆细胞）：能产生单一抗体，但不能无限增殖；②骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体；③杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能在体外培养条件下无限增殖。
【详解】
诱导动物细胞融合的方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒（如灭活的仙台病毒）等，A正确；两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞虽然能无限增殖，但缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，免疫B细胞虽然有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，但不具有无限增殖的本领，所以在HAT筛选培养液中，两两融合的具有同种核的细胞都无法生长，只有杂交瘤细胞才能生长，B错误；因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体，因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体，不一定都是人类所需要的，还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来，C正确；动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的，D正确。故选ACD。
39．（2021·山东烟台市·高三二模）SOD是一种广泛分布于各种细胞中的抗氧化酶，它能催化超氧阴离子自由基形成H2O2，增强植物的抗逆性。下图为培育能够产生SOD农作物新品种的一种方式，有关叙述错误的是（ ）

A．①过程中最常用的方法是采用显微注射技术将SOD基因导入植物细胞
B．②、③分别表示脱分化、再分化过程，无需严格的无菌操作
C．该育种方式利用了细胞工程和基因工程，能体现细胞的全能性
D．利用植物组织培养生产SOD时，需要将外植体培养到胚状体
【答案】ABD
【分析】
分析题图：SOD基因是目的基因，图中①表示采用基因工程技术将目的基因导入受体细胞的过程；②③表示植物组织培养过程，其原理是植物细胞具有全能性，其中②表示脱分化形成愈伤组织的过程；③表示再分化形成胚状体的过程。
【详解】
A、①过程中最常用的方法是采用农杆菌转化法将SOD基因导入植物细胞，A错误；
B、②、③分别表示脱分化、再分化过程，均需要在严格的无菌条件下完成，B错误；
C、该育种方式利用了细胞工程和基因工程，从植物细胞培育成植物个体，能体现细胞的全能性，C正确；
D、利用植物组织培养生产SOD时，只需要将外植体培养到愈伤组织即可，D错误。
故选ABD。
【点睛】

40．（2021·江苏南通市·高三三模）下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述，正确的（　　）
A．小鼠在特定条件下饲养，服用相关激素有促进超数排卵的作用
B．将成熟的卵母细胞与新采集的精子同时放在获能液中培养利于受精
C．注射到小鼠囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育
D．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，发育成的个体也会有形态学差异
【答案】ACD
【分析】
1、体外受精主要包括：卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能、受精。
2、囊胚：细胞开始分化，其中个体较大的细胞叫内细胞团将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部逐渐出现囊胚腔，注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化。
【详解】
A、小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射相关激素（促性腺激素）有促进超数排卵的作用，A正确；
B、处于减数第二次分裂中期的卵母细胞具有受精功能，可以和在获能液中获能的精子受精，B错误；
C、注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以分化形成各种组织，因此可以参与个体器官的发育，C正确；
D、分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，但生物的性状还受环境因素的影响，因此发育成的个体有形态学差异，D正确。
故选ACD。
41．（2021·山东青岛市·高三三模）我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因（An）导入矮牵牛中，使其花朵呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了其观赏价值。如图为 An 基因两端的序列和质粒中相关的序列，已知限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶 II的识别序列和切点是-↓GATc-。下列相关叙述错误的是（ ）

A．构建基因表达载体时需要使用限制酶Ⅰ切割质粒
B．新品种矮牵牛所呈现的颜色变异来源于基因重组
C．An基因在矮牵牛植株的所有细胞内都表达
D．Gene I、II 的上游和下游要添加启动子和终止子
【答案】CD
【分析】
1．基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2．在获取目的基因时，需要用到限制酶；构建基因表达载体时，还需要用到DNA连接酶和运载体。作为运载体，要有合适的限制酶切割位点，具有复制原点，有启动子和终止子，还需要有标记基因。
3．将目的基因导致受体细胞时，依据操作对象不同而采用不同的方法，对于植物采用农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，对于动物常用显微注射法，对微生物常用Ca2+处理然后再进行转化。
4．目的基因的检测与鉴定分三个方面：一是用DNA分子杂交检测目的是否导入受体细胞；二是检测目的基因是否转录，用DNA-RNA分子杂交；三是个体水平的检测，检测受体生物是否表达出相应的性状。
【详解】
A、由题可知，限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC，限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC，限制酶II能识别并切割限制酶I的识别序列，所以切割质粒时，只能用限制酶I，因为限制酶II能将质粒切割成两段，A正确；
B、由题可知，我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因（An）导入矮牵牛中，属于转基因技术，因此新品种矮牵牛所呈现的颜色变异来源于基因重组，B正确；
C、An基因能使矮牵牛其花朵呈现出自然界没有的颜色变异，基因具有选择性表达的特性，因此An基因在矮牵牛植株的花朵中表达，C错误；
D、质粒作为运载体，原本存在启动子和终止子，无需添加，D错误。
故选CD。
【点睛】

42．（2021·山东潍坊市·高三三模）已知B基因存在于水稻基因组中。其仅在体细胞和精子中正常表达。在卵细胞中不转录。研究人员将B基因编码蛋白的序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体导人到水稻愈伤组织中，示意图如下。下列有关说法正确的是（　　）


A．B-Luc融合基因的形成需要DNA连接酶的催化
B．构建B基因编码蛋白的cDNA文库，只能从水稻体细胞中提取全部RNA进行逆转录操作
C．B基因在水稻卵细胞中不转录，据图推测其可能的原因是卵细胞中该基因的启动子无法启动转录
D．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交实验可对获得的转基因植株进行鉴定筛选
【答案】AC
【分析】
基因工程中需要限制酶和DNA连接酶，构建基因表达载体需要启动子、终止子、目的基因、标记基因。
【详解】
A、将两个基因连接起来需要DNA连接酶，A正确，
B、B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录，B错误，
C、B基因在水稻卵细胞中不转录，据图推测其可能的原因是卵细胞中该基因的启动子无法启动转录，C正确，
D、将B基因编码蛋白的序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因，D错误。
故选AC。
43．（2020·山东临沂市·高三二模）目前，精子载体法逐渐成为最具诱惑力的制备转基因动物的方法之一。该方法以精子作为外源基因载体，使精子携带外源基因进入卵细胞。下图表示利用该方法制备转基因鼠的基本流程。下列说法正确的是（ ）

A．PCR扩增外源基因时，应根据外源基因设计引物碱基序列
B．导入外源基因的精子与卵细胞结合即可完成转化
C．②采用体外受精技术，受精的标志是观察到两个极体
D．②③过程所用培养液的成分相同且都加入动物血清
【答案】AC
【分析】
转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。
【详解】
A、PCR扩增外源基因时，需要设计引物，引物的设计是根据外源基因的碱基序列设计产生的，A正确；
B、由转化的概念可知，导入外源基因的精子与卵细胞结合的过程并不意味着完成转化，B错误；
C、②采用体外受精技术时，在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子完成了受精，C正确；
D、②过程在精子获能液或专用的受精溶液中进行，而③过程为早期胚胎培养过程，该过程所用培养液的成分为无机盐和有机盐、同时还需要有维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等，显然二者的成分不同，D错误。
故选AC。
44．（2020·江苏高三二模）如图为某一重组质粒示意图，下列叙述正确的是（ ）

A．用限制酶EcoR V处理该质粒得到的分子共含有4个游离的磷酸基团
B．同时用限制酶EcoR V和BamHⅠ处理该质粒可得到3个双链DNA片段
C．在获得目的基因时应该使用的限制酶是BamH I
D．将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞
【答案】ABD
【分析】
该重组质粒四个酶切位点，一个EcoRV位点在卡那霉素抗性基因中，BamHI位点在目的基因中。
【详解】
A、限制酶EcoRV在图中含有两个切点，用限制酶EcoRV处理该质粒可得到2个线性DNA分子，每个线性DNA分子含有2个游离的磷酸基团，共含有4个游离的磷酸基团，A正确；
B、限制酶EcoRV和BamHⅠ在图中共含有3个切点，同时用它们处理该质粒可得到3个双链DNA分子，B正确；
C、在获得该重组质粒时，不应该使用限制酶BamHI，若使用该限制酶，则会破坏目的基因，C错误；
D、将受体细胞培养于含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有目的基因的细胞，D正确。
故选ABD。

四、综合题
45．（2021·广东高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。

回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】基因文库中获取、人工合成法 盐析法、酶解法或高温变性 感受态 抗原-抗体杂交技术 有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】
本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
46．（2021·河北高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。
【答案】基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【分析】
1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
47．（2021·湖南高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：

（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_________断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_________。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________（答出两点即可），功能上具有_________。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路_________。
【答案】限制性核酸内切酶（限制酶） 磷酸二酯键 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害 动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答） 发育的全能性 B 用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、核移植：
（1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物；
（2）原理：动物细胞核的全能性；
（3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
【详解】
（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。用特定抗原刺激小鼠，然后取出已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，看筛选出杂交瘤细胞能否产生M蛋白的单克隆抗体，如果不能产生，说明M基因在克隆动物A中已失活。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。
48．（2021·全国高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
【答案】EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV 磷酸二酯键 自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】
（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
49．（2021·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。
（1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。
（2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。
（3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。
（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。
（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。
（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。
（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【答案】涂布分离 单菌落 筛选 未固定的细菌 降解富营养化污水污染物的能力 包埋法和吸附法 特定介质能为菌株繁殖提供X 遗传 间种 DNA聚合酶 愈伤组织 继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度
【分析】
1、分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法（平板划线法）和涂布分离法（稀释涂布平板法）。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体--菌落。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。
2、固定化酶( insoluble enzyme)就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。
3、植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程：外植体→愈伤组织→胚状体→新植体，其中脱分化过程要避光，而再分化过程需光。
4、在植物组织培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。
【详解】
（一）分析题意可知，本实验目的是从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备固定化菌株。
（1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。
（2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。
（3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。
（二）（1）生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，为保护三叶青的遗传多样性和保证药材的品质；三叶青的林下种植，是利用间种技术。
（2）分析题意可知，从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA），DNA复制需要DNA聚合酶，故可知，酚类化合物诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达，形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。根据植物组织培养技术过程可知，相应植物激素可以促使叶片细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成毛状根。
（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次继代培养，培养基中添加抗生素的主要目的是杀灭发根农杆菌。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的转速和温度，调节培养基成分中的营养元素以及生长调节剂的种类和浓度，获得大量毛状根，用于提取药用成分。
【点睛】
本题考查了特定微生物的分离、固定化技术及基因工程、植物组织培养的应用等相关知识，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识，准确判断问题的能力。
50．（2020·海南高考真题）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。

回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_______________。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计__________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为_________；出现阴性反应者，胚胎为_________。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是______________，检测的基本思路是_________________。
【答案】雄性原核较大，更容易容纳外源DNA 引物 雄性小鼠 雌性小鼠 抗原-抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功
【分析】
根据题意和图示分析可知：图示首先通过转基因技术将目的基因导入到成熟精子的染色体中，再通过体外受精作用将目的基因移入到受精卵中，再通过早期胚胎培养和胚胎移植，最终获得转基因鼠。
【详解】
（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
【点睛】
本题结合胚胎工程考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节；识记体外受精技术的过程，掌握早期胚胎培养的条件及胚胎移植的生理学基础，能结合图中信息准确答题。
51．（2020·北京高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
（1）纤维素属于__________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是__________。
（2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为____________________。
（3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是__________。

（4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为____________________。
（5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用__________。（举一例）
【答案】多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染
【分析】
基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端；
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
图2中对照组2也可以将纤维素进行分解，但其分解能力较弱。
【详解】
（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。
（2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。
（3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。
（4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1酶）。
（5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
【点睛】
本题以基因工程为核心，考查表达载体的构建、工程菌的实验的知识，难点是分析基因表达时DNA的方向，mRNA与DNA的模板链互补；（4）中结合实验目的找到自变量。
52．（2020·北京高考真题）研究者以拟南芥根段作为组织培养材料，探讨了激素诱导愈伤组织分化生芽的机制。
（1）离体的拟南芥根段在适宜条件下可以培育出完整的植株，说明植物细胞具有__________。在组织培养过程中，根段细胞经过__________形成愈伤组织，此后调整培养基中细胞分裂素（CK）与生长素的比例可诱导愈伤组织分化。
（2）在愈伤组织生芽过程中，CK通过ARRs（A）基因和WUS（W）基因起作用。为探讨A基因与W基因的关系，将A基因功能缺失突变体（突变体a）和野生型的愈伤组织分别置于CK与生长素比例高的（高 CK）培养基中诱导生芽，在此过程中测定W基因的表达量。图1中，野生型的W基因表达量与高CK诱导时间的关系是____________________。分析图1结果可得出的结论是：在高CK诱导下A基因促进W基因表达。得出结论的依据为：与野生型相比，________________________________________________。

（3）用转基因方法在上述突变体a中过量表达W基因，获得材料甲。将材料甲、突变体a和野生型三组愈伤组织在高CK培养基中培养，三组愈伤组织分化生芽的比例如图2，由此能得出的结论包括__________。
A．A基因在愈伤组织分化生芽的过程中起作用
B．w基因的表达产物调控A基因的表达
C．缺失A基因时W基因表达不能促进生芽
D．过量表达W基因可使生芽时间提前
【答案】全能性 脱分化 随着高CK诱导时间的延长，野生型的W基因表达量显著升高 随着高CK诱导时间的延长，突变体的W基因表达量低于野生型 ACD
【分析】
植物组织培养依据的原理为植物体细胞的全能性，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整植株的潜能；生长素和细胞分裂素能促进细胞分裂分化，在培养的不同时期对两者的比例会有不同要求，在再分化过程中，生长素高，促进根的分化，细胞分裂素比例高，促进芽的分化。植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。
【详解】
（1）离体的植物组织培养成完整植株的过程体现了细胞的全能性。已分化的细胞形成愈伤组织的过程称之为脱分化。
（2）由图可知，野生型的W基因表达量与高CK诱导时间的关系是随着处理时间的延长，W基因的表达量显著升高，突变体的W基因的表达量明显少于对照组，说明在高CK诱导下A基因促进W基因表达。
（3）由题可知，材料甲体内的W基因过量表达，突变体a的A基因不能表达，野生型是正常的，分析图2可知，由野生型曲线和突变体a曲线对比可知，A基因在愈伤组织分化生芽的过程中起作用，缺失A基因时W基因表达不能促进生芽；由材料甲曲线和野生型曲线比较可知，过量表达W基因可使生芽时间提前，故选ACD。
【点睛】
本题结合柱形图和折线图，考查植物组织培养过程分析，要求考生能够从题目中提取有效信息进行分析，并得出正确结论。
53．（2020·江苏高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）：

请据图回答问题：
（1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。
（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。

DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列

PCR引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′

（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′
【答案】限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B
【分析】
采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
【详解】
（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
【点睛】
本题主要考查PCR的过程和应用，意在强化考生对PCR技术的理解，要求考生能分析题图提取有效信息，从引物碱基序列、延伸方向等方面进行分析和解答，对考生的理解和分析能力提出了较高要求。
54．（2020·天津高考真题）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。

据图回答：
（1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。

（2）在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。
（4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是________________________________。
（5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________。
A．B细胞 B．T细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞
【答案】6 ABCD 3 核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 AB
【分析】
本题以自身免疫病和Ⅰ型糖尿病为背景，考查了基因工程的相关知识，乳酸菌是原核细菌，要表达人体的人胰岛素抗原，必须通过基因工程技术才能实现。图示中将人胰岛素编码序列进行了改造，再与一小段短肽编码序列结合形成重组人胰岛素编码序列，进而构成重组表达载体。
【详解】
（1）从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。
（2）要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。
（4）乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。
（5）人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。
【点睛】
本题综合考查细胞的结构和功能、免疫调节和基因工程等相关的知识点，考向灵活，各知识点联系紧密，需认真审题。
55．（2020·山东高考真题）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。

（1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____________。
（2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了______，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列___ (填：发生或不发生)改变，原因是_____________。
（3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____________。
（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____________。
【答案】限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合） 品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
【分析】
基因工程的操作步骤：
1、获取目的基因（从基因组文库中获取、利用PCR技术扩增目的基因、化学合成法）；
2、基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；一个完整的基因表达载体包括：
（1）启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动目的基因的转录；（2）目的基因：编码蛋白质的基因；（3）终止子：位于基因的尾端，其作用使转录在需要的地方停止；（4）标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
3、将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
4、目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】
（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。
（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。
（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
【点睛】
本题考查基因工程的知识点，要求学生掌握基因工程的操作工具和操作步骤是解决问题的关键。识记并理解基因工程中工具酶的种类和作用，把握基因表达载体构建的过程，理解启动子的功能和编码蛋白质的基因的结构，这是该题考查的难点；把握PCR扩增技术的操作过程和引物的作用，这是突破第（3）问的关键。
56．（2020·天津高考真题）某植物有A、B两品种。科研人员在设计品种A组织培养实验时，参照品种B的最佳激素配比（见下表）进行预实验。
品种B组织培养阶段
细胞分裂素浓度（μmol/L）
生长素浓度（μmol/L）
Ⅰ诱导形成愈伤组织
m1
n1
Ⅱ诱导形成幼芽
m2
n2
Ⅲ诱导生根
m3
n3

据表回答：
（1）Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是________________。
（2）在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中发生基因选择性表达的是________________阶段。
（3）为确定品种A的Ⅰ阶段的最适细胞分裂素浓度，参照品种B的激素配比（m1>2．0），以0．5 μmol/L为梯度，设计5个浓度水平的实验，细胞分裂素最高浓度应设为________μmol/L。
（4）Ⅲ阶段时，科研人员分别选用浓度低于或高于n3 μmol/L的生长素处理品种A幼芽都能达到最佳生根效果，原因是处理幼芽时，选用低浓度生长素时的处理方法为________，选用高浓度生长素时的处理方法为________。
（5）在________阶段用秋水仙素对材料进行处理，最易获得由单个细胞形成的多倍体。
【答案】细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ m1+1.0 浸泡法（长时间处理） 沾蘸法（短时间处理） Ⅰ
【分析】
愈伤组织是由一团未分化的细胞组成的，在组织培养中，条件适宜就会分化成各种组织。如果培养基中细胞分裂素和生长素的比例合适，会促进愈伤组织的生长，分化出根和茎叶；细胞分裂素太多时，有利于芽的分化、抑制根的形成；生长素用量太多时，有利于根的分化、抑制芽的形成；而当生长素少，细胞分裂素也不多时，则愈伤组织继续生长，不发生分化。基因的选择性表达是指基因在特定的时间和空间条件下有选择表达的现象，据此分析。
【详解】
（1）在诱导愈伤组织形成时，通常采用茎尖、幼叶做外植体，因为这些部位的细胞分裂能力强、分化程度低，全能性容易表达，容易诱导产生愈伤组织。
（2）Ⅰ过程愈伤组织形成是离体的植物细胞脱分化的结果，脱分化过程中细胞的结构和功能发生的明显改变，成为未分化状态；Ⅱ、Ⅲ过程形成幼芽、根的过程存在细胞的分化，分化和脱分化都存在基因的选择性表达，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段都存在基因的选择性表达。
（3）根据题意，表中数据为品种B的最佳激素配比，若要确定品种A的Ⅰ阶段最佳细胞分裂素浓度，以0.5μmol/L为梯度，可参考m1为中间值，故实验中细胞分裂素最高浓度可设为m1+1.0μmol/L。
（4）实验中用生长素处理插条的方法可选用浸泡法或沾蘸法，浸泡法时间长、所需浓度低，而沾蘸法处理时间短、所需浓度高；因此Ⅲ过程中分别选用浓度低于或高于n3μmol/L的生长素处理品种A的幼苗芽，选用低浓度生长素时的处理方法为浸泡法，时间长，而选用高浓度生长素时处理方法为沾蘸法，时间短，都能达到比较适宜的浓度，达到最佳生根效果。
（5）秋水仙素可抑制纺锤体形成，导致染色体加倍形成多倍体，愈伤组织分裂旺盛，故在Ⅰ阶段用秋水仙素处理，最易获得由单个细胞形成的多倍体。
【点睛】
本题以植物组织培养为背景，主要考查组织培养过程激素的使用，意在考查考生能理解所学知识的要点,把握知识间 的内在联系和分析数据、处理数据的能力。
57．（2020·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：
（1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。
（2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。
（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。
【答案】澄清度 95%乙醇 较小 抽滤 细菌悬液 灭菌 较小 粘性 抗性基因 全能性表达充分 显微注射 短 脱分化 生长素 根的分生组织 B
【分析】
发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
【详解】
（一）（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。
（2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。
（二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。
（2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。
【点睛】
本题主要考查果胶的降解、基因工程及植物克隆知识，要求学生熟悉教材，并能将理论知识与实际应用相结合。
58．（2020·全国高考真题）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。

（1）步骤①中需要使用的工具酶有________________。步骤②和③所代表的操作分别是________________和________________。步骤④称为________________。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的______________（答出2点即可）的限制。
（3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________（填相同或不同），原因是_________。
（4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有_____________（答出2点即可）。
【答案】限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 性别、年龄 相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵 体外受精、胚胎移植
【分析】
1、膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易,不会对动物造成伤害。此外,该系统可从动物一出生就收集产物,不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
2、基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
3、分析题图可知，步骤①为将W基因与运载体结合，构建基因表达载体；步骤②为将重组表达载体导入受精卵，常用显微注射法；步骤③为早期胚胎培养；步骤④为胚胎移植。
【详解】
（1）由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接粘性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为早期胚胎培养；步骤④为胚胎移植。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物,不受动物的性别和年龄的限制。
（3）在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。
（4）由分析可知，步骤③为早期胚胎培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。
【点睛】
本题考查基因工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的基本工具和操作步骤，掌握胚胎工程各项技术的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查。
59．（2020·全国高考真题）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。

回答下列问题：
（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_________________。
（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_________________。
（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于_________________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_________________。
（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有________________（答出2点即可）。
【答案】诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞 取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液 选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存 抗原与抗体的反应具有特异性 将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养
【分析】
由图可知，筛选1指用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，筛选2指进行克隆化培养和专一抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
【详解】
（1）实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。
（2）取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶处理获得单个细胞，加入培养液可以制成单细胞悬液。
（3）图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，故筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。
（4）获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，可以在体外培养液中进行培养，或在小鼠的腹腔中进行培养，使杂交瘤细胞大量增殖。
【点睛】
制备单克隆抗体的过程中，需要用到动物细胞融合和动物细胞培养，需要用到两次筛选，第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
60．（2020·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。
（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。
【答案】果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 喜好氧的 不耐酸的 稀释 涂布分离 酸碱指示剂 乙醇 过滤灭菌 染色法，渗透吸水或失水 化学合成 两种限制性核酸内切酶 扩增 细胞壁 胚胎发生
【分析】
泡菜制作：
①菌种：假丝酵母和乳酸菌；②发酵原理：在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，还有亚硝酸。③亚硝酸盐的测定：亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。
【详解】
（一）
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。
（二）
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。
（2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的粘性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。
【点睛】
本题考查选修教材中的相关知识，在学习本部分内容时，要求考生对所学知识进行对比、归纳，然后建立知识间的联系，做到夯实基础，学会融会贯通。
（2019·上海高考真题）接种疫苗是预防疾病的措施之一。图显示了某种DNA疫苗的制备与使用过程，人体内将产生抗r的抗体。

61．图所示抗原蛋白基因最可能是致病菌M的 。
A．特有致病基因 B．特有不致病基因 C．全部致病基因 D．全部不致病基因
62．图所示的1-IV阶段中，需要使用DNA连接酶的是 ______阶段。筛选含有目的基因的受体细胞，发生在______阶段。
63．图所示的第V阶段，抗原蛋白r和抗r抗体的不同 。
A．基因来源的物种 B．转录mRNA序列
C．表达两种蛋白的细胞 D．翻译时tRNA所来源的物种
64．结合图及所学的知识，比较DNA疫苗和致病菌M，用“是”或“否”填写表相关内容。

核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗




致病菌M




___________________

【答案】
61．B
62． Ⅰ Ⅳ
63．ABC
64．

核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
是
是
是
否
致病菌M
否
是
是
否
【分析】
1.基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
2.识图分析可知：某种DNA疫苗的制备与使用过程，其中Ⅰ表示从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体，Ⅱ表示将目的基因导入受体菌细胞，Ⅲ表示受体菌的扩增过程，Ⅳ表示筛选含有目的基因的受体菌，Ⅴ为基因疫苗的注射使用以及在人体细胞内表达出抗原蛋白的过程。
61．由于制备的疫苗往往是减毒或者灭活的，使其使其致病性但是具有抗原性的特点，因此推测图所示抗原蛋白基因最可能是致病菌M的特有不致病基因，制备成基因疫苗后表达的蛋白质具有抗原性，但是不具有致病性。综上所述，B符合题意，A、C、D不符合题意。故选B。
62．在如图所示的疫苗制备过程中，通常需要用到DNA连接酶的过程是Ⅰ表示从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体。根据以上分析可知，筛选含有目的基因的受体细胞，发生在Ⅳ阶段。
63．基因表达包含了转录和翻译，抗原蛋白r和抗r抗体属于两种不同的蛋白质，由不同的基因转录，故基因所来源的物种、转录出的mRNA碱基序列、翻译出的氨基酸序列都不同，翻译时tRNA所来源的物种相同。综上所述， A、B、C正确，D错误。故选ABC。
64．根据题意和识图分析可知，DNA疫苗是以致病菌M的特有不治病性基因为目的基因制成的，因此没有致病性。DNA疫苗以核苷酸式进入人体，在人体细胞内表达出相应的抗原蛋白，刺激机体发生特异性免疫。包括体液免疫和细胞免疫的过程，引起机体产生抗体和相应的记忆细胞，为二次免疫做好准备。致病菌M以病原体的形式进入人体，作为抗原被识别后引起机体发生体液免疫和细胞免疫，由于激发特异性免疫需要时间较长，因此初次免疫过程中会表现出明显的致病性。综上所述，表格内容如下：

核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
是
是
是
否
致病菌M
否
是
是
否
【点睛】
65．（2019·海南高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。
【答案】mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【分析】
基因工程的操作步骤：获取目的基因（基因文库获取、PCR、人工合成等）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（动物—显微注射法；植物—农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；微生物—钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平和个体水平）。
【详解】
（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
【点睛】
天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，即基因通过表达产生具有氨基酸序列的多肽链，加工后形成具有高级结构的蛋白质，进而行使生物功能。蛋白质工程与之相反，它是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列来进行改造。
66．（2019·江苏高考真题）利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。下图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题：

（1）对1号猪使用_________处理，使其超数排卵，收集并选取处在__________时期的卵母细胞用于核移植。
（2）采集2号猪的组织块，用__________处理获得分散的成纤维细胞，放置于37℃的CO2培养箱中培养，其中CO2的作用是________。
（3）为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行__________。产出的基因编辑猪的性染色体来自于_________号猪。
（4）为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有__________（填序号）。
①DNA测序 ②染色体倍性分析 ③体细胞结构分析 ④抗原—抗体杂交
【答案】促性腺激素 减数第二次分裂中期 胰蛋白酶（胶原蛋白酶） 维持培养液的pH 分割 2 ①④
【分析】
据图分析，图示基因编辑猪培育过程涉及的技术手段有转基因技术、核移植技术、早期胚胎培养技术和胚胎移植技术等，利用转基因技术将病毒外壳蛋白基因（目的基因）导入2号猪的体细胞核中，然后将2号猪的体细胞核移植到1号猪的去核卵母细胞中，再将重组细胞培养到囊胚并移植到3号猪的子宫中去，最后分娩产生了4号转基因克隆猪。
【详解】
（1）据图分析可知，1号猪提供的是卵母细胞，对其注射促性腺激素可使其超数排卵，获得的卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期才能进行核移植。
（2）将2号猪的组织块分散成单个的成纤维细胞需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，该细胞的培养应在37℃含5%的CO2的恒温培养箱中进行，其中CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（3）利用胚胎分割技术对图示早期胚胎进行分割，可以获得更多的基因编辑猪；据图分析可知，核移植的细胞核来自于2号猪，因此产出的基因编辑猪的性染色体来自于2号猪。
（4）检测病毒外壳蛋白基因（目的基因）是否导入4号猪，可以采用DNA分子杂交法检测目的基因的序列；目的基因表达的最终产物是蛋白质（病毒外壳蛋白），可以利用抗原-抗体杂交法进行检测，故选①④。
【点睛】
解答本题的关键是掌握转基因技术、动物细胞培养、胚胎移植等过程，能够弄清楚题图中不同的猪提供的结构和作用，明确核移植时的卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期，并能够选择正确的方法检测目的基因是否表达。
67．（2019·江苏高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。
【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接
【分析】
基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后会破坏四环素抗性基因（tetr）。
【详解】
（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶（EcoRV酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】
解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤——构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。
68．（2019·全国高考真题）植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。回答下列问题。

（1）植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有______________________（答出2点即可）。
（2）通过组织培养技术，可把植物组织细胞培养成胚状体，再通过人工种皮（人工薄膜）包装得到人工种子（如图所示），这种人工种子在适宜条件下可萌发生长。人工种皮具备透气性的作用是_______________________________。人工胚乳能够为胚状体生长提供所需的物质，因此应含有植物激素、___________和___________等几类物质
（3）用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物的___________进行组织培养。
（4）植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是______________________________________________（用流程图表示）。
【答案】能保持植物原有的遗传特性，繁殖速度快 有利于胚状体进行呼吸作用 矿质元素 糖 茎尖 含目的基因的细胞愈伤组织小植株
【分析】
植物组织培养的流程是：离体的植物器官、组织或细胞经脱分化形成愈伤组织，经再分化形成芽、根或胚状体，进而形成完整植株。植物组织培养技术在微型繁殖、制造人工种子、作物脱毒等方面具有广泛的应用。微型繁殖属于无性生殖的范畴，能够保持亲本的优良特性，实现种苗的快速大量繁殖。人工种子是以通过植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子，其中的如果胚乳可为“种子”的萌发提所需的供营养物质。以无病毒或病毒极少的茎尖为材料进行组织培养可获得高产优质的无病毒植株。
【详解】
(1) 植物微型繁殖是指用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有：保持优良品种的遗传特性；高效快速地实现种苗的大量繁殖。
(2) 人工种子的胚状体在进行细胞呼吸时，需要从外界环境吸收O2，并将产生的CO2释放到外界环境中，因此人工种皮具备透气性的作用是：有利于胚状体进行呼吸作用，以保持胚状体的活力。人工胚乳的作用是为胚状体的发育提供营养，因此应含有植物激素、矿质元素、糖等物质。
(3) 植物分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，因此为了获得脱毒苗，可以选取植物的茎尖进行组织培养。
(4)将含有目的基因的植物细胞培养为一个完整的转基因植物，需借助植物组织培养技术才能实现，其基本程序是：。
【点睛】
解题的关键是识记并理解植物组织培养的过程和植物组织培养技术在微型繁殖、制造人工种子、作物脱毒等方面的实际应用。在此基础上，从题意中提取有效信息，进而对各问题情境进行分析解答。
69．（2019·全国高考真题）培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。

回答下列问题。
（1）利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。用分化的植物细胞可以培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有__________。
（2）步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是____________。
（3）从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是____________。在新的培养基上愈伤组织通过细胞的____________过程，最终可形成试管苗。
（4）步骤⑥要进行照光培养，其作用是____________。
（5）经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的__________，这种繁殖方式属于____________繁殖。
【答案】全能性（或答：形成完整植株所需的全部基因） 形成层容易诱导形成愈伤组织 诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同 分化（或答：再分化） 诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用 遗传特性 无性
【分析】
根据题干信息分析，培养胡萝卜组织获得试管苗的过程利用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性；该过程中离体的组织块脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，最终培育成试管苗。
【详解】
（1）细胞全能性是指已经分化的细胞，仍然具有发育成完整生物体的潜能。根据题意分析，用胡萝卜的组织细胞可以培育成完整的植株，其原理是植物细胞的全能性。
（2）形成层细胞具有分裂能力，分化程度低，易形成愈伤组织，因此步骤③中切取胡萝卜块时强调要切取含有形成层的部分。
（3）步骤⑤为脱分化过程，步骤⑥为再分化过程，由于营养物质的消耗以及两个过程需要激素的比例要求等有所不同，因此由步骤⑤到步骤⑥的过程需要更换新的培养基；愈伤组织形成试管苗的过程为再分化。
（4）步骤⑥为再分化过程，需要进行光照，以诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用。
（5）植物组织培养技术属于无性繁殖，获得的后代可以保持亲本的遗传特性。
【点睛】
解答本题的关键是掌握植物组织培养的详细过程及其原理，明确离体的组织需要经过脱分化和再分化过程才能发育为完整的植株，并能够对不同过程进行合理的分析。
70．（2019·全国高考真题）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。
【答案】基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【分析】
基因工程的操作步骤：目的基因的获取（基因文库获取、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平—DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平—抗虫、抗病接种实验等）。
【详解】
（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库(CDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。
（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。
【点睛】
PCR的原理是DNA双链的复制，故类似于细胞内的DNA复制过程，需要模板、原料等条件。由于该过程中特殊的高温条件，需要用耐高温的DNA聚合酶。
71．（2019·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与果胶和果胶酶有关的问题：
（1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其原因除水果中果胶含量较高外，还因为______。
（2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分离或诱变后的微生物悬液进行______。
（3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量，其主要原因是果胶酶水解果胶使______。果汁生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓缩后再加入______。使之形成絮状物，然后通过离心、真空干燥等步骤获得果胶制品。
（4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点有______和可连续处理等。在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要有______和______。
（二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
（1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
（2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物）。
（3）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
（4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。
【答案】腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多 涂布分离（或划线分离） 水果组织软化疏松及细胞受损 95%乙醇 提高果胶酶的稳定性 固定化的方法 固定化所用的介质 单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花粉离体 胚的离体培养
【分析】
（一）果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散；果胶不溶于乙醇，是鉴别果胶的一种简易方法。
（二）目的基因表达产物在分子水平的检测包括DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交和抗原抗体杂交；生物变异在生产上应用时，可通过杂交育种、单倍体育种的方式获得稳定遗传的植株，单倍体育种的速度更快，相对的操作更加复杂。
【详解】
（一）
（1）腐烂的水果通常细胞壁被分解较多，所以含有能产生果胶酶的微生物较多；
（2）获取单菌落的方式有划线分离法和涂布分离法两种，本题中两种方式均可；
（3）果胶酶的作用是水解果胶，果胶位于植物细胞壁中，故水解果胶会使得水果组织软化疏松及使细胞受损；果胶不溶于酒精，故提取回收果胶需要使用95%乙醇，使果胶形成絮状物回收；
（4）固定化的果胶酶在处理含果胶的污水时，可提高果胶酶的稳定性并可连续处理；在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的因素有固定化的方法和固定化所用的介质。
（二）
（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；
（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；
（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；
（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。
【点睛】
本题考察①果胶和果胶酶的性质以及果胶酶的固定；②基因工程以及变异品种的筛选，考察学生对课本知识的理解和题干的阅读能力，考查理解能力和科学思维能力。在变异品种的筛选中，要求获得的是抗致病真菌能力强的细胞，则只加入致病真菌只能筛选具有抗致病真菌能力的细胞，需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，则需要添加高浓度的致病真菌，这对考查学生对筛选培养基的理解有一定的要求。
72．（2019·浙江高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与微生物培养及应用有关的问题：
（1）对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从__________时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转人G6玻璃砂漏斗中，采用__________方式可较快地进行过滤灭菌。
（2）酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加__________的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是__________。
（3）为筛选胞外A–淀粉酶分泌型菌种，一般从__________（A果园树下 B肉类加工厂周围 C 米酒厂周围 D枯树周围）获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个__________比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取__________用于检测酶活性。
（二）某农业生态工程示意图如下，回答下列问题；

（1）该农业生态工程体现的生态工程原理主要是__________。对该工程的经济效益分析，可从系统内部的投入和产出、__________、系统的有效贡献等三方面进行核算。
（2）若要提高该工程的经济效益，可采用农业生产的__________技术在桑基上再种植大豆，也可采用农业生态工程的__________技术放养适量的鸡鸭等动物以调整该工程的产业结构。
（3）某小组应用基因工程方法开展适用于该生态工程的抗虫植物改良研究。为提高将重组DNA分子导入受体细胞的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有____________________（答出2点即可）。农杆菌介导法是目前植物转基因的常用方法，该方法的基本过程是农杆菌感染植物时，__________，并将其插入到受体细胞的基因组中。欲获得稳定遗传的抗虫性强的转基因植物品种，则转入的抗虫基因必须能在受体细胞中__________。
【答案】达到设定的温度或压力值 抽滤 将淀粉分解成糖 作为碳源 C 水解圈直径与菌落直径 上清液 物质循环 系统的实际消费 间种 种植业和畜牧业合理优化 重组DNA的质量和浓度、受体细胞的生长状态与密度 携带目的基因的Ti质粒转移到受体细胞 稳定和高效地表达
【分析】
1、酿造果醋的原理：C6H12O6C2H5OH＋CO2，C2H5OH＋O2CH 3COOH＋H2 O。
2、生态工程的原理：物质循环再生原理、协调与平衡原理、整体性原理。
【详解】
（一）（1）对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用抽滤方式可较快地进行过滤灭菌，例如尿素。
（2）大米、高粱等原料中富含淀粉，醋化醋杆菌无法直接利用淀粉，应先将淀粉分解为糖。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中蛋白胨为微生物提供氮源，酵母提取物和甘露醇为微生物提供碳源。
（3）以淀粉原料生产酒时，淀粉需在淀粉酶的催化作用下水解为可以进行发酵的糖。因此，可从米酒厂周围获得土样，筛选胞外ａ–淀粉酶分泌型菌种。淀粉遇碘液变蓝，淀粉在ａ–淀粉酶的催化作用下水解生成糊精，糊精滴加碘液，不会变蓝。在培养基表面滴加碘液，由于菌种产生胞外ａ–淀粉酶水解淀粉形成透明圈，透明圈越大，说明ａ–淀粉酶的活性越高。因此，挑选透明水解圈直径与菌落直径比值大的菌落来筛选酶活性较高的菌种。然后利用液体培养基振荡培养进行扩增，再对培养液进行离心取上清液得到淀粉酶提取液，用于检测酶活性。
（二）（1）根据题图中农业生态工程示意图可知，蔗叶、蚕沙养鱼，塘泥作为甘蔗和桑树的肥料回到桑基和蔗基，桑叶养蚕，而桑葚、蚕茧、鱼和甘蔗均可加工，为人类利用，这样实现物质的良性循环。可从系统内部的投入和产出、系统的实际消费、系统的有效贡献等三方面分析该工程的经济效益。
（2）为了提高该工程的经济效益，可采用间种技术在桑基上种植大豆，也可以适量放养鸡鸭等动物来优化种植业和畜牧业等产业结构。
（3）为提高将重组DNA分子导入受体细胞的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有重组DNA的质量和浓度、受体细胞的生长状态与密度等。将重组DNA分子导入受体细胞方法有农杆菌转化法、显微注射技术和氯化钙处理法。其中农杆菌转化法是目前植物转基因的常用方法，该方法的基本过程是农杆菌感染植物时，携带目的基因的Ti质粒转移到受体细胞，并将其插入到受体细胞的基因组中。欲获得稳定遗传的抗虫性强的转基因植物品种，则转入的抗虫基因必须能在受体细胞中稳定和高效地表达。
【点睛】
1、识记无菌技术和微生物接种的常用方法及微生物的筛选等进行解答。
2、了解生态工程建设的意义，理解生态工程的概念和遵循的五项基本原理，利用生态工程原理，分析生态环境问题及探求解决问题对策。
3、了解基因工程的基本操作步骤程序，尤其是将重组DNA分子导入受体细胞这一步。
73．（2021·山东烟台市·高三三模）中国甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因（PDC）密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员构建了质粒A和质粒G（如图1、图2所示），利用酵母菌进行了相关实验探究。

（1）启动子位于基因首端，是____________的位点，启动子区域还存在着许多调控蛋白的结合位点，可影响基因的转录水平。PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在____________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行____________。
（2）利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导代谢缺陷型酵母菌，用不含____________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。质粒G上的AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，因此需获得待测蛋白与AD蛋白的融合蛋白用于后续筛选。科研人员从中国甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种____________与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点____________。（填序号1～5）作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（3）重组酵母Y187与Y1H能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图3阐述作出该推测的理由____________。
（4）筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于___________工程，该工程的起点是____________。
【答案】RNA聚合酶识别和结合 DNA连接酶 PCR 尿嘧啶 cDNA 2 接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性 蛋白质 预期蛋白质的功能
【详解】
略
74．（2021·福建三明市·高三三模）为提高小对磷元素的吸收能力，研究人员通过质粒P把水稻耐低磷因导入小麦细胞得到耐低磷转基因小麦，基本流程如下图。质粒P含3种限制酶（NheⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ）切割位点，全部切割可以得到F1、F2、F3、F4片段，标记基因和启动子分别位F1和F2片段中。耐低磷基因两侧的限制酶切割位点为NheⅠ和SalⅠ，据图回答下列问题：

（1）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是______法，还有基因枪法和我国科学家独创的______法。
（2）有人将质粒P用NheⅠ与SalⅠ双酶切割后，与耐低磷基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，得到的重组质粒不一定都是所需要的，原因是__________________。
因此，需采取以下步骤进行重组质粒的构建：
第一步，取质粒P用______和______酶切测，从中选取______片段备用；
第二步，另取质粒P用______和______酶切割，从中选取______片段备用；
第三步，将耐低磷基因与前两步选取的片段用DNA连接酶连接即可得到所需重组质粒。
（3）剥取小麦种子的幼胚接种在诱导培养基上经______形成愈伤组织，该过程需要的植物激素有_________，将重组质粒导入愈伤组织，培养一段时间后，还需要转移至______培养基上。
【答案】农杆菌转化法 花粉管通道法 质粒P有两个NheⅠ的酶切位点，得到的重组质粒可能有：①只含F4和耐低磷基因 ②只含F3和耐低磷基因 ③F4、耐低磷基因和F2-F1片段（反向连接） ④F3、耐低磷基因和F2-F1片段（反向连接）⑤F3、耐低磷基因和F1-F2片段。不符合要求 EcoRⅠ SalⅠ F1+F4 EcoRⅠ NheⅠ F2 脱分化 细胞分裂素和生长素 分化
【详解】
略
75．（2021·山东淄博市·高三三模）新冠病毒为单股正链RNA病毒，其主要表面抗原为S蛋白，由S基因控制合成。到目前为止，我国已有5款新冠病毒疫苗获批使用。5款疫苗按技术路径分为三类：灭活疫苗（Vero细胞）、重组新型冠状病毒疫苗（CHO细胞）和腺病毒载体疫苗。回答下列问题：
（1）以新冠病毒的RNA为模板，通过RT-PCR获取S基因（DNA）时需要的酶是________。在RT-PCR过程中，引物的作用是________。
（2）Vero细胞为非洲绿猴肾细胞的传代细胞系细胞，将新冠病毒接种到Vero细胞，经培养、灭活后可制成新冠病毒灭活疫苗。Vero细胞的培养应培养箱中进行，培养箱的气体环境为________，为利于Vero细胞生长，培养基中一般添加________。
（3）CHO细胞是中国仓鼠卵巢的细胞系细胞。CHO-GS是人工敲除了谷氨酰胺合成酶基因（GS基因）的CHO细胞，该细胞在不含甲硫氨酸硫氧胺（MSX）的培养基上不能生活。将________构建于质粒上并导入CHO-GS细胞后，该细胞可在不含MSX的培养基上生活，并产生S蛋白。
（4）腺病毒是DNA病毒，位于两ITR间的基因可以表达。其中，E1区控制合成的E1蛋白能启动基因组的复制。用腺病毒作载体，研制腺病毒新冠疫苗的技术路径如下图所示。

人工改造腺病毒DNA时，科研人员删除了E1区。删除E1区的好处是_________。重组S基因腺病毒在人胚胎肾细胞中不能完成复制，但在基因工程改造过的人胚胎肾细胞（细胞系293）中却能大量增殖，推测“基因工程改造”应是_____。
（5）新冠灭活疫苗采取2针免疫，重组新型冠状病毒疫苗采取3针免疫。多针免疫的目的是_______。
【答案】逆转录酶、Taq酶 界定要扩增的目的基因；是逆转录酶、Taq酶的结合部位；是子链延伸的起点 5%CO2、95%空气 血清 S基因、GS基因 限制腺病毒DNA的复制，提高安全性；增大对目的基因的载量 将E1基因导入人胚胎肾细胞 提高人体中记忆细胞数量和新冠抗体浓度
【分析】
（1）动物细胞培养的条件：①营养物质：由于目前人们对动物细胞所需的营养成分还未完全搞清楚，因此除了加入糖类、氨基酸、无机盐、微量元素、维生素、促生长因子外，还要加入血清、血浆等天然物质。②无菌、无毒的环境：定期更换培养基；为防止杂菌污染，加入抗生素。③适宜的温度和PH。④气体环境：O2是细胞代谢所必须的，CO2是调节培养液的PH，一般把细胞培养在含5%CO2、95%空气的混合气体的培养箱中。
（2）PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
【详解】
（1）通过RT-PCR获取的基因时，先在逆转录酶由RNA得到cDNA，再以cDNA为模板，在Taq酶的作用下通过PCR进行DNA扩增。在RT-PCR过程中，引物的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，是子链延伸的起点，同时也可以界定要扩增的目的基因。
（2）Vero细胞是动物细胞，动物细胞培养是培养箱的气体环境为(95%空气+ 5%的二氧化碳)。为利于vero加胞生长，培养基一般添加血清等天然成分。
（3）将S基因构建于质粒上并导入CHO-Gs细胞后，其表达后会产生S蛋白，(S基因控制产生S蛋白)，同时要想该细胞在不含MSX的培养基生活，还必须导入GS基因，则此细胞就可在不含MSX的培养基上生活，并产生S蛋白。
（4） E1区控制合成的E1蛋白能够启动基因组的复制，删除E1区后改造后的腺病毒缺少E1基因无法合成E1蛋白，从而限制腺病毒DNA的复制，提高安全性。重组后S基因腺病毒在人胚胎肾胞不能完成复刺，但在基因工程改造过程的人胚胎肾细胞中却能大量增殖，推则基因程改造的目的增大对目的基因的载量。
（5）多针免疫能促进机体产生更多的记忆细胞，并促进记忆细胞增值分化产生更多的浆细胞并产生抗体进而提高机体免疫力，所以多针免疫的目的是提高人体中记忆细胞数量和新冠抗体浓度。
【点睛】
该题通过基因工程考查了细胞免疫的应用，意在考查学生理解所学知识的要点，并能理论联系实际，解决实际问题的能力。
76．（2021·山东烟台市·高三二模）神经纤毛蛋白-1（NRP-1）能在肿瘤细胞内表达，是血管内皮生长因子的新型受体，通过参与多种信号转导来促进肿瘤血管的生成。研究人员从肿瘤细胞中扩增出NRP-1基因并将其导入大肠杆菌体内进行发酵培养，分离提纯相应NRP-1，并将其免疫小鼠，为靶向治疗乳腺癌（MCF7）提供抗NRP-1的单克隆抗体（NRP-1MAb）。

（1）利用PCR技术可以从肿瘤细胞的基因组中分离扩增得到完整的NRP-1基因，其原因是使用________的引物可以从模板DNA中扩增出该基因。该技术可用于基因工程四个基本步骤中的________步骤。
（2）NRP-1基因表达载体的构建如图1所示。表达载体上除了标注的DNA片段外，在NRP-1基因上游还必须拥有的DNA片段（箭头所示）是________，其作用是________。
（3）研究人员将分离提纯的NRP-1免疫小鼠后，取其脾脏中B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上不能存活的是________。选取检测抗体阳性的杂交瘤细胞进行体外培养时需要的气体环境是________。
（4）研究发现，NRP-1在MCF7细胞中高表达。将MCF7细胞制成单细胞悬液，等量注入4组裸鼠右前腋下，接种后3天开始给药NRP-1MAb（低剂量1mg/kg；中剂量5mg/kg；高剂量10mg/kg），共给药7次。每隔5天测算一次肿瘤的体积，如图2所示。分析上图可得出的结论是___。
（5）由题中信息推测NRP-1Mab抑制肿瘤的作用机理是：NRP-1 Mab与NRP-1 特异性结合，阻断了________，抑制了肿瘤血管生成，进而降低了肿瘤的体积。
【答案】与NRP-1基因两端特异性结合 获取目的基因和目的基因的检测与鉴定 启动子 RNA聚合酶识别和结合的位点，启动转录 未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞 95%的空气和5%的CO2 NRP-1MAb能有效的降低肿瘤的体积，中、高剂量抗体的降低效果比低剂量的更显著 血管内皮生长因子与NRP-1的结合
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
【详解】
（1）利用PCR技术可以获取目的基因，所以利用PCR技术可以从肿瘤细胞的基因组中分离扩增得到完整的NRP-1基因，其原因是使用与NRP-1基因两端特异性结合的引物可以从模板DNA中扩增出该基因。在检测与鉴定中，鉴定是否成功插入和转录需要提取出转基因生物的基因组DNA与探针进行杂交，而探针可以利用PCR技术扩增出来，所以PCR技术可用于基因工程四个基本步骤中的获取目的基因和目的基因的检测与鉴定。
（2）表达载体上需要启动子、终止子、目的基因和标记基因，所以除了标注的DNA片段外，在NRP-1基因上游还必须拥有的DNA片段是启动子，其作用是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动基因的转录。
（3）将分离提纯的NRP-1免疫小鼠后，取其脾脏中B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上不能存活的是未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞。选取检测抗体阳性的杂交瘤细胞进行体外培养时需要的气体环境是95%的空气和5%的CO2，CO2用于调节pH。
（4）注射不同剂量NRP-1Mab，在33天后，剥离肿瘤组织称重，根据图2的实验数据可知，NRP-1Mab比对照组的肿瘤体积小得多，且剂量越高，减小肿瘤体积的作用越明显，所以说明其能够有效地降低肿瘤组织的重量，中、高剂量抗体的降低效果比低剂量的更显著。
（5）由题中信息可知，NRP-1是血管内皮生长因子的新型受体并促进肿瘤血管的生成，所以NRP-1Mab抑制肿瘤的作用机理是：NRP-1Mab与NRP-1特异性结合，阻断了血管内皮生长因子与NRP-1的结合，抑制了肿瘤血管生成，进而降低了肿瘤的体积。
【点睛】
本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。
77．（2021·山东泰安市·高三三模）基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。可用于基因功能的研究和单基因遗传病的治疗。为研究小鼠细胞中基因X的功能，科学家通过同源重组法将小鼠胚胎干细胞中的基因X的活性消除并获得嵌合体小鼠。在制备置换载体时，将neor基因（抗新霉素基因）作为置换基因X的插入突变，同时在neor基因外侧添加HSV-tk基因，该基因的表达产物能将DHPG转化为有毒物质而使细胞死亡，如图甲所示。置换载体导入ES细胞后，可发生同源重组和非同源重组，如图乙所示。


（1）根据图甲可知，在构建基因X的置换载体时，需用相同的________酶切割基因X和_______，该酶的切割位点应位于__________，用相同酶切的目的是__________________。
（2）ES细胞在功能上具有的特征是_______________，常用____________技术将置换载体导入ES细胞，将置换载体导入ES细胞后，如何将发生同源重组的ES细胞筛选出来？并简述理由。方法：_________________________；理由：_______________________________。
（3）将嵌合体胚胎移植到受体小鼠并能在受体小鼠内存活的原因是：_______________。
【答案】限制酶 neor基因 基因X的内部和neor基因的两端 产生相同的黏性末端，便于被DNA连接酶连接 发育的全能性 显微注射 在培养基中加入新霉素和DHPG，培养导入置换载体的细胞 未成功导入的ES细胞中不含neor基因，不抗新霉素， 所以在培养基中无法存活。成功导入，但发生非同源重组的ES细胞中，HSK-tk基因可以表达，其产物会将培养基中的DHPG转化为有毒物质从而杀死ES细胞。只有发生同源重组的细胞，含有neor基因，同时无HSV-tk基因，可以在培养基中存活 受体对外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应
【分析】
1.胚胎移植的生理基础：
（1）供体与受体相同的生理变化，为供体的胚胎植入受体提供了相同的生理环境；
（2）胚胎在早期母体中处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能；
（3）子宫不对外来胚胎发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；
（4）胚胎遗传性状不受受体任何影响。
2.基因敲除技术是用外源片段整合到活体细胞DNA的同源序列中，使某个基因被取代或破坏而失活，是在DNA水平对细胞遗传信息进行改造的技术。基因敲除技术可使细胞的基因定点改变的原理是基因重组，其可使某个基因被取代或破坏而失活，故将来有可能用到癌症的治疗。
3.基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）在制备置换载体时，要将neor基因（抗新霉素基因）作为置换基因X的插入突变，因此在构建基因X的置换载体时，需用相同的限制酶处理基因X和neor基因，使它们形成相同的粘性末端。由图可知，neor基因需要插入到基因X的内部，并且在neor基因外侧添加HSV-tk基因，所以该酶的酶切位点应位于基因X的内部和neor基因的两端，该过程中用相同限制酶切割的目的是为了获得相同的黏性末端，便于被DNA连接酶连接。
（2）ES细胞具有发育的全能性。基因表达载体导入动物细胞时常用显微注射技术，导入后的ES细胞需要进行筛选，此时存在三种类型的细胞：未成功导入的ES细胞、成功导入但发生了非同源重组的细胞、成功导入发生同源重组的细胞。在未成功导入置换载体的ES细胞中，不含有neor基因，不抗新霉素，根据neor基因和HSV-tk基因的作用可知，若培养基中添加新霉素，此种细胞不能存活；若成功导入但发生非同源重组，根据图乙可知，HSV-tk基因可以正常表达，所以在培养基中加入DHPG后，HSV-tk基因的表达产物会将DHPG转化为有毒物质杀死ES细胞，此种细胞不能存活；而发生同源重组的ES细胞中，不再含有HSV-tk基因，所以在此培养基上能正常生存。因此要将发生同源重组的ES细胞（培养导入置换载体的ES细胞）筛选出来，可以在培养基中加入新霉素和DHPG。
（3）将嵌合体胚胎移植到受体小鼠并能在受体小鼠内存活的原因实际上就是胚胎移植成功的原理，即受体子宫对移入的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。
【点睛】
理解“基因敲除”技术的含义及其相关的有用信息是解答本题的前提，熟知基因工程的原理、工具及步骤是解答本题的关键，掌握胚胎移植的原理是解答本题的另一关键。
78．（2021·湖北高三二模）单克隆抗体技术在生物工程中有着广泛的应用，下图1是单克隆抗体制备流程图，下图2是我国科研人员为了准确筛选没有明显表型特征的某种微生物所采用的流程图，图4是某双特异性抗体作用示意图，双特异性抗体是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合。




（1）据图2分析，科研人员利用目标微生物编码膜蛋白的基因序列，构建____________，并导入用____________处理的大肠杆菌细胞中，获取大量膜蛋白。
（2）已知细胞合成DNA有“D途径”和“S途径”两条途径，其中“D途径”能被氨基嘌呤阻断。兔子的已免疫的淋巴细胞有上述两种途径，但一般不分裂增殖；兔子的骨髓瘤细胞中只有“D途径”，但能不断分裂增殖。据此，图1所示的__________（填“HAT培养基”/“多孔板”）中添加氨基嘌呤可以达到筛选目的，其原理是__________________________。
（3）将上述带有荧光的单克隆抗体与待分离微生物群体混合，目的是_______目标微生物。用流式细胞仪分离不同荧光强度的细胞，结果如图3所示。对结果进行比较，应从区域_____________（选填图中数字）的细胞中筛选目标微生物。

（4）与直接使用抗肿瘤药物相比，将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药，对人体的副作用更小，原因是______，体现的是双特异性单克隆抗体在_______________方面的用途。


【答案】基因的表达载体 Ca2+或CaCl2 HAT培养基 淋巴细胞和淋巴细胞自身融合细胞因缺乏在体外培养液中增殖的能力，故不能在HAT培养液中生长；骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞自身融合细胞在HAT培养液中因DNA合成途径被氨基喋呤阻断而不能进行DNA复制，而不生长。 标记 ② 双特异性单克隆抗体能将抗癌药物定向带到肿瘤细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。 治疗疾病（运载药物）
【分析】
1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、利用HAT培养基选择B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，在该培养基上B淋巴细胞不能长期存活，骨髓瘤细胞因为代谢缺陷也不能存活。
【详解】
（1）据图分析，科研人员利用基因工程将目标微生物编码膜蛋白的基因序列，构建基因表达载体，并导入用CaCl2处理的大肠杆菌细胞中，使目的基因增殖并表达可获取大量膜蛋白。
（2）杂交瘤细胞由淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而成，其合成DNA有“D途径”和“S途径”两条途径。“HAT培养基”有筛选作用，在添加了氨基嘌呤的HAT培养基中，杂交瘤细胞“D途径”虽然被氨基嘌呤阻断，但可通过“S途径”合成DNA，不断分裂增殖；而淋巴细胞和淋巴细胞自身融合细胞因缺乏在体外培养液中增殖的能力，而不能在HAT培养液中生长；骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞自身融合细胞在HAT培养液中因DNA合成途径被氨基喋呤阻断而不能进行DNA复制，也不生长。
（3）带有荧光的单克隆抗体与待分离微生物群体混合，可起到标记目标微生物的作用。加入抗体后荧光性强的场所说明含有目标微生物多，所以据图可知应从区域②的细胞中筛选目标微生物。
（4）双特异性单克隆抗体借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，这样既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。体现的是双特异性单克隆抗体在治疗疾病方面起到运载药物的用途。
【点睛】
本题考查单克隆抗体制备的过程和基因工程的基本操作步骤，意在考查学生对所学知识的理解与掌握程度，培养了学生分析图形、获取信息、解决问题的综合应用的能力。
79．（2021·天津滨海新区·高三三模）针对新冠病毒（SARS-CoV-2）的重组蛋白疫苗、核酸疫苗（包括 DNA疫苗和 RNA疫苗）等疫苗都在研发当中。下图为其中一种疫苗的研发思路，图中①~⑦表示过程，虚线箭头表示 NcoⅠ、SphⅠ、NheI、BamHⅠ的酶切位点（四种酶的识别序列详见表），标记基因 SUC2控制合成蔗糖酶，使 P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存。
限制酶
Nco I
Sph I
Nhe I
BamH I
识别序列和切制位点
C↓CATGG
CCATG↓C
G↓GATCC
G↓CTAGC．

（1）图中①过程需要使用_________酶先得到cDNA，再使用________技术扩增得到S基因。
（2）为使③过程顺利进行，需先使用限制酶_________和__________切割质粒B，选用两种限制酶对新冠病毒的S基因进行切割的目的是____________________________________________________（答出1点即可）。
（3）图中表示筛选的过程是_______（填编号），为达到利用标记基因筛选的目的，普通的P型酵母菌应该满足的条件是_______________________________。
（4）重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为 _______________，刺激机体产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足的条件之一是_______（选填“有”或“无”）SARS-CoV-2感染史，理由是________________。
【答案】逆转录 PCR NcoⅠ NheⅠ 防止S基因自身环化、防止S基因与运载体反向连接、防止运载体自身环化 ⑤ 不能合成蔗糖酶 抗原 无 有SARS-CoV-2感染史的志愿者血清中会存在一定量的相应抗体，对试验结果产生干扰
【分析】
分析题图：图中①为逆转录过程，②表示用限制酶切割获得目的基因，③表示构建基因表达载体，④表示将目的基因导入受体细胞，⑤表示筛选获得含有重组质粒的P型酵母菌，⑥表示目的基因的表达，⑦表示制备获得疫苗。
【详解】
（1）利用RNA得到相应DNA的方法为逆转录，起作用的酶为逆转录酶，在体外将DNA扩增的技术是PCR（聚合酶链式反应）。
（2）NcoⅠ的识别切割位点为C↓CATGG，NheⅠ的识别切割位点为G↓GATCC，C分子的两端分别有-GATC和GTAC-序列，根据碱基互补配对原则，可知需要用限制酶NcoI、NheI切割质粒B。由于同种限制酶切割得到的DNA片段两端黏性末端相同，用DNA连接配连接时可出现S基因自身环化以及S基因与运载体反向连接的现象，所以常选用两种限制酶对新冠病毒的S基因进行切割，目的是防止基因自身环化、防止S基因与运载体反向连接、防止运载体自身环化。
（3）图中表示筛选的过程是⑤（筛选含重组质粒的P型酵母菌），其质粒上的标记基因SUC2能控制合成蔗糖酶，使P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存，筛选时应使用以蔗糖为唯一碳源的培养基。为达到利用标记基因筛选的目的，普通的P型酵母菌应该满足的条件是自身不能合成蔗糖酶（普通的P型酵母菌不能利用培养基中的蔗糖生存）。
（4）重组疫苗注入志愿者体内后，S蛋白基因指导合成的S蛋白作为抗原，刺激机体产生特异性免疫过程，机体免疫系统产生能与之相结合的抗体，抗体的分泌量可作为检测疫苗对志愿者免疫效果的指标。参加临床试验的志愿者需要满足无SARS-CoV-2感染史，即未感染过新冠病毒，因为有SARS-CoV-2感染史的志愿者血清中会存在一定量的相应抗体，对试验结果产生干扰。
【点睛】
本题结合图解，考查基因工程的原理及技术，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，了解基因工程技术的相关应用，能结合图中信息准确答题。
80．（2021·江苏高三三模）长期高血糖可引发血管细胞衰老。科研人员为研究S蛋白在因高血糖引发的血管细胞衰老中的作用，以腺病毒为载体将编码S蛋白的S基因导入血管细胞，实现S蛋白在血管细胞中的大量表达。
（1）腺病毒的遗传物质为DNA，其复制需要E1， E2， E3基因共同完成。为将S基因导入腺病毒，科研人员首先构建了含S基因的重组质粒，过程如图1所示。

①科研人员将S基因用_______酶切后，用DNA连接酶连入质粒I，得到重组质粒I（图1甲所示），导入用__________________处理制备的感受态细菌。用添加抗生素的培养基筛选，对所长出的单菌落提取质粒，通过_______的方法可鉴定重组质粒I是否插入了S基因。
②用PmeI酶切重组质粒I获得DNA片段。将此DMA片段与质粒II（图1乙所示）共同转化BJ细菌。在BJ细菌体内某些酶的作用下，含同源序列的DNA片段（图1甲、乙所示的左臂、右臂）可以发生同源重组从而产生重组质粒II（图1丙所示）。使用添加_______的培养基可筛选得到成功导入重组质粒II的菌落。
③将含S基因的重组质粒II，用_______酶切后，获得改造后的腺病毒DNA。将其导入A细胞（A细胞含有E3基因，可表达E3蛋白），如图2所示。腺病毒DNA在A细胞内能够_______，从而产生大量重组腺病毒，腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上。
④综合上述信息，从生物安全性角度分析重组腺病毒载体的优点：_______（写出2点）。
（2）用含S基因的重组腺病毒分别感染正常人及糖尿病患者的血管细胞，使S蛋白在血管细胞中大量表达。
①提取正常人、糖尿病患者及两者转入S基因后的血管细胞的蛋白，用_______的方法检测I蛋白（一种能促进细胞衰老的蛋白）的表达量，结果如图3所示。

②实验结果显示_______血管细胞中I蛋白表达量最高，推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是_______。
【答案】BamH I和EcoR I CaCl2（或Ca+） DNA分子杂交 卡那霉素 Pac I 复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成 重组腺病毒只有在A细胞中才能够复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因 抗原-抗体杂交 糖尿病患者 S蛋白通过降低I蛋白的表达，抑制高血糖引发的血管细胞衰老
【分析】
题图分析，图1中甲是由S基因和质粒Ⅰ组成的重组质粒Ⅰ，乙为质粒Ⅱ，甲和乙中的同源区段左臂和右臂进行交换后形成丙重组质粒Ⅱ。分析图2：用Pac I酶切重组质粒Ⅱ后，将其导入腺病毒，再让成功导入S基因的腺病毒去感染A细胞，经培养后，可得到含S基因的重组腺病毒。
【详解】
（1）①据图1信息可知，甲中S基因两边的酶切位点是 BamHⅠ和EcoRⅠ，故将S基因用BamHⅠ和EcoRⅠ限制酶切割后，用DNA连接酶连入质粒Ⅰ，得到重组质粒Ⅰ；
用CaCl2处理可以使细菌处于感受态，即有利于重组质粒的导入状态。
鉴定目的基因是否成功导入受体细胞通常采用DNA分子杂交技术完成，因此鉴定重组质粒I是否插入了S基因，需要对所长出的单菌落提取质粒，通过DNA分子杂交技术来鉴定。
②用PmeI酶切重组质粒I获得DNA片段。将此DMA片段与质粒II（图1乙所示）共同转化BJ细菌。在BJ细菌体内某些酶的作用下，含同源序列的DNA片段（图1甲、乙所示的左臂、右臂）可以发生同源重组从而产生重组质粒II（图1丙所示），由图1中丙图可知，重组质粒Ⅱ上含有卡那霉素抗性基因，可以使用添加卡那霉素的培养基筛选得到成功导入重组质粒Ⅱ的菌落。
③结合重组质粒II可知，将含S基因的重组质粒II，用Pac I酶切后，获得改造后的腺病毒DNA。将其导入A细胞（A细胞含有E3基因，可表达E3蛋白）因此腺病毒在A细胞中能完成复制，即腺病毒DNA在A细胞内能够复制并指导腺病毒外壳蛋白的合成，从而产生大量重组腺病毒，但在宿主细胞中，腺病毒进入后并不整合到宿主细胞染色体上。
④结合上述信息可知，由于重组腺病毒只能在 A 细胞（含有E3基因）中才能够复制，即使侵染其他细胞，也不能复制；重组腺病毒进入宿主细胞后不整合到宿主细胞染色体上；腺病毒是人工改造的载体，不含致病基因等原因，所以实验具有安全性。
（2）①提取正常人、糖尿病患者及两者转入S基因后的血管细胞的蛋白，检测蛋白质的表达需要采用抗原--抗体杂交技术来完成，图3为用抗原--抗体杂交的方法检测I蛋白（一种能促进细胞衰老的蛋白）的表达量的结果。
②根据实验结果可以看出，糖尿病患者血管细胞中I蛋白表达量最高，但无论正常人还是糖尿病人，经过转基因后I蛋白表达量均下降，据此可推测S蛋白对高血糖引发的血管细胞衰老的作用及机制是S蛋白通过降低I蛋白的表达，进而抑制高血糖引发的血管细胞衰老，从而达到了延缓衰老的目的。
【点睛】
熟知基因工程的原理和应用是解答本题的关键，正确辨析图中重组质粒构建的过程是解答本题的前提，掌握基因工程的应用前景是解答本题的另一关键，能正确分析题中的相关信息从而获得合理的结论是解答本题的必备能力。
81．（2021·广东茂名市·高三二模）CCR5是HIV入侵机体细胞的主要辅助受体之--，某科学家通过基因编辑技术关闭CCR5基因，欲使基因编辑婴儿天生能抵抗艾滋病病毒的感染。基因编辑技术通过CRISPR/Cas9系统可人为选择DNA上的目标位点进行定点切割。回答下列问题：
（1）HIV入侵机体后，首先与靶细胞上的CD4受体结合，据此推测，___________细胞含有CD4受体比较多，是HIV攻击的主要细胞。若通过HIV抗体检测，某人的检查结果为阴性，他___________（填“有可能”或“不可能”）感染了HIV。
（2）动物细胞中没有编码Cas9的基因，可利用基因工程将其导入真核细胞中。在基因工程中的关键步骤是_______________，此过程需要的工具酶有___________。可用______方法将Cas9基因导入受体细胞。
（3）所谓关闭CCR5基因，其实就是敲掉CCR5基因上的32个碱基，从而使其发生__________，基因编辑技术与传统的基因工程相比，其优点是_____________________。
（4）有部分专家指出，通过基因编辑技术诞生的婴儿是否真的天生具有抗HIV能力，还不能完全确定，做出此判断的原因是_________________________________。
【答案】T 有可能 基因表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶 显微注射法 基因突变 它比传统的基因工程技术更准确，目的性更强 不能通过病原体感染实验进行验证（或无法确定HIV感染T细胞是否只由CCR5基因一种基因控制）
【分析】
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）HIV主要攻击T细胞，因此，T细胞含有CD4受体比较多；某人的检查结果为阴性也有可能感染了HIV，因为人体的免疫系统接受抗原刺激后，需要一段时间才能产生达到检测数量的抗体，该人可能是处于HIV感染初期。
（2）基因工程中的关键步骤是基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。将目的基因导入动物的受体细胞常用显微注射法。
（3）敲掉CCR5基因上的32个碱基造成了基因中碱基序列改变，因此是基因突变；CRISPR/Cas9系统可人为选择DNA上的目标位点进行定点切割，因此，基因编辑技术比传统的基因工程技术更准确，目的性更强。
（4）因为不能通过病原体感染实验进行验证婴儿是否真的天生具有抗HIV能力或无法确定HIV感染T细胞是否只由CCR5基因一种基因控制，因此，还不能完全确定通过基因编辑技术诞生的婴儿是否真的天生具有抗HIV能力。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合题干信息准确答题。
82．（2021·广东珠海市·高三二模）稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容。在非香型水稻品种中，Badh2 基因表达产物Badh2 蛋白能抑制香味物质 2AP 的合成，使得稻米丧失了香味。研究发现，香味物质 2AP 含量越高，稻米香味越强。为改良水稻的品质，科研人员利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术将非香型粳稻中的 Badh2 基因进行定点编辑，该技术是通过人工设计的单链向导 RNA（称 sgRNA）来识别且结合特定的 DNA 序列，并引导 Cas9 蛋白到相应位置剪切 DNA，最终获得Badh2 发生突变的 6 个基因编辑株系。请回答下列问题。


（注：WT-野生型，E2-6、E2-9、E2-11、E2-13、E3-6、E3-14分别是经基因编辑的6个Badh2突变株系。）
（1）构建编辑水稻 Badh2 基因的 CRISPR/Cas9 系统表达载体时，首先要依据____________ 的部分序列设计编码特定 sgRNA 的 DNA 片段，再将该 DNA 片段与含有 Cas9 基因的 Ti 质粒连接。
（2）将构建成功的表达载体通过农杆菌转化法导入水稻受体细胞，借助 Ti 质粒上的 T-DNA，将目的基因转移并__________________，从而使其得以维持稳定和表达。
（3）为了检测 Badh2 突变株系中 Badh2 基因的表达情况，研究人员分别提取了 Badh2 突变体和野生型植株的总 RNA，经逆转录过程获得总 cDNA，通过 PCR 技术可在总 cDNA 中专一性的扩增出 Badh2 基因的 cDNA，原因是___________________________________。
（4）6 个株系 Badh2 基因表达水平检测结果如上图所示，据图推测香味最强的株系为_________，原因是__________________________。
（5）综合上述信息，请推测 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑技术还在_________等方面具有广阔的应用前景。
【答案】Badh2基因 整合到受体细胞染色体DNA上 引物是根据Badh2基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Badh2基因的cDNA特异性结合） 株系E2-13 株系E2-13的Badh2基因表达水平最低，控制合成的Badh2蛋白最少，使得2AP合成量增加最多，稻米香味最强 基因治疗、研究基因功能、疾病治疗动物模型
【分析】
1、基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的基本工具（1）“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。（2）“分子缝合针”--DNA连接酶①两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a相同点：都缝合磷酸二酯键；b区别：E•coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键．DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。（3）“分子运输车”--载体①载体具备的条件：a能在受体细胞中复制并稳定保存；b具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；c具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。
3、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
【详解】
（1）CRISPR/Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两个部分，向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑，因此在对Badh2基因进行编辑时，需根据其碱基序列设计相关引物以合成DNA片段；构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接。
（2）利用农杆菌侵染的特点对植物细胞进行转化，借助Ti质粒上的T-DNA，可将目的基因转移到受体细胞内，为使目的基因能在受体细胞中稳定遗传和表达，还要确保目的基因整合到受体细胞染色体DNA上。
（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Badh2基因的cDNA，需要以Badh2基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Badh2基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Badh2基因的cDNA。
（4）由图分析可知，株系E2-13的Badh2基因的基因表达水平最低，控制合成的Badh2蛋白最少，使得2AP合成量增加最多，稻米香味最强。
（5）综合上述信息，CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术还在基因治疗、研究基因功能、疾病治疗动物模型等方面具有广阔的应用前景。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念和基本操作程序，意在考查学生的识记能力和图形分析能力，运用所学知识综合分析问题和解决问题的能力。
83．（2021·山东济南市·高三二模）COVID—19的抗原性与感染性与其表面的S蛋白（刺突糖蛋白）密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题。

（1）①过程所使用的酶为_______________，为保证PCR技术扩增S蛋白基因正常进行，该反应体系的主要成分有_______________。PCR技术中低温复性的目的是_______________。
（2）通过PCR技术可在cDNA分子中专一性扩增出S蛋白基因，其原因是_______________。PCR过程经过4次循环，需要的引物的数量是_______________个。
（3）构建好的重组质粒长度共2000bp，用限制酶HindⅢ及限制酶HindⅢ和BamHI分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamHI在重组质粒上有_____________个酶切位点。为使S蛋白基因在受体细胞中高效表达，需要把S蛋白基因正确插入重组质粒的_____________之间。
（4）目前人们注射的新冠疫苗中有一种为腺病毒载体疫苗。该疫苗是将S蛋白基因插入到改造之后的腺病毒基因组中，待腺病毒侵染人体后，可引发机体的免疫反应。请用文字和箭头写出腺病毒载体疫苗进入机体后产生抗体的过程____________。
【答案】逆转录酶 模板DNA、dNTP、引物、Taq酶 引物结合到互补DNA链 引物是根据S蛋白基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与S蛋白基因特异性结合） 30 3 启动子和终止子 S蛋白基因→mRNA→S蛋白作为抗原→体液免疫→抗体
【分析】
1、图甲中①是逆转录过程，②是经过复制形成双链cDNA，③是将S蛋白基因和质粒结合形成基因表达载体，图乙是用限制酶切割后形成的电泳图。
2、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
3、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】
（1）①过程是利用RNA合成DNA的过程，是逆转录，需要逆转录酶，PCR过程中，其反应体系的主要成分有模板DNA、dNTP、引物、Taq酶；低温复性的目的是让引物结合到互补DNA链。
（2）由于在PCR技术中引物是根据S蛋白基因的一段已知序列设计合成的，所以能够专一性的扩增出S蛋白基因。PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2，因此若一个该DNA分子在PCR仪中经过4次循环，需要24+1-2=30个引物。
（3）用HindⅢ将质粒2000bp切割后形成了形成了200bp、400bp和1400bp共3个片段，而用HindⅢ和BamHI将质粒切割后形成了200bp、420bp、560bp的片段，2000=420×2+560+200×3，所以一共形成了6个片段，因此有5个酶切位点，因此BamHI在重组质粒上有5-2=3个酶切位点；为使S蛋白基因在受体细胞中高效表达，需要把S蛋白基因正确插入重组质粒的启动子和终止子之间。
（4）腺病毒载体疫苗是S蛋白基因插入到改造之后的腺病毒基因组中，其表达的产物是S蛋白，作为抗原进入机体后刺激机体启动体液免疫产生抗体，其过程如下：S蛋白基因→mRNA→S蛋白作为抗原→体液免疫→抗体。
【点睛】
本题难点是根据电泳图分析出酶切位点，考生根据酶切的位点结合DNA分子的长度进行分析，同时识记PCR技术的基本操作要求。
84．（2021·江西南昌市·高三三模）新冠疫情发生后，重庆医科大学免疫研究中心科研团队仅用10天时间，快速成功地研发了新冠病毒（COVID-19）一系列抗体快速筛选技术，并成功获得新冠病毒全人源单克隆抗体。
（1）动物细胞体外培养需要无菌、无毒的环境。保证培养的细胞处于无菌、无毒环境的具体措施有：___________。（至少写出两点）。
（2）单克隆抗体制备过程中，运用了动物细胞融合技术，动物细胞融合是指___________。细胞融合是随机的，经选择性培养的目的是___________。还需进行___________，才能获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
（3）单克隆抗体的优点是___________。
（4）科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因（prG），该基因能激发动物细胞分裂，这为单克隆抗体的制备提供了更多的思路。除本题描述的制备单克隆抗体技术外，请从不同角度、再简要写出两种制备单克隆抗体的思路：
①________________。
②________________。
【答案】对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液 两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程 筛选出杂交瘤细胞 克隆化培养和抗体检测 特异性强、灵敏度高、可大量制备 通过基因工程向浆细胞中导入prG 利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的能无限增殖细胞中
【分析】
1、动物细胞的培养：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织，将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
2、单克隆抗体的制备过程是：对小动物注射抗原，从该动物的脾脏中获取效应B细胞，将效应B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞，克隆化培养杂交瘤细胞（体内培养和体外培养），最后获取单克隆抗体．诱导动物细胞融合的方法有：物理法（离心、振动）、化学法（聚乙二醇）、生物法（灭活的病毒）。
【详解】
（1）细胞培养过程需要在无菌、无毒的环境中进行。为了创造上述条件，通常需要对培养液和所有培养用具进行无菌处理；并在细胞培养液中添加一定量的抗生素；还要做到定期更换培养液等。
（2）动物细胞融合是指两个或多个动物细胞结合形成一个单核细胞的过程。细胞融合是随机的过程，因此需要筛选，第一次筛选是在特定的选择性培养基中进行培养，目的是获得杂交瘤细胞。第二次筛选是抗体检测和克隆化培养，获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
（3）单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、并可大量制备等优点。
（4）据题意，可以通过基因工程向浆细胞细胞核染色体DNA中导入prG或提取该浆细胞细胞核，和去核的无限增殖细胞融合为重组细胞，进行细胞培养产生单克隆抗体。
【点睛】
本题考查了单克隆抗体的制备过程和动物细胞培养等相关知识，意在考查考生的识图能力和理解所学知识要点，属于考纲识记和理解层次的考查。
85．（2021·广东梅州市·高三一模）水熊抗辐射能力是人类的千倍之多。研究发现水熊体内含有抗辐射基因Dsup，指导合成的Dsup蛋白可将X射线引起的DNA损害降低大约40%。研究者将Dsup基因转入模型动物细胞，以研究动物具有的抗辐射能力的机理。请回答下列问题∶
（1）若要获得Dsup基因，可将从水熊体细胞中提取_____作为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA，再进行PCR扩增。
（2）构建的表达载体含有Dsup基因及其启动子等，其中启动子的作用是_______。重组载体进入受体细胞，并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
（3）一般将基因表达载体导入动物的__________中，再对其进行胚胎早期培养，培养时需要的气体主要有O2和CO2，其中CO2的主要作用是_____。
（4）研究者利用_________技术筛选出 Dsup基因成功表达的胚胎进行移植。
【答案】mRNA 驱动基因转录 转化 受精卵 维持培养液中的Ph 抗原—抗体杂交
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）由于水熊的Dsup基因可以产生Dsup 蛋白，要获得Dsup基因，可从水熊体细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增；
（2）构建基因表达载体必需的工具酶是限制酶和DNA连接酶；构建的表达载体含有Dsup基因及其启动子、终止子等，其中启动子是位于目的基因首端的特殊的DNA序列，是RNA聚合酶的结合位点，显然启动子的作用是驱动基因转录。重组载体进入受体细胞，并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。
（3）一般将目的基因导入动物细胞的方法为显微注射法；受体通常是动物的受精卵细胞，因为该类细胞的全能性高，而后再对导入目的基因的受精卵进行胚胎早期培养，培养时需要的气体主要有O2和CO2，其中CO2能维持培养液中的pH保持稳定。
（4）基因成功表达的产物是蛋白质，据此可知要检测目的基因是否成功表达需要用抗原--抗体杂交技术筛来完成。
【点睛】
熟知基因工程的原理和操作流程是解答本题的关键，能根据题目信息进行合理的分析、综合从而得出正确的结论是解答本题的关键，目的基因的获取以及转化的概念是本题的易错点。
86．（2020·广西高三二模）垃圾分类已成为中国当前的新时尚。下图是对分类回收后的厨余垃圾进行处理的模式图：

请据图分析回答：
（1）将厨余垃圾中的油水转化为生物柴油，处理过程中利用了微藻，酵母菌等工程菌，这体现了生物多样性的______________________价值。
（2）菜叶，果皮等厨余垃圾经无毒处理后，作为饲料供牲畜利用，实现了能量的_____________________利用，从而大大提高了能量的______________________率。
（3）某批次厨余垃圾处理后，所生成的沼气彻底燃烧释放的能重，较固体有机物中储存的能量少，据图从生态系统能量流动的角度分析，原因__________________________________________。
（4）为了高效进行厌氧发酵，从发酵过程分析，除了需考虑所选取的厌氧菌的种类与产沼气效率外，还要考虑__________________________________________。另外，从发酵原料用度考虑，为了提高沼气生产速率还应__________________________________________。
【答案】直接 多级 利用 部分能量储存在沼渣中，部分能量通过厌氧菌呼吸作用以热能散失，另有部分能量储存在厌氧菌体内 发酵所需的环境条件 对固体厨余垃圾进一步分类，选出适合厌氧发酵的作为原料（或对原料进行粉碎，使垃圾与厌氧菌充分接触）。
【分析】
根据图文分析，图中是利用生态工程的原理处理厨余垃圾，将有废弃物转化为有用的能源，实现能量的多级利用。
生态工程利用的原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理、整体性原理和系统学和工程学原理。
【详解】
（1）利用微生物进行发酵，产生对人类有用的代谢产物，体现了生物多样性的直接价值。
（2）菜叶、果皮中有机物的能量不能直接被人类使用，通过无毒处理后，作为饲料，将能量传递到牲畜体内，实现了能量的多级利用，提高了能量的利用率。
（3）不考虑燃烧效率，仅从生态学能量流动角度分析，固体有机物的部分能量储存在沼渣中，厌氧微生物也将利用固体有机物用于其自身的呼吸以热能散失、另有部分能量储存在厌氧菌体内。
（4）为了高效进行厌氧发酵，从发酵过程分析，除了需考虑所选取的厌氧菌的种类与产沼气效率外，还要考虑发酵所需的环境条件，比如气体调节、温度、pH等。从发酵原料角度考虑，为了提高沼气生产量还应对固体厨余垃圾进一步分类，选出适合厌氧发酵的作为原料。
【点睛】
本题考查生态工程的相关知识，要求考生识记生态工程的原理，掌握生态工程依据的生态学原理，意在考查考生理解所学知识并能从题目所给的图形中获取有效信息处理信息的能力。
87．（2020·陕西榆林市·高三一模）绞股蓝又名七叶胆，是一种含有中草药成分的天然植物。具有清心提神、抗疲劳、清热解毒、祛痰止咳、降低胆固醇和血脂等功效。不仅如此、绞股蓝细胞中还含有抗烟草花叶病毒（TMV）的基因，可以合成一种抗TMV蛋白，使其叶片对TMV具有抗感染特性。烟草是具有经济价值的双子叶植物，TMV的感染会导致烟草大幅度减产。科研人员利用基因工程技术培育出了抗TMV的烟草。主要流程如图所示。


（1）从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中①过程需要_____酶。在体外通过_____技术可以获得较多的目的基因。
（2）图中能体现基因工程核心的是_____过程（用图中的数字表示），该过程要用到的酶是_____。
（3）④过程表示将重组Ti质粒导入烟草体细胞，常用方法是_____。
（4）由图分析，在③过程构建的重组Ti质粒上应该含有的标记基因是_____基因。
（5）⑤过程中，烟草体细胞经过_____形成愈伤组织，然后经过再分化形成再生植株。
（6）在个体水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是_____。
【答案】反（逆）转录 PCR扩增 ③ 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 农杆菌转化法 卡那霉素抗性 脱分化 用TMV感染烟草，观察烟草是否出现患病症状
【分析】
1、基因工程是狭义的遗传工程，基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获取、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞也称(宿主)细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
2、识图分析可知，图中①为逆转录过程，②为获取目的基因，③是基因表达载体的构建，④是将基因表达载体导入受体细胞，⑤利用标记基因进行筛选的过程，⑥是目的基因的检测与鉴定过程。
【详解】
（1）由RNA合成DNA称为逆转录，需要逆转录酶。在体外通过PCR扩增技术可以获得较多的目的基因。
（2）基因工程操作程序中，基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。即图中的过程③，图中构建基因表达载体的过程中，切割含目的基因的DNA时用到限制酶，使其与质粒产生相同的黏性末端，将目的基因与质粒连接时用到DNA连接酶。
（3）将重组Ti质粒导入植物细胞，常用农杆菌转化法。
（4）从培养基含有卡那霉素可知，在③过程构建的重组Ti质粒上应该含有的标记基因是卡那霉素抗性基因，它的作用是鉴定和筛选成功导入目的基因的受体细胞。
（5）愈伤组织是一团未分化的细胞，烟草体细胞高度分化，因此需先经过脱分化形成愈伤组织，在经过再分化形成再生植株。
（6）图中⑥过程还需要进行的基因工程操作步骤是目的基因的检测与鉴定，用TMV感染烟草，观察烟草是否出现患病症状，可以在个体水平上检验获得的烟草能否抗TMV。
【点睛】
本题主要考查基因工程及植物组织培养的知识，要求学生有一定的分析处理问题的能力。要求学生掌握基因工程的操作工具和操作的程序，把握基因表达载体的构建过程，能够正确识图判断图中的操作过程，理解标记基因在筛选中的作用，识记植物组织培养的关键步骤。
88．（2020·四川内江市·高三一模）2017年11月27日，世界上首只体细胞克隆猴中中诞生，10天后第二只克隆猴华华诞生。2018年1月25日，国际权威学术期刊《细胞》以封面文章形式在线发布了这一重要成果，该成果表明我国在灵长类体细胞核移植技术研究方面已经走在世界前列。中中和华华诞生的实验流程如图所示，回答下列问题：

（1）克隆猴在培育过程中用到的细胞工程技术主要有_____、_____、_____等。
（2）上述实验操作中，选择卵母细胞的原因可能是_____。
（3）克隆猴“中中”和“华华”核基因组理论上与_____（填“甲”“乙”或“丙”）猴一致；“中中”和“华华”的某些性状与核基因组供体并不完全相同，除环境因素外，产生此现象的主要原因是_____。
（4）与克隆羊多莉培养成功一样，克隆猴的成功也证明了_____。
【答案】核移植 早期胚胎培养 胚胎移植 卵母细胞的细胞质中含有能使已分化的细胞核表达出全能性的营养和物质 甲 卵母细胞的细胞质中遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 动物细胞的细胞核具有全能性
【分析】
细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。细胞核移植，就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。前者为供体，可以是胚胎的干细胞核，也可以是体细胞的核。受体大多是动物的卵子。因卵子的体积较大，操作容易，而且通过发育，可以把特征表现出来，因此细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中，细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系;探讨有关遗传，发育和细胞分化等方面的一些基本理论问题。
【详解】
（1）克隆猴在培育过程中用到的细胞工程技术主要有：核移植、早期胚胎培养、胚胎移植。
（2）卵母细胞做受体细胞的原因：卵母细胞的细胞质中含有能使已分化的细胞核表达出全能性的营养和物质。
（3）甲提供的细胞核，克隆猴“中中”和“华华”核基因组理论上与甲候一致，“中中”和“华华”的某些性状与核基因组供体并不完全相同，除环境因素外，产生此现象的主要原因是：卵母细胞的细胞质中遗传物质会对克隆动物的性状产生影响。
（4）细胞核移植技术的理论基础是：动物细胞的细胞核具有全能性。与克隆羊多莉培养成功一样，克隆猴的成功也证明了动物细胞的细胞核具有全能性。
【点睛】
解答此类题目的关键是掌握克隆技术的特点及过程。
（2020·上海闵行区·高三一模）自2019年12月新型冠状病毒（COVID-19）引发肺炎疫情以来，许多国家正加紧研制相关疫苗。若欲制备和使用DNA疫苗，应先制备含病毒抗原基因的重组质粒，再将其注入人体，最终表达出具有疫苗性质的蛋白质。左图是备选质粒。右图是含有抗原基因的一段DNA，逆转录自COVID-19。图中涉及的BamHI、HindII、PstI三种限制酶的识别序列和产物均不同。

89．为使目的基因与备选质粒高效拼接，构建重组质粒应选用__________（限制酶），理由是_______________________________________________________________________________。
90．若备选质粒被HindⅢ限制酶切割后产生的单链末端是AGCT-，切割位点在A与A之间，则HindⅢ的识别序列最可能是__________。
A．-AAGCTT- B．-AGCT- C．-TAGCTA- D．-AAGCT-
91．若注入人体的DNA疫苗已成功免疫，则涉及的生理过程是__________。
①有丝分裂 ②减数分裂 ③细胞分化 ④转录 ⑤翻译
A．①③④⑤ B．②③④⑤ C．②④⑤ D．①④⑤
猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，培育出抗猪瘟病毒猪。如下图所示，该技术主要由Cas9蛋白与向导RNA的复合物共同完成，其中向导RNA可识别LamR基因中的特定序列。

92．据上图推测，Cas9蛋白与向导RNA的复合物功能类似于_____________。
93．中科院生物学家将LamR基因中的C·G编辑为T·A，此过程改造前后的两种LamR基因之间的关系是_______________。
A．等位基因 B．同源染色体上的非等位基因
C．连锁基因 D．非同源染色体上的非等位基因

【答案】
89． HindⅢ和PstⅠ BamHⅠ破坏抗原基因（或且的基因），不能选；使用HindⅢ和PstⅠ双酶切，在切开质粒、切下且的基因的同时破坏标记基因①，避免自身环化而使目的基因与质粒高效拼接
90．A
91．A
92．限制酶
93．A
【分析】
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与表达：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
89．
由图示可知，BamHⅠ破坏抗原基因（或目的基因），不能使用；若只用限制酶PstI切割目的基因和质粒，会产生引起目的基因和质粒的自身环化，不能达到高效连接的目的，因此，使用HindⅢ和PstI双酶切，在切开质粒、切下目的基因的同时破坏标记基因①，避免自身环化，从而达到使目的基因与质粒高效拼接的目的。
90．
若备选质粒被HindⅢ限制酶切割后产生的单链末端是AGCT-，切割位点在A与A之间，则HindⅢ的识别序列最可能是在左侧连上A，根据碱基互补配对原则，右侧应连上T，故其识别序列为一AAGCTT一；而-AGCT-和-TAGCTA-都没有AA序列，序列-AAGCT-不是反向重复序列，因此A正确，故选A。
91．
若注入人体的DNA疫苗已成功免疫，则DNA疫苗起作用并控制产生相应的抗原蛋白，则在该过程中需要经过细胞分裂、分化过程，又知蛋白质的合成需要相应DNA指导合成，该过程需要经过转录和翻译两个过程，即需要经过①有丝分裂、 ③细胞分化、④转录和 ⑤翻译过程，即A正确。故选A。
92．
分析图3，Cas9蛋白与向导RNA的复合物与基因结合后，使DNA发生断裂，其功能类似于限制酶的作用。
93．
中科院生物学家将LamR基因中的C·G编辑为T·A，图3中LamR基因被切断后，重新连接前，会切掉或增加几个碱基对，此过程导致的变异属于基因突变。改造前后的两种LamR基因之间的关系是等位基因，即A正确。故选A。
【点睛】
本题考查基因工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的具体步骤及相关细节；识记胚胎移植的基本程序；掌握目的基因检测与鉴定的方法，能结合所学的知识准确答题。
（2020·上海高三一模）苹果切开或咬开后不久颜色便会加深，这种现象称为“褐变”。褐变是由位于细胞器中的多酚氧化酶（PPO）催化位于液泡中的多酚类物质（如绿原酸等）生成棕色色素所致。据此，科研人员培育出了褐变能力显著降低的转基因苹果，其工作流程如图所示。

94．根据题干信息判断，要想构建褐变能力显著降低的转基因苹果，目的基因应选___________。
A．卡那霉素抗性基因 B．绿原酸合成基因
C．棕色色素降解基因 D．提高液泡渗透压的基因
E.抑制PPO表达的基因
95．实施图中步骤①所需要的酶是_______________。
96．在步骤③进行之前，需要用氯化汞或次氯酸钙溶液对苹果嫩叶碎片（外植体）进行处理，目的是________________。
A．消毒 B．灭菌 C．清洗 D．诱导分化
97．步骤④是植物组织培养的重要阶段，这个阶段称为_______________。该阶段使用的MS培养基中除了含有必要的植物激素外，从基因工程流程的角度考虑，还需要添加_______________。
98．一般而言，在经历步骤⑤后培育出来的转基因植株中，目的基因插在一条染色体上。要想培育转基因纯合子的苹果植株，较为合理可行的方案是_______________。
99．为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，需要选择无目的基因的对照植株，如野生株（同样进行步骤②、④、⑤操作）或含质粒pBI121的植株，两者中最佳的是_______________，理由是_______________。

【答案】
94．CE
95．限制酶和DNA连接酶
96．A
97． 脱分化 卡那霉素
98．让转基因植株杂交
99． 含质粒pBI121的植株 相比野生株，含质粒 pBI121的植株作为对照，可以排除质粒pBI121中的基因对实验结果的干扰
【分析】
分析图示：过程①为构建目的基因表达的载体，过程②为获取受体细胞，过程③为将目的基因导入受体细胞，过程④为脱分化，过程⑤为再分化。　
94．
褐变是由位于细胞器中的多酚氧化酶（PPO）催化位于液泡中的多酚类物质（如绿原酸等）生成棕色色素所致，则目的基因应选棕色色素降解基因和抑制PPO表达的基因，CE正确。
故选CE。
95．
过程①为构建目的基因表达的载体，该过程需要的酶为限制酶和DNA连接酶。
96．
在步骤③将目的基因导入受体细胞进行之前，需要用氯化汞或次氯酸钙溶液对苹果嫩叶碎片（外植体）进行处理，目的是消毒，A正确。
故选A。
97．
步骤④是植物组织培养的重要阶段，这个阶段称为脱分化。该阶段使用的MS培养基中除了含有必要的植物激素外，从基因工程流程的角度考虑，还需要添加卡那霉素，其作用是将含有目的基因的细胞筛选出来。
98．
一般而言，在经历步骤⑤再分化后培育出来的转基因植株中，目的基因插在一条染色体上，该转基因植株可看作是杂合子，要想培育转基因纯合子的苹果植株，较为合理可行的方案是让转基因植株杂交。
99．
为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，需要选择无目的基因的对照植株，如野生株（同样进行步骤②、④、⑤操作）或含质粒pBI121的植株，两者中最佳的是含质粒pBI121的植株，因为相比野生株，含质粒 pBI121的植株作为对照，可以排除质粒pBI121中的基因对实验结果的干扰。
【点睛】
本题结合褐变能力显著降低的转基因苹果的示意图，考查基因工程的相关知识，难度不大，属于考纲中识记内容。
100．（2020·陕西汉中市·高三一模）镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。请回答下列问题：
（1）异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。
（2）将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的，此操作________（填“属于”或“不属于”）蛋白质工程。
（3）用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_________，以其作为模板，在________酶的作用下反转录合成cDNA；cDNA与载体需在限制酶和_________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，用_________（方法）导入受体菌后进行表达。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_________技术。
（4）检查受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_________，用相应的抗体进行________杂交，若出现_________，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
【答案】碱基对（脱氧核苷酸） 不属于 mRNA 逆转录酶（反转录酶） DNA连接酶 Ca2+处理法（感受态法) PCR扩增 蛋白质 抗原-抗体 杂交带
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。。
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求．也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
【详解】
（1）题意显示，患者的血红蛋白多肽链中，一个谷氨酸被缬氨酸替换，此氨基酸的变化是由于控制合成血红蛋白分子的DNA的碱基序列发生了改变，从而导致了mRNA上密码子的改变，即根本原因是基因中脱氧核苷酸（或碱基对）序列改变。
（2）将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的，该过程没有对现有的蛋白质进行改造，因此此操作不属于蛋白质工程，属于基因工程。
（3）用基因工程方法制备血红蛋白时，可以利用反转录法获得目的基因，即先提取早期红细胞中的mRNA，用早期红细胞的mRNA做模板，在逆转录酶酶的作用下反转录合成cDNA片段，cDNA与载体需在限制酶和DNA连接酶的作用下，拼接构建基因表达载体，用感受态细胞法导入受体菌后进行表达。若要在体外获得大量反转录产物，常采用PCR扩增技术，即体外扩增DNA技术。
（4）检查受体菌是否已合成血红蛋白，需要从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，用相应的抗体进行抗原--抗体特异性杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
【点睛】
熟知基因工程的原理及其操作流程是解答本题的关键，能正确辨析基因工程和蛋白质工程的区别是解答本题的另一关键。
101．（2020·湖南永州市·高三一模）科学家将胰蛋白酶抑制剂基因通过农杆菌导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。回答下列问题：


（1）构建该重组质粒时，可选择的限制酶有_____________，相比较而言______________更合适，原因是___________________________________________。
（2）Ti质粒是基因工程中常用的运载体，从图中可以看出其作为运载体具备的条件有________________________________________________________（答出两点），Ti质粒上有T-DNA，其作用是_______________________________________________________________________。
（3）重组质粒除了有目的基因和复制原点外，还应该有_____________________________。
（4）从过程④到⑤需要更换培养基，两者培养基所需成分中主要是___________________的比例不同。
【答案】EcoRⅠ或者BamHⅠ和HindⅢ BamHⅠ和HindⅢ 既能防止质粒自身环化，又可以保证目的基因正确连接在质粒上 有一个或多个限制酶切割位点；具有特殊的标记基因 可转移至受体细胞，并且能整合到受体细胞染色体的DNA上 启动子、终止子、标记基因 生长素和细胞分裂素或不同激素
【分析】
一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并且在特点的位点切割DNA分子。作为运载体的质粒要具有多个限制酶的切点，且能在受体细胞中复制和标记基因等特点。
【详解】
（1）构建该重组质粒时，可选择的限制酶有EcoRⅠ或者BamHⅠ和HindⅢ，相比较而言BamHⅠ和HindⅢ更合适，原因是这样切割的目的基因和质粒两端的粘性末端不同，既能防止质粒自身环化，又可以保证目的基因正确连接在质粒上。
（2）从图中可以看出其作为运载体具备的条件有，一个或多个限制酶切割位点；具有特殊的标记基因（抗性基因）。Ti质粒上T-DNA的作用是可转移至受体细胞，并且能整合到受体细胞染色体的DNA上。
（3）重组质粒要具有启动子、终止子、标记基因、目的基因和复制原点等。
（4）过程④是脱分化，过程⑤是再分化，两个过程生长素和细胞分裂素等激素的比例不同。
【点睛】
解答本题的关键之一是掌握好基因工程过程中限制酶和质粒应具备的条件。除此之外，学生还要对植物组织培养的相关条件有所了解。
102．（2020·吉林长春市·高三一模）单克隆抗体在临床上主要用于癌症治疗，下图为研发治疗乳腺癌的某种单克隆抗体的实验流程。请分析回答：


（1）A组鼠应注射___________________________________________。
（2）过程①经诱导融合后需用特定的_______________培养基进行筛选，获得杂交瘤细胞，还需进行_______________和________________，经多次筛选后可获得具备既能_______________，又能________________特点的细胞。
（3）若C组鼠为已注射乳腺癌肿块的实验模型鼠，用于检测物质甲的治疗效果。为了保证实验结果的可靠性，C组鼠应该切除_______________（器官）。进行检测疗效的实验时，需将C组鼠随机分成两组，一组处理如图，另一组处理为____________________________。
【答案】抗原 选择性 克隆化培养 抗体检测 产生专一抗体 无限增殖 胸腺 2mL生理盐水
【分析】
单克隆抗体的制备过程是：对小动物注射抗原，从该动物的脾脏中获取效应B细胞，将效应B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞，克隆化培养杂交瘤细胞（体内培养和体外培养），最后获取单克隆抗体。单克隆抗体的两次筛选：筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。
【详解】
（1）根据单克隆抗体的实验流程可知，A组鼠应注射抗原，目的是获得相应的能够产生特异性抗体的B淋巴细胞。
（2）据图可知，过程①为细胞融合，在制备单克隆抗体的过程中，对骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，需用特定的选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，还需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选后可获得具备既能产生专一抗体，又能无限增殖特点的细胞。
（3）若C组鼠为已注射乳腺癌肿块的实验模型鼠，用于检测物质甲的治疗效果。为了保证实验结果的可靠性，C组鼠应该切除胸腺，这样可以避免小鼠的免疫系统对单克隆抗体和乳腺癌肿块进行攻击。进行检测疗效的实验时，需将C组鼠随机分成两组，一组处理如图，另一组处理为注射2mL生理盐水。
【点睛】
答题关键在于掌握单克隆抗体制备过程、杂交瘤细胞的特点等知识。
103．（2020·上海金山区·高三二模）在基因工程中，人们常常会将两个不同的目的基因（不含终止密码子编码序列的A和不含起始密码子编码序列的B）串联在一个质粒分子上，使其联合表达成一种杂合蛋白（如图所示）。质粒pZHZ5上基因C为卡那霉素抗性基因。（注：起始密码子为GUG、AUG）

1. 基因工程的第二步是将目的基因和运载体进行重组。此时，需要选择合适的限制酶和________酶。
2. 如果质粒pZHZ5（2.7kb）上的限制酶E和限制酶F识别序列相距0.3kb，经E和F联合切割后直接加入DNA连接酶进行连接。所形成的含抗菌素抗性基因（C）的DNA分子中，长度最小的两种分子分别为__________和__________kb。
3. 下列是部分限制酶的识别序列和切割位点（用箭头表示）。若要将目的基因B直接插在重组质粒pZHZ6（3.9kb）的限制酶F位点处，则目的基因B上的X必须为______________。
A． B．
C． D．
4. 若trpA基因能利用无机氮源合成色氨酸。则选用的受体细胞应该是_________。
A．能利用无机氮源合成色氨酸，卡那霉素抗性
B．能利用无机氮源合成色氨酸，卡那霉素敏感
C．不能利用无机氮源合成色氨酸，卡那霉素抗性
D．不能利用无机氮源合成色氨酸，卡那霉素敏感
5. 若本次基因工程选用的受体细胞是大肠杆菌，在筛选过程中，制备的培养基除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入物质有_________
A．无机氮源 B．琼脂 C．噬菌体 D．卡那霉素
6. 动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的原因是_________。
【答案】
【小题1】DNA连接酶
【小题2】 2.4 2.7

【小题3】C
【小题4】D
【小题5】ABD
【小题6】受精卵全能性最高，且尺寸较大，便于DNA导入操作
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）将目的基因和运载体重组时需要用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶连接。
（2）根据题中信息，原来质粒长度为2.7kb，切去EF之间的片段（0.3kb）还剩2.4kb，若经E和F联合切割后直接加入DNA连接酶进行连接，此时连接体系中仍存在切割下的EF位点之间的片段，所以该片段可能重新连入载体，产生2. 7kp的分子，由于没有说明E和F位点切割后的端口情况，所以不排除切开后的载体在E和F位点自连，产生2. 4kg的分子。片段A的大小明显大于EF之间片段的大小，若EF之间的片段或A片段自连不会含有抗菌素抗性基因。综上，产生的含有抗菌素抗性基因（C)的最小DNA分子中，长度最小的两种分子分别为2.4kb和2.7kp。
（3）基因表达载体必须具备启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构。目的基因B不含起始密码子编码序列，题目中给的起始密码子为GUG、AUG，目的基因B的模版链中碱基为CAC、TAC，基因对应互补链上的碱基序列为GTG、ATG，只有C选项包含目的基因B的碱基序列，C正确。
故选C。
（4）由于基因trpA的表达产物可使细胞利用无机氮源合成色氨酸，故选用的受体细胞为trpA基因缺陷型，不能利用无机氮源合成色氨酸，对卡拉霉素敏感，在含卡拉霉素的培养基中不能存活，D正确。
故选D。
（5）对导入重组质粒的大肠杆菌进行筛选时可以先在含无机氮源、不含色氨酸的固体培养基上培养，能生长的受体细胞即导入了质粒，但不一定是重组质粒，还需要进行第二步筛选，由于重组质粒中含有卡那霉素抗性基因，导入重组质粒的受体细胞在含有卡那霉素的培养基上可以生长，故选择培养基上还需要添加无机氮源、琼脂、卡拉霉素，ABD正确。
故选ABD。
（6）动物体细胞的全能性受到限制，不能表现出来，而受精卵的全能性最高，可以发育成完整的动物个体，且受精卵尺寸较大，便于DNA导入操作，故动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞。
【点睛】
本题结合图形，主要考查基因工程的相关知识，要求考生能够识记基因工程的操作步骤，能够根据图形获取有效信息，难度中等。
104．（2020·浙江高三一模）回答下列（一）（二）小题
（一）各式各样的奶制品如牛奶、奶酪、马奶酒等的生产与微生物的活动密切相关。
（1）市面上出售的牛奶通常用巴氏消毒法（80℃水浴，15min）处理，其原理为_____。通过涂布分离将接种的 3 个平板和 1 个未接种的平板放入恒温培养箱培养 48h，统计出 4 个平板上的菌落数分别是 57、53、55 和 9。根据这样的实验结果_____（填“能”或“不能”）判断该兴趣小组消毒后的牛奶细菌超标，原因是_____。
（2）奶酪是发酵的牛奶制品，蓝纹奶酪是成熟过程中内部生长蓝绿霉菌一类奶酪的总称。其制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌，原因是_________。制作中所用的二级发酵剂为娄地青霉，接种后需给奶酪穿刺扎孔，原因是_____。娄地青霉产生的蛋白酶可将奶酪中的蛋白质分解为_____，可增添奶酪的风味。
（3）马奶酒是利用马奶酿制的酒精含量较低的饮料。马奶中含有的糖类主要为乳糖，某些微生物将其水解为葡萄糖和半乳糖，酵母菌可利用这些水解产物发酵产生酒精。现研究野生型酵母菌和马奶酒酵母菌的发酵情况，其结果如下图所示：

马奶酒酵母菌在利用葡萄糖、半乳糖或产生酒精等方面的优势是_____。马奶酒酵母菌不同于野生型酵母菌的营养利用方式，使其种群数量快速增加，这一优势使马奶酒酵母菌更好地适应_____的生活环境。
（二）玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP（冷激蛋白）基因与玉米基因的 ubi 启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，如图 1 所示。请回答：


（1）研究者提取玉米的 DNA，可利用_____________技术将ubi 启动子扩增出来。图 1 所示过程① 需_____的催化，获得的ubi-CSP 基因在构建基因表达载体时须插入到T-DNA 片段中的原因是_________ 。
（2）过程②需要用_________处理农杆菌以利于重组 DNA 的导入。影响过程③的因素主要有_____________，一般来说只有处于细胞周期____（时期）的细胞才具有被转化的能力。为了减小农杆菌对愈伤组织再分化的影响，需要在培养基中添加_____________。
（3）研究者分别提取了野生型玉米及 5 株转基因玉米的染色体 DNA，用限制性核酸内切酶处理后进行电泳。电泳后的 DNA 与基因探针进行杂交，得到图 2 所示放射性检测结果， 该结果表明第_________株CSP 基因已整合到玉米染色体基因组。
【答案】高温使蛋白质变性 不能 培养基灭菌不彻底 缺氧和较低pH值会抑制其他杂菌的生长繁殖 提供氧气促进菌体繁殖 小分子肽和氨基酸 能更有效利用半乳糖、产生酒精更快 富含乳糖 PCR 限制酶性内切酶和 DNA连接酶 只有T-DNA 片段可整合到植物的染色体上 CaCl2溶液 农杆菌的种类、外植体的类型及状态、共培养的时间等 S期 抗生素 1、2、4、5
【分析】
1、采用巴氏杀菌法加工牛奶，在70-75℃煮30分钟或80℃煮15分钟进行杀菌，在杀灭牛奶中有害菌群的同时牛奶的营养成分不被破坏，完好的保存了营养物质和纯正口感。据左图可知，葡萄糖的浓度先于半乳糖下降，可推知野生型酵母菌首先利用葡萄糖进行发酵，当这种糖耗尽时，酒精产量趋于平稳，不再增加，一段时间后随着半乳糖的浓度下降酒精产量再次上升，可推测葡萄糖消耗完后，野生型酵母菌才开始利用半乳糖发酵。分析右图可知，马奶酒酵母菌可先利用的是半乳糖，随之同时利用半乳糖和葡萄糖。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因，即DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA，即分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，即抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（一）（1）巴氏消毒法的原理是高温使蛋白质变性，从而使微生物失去活性。根据这样的实验结果不能判断该兴趣小组消毒后的牛奶细菌超标，原因是因为未接种的培养基上有菌落出现，说明培养基灭菌不彻底，则其它培养基上的菌落数不能表示牛奶中细菌数量。
（2）蓝纹奶酪制作的初级发酵的原理是乳酸菌发酵，初级发酵过程中不需要严格灭菌，是因为乳酸菌发酵时产生乳酸，缺氧和较低pH值的环境可以抑制其他杂菌的生长繁殖；制作中所用的二级发酵剂为娄地青霉，接种后需给奶酪穿刺扎孔，目的是提供氧气促进菌体繁殖。娄地青霉产生的蛋白酶可将奶酪中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，可增添奶酪的风味。
（3）比较两图中的实验结果可推测，与野生型酵母菌相比，马奶酒酵母菌在利用葡萄糖、半乳糖方面显示的是马奶酵母菌先利用的是半乳糖，随之同时利用半乳糖和葡萄糖，即能更有效利用半乳糖，在产生酒精方面马奶酒酵母菌发酵产生酒精的速度快，由此导致了酒精浓度高峰出现早。由实验结果可知，马奶酒酵母菌与野生型酵母菌的营养利用方式有所不同，即马奶酒酵母菌能够利用半乳糖进行快速发酵，由此可推测马奶酒酵母菌比野生酵母菌能更好地适应富含乳糖的生活环境。
（二）（1）扩增ubi启动子可用PCR技术。过程①为ubi启动子和GSP基因相连的过程，因此需用限制酶切出相同的粘性末端，并用DNA连接酶的催化从而实现连接。由于只有T-DNA 片段可整合到植物的染色体上，所以获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时须插入到T-DNA片段中。
（2）过程②为导入受体细胞的过程，为了提高导入的成功率，通常用CaCl2溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于吸收外源DNA。过程③为农杆菌感染愈伤组织的过程，影响其成功导入的因素包括农杆菌的种类、外植体的类型及状态、共培养的时间等，由于只有处于细胞周期S期的细胞才能进行DNA复制，使外源DNA整合到宿主细胞的染色体上，故只有处于细胞周期S期的细胞才具有被转化的能力。为了减小农杆菌对愈伤组织再分化的影响，需要在培养基中添加抗生素。
（3）实验结果显示在野生型玉米及5株转基因玉米中检测目的基因的放射性，野生型玉米没有放射性，作为对照，其它除植株3外，另外4株转基因玉米中均检测到了放射性，说明CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中。　
【点睛】
本题考查微生物的培养和应用、基因工程等相关知识，要求学生识记常见微生物培养灭菌方法的选择、微生物培养条件。熟知基因工程各步骤的操作流程是解答本题的关键，利用所学知识综合分析题干信息是找到解题突破口的另一关键！
105．（2020·安徽马鞍山市·高三一模）研究人员为了让某种已经灭绝生物的基因表达出产物，进行了相关实验，实验流程如下图，请据图回答下列相关问题。


（1）通过比对分析、补充灭绝生物中目的基因的碱基序列，获得种类较多的目的基因碱基序列，但有些不同碱基序列的目的基因能表达出相同产物，可能的原因是_______。
（2）流程图中①表示________________________。
（3）基因工程的核心步骤是构建表达载体，其目的是________________________。基因表达载体中除了有目的基因、启动子、终止子外，还应有_______________等，其中启动子是________________________识别和结合的位点。
（4）将基因表达载体导入到大肠杆菌前，用____________处理细胞，使其处于感受态。大肠杆菌作为受体细胞具有_______________________________________________等优点。
【答案】密码子具有简并性或基因含有内含子 人工合成目的基因 在受体细胞中稳定存在、能传给下一代、使目的基因可以表达和发挥作用 标记基因 RNA聚合酶 钙离子 繁殖快、单细胞生物、遗传物质相对较少
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）由于密码子具有简并性或基因含有内含子，故有些不同碱基序列的目的基因能表达出相同产物。
（2）通过对比分析得到灭绝生物中目的基因的碱基序列，再通过流程①人工合成目的基因，进行基因工程操作。
（3）基因工程的核心步骤是构建表达载体，其目的是在受体细胞中稳定存在、能传给下一代、使目的基因可以表达和发挥作用。基因表达载体中除了有目的基因、启动子、终止子外，还应有标记基因，便于筛选，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点。
（4）将基因表达载体导入到大肠杆菌前，需要用钙离子处理大肠杆菌，使其处于感受态，易于接受吸收周围坏境中的DNA。大肠杆菌作为受体细胞具有繁殖快、单细胞生物、遗传物质相对较少等优点。
【点睛】
本题难度不大，属于考纲中识记层次的要求，着重考查了基因工程等方面的知识，相关知识考生应构成一定的知识网络，并加以识记。
106．（2020·安徽马鞍山市·高三三模）普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制合成的酶能破坏细胞壁使番茄软化，不耐储存。科学家将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞，获得耐储存番茄。作用机理如下图。回答下列问题：

（1）基因工程中，抗多聚半乳糖醛酸酶基因称为____________。
（2）图示科学家将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入到番茄细胞的__________上，采用的方法为___________，因为Ti质粒的_________片段有转移能力。
（3）抗多聚半乳糖醛酸酶基因成功导入番茄细胞后，通过________技术培育出转基因番茄植株。转基因番茄耐储存的机理是多聚半乳糖醛酸酶基因表达的_______过程受阻。如果在转基因番茄中采用__________技术检测到了抗多聚半乳糖醛酸酶基因，但番茄果实依然软化不耐储存，则最可能的原因是_______________________。
【答案】目的基因 染色体（细胞核DNA） 农杆菌转化法 T-DNA 植物组织培养 翻译 DNA分子杂交 没有产生mRNA2（或抗多聚半乳糖醛酸酶基因没有转录）
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）本实验的目的是获得耐储存番茄，所以抗多聚半乳糖醛酸酶基因是目的基因。
（2）将目的基因导入双子叶细胞通常采用农杆菌转化法；因为Ti质粒上的T-DNA片段有转移的能力；为保证该性状的稳定遗传需要将目的基因倒入番茄细胞的染色体（细胞核DNA）上。
（3）将植物细胞培育成植株需要用到植物组织培养技术；从图中看出抗多聚半乳糖醛酸酶基因产生的mRNA2和多聚半乳糖醛酸酶基因产生的mRNA1结合，从而阻止了翻译过程；检测目的基因是否导入细胞常采用的方法是DNA分子杂交，如果检测到了抗多聚半乳糖醛酸酶基因，但番茄果实依然软化不耐储存，则最可能的原因是没有产生mRNA2（或抗多聚半乳糖醛酸酶基因没有转录）。
【点睛】
本题考查基因工程的知识，考生需要识记基因工程的基本操作步骤，同时理解图中果实耐储存的原理。
107．（2020·天津北辰区·高三二模）科研人员利用大肠杆菌构建了抗虫基因文库。最新研究发现漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有显著的杀虫效果，现以p-B质粒为载体，构建AH基因的cDNA文库。图1表示p-B质粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA复制。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点，且不同种限制酶识别序列不同，其中Aiu I。Xba I、Ssp I和Mfe I识别的碱基序列和酶切位点分别是AG↓CT，T↓CTAGA、AAT↓ATT、C↓AATTG。请分析回答：

（1）为获得大量AH基因的cDNA，需从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞提取RNA，反应体系中需添加特异性引物和_____________________________________________________酶。
（2）利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用_______________双酶切目的基因，再选用_______________________切割质粒，将切割后获得的DNA片段混合，经DNA连接酶处理后，再与大肠杆菌混合培养，在含有适量_________________________________的培养基中添加适量冷冻的CaCl2以促进目的基因转化。
（3）经上述处理培养后，获得存活的大肠杆菌中应含有的质粒是___________（“普通质粒”或“重组质粒”），原因是_______________________________________________________。
【答案】逆转录酶和Taq酶 SspⅠ和MfeⅠ AiuⅠ和MfeⅠ 氯霉素 重组质粒 重组质粒中的ccdB基因被破坏，不能抑制DNA复制
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）cDNA是以RNA为模板逆转录而成的，因此为获得AH基因的cDNA，先要从漏斗蜘蛛毒素肽分泌细胞中提取RNA，再利用反应体系中添加的特异性引物、逆转录酶和Taq酶，从而准确合成出AH基因的cDNA。
（2）质粒中含有多种限制酶识别序列，但用限制酶XbaⅠ切割会破坏复制原点，因此不能用该酶切割；由于ccdB基因表达产物能抑制大肠杆菌DNA复制，因此构建基因表达载体时，应该破坏该基因，即需要用限制酶MfeⅠ切割；若用SphⅠ和MfeⅠ切割会导致启动子丢失，因此不能用限制酶SphⅠ切割；若用MfeⅠ和SacⅠ切割则不能获取目的基因AH；
综合以上可知，利用图中的质粒和AH基因构建重组质粒时，宜选用AiuⅠ（产生平末端）和MfeI双酶切质粒，再选用SspI（产生平末端）和MfeI切割目的基因。
将切割后获得的DNA片段混合，经DNA连接酶处理后，再与大肠杆菌混合培养，在含有适量氯霉素的培养基中添加适量冷冻的CaCl2（或Ca2+），使受体细胞成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞，以促进转化。
（3）由于重组质粒中的ccdB基因被破坏，不能抑制DNA复制，因此获得的存活的大肠杆菌中应含有的质粒是重组质粒。
【点睛】
本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合题中和图中信息准确答题。

五、实验题
108．（2019·天津高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。

据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程______________中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程__________________在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明_________________。
【答案】D 精子 cDNA ② ① BCD B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【分析】
基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建:（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
3、将目的基因导入受体细胞:（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【详解】
（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示用含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。
（5）转基因植株含有促进B基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
【点睛】
本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能够识记基因工程的操作步骤；明确农杆菌转化法在植物基因工程中的应用；并能够掌握植物组织培养技术的过程等知识。
109．（2021·江苏南通市·高三三模）人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，现可以用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）。下图甲为获取的含有目的基因（HSA基因）的DNA片段，Sau3A Ⅰ、EcoRⅠ、BamH Ⅰ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请回答下列问题：


（1）三种限制酶中能产生相同黏性末端的是____________；为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的最佳方案是选用_______酶，所得重组质粒____________（选填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamH Ⅰ切割。
（2）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，这里所说的膜系统是指____________。
（3）获取HSA基因还可以通过下列方式：首先采集人的血液，从中提取__________合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。与基因组文库获取的目的基因相比，利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其特点是不含__________和__________。
（4）已知HSA基因一条链两端的碱基序列为：
5’—CTTCGAAATTC-HSA基因-TCTCCCGATCGG—3’
请根据其两端碱基序列设计一对引物，引物Ⅰ、Ⅱ分别是：磷酸端﹣________﹣羟基端；磷酸端﹣______﹣羟基端。1个DNA分子经PCR扩增，第n次时需要消耗引物Ⅰ_______个。
【答案】BamHⅠ和Sau3AⅠ BamHⅠ和EcoRⅠ 不一定能 内质网膜、高尔基体膜 mRNA 启动子（和终止子） 内含子 CTTCGAAATTC CCGATCGGGAGA （引物I、 II顺序可换） 2n-1
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）根据图乙分析可知，Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ三种限制酶，产生相同黏性末端的是BamHⅠ和Sau3AⅠ，其粘性末端为(-GATC-)；为了防止目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定等情况，应该选择不同的限制酶切割目的基因的两侧以及质粒，结合图1和图3分析，Sau3AⅠ会破坏目的基因，应该选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割图1所示DNA片段。结合以上分析以及Sau3AⅠ与BamHⅠ酶的识别序列可知，形成的重组质粒上肯定含有EcoRⅠ、Sau3AⅠ的识别位点，不一定含有BamHⅠ的识别位点，所以所得重组质粒不一定能被BamHⅠ切割。
（2）人体合成的初始HSA多肽，需要经过内质网的加工修饰，以及高尔基体的进一步加工、分类和包装，才可具有生物学活性，故需要膜系统：内质网膜和高尔基体膜。
（3）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。首先采集人的血液，从中提取mRNA合成总cDNA，然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其特点是不含启动子（和终止子）、内含子等。
（4）PCR技术是以从生物材料中提取的DNA作为模板，利用引物寻找HSA基因的位置并进行扩增。故引物是基因两端的碱基序列。根据题意可知，引物Ⅰ为磷酸端﹣CTTCGAAATTC﹣羟基端；引物Ⅱ为磷酸端﹣CCGATCGGGAGA﹣羟基端（引物Ⅰ和引物Ⅱ顺序可互换）。1个DNA分子经PCR扩增，第n次时将具有DNA分子数为2n；第n-1次时将具有DNA分子数为2n-1；故第n次比第n-1次增加的DNA分子数为2n-2n-1=2n-1，故需要引物Ⅰ的个数为2n-1。
【点睛】
本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够掌握限制酶的作用特点，根据题干信息判断两种酶切割后的黏性末端是否能发生重组以及连接的方式；同时考察PCR引物的设计原则等知识，再结合题干信息准确答题。
110．（2021·重庆高三三模）2017年11月，世界上首例体细胞克隆猴在我国诞生，分别叫“中中”和“华华”，这一成功轰动了全世界，相比较克隆羊和克隆鼠，克隆猴对于研究人类疾病意义更大。下图是克隆“中中”的相关示意图。请回答下列问题：


（1）在采集卵子之前，需要给卵子供体注射适量的__________，以增加排卵。选用去核卵子作为核移植的受体细胞的原因有_____________（答出点）。
（2）从卵巢中吸取的卵子，需在体外培养到_______期，再通过__________法去除细胞核，得到去核卵子。
（3）核移植形成的重组细胞需要用__________（物理方法）激活，使其完成细胞分裂和发育进程。体外培养早期胚胎时，培养液的成分除了无机盐、有机盐、激素和核苷酸等营养物质外，还需额外添加_________等天然成分。代孕猴对移入子宫的外来胚胎___________，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。
（4）哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度小于体细胞核移植，其原因是___________________。
【答案】促性腺激素 营养物质丰富；体积大，易操作；含有激发细胞核全能性表达的物质 减数第二次分裂中期（MII中期） 显微操作 电刺激（或电脉冲） 血清 基本不发生免疫排斥反应 胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易（或体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难）
【分析】
1、胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。
2、分析题图：胎儿成纤维细胞提供细胞核，卵子供体提供细胞质，经过核移植技术形成重组细胞，并发育形成早期胚胎，再胚胎移植到受体代孕猴子宫发育成小猴，称为克隆猴“中中”。
3、胚胎移植的生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
【详解】
（1）在采集卵子之前，为保证有可以移植的、有活力的胚胎，需要对给卵子供体注射促性腺激素可促使其超数排卵。选用去核卵子作为核移植的受体细胞的原因有：卵（母）细胞大，容易操作；卵（母）细胞质多，营养丰富；含有促使细胞全能性表达的物质。
（2）从供体 的卵巢中吸取的卵母细胞需要在体外培养到 MⅡ中期，并通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核，得到去核卵子。
（3）核移植形成的重组细胞需要用物理或化学方法，激活重组细胞，使其完成细胞分裂和发育进程，形成重组胚胎。利用早期胚胎培养技术培养早期胚胎时，所用培养液成分除一些无机盐和有机盐类外，还需添加 维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分以及动物血清等天然成分。受体代孕猴对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。
（4）由于胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难；因此胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度小于体细胞核移植。
【点睛】
本题考查动物细胞工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记核移植的具体过程；识记动物细胞培养的条件；识记胚胎移植的生理学基础，再结合所学的知识准确答题。
111．（2020·北京延庆区·高三一模）纳米材料为癌症治疗带来了曙光。科研人员利用纳米材料SW诱导肝癌细胞凋亡开展相关实验。
（1）正常情况下，线粒体内膜上的质子泵能够将______________中的H+泵到膜间隙，使得线粒体内膜两侧形成__________________，为ATP的合成奠定了基础。
（2）科研人员使用不同浓度的SW溶液与肝癌细胞混合后，置于_________培养箱中培养48小时后，检测肝癌细胞的线粒体膜电位。（已有实验证明对正常细胞无影响）
组别
实验材料
实验处理
实验结果
线粒体膜电位的相对值
ATP合成酶活性相对值
1
人肝癌细胞
不加入SW
100
100
2
加入SW
59
78

1、2组比较说明SW能___________________________________导致肝癌细胞产生ATP的能力下降，__________肝癌细胞凋亡。
（3）科研人员使用SW处理肝癌细胞，一段时间后，相关物质含量变化如下图所示。

由于细胞中GPDC蛋白的表达量__________________，在实验中可作为标准对照。
VADC为线粒体膜上的通道蛋白，SW处理肝癌细胞后，VADC含量____________，促进CYTC_______________________________，与细胞凋亡因子结合，诱导细胞凋亡。
（4）综上所述，推测SW诱导肝癌细胞凋亡的机理是________________________。
【答案】线粒体基质 跨膜电位（H+浓度差/H+化学势能） CO2 降低肝癌细胞线粒体的膜电位，降低（抑制）ATP合成酶活性 促进 相对稳定 上升 从线粒体基质通过通道蛋白VADC进入细胞质基质 一方面抑制ATP的产生，促进细胞凋亡，另一方面促进CYTC通过线粒体膜上的VADC进入细胞质基质，与细胞凋亡因子结合，诱导细胞凋亡
【分析】
线粒体是有氧呼吸的主要场所，线粒体内膜进行有氧呼吸第三阶段，可产生大量的ATP。分析表格可知，SW能降低肝癌细胞线粒体的膜电位，降低（抑制）ATP合成酶活性。
【详解】
（1）因线粒体内膜的外侧是膜间隙，线粒体内膜的内侧是线粒体基质，所以正常情况下，线粒体内膜上的质子泵能够将线粒体基质中的H+泵到膜间隙，使得线粒体内膜两侧形成跨膜电位，为ATP的合成奠定了基础。
（2）动物细胞培养时，需要用CO2培养箱，一定量的CO2可维持培养液的PH。所以需将不同浓度的SW溶液与肝癌细胞混合后，置于CO2培养箱中培养48小时后，检测肝癌细胞的线粒体膜电位。2组加入了SW，1组没加入SW，2组的线粒体膜电位的相对值和ATP合成酶活性相对值均低于1组，说明SW能降低肝癌细胞线粒体的膜电位，降低（抑制）ATP合成酶活性，导致肝癌细胞产生ATP的能力下降，促进肝癌细胞凋亡。
（3）分析图示可知，使用SW处理肝癌细胞一段时间后，细胞中GPDC蛋白的表达量相对稳定，在实验中可作为标准对照。VADC为线粒体膜上的通道蛋白，SW处理肝癌细胞后，VADC含量增加，促进CYTC从线粒体基质通过通道蛋白VADC进入细胞质基质，与细胞凋亡因子结合，诱导细胞凋亡。
（4）根据上述分析可知，SW诱导肝癌细胞凋亡的机理为：一方面抑制ATP的产生，促进细胞凋亡，另一方面促进CYTC通过线粒体膜上的VADC进入细胞质基质，与细胞凋亡因子结合，诱导细胞凋亡。
【点睛】
本题考查SW诱导肝癌细胞凋亡的相关实验，意在考查考生根据实验结果进行分析推理得出结论的能力。
112．（2020·安徽马鞍山市·高三二模）埃博拉病毒（EBO）传染性强，2014年非洲埃博拉病毒出血热的感染及死亡人数都达到历史最高。利用细胞融合技术可制备抗EBO的单克隆抗体。回答下列问题。
（1）动物体内抗体的作用，体现了蛋白质的_____________功能。
（2）给小鼠定期注射EBO，其目的是_________________。一段时间后，从小鼠脾脏中分离出已免疫的B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，诱导融合时需加入化学试剂________________。
（3）利用特定的选择培养基筛选出_______________细胞，再用多孔培养板培养筛选出的细胞并收集上清液，上清液中含________________。将上清液加入到另一个预先包埋好_________________的多孔培养板上，进行抗体阳性检测。
（4）将阳性孔中的细胞在体外培养液中进行培养后提取单克隆抗体。从培养液中提取、纯化的单克隆抗体与常规的血清抗体相比，其优点是____________________。
【答案】免疫 引起小鼠对EBO的免疫应答，产生相应的浆细胞或已免疫的B淋巴细胞 PEG（聚乙二醇） 杂交瘤 杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 EBO（埃博拉病毒） 特异性强、灵敏度高、可大量制备
【分析】
单克隆抗体制备的过程：对小动物注射抗原，从该动物的脾脏中获取效应B细胞，将效应B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生单一抗体的杂交瘤细胞，克隆化培养杂交瘤细胞（体内培养和体外培养），最后获取单克隆抗体。
【详解】
（1）动物体内抗体的作用，体现了蛋白质的免疫功能。
（2）在制备过程中，先向小鼠体内注射适量的EBO，一段时间后，若小鼠血清中抗EBO的抗体检测呈阳性，引起小鼠对EBO的免疫应答，产生相应的浆细胞或已免疫的B淋巴细胞；将该细胞与小鼠的瘤细胞融合。实践中常用聚乙二醇作为促融剂。
（3）利用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，再用多孔培养板培养筛选出的细胞并收集上清液，上清液中含杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。将上清液加入到另一个预先包埋好EBO（埃博拉病毒）的多孔培养板上，进行抗体阳性检测。
（4）将阳性孔中的细胞在体外培养液中进行培养后提取单克隆抗体。从培养液中提取、纯化的单克隆抗体与常规的血清抗体相比，其优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。
【点睛】
该题目主要考查免疫调节和单克隆抗体的制备过程，意在考查考生的识图能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识，准确判断问题的能力，属于考纲识记和理解层次的考查。
113．（2020·浙江温州市·高三三模）在一定剂量范围内苜蓿中的黄酮对动物乳腺上皮细胞增殖具有一定促进作用。为研究不同浓度苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞的增殖及其对乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响，科研人员用MTT法以细胞悬液OD值为观测指标测定细胞增殖能力，进行了相关实验研究。请完善实验思路，并根据实验结果进行分析。
实验材料与仪器：
用二甲基亚砜（DMSO）配置的浓度为25、50、75和100µ/mL苜蓿黄酮溶液、用动物细胞培养液配制的一定密度的动物乳腺上皮细胞悬液、光电比色计、MTT法细胞增殖测定仪器等
（要求与说明：MTT法测定细胞增殖具体操作不作要求；乳酸脱氢酶（LDH）活性检测不作要求；在一定细胞数范围内，OD值与细胞数成正比；培养过程中培养液变化忽略不计；实验条件适宜）
（1）完善实验思路
①取若干培养瓶，各加入998mL的细胞悬液，分为5组，编号甲~戊，每组5个重复。
②甲组：加入2mL二甲基亚矾；_______。
③________。
④实验第5天，_______。
⑤________。
（2）结果分析与结论
苜蓿黄酮对某动物乳腺上皮细胞增殖及其乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响
项目
时间/d
甲组
乙组25µg/mL
丙组50μg/mL
丁组75μg/mL
戊组100µg/mL
细胞增殖
3
0．37
0．38
0．38．
0．37
0．37
细胞增殖
5
0．39
0．39
0．41*
0．46*
0．40*
乳酸脱氢酶活性
5
1078．80
675．60*
573．21*
1138．04
796．89*

注：表中*表示与对照组比较有统计学上的显著差异，不带*数据表示与对照组无显著差异；（单位：略）
根据上表可得实验结论：
结论一：作用时间较短时（3天），苜蓿黄酮对细胞增殖无明显作用；
结论二：_______；
结论三：_______。
（3）实验分析
细胞呼吸中，乳酸脱氢酶（LDH）催化的反应_______（填“产生”或“不产生”）ATP，这一催化反应发生在_______（填“需氧”或“厌氧”）呼吸中。本实验中还可用细胞培养上清液中LDH的浓度代表细胞的受损程度的原因是_______。为减少微生物对实验结果带来的干扰，实验中的动物细胞培养基中添加的胎牛血清可采用_______（方法）去除杂菌。
【答案】实验组乙~戊：分别加入等量的用二甲基亚砜配置的浓度为25、50、75和100μg/mL的苜蓿黄酮 细胞培养到第3天和第5天时，分别用MTT法测各组细胞悬液OD值，取平均值并记录 测各组乳酸脱氢酶（LDH）的活性，取平均值并记录 统计、比较、分析实验结果（或对所得实验数据进行统计分析） 随着培养时间加长（5天），较高浓度的苜蓿黄酮对细胞增殖有明显促进作用 在较低浓度或较高浓度下，苜蓿黄酮显著提高乳腺上皮细胞中的乳酸脱氢酶的活性 不产生 厌氧 正常情况下LDH分布在细胞内，只有当细胞受损时乳酸脱氢酶（LDH）才能释放出来，且受损越严重，释放出来的LDH越多 过滤/添加抗生素
【分析】
解答此题，应以题意所示的实验目的--研究苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞的增殖及其对乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响为切入点，结合题意给出的不完善的实验步骤以及实验设计遵循的单一变量原则和等量原则等，找出实验变量（自变量、因变量、无关变量），进而围绕问题情境补充完善实验思路并对相关问题进行解答。
【详解】
（1）本实验研究的是不同浓度的苜蓿黄酮溶液对乳腺上皮细胞的增殖及其对乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响，实验遵循单一变量原则和等量原则，甲组用2mL二甲基亚矾，则乙~戊组分别加入等量的用二甲基亚砜配置的浓度为25、50、75和100μg/mL的苜蓿黄酮，同时将五组细胞培养到第3天和第5天时，分别用MTT法测各组细胞悬液OD值，取平均值并记录，到实验第5天，测各组乳酸脱氢酶（LDH）的活性，取平均值并记录，再统计、比较、分析实验结果（或对所得实验数据进行统计分析）。
（2）根据表格分析可以得出：作用时间较短时（3天），苜蓿黄酮对细胞增殖无明显作用；随着培养时间加长（5天），较高浓度的苜蓿黄酮对细胞增殖有明显促进作用；在较低浓度或较高浓度下，苜蓿黄酮显著提高乳腺上皮细胞中的乳酸脱氢酶的活性。
（3）LDH催化丙酮酸转化为乳酸，发生在无氧呼吸的第二阶段，不产生ATP。正常情况下LDH分布在细胞内，只有当细胞受损时乳酸脱氢酶（LDH）才能释放出来，且受损越严重，释放出来的LDH越多，因此本实验中还可用细胞培养上清液中LDH的浓度代表细胞的受损程度。动物细胞培养基中添加的胎牛血清可采用过滤或添加抗生素去除杂菌。
【点睛】
本题以“研究不同浓度苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞的增殖及其对乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响”为情境，考查学生对一些生物学问题进行初步探究的能力，并能对实验现象和结果进行解释、分析和处理的能力。
114．（2020·浙江台州市·高三一模）回答下列（一）、（二）小题：
(一)某科研团队利用植物细胞工程技术，把基因序列已知的抗除草剂(Bar)基因导入原生质体获得抗除草剂大豆。请回答下列相关问题：

（1）对于已获得的Bar基因可以用________技术进行扩增。图中的a过程通常使用相同的________酶和DNA连接酶，使目的基因与载体连接形成重组DNA。
（2）在b过程中，获得原生质体除了需要纤维素酶和果胶酶，还需要用到的试剂是__________。
（3）成功导入重组DNA的原生质体经脱分化形成Ⅰ____________，进而生长发育成植株。
下列不属于Ⅰ细胞应具有的特征是________。
A．薄壁细胞 B．细胞质丰富 C．液泡小 D．细胞核小
（4）若要判断转基因抗除草剂大豆是否成功，比较简便的检测方法是_______________。
(二)下图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程，请回答下列问题：

（5）该实验培养基不能含有_______。
A．尿素 B．氯化钠 C．葡萄糖 D．琼脂
（6）尿素溶液可用____________使之无菌。若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是________。
（7）图中步骤C为____。相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是___。
（8）如果菌落周围出现___________色环带，说明该菌落能分泌脲酶。
【答案】PCR 限制性核酸内切 （较高浓度的）甘露醇 愈伤组织 D 用一定浓度的除草剂喷洒，观察转基因大豆的生长情况 D G6玻璃漏斗过滤 将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现 倒平板 单菌落更易分开 红
【详解】
（一）(1)可通过PCR技术进行体外扩增，获得大量Bar基因。a过程为构建基因表达载体，需要相同的限制性核酸内切和DNA连接酶，使目的基因与载体连接形成重组DNA。
（2）在获得植物原生质体时，需在0.5～0.6mol/L的甘露醇溶液环境（较高渗透压）下用纤维素酶和果胶酶混合液处理实验材料，将细胞壁消化除去，获得球形的原生质体。
（3）成功导入重组DNA的原生质体经脱分化形成愈伤组织，再经过再分化，分化出芽和根，进而生长发育成植株。
（4）Ⅰ细胞为愈伤组织，该类单细胞具有细胞质丰富、液泡小、细胞核大等特征，故D错误。
（二）（5）分离以尿素为氮源的微生物，需要液体培养基，不需要琼脂，D错误。
（6）尿素溶液可用G6玻璃漏斗过滤使之无菌，将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现来检查B过程灭菌是否彻底。
（7）图中步骤C为倒平板，过程D为涂布分离法，均匀的涂布在培养基上，使得单菌落更易分开。
（8）鉴定尿素分解菌常采用酚红指示剂染色，尿素分解产生的氨使指示剂变红色，如果菌落周围出现红色环带，说明该菌落能分泌脲酶。
115．（2020·山东青岛市·高三一模）玉米具有易种植、遗传背景清晰等特点，是遗传学家常用的实验材料。
（1）研究者利用一种紫色籽粒玉米品系与无色籽粒玉米品系进行杂交实验，实验过程及结果如图1所示。据此推测，籽粒颜色的遗传由__________对基因控制，符合__________定律。

（2）为研究花斑性状出现的原因，研究者进行了系列实验。
①利用F2代花斑籽粒玉米进行测交实验，发现后代中超过10%的玉米籽粒颜色为紫色，该现象__________（填“可能”或“不可能”）是由于发生了基因突变，原因是__________。
②针对花斑性状的这种“不稳定性”，有学者提出决定玉米籽粒颜色的基因（A/a）中存在一种移动因子，可以插入到基因中，也可以从基因中切离，该因子的移动受到另一对等位基因（B/b）控制。因此花斑性状产生的原因是玉米发育过程中进行__________分裂时，B基因的存在使得a基因中的移动因子随机切离，恢复为A基因，这一事件在发育过程越早的时期，紫斑越__________。类似地，测交实验后代中出现紫色性状的原因是__________。
③研究者发现上述测交实验中恢复为紫色籽粒的玉米中，又出现了一些籽粒无色、凹陷、非蜡质的新表型（图2a）。经研究，决定籽粒颜色、性状、蜡质的基因均位于9号染色体上（图2b）。

由此，研究者提出切离的移动因子可能会插入其他位置，并从其他位置切离导致染色体断裂。根据该推测，请在图2b中画出移动因子插入、切离的位置_____。
（3）科学家发现的移动因子可以导致频繁的_____（变异类型），从而为育种提供丰富的材料。请根据本题信息，提出基于移动因子的育种基本思路_________。
【答案】2 自由组合 不可能 基因突变具有低频性 有丝 大 花斑玉米产生的aB配子中，B基因的存在使a基因恢复为A，获得该配子的子代玉米表现为紫色籽粒 基因突变和染色体结构变异 选择具有移动因子和B基因的品种进行杂交，选取后代出现符合需要的突变性状且bb纯合的植株留种
【分析】
基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。
紫色籽粒玉米品系与无色籽粒玉米品系进行杂交，F1全为紫色玉米，F1自交得到F2，F2中性状分离比为12:3:1，属于9:3:3:1的变形，说明玉米籽粒是由两对等位基因控制，且遵循基因的自由组合定律。
【详解】
（1）通过分析可知，玉米籽粒颜色性状受2对基因控制，符合自由组合定律。
（2）①基因突变具有低频性，而题中变异率高达10%，故不可能是基因突变。
②籽粒颜色是由体细胞中基因表达的结果，体细胞是由受精卵有丝分裂而成。切离事件发生时间越早，更原始的体细胞表达出A基因决定的紫色性状，紫色斑越大。测交时，花斑玉米（aaB_）产生的aB配子中，B基因的存在使a基因恢复为A，获得该配子的子代玉米表现为紫色籽粒。
③测交后代中，恢复为紫色籽粒的玉米基因型为A_Bb，其中B基因能够让已存在的移动因子让A、S、W基因由于染色体断裂而消失，那么移动因子插入并切离的位置需要在着丝点和A+S+W基因之间，让三个基因一起断裂消失，具体如图。
（3）由上述题目分析可见，移动因子能够破坏基因和染色体的结构，引起基因突变和染色体结构变异。在育种时，为了保持突变体（由于移动因子插入野生型基因产生）的性状，选择具有移动因子和B基因的品种进行杂交，选取后代出现符合需要的突变性状且bb纯合的植株留种。
【点睛】
本题旨在考查学生理解并掌握基因的自由组合定律的实质等知识，把握知识的内在联系，形成知识网络，并结合题干题干信息进行推理、解答问题。