2021学年二 动物细胞融合技术与单克隆抗体教课ppt课件

这是一份2021学年二 动物细胞融合技术与单克隆抗体教课ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了动物细胞融合，①什么是病毒的灭活，细胞膜的流动性，诱导的手段，融合后细胞的类型，动物细胞融合过程，小结1，初试牛刀初试牛刀，乙肝病毒模式图，什么是抗原等内容，欢迎下载使用。

思考：1、动物细胞融合的概念是什么？ 2、动植物细胞在结构上有何区别？这对它们杂交或融合过程有什么影响？ 3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？那动物细胞融合呢？4、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、动物细胞融合有什么意义？主要应用在哪些方面？
2个完整的杂交细胞AB
讨论：6、植物体细胞杂交可得到杂种植株，动物细胞融合后能象电影上一样形成杂种动物个体吗?为什么？
1970年，有两位科学家做了一个著名的实验：人—鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。
人—鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？
一、动物细胞融合1.细胞融合： 是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。⑴自然发生： 受精卵⑵人工诱导： 利用诱导剂诱导动物细胞融合 诱导因素：聚乙二醇、灭活的病毒或电激等。
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
②灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞
正在融合的鸡血细胞
⑶动物细胞融合的原理：
把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交细胞。 融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞
灭活病毒、PEG、电激等
融合后的细胞进行有丝分裂，形成完整的杂交细胞
AB杂种细胞遗传物质有什么特点？
三种AA、AB、BB（A、B）
物理法的融合效率较高,且对细胞（原生质体）的伤害小,易操作、控制和观察。
太空中处于失重状态，不同种细胞（原生质体）更容易亲近；
为什么在太空中细胞（原生质体）融合率会大大上升？为什么选用物理法诱导？
2、动物细胞融合的应用
1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。
2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。
鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡 、人—胡萝卜等
3、重要用途：制备单克隆抗体。
去壁—原生质体融合—诱导新壁—杂种植株
植物、动物细胞融合的比较
【例1】能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 （ ）A.离心 B.灭活的病毒 C.电刺激 D.振动【例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（ ）具有原来两个或多个细胞的遗传信息 B.能无限增殖 C.可形成新个体 D.培养过程会贴壁【例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（ ）A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新物种 D.生产杂种细胞
使用相应的抗体检测乙肝病毒——抗原
二、单克隆抗体的制备 医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？

凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原。
例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。
抗原决定簇：抗原表面具有的某些特定的化学基团，能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗原的重要依据。各种抗原的决定簇数目不同，同一抗原的决定簇可能有多种。
2、什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？

当机体受到抗原刺激剂后由效应B细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白——抗体。 抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。
抗体与相应抗原特异性结合
抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里?
3、抗体的传统生产方法：
血清抗体（也称多克隆抗体） 由血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆抗体。特点： 产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。
每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。 如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体。
问题： 怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？
在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？
抗体 抗原 应答 抗体的不纯性
动物细胞受到抗原刺激,引起免疫反应产生的球蛋白.
不是自己的而又能引起免疫应答反应的物质就是抗原.
一种抗原有多种不同的决定簇,刺激的是多种B细胞,作用于不同的B细胞后,会产生多种抗体, 这是多克隆的, 故不纯!
4.制备单克隆抗体的思路
怎么才能得到纯的抗体?光纯还不行,还要大量.怎么办?但，有问题:找，什么细胞能无限繁殖呢?思路就出来了:
要想获单一的纯抗体,就必须从一个B细胞出发.
让B细胞大量繁殖(克隆)就可以产生大量抗体了.
B细胞是不能无限繁殖的.怎么办?
癌! 只有癌细胞. 但它不能产生抗体.
癌细胞能无限繁殖,但不能产生抗体.B细胞能产生抗体,但不能大量繁殖.融合呀!只要将两个细胞融合即可互补.
问题: 在培养体系中, 有5种细胞. B细胞、瘤细胞,和杂交细胞。 我们还是拿不到McAb,怎么办? 筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛? 又是一个思路问题。


加入聚乙二醇（PEG）
⑴如何得到B淋巴细胞？
6.制备单克隆抗体的过程
⑶细胞两两融合后，有哪些类型？
B-B B-瘤(杂交瘤细胞) 瘤-瘤
⑷如何筛选出杂交瘤细胞？

单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 ①首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？
在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！ 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。
例：已知细胞增殖时合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。 人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖， 将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有 种细胞。
加入氨基喋呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的 及其彼此融合的细胞不能增殖。 人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。
如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？
通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。
②再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
方法——抗原-抗体杂交法
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。
⑻如何得到大量的单克隆抗体？

单克隆抗体 ——化学性质单一、特异性强
4.第一次筛选出的杂交瘤细胞为何需进行克隆化培养和专一抗体检测？
单克隆抗体的制备过程：
特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖
特点：特异性强灵敏度高可大量制备
②定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病
用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。
③用于治疗疾病和运载药物
利用同位素标记单抗，在特定组织成像
制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。
单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。
⑵用于治疗疾病和运载药物 ①特异性强、灵敏度高 生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物 ②疗效高、毒副作用小
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞膜的流动性、细胞增殖
动物细胞融合与两次筛选
对产生特定抗体的杂交瘤细胞培养
单抗有助于疾病的诊断、治疗
获得具优良性状的杂种植株
动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用 动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术
⑶图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________ 。
1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案
⑴该实验方案的目是 ；
⑵A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生 ；
1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？2、从何处获得较多的B淋巴细胞？3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4、怎样筛选出杂交瘤细胞？5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？7、怎样获得大量的单一抗体？
反复注射特定的抗原，免疫小鼠。
利用HAT选择培养基培养，筛选
用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
体内或体外大量培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。
产生所需抗体的杂交瘤细胞
1、该过程中用到了两种技术
2、单克隆抗体的制备过程的三个“一”：
一种诱导细胞融合的新方法，产生了一种新细胞，得到了一种优势抗体。
单克隆抗体优势：特异性强、灵敏度高，可大量制备
一个诱导细胞融合的新方法 －－灭活病毒
一个新细胞－－杂交瘤细胞
一个优势－－单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势
1975年Khler和Milstein的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图10示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：图10（1）该技术是在动物细胞培养技术和 技术的基础上发展起来的。（2）图10中细胞A体外培养不具有分裂能力，但能分泌 ，细胞B体外培养能够 。（3）动物细胞融合常用的方法是 。
（1）动物细胞融合（2）分泌特异性抗体 、无限增殖（3）PEG（灭活的病毒、电刺激）
（4）细胞融合是随机的过程，在HAT培养基中培养，要筛选出 细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡萄糖，常向培养液中加入 （激素）。 （5）培养2周后，即测定培养细胞的特征，筛选出 细胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到7～10个细胞/ml，每孔滴入0.1ml细胞稀释液，其目的是 。（6）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行 培养。
（4）杂交瘤、胰岛素（5）特异性分泌抗X蛋白抗体的、保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）、（6）体外或体内
单克隆抗体制备过程
8.已知细胞合成DNA有 D 和 S 两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般DNA不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：
⑴试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞

⑵设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。 培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。
（1）融合后的杂种细胞容易成活吗？（2）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程技术手段？ （3）在整个制备的过程中要经过几次筛选？
细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活
细胞融合技术、细胞培养技术
Ⅰ.筛选得到杂交瘤细胞， Ⅱ.筛选先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交 瘤细胞下培养筛选出特异抗体的细胞群
⑷怎样筛选出B淋巴细胞和骨髓瘤细胞间融合所形成的能产生特定抗体的杂交瘤细胞？
用抗体检测和克隆化培养得到能分泌所需抗体的杂种细胞——专一抗体检测。
18.如何利用杂交瘤细胞来大量生产单克隆抗体？
①将杂交瘤细胞在体外大规模培养，从细胞培养液中就能提取大量的单克隆抗体； ②把杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖，再从小鼠腹腔中提取单克隆抗体。
⑸如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？ 融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。 阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
第二次筛选的原理和方法： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。 通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。
1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？
植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。
诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。
2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？
哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。
3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？
就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
4.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？
融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。