2020版高考新创新一轮复习生物通用版学案：选修3第1讲基因工程

第1讲 基因工程

1．基因工程的基本工具

2．基因工程的基本操作程序

3．蛋白质工程

4．DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理

2．实验流程

[基础微点全练]
1．判断正误
(1)限制酶只能用于切割目的基因(×)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)
(4)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(5)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(√)
(6)用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质(√)
(7)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(×)
(8)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同(×)
2．(2013·广东高考)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是(　　)
A．合成编码目的肽的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
解析：选C　该基因的表达产物多肽P1的抗菌性和溶血性均很强，要研发出抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先应根据P1的氨基酸序列设计模拟肽，再构建相应的DNA片段。
3．下列有关限制酶的叙述正确的是(　　)
A．用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
解析：选B　用限制酶切割DNA分子中部获得一个目的基因时，需剪切2次，水解磷酸二酯键4个；限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端均有4个碱基；切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系，则两末端也可连接。
4．(2019·郴州质检)利用基因工程技术培育马铃薯新品种，目前已经取得丰硕成果。请根据教材所学知识回答下列问题：
(1)马铃薯易患多种疾病，导致其产量不高。通过导入抗病基因并使其表达可以提高马铃薯产量，基因工程中使用最多的抗病基因是________________和病毒的复制酶基因。
(2)马铃薯是双子叶植物，常用__________(方法)将目的基因导入马铃薯受体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构包括目的基因、标记基因、________、________、________等五部分。
(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，其设计方法为：修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂________(填“敏感”或“不敏感”)，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能________。
(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行________________。
解析：(1)在基因工程中，使用最多的抗病基因是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。(2)常用农杆菌转化法将目的基因导入马铃薯等双子叶植物的受体细胞中。构建好的基因表达载体的基本结构包括目的基因、标记基因、终止子、启动子和复制原点等五部分。(3)培育抗除草剂的转基因马铃薯，需通过修饰，使除草剂作用的靶蛋白对除草剂不敏感，或使靶蛋白过量表达，使植物吸收除草剂后仍能正常代谢。(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行目的基因的检测与鉴定。
答案：(1)病毒外壳蛋白基因　(2)农杆菌转化法　启动子　终止子　复制原点　(3)不敏感　正常代谢　(4)目的基因的检测与鉴定







一、基因工程的操作工具
[试考题·查欠缺]
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是______________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。
解析：(1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　(3)E·coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶
2．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________________________；并且__________________________和______________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有______________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________________。
解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞



[强知能·补欠缺]
1．据图分析选择限制酶的两个依据

选择依据
内容
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲可选择PstⅠ，不能选择SmaⅠ；
②为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
根据质粒的特点确定限制酶的种类
①切割质粒和目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；
②质粒上有标记基因等，所选限制酶尽量不要破坏这些结构。如图乙中选SmaⅠ会破坏标记基因；
③如果所选限制酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制

2．与DNA有关的酶的比较
比较项目
限制酶
DNA
连接酶
DNA
聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA
分子片段
脱氧
核苷酸
DNA分子
作用部位
磷酸
二酯键
磷酸
二酯键
磷酸
二酯键
碱基对
间的氢键
形成产物
黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
新的
DNA分子
形成单链DNA
3.全面理解基因工程中的载体
(1)应具备的条件
①能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。
②具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。

(2)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
4．载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：

[练题点·全过关]
1．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
　　　　　G……CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是___________________________________。
(3)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(4)基因工程中除质粒外，________和________也可作为载体。
解析：(1)当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。(2)为使载体与目的基因相连，不同的限制性核酸内切酶应该切出相同的黏性末端。(3)反转录是指以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR(多聚酶链式反应)。(4)基因工程中可以作为载体的除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
答案：(1)黏性末端　平末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
(3)mRNA(或RNA)　cDNA(或DNA)　PCR
(4)λ噬菌体的衍生物　动植物病毒
2．(2016·江苏高考节选)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点







(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过______________作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_______________________________
_________________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2＋处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。
答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA连接酶　感受
(2)四环素　引物甲和引物丙
(3)　都不能

二、基因工程的基本操作程序　

[试考题·查欠缺]
1．(2018·海南高考)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_____________________________________
________________________________。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到________________(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用________作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

解析：(1)当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，因此用农杆菌感染时，优先选用黄瓜受伤的叶片。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，说明目的基因－甜蛋白基因在受体细胞中已经完成表达；若甜蛋白基因整合到线粒体基因组或叶绿体基因组中，在遗传时遵循母系遗传，不会出现固定的分离比，所以子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组。(4)基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出符合人们需要的新生物类型和生物产品。
答案：(1)受伤的　叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞　(2)甜蛋白基因　核基因组　(3)茎尖　(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
2．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是______________________________
________________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是________________________。
解析：(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需的启动子。(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　
(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子　(4)磷酸二酯键　
(5)目的基因的转录或翻译异常
3．(2018·江苏高考有改动)为生产具有特定性能的α­淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α­淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α­淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增α­淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度　②退火温度　③延伸温度　④变性时间　
⑤退火时间　⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α­淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α­淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50 mmol/L Na2HPO4­KH2PO4
50 mmol/L
Tris­HCl
50 mmol/L
Gly­NaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相对活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8

根据上述实验结果，初步判断该α­淀粉酶活性最高的条件为________________________
________________________________________。
解析：(1)利用PCR技术扩增α­淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α­淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α­淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris­HCl。
答案：(1)基因组DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连　(3)②　⑥　(4)8　13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris­HCl
[强知能·补欠缺]
1．获取目的基因的方法
(1)几种获取目的基因方法的比较
方法
从基因文库中获取
人工合成
从基因组文
库中获取
从部分基因文库，如cDNA文库中获取
化学
合成法
逆转录法
过程





(2)诠释PCR技术
①PCR原理：DNA复制原理，即：

②PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链

复性
温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸
温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸


③结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2．基因表达载体的组成
目的基因
能够控制特定性状
启动子
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
终止子
RNA聚合酶脱离部位，终止转录
标记基因
鉴别受体细胞中是否含有目的基因
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

4．目的基因检测与鉴定的方法

[练题点·全过关]
1．(2019·上饶一模)基因工程技术是现代生物科技中非常重要的技术。现假设植物甲具有极强的耐旱性(其耐旱性与某个基因有关)，若从植物甲中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，可提高植物乙的耐旱性。请回答下列问题：
(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤，属于基因工程核心步骤的是____________________。
(2)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即___________________和___________________中分离出来。
(3)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因文库，再从中筛选出所需的耐旱基因。基因文库可分为两种，分别是________________________。
(4)若将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。
(5)若将耐旱基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒包含________________________________________________________________________两种。
(6)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了____________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
解析：(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。(2)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界中已有的物种中分离出来。(3)基因文库可分为两种，分别是基因组文库和部分基因文库。(4)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的表达产物，如果检测结果呈阳性，再进行个体生物学水平的测试，在田间试验中检测植株的耐旱性(目的性状)是否得到提高。(5)若将耐旱基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒包含钨粉粒子和金粉粒子两种。(6)设该耐旱基因为A，相应的不耐旱基因为a。用得到的二倍体转基因耐旱植物自交，若耐旱基因整合到了同源染色体的一条上时，则此时亲本的基因型为Aa，子代中耐旱(A_)与不耐旱(aa)植株的数量比为3∶1；若耐旱基因整合到了同源染色体的两条上时，则此时亲本的基因型为AA，后代均为耐旱植株。
答案：(1)基因表达载体的构建　(2)用人工的方法合成　从自然界中已有的物种　(3)基因组文库和部分基因文库　(4)表达产物　耐旱性　(5)钨粉粒子和金粉粒子
(6)同源染色体的一条上

2．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。
解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。
答案：(1)逆转录　cDNA　(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对　(3)变性　(4)引物与模板　GC含量高　(5)②③

三、基因工程的应用与蛋白质工程
[试考题·查欠缺]
1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了______________________________________________________________________________
________________________________________________ (答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
2．(2019·大庆质检)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β­肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：
(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的______________序列发生改变。
(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作____________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。
(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的________，以其作为模板，在________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和________酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。

(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行______________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
解析：(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质。(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原—抗体杂交实验加以判断。
答案：(1)碱基对(或脱氧核苷酸)　(2)不属于　没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰) (3)mRNA(或RNA)　逆转录　DNA连接　(4)蛋白质　抗原—抗体
3．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的____________________________________________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括__________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________________________________________________________________
和____________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸序列进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如图所示：

由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(合理即可)　(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)　(3)设计预期的蛋白质的结构　推测应有的氨基酸序列　功能
[强知能·补欠缺]
1．基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。
(3)比较基因治疗与基因诊断

原理
操作过程
进展
基因
治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因
诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2．蛋白质工程
(1)流程图

(2)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(3)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
3．蛋白质工程与基因工程的关系

蛋白质工程
基因工程
区　别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造


[练题点·全过关]
1．(2019·潍坊一模)人参是珍贵的药用植物，研究人员运用转基因技术构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统，为珍贵药用植物与疫苗联合应用开辟了新思路，其构建过程如图所示，图中SmaⅠ、SstⅠ、EcoRⅤ为限制酶。请回答相关问题：

(1)②的构建过程除限制酶外还需要________酶；想要从②中重新获得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRⅤ或SmaⅠ，原因是____________________________________。
(2)将重组质粒转入农杆菌常用________处理细胞；要使目的基因成功整合到人参细胞的染色体上，该过程所采用的质粒应含有________________。
(3)分析图可知，②中应含有的标记基因是____________；过程⑤的目的是____________________。
(4)该疫苗进入机体后可刺激机体产生能与乙肝病毒特异性结合的________，同时还能产生________使机体长期对乙肝病毒具有免疫力。
解析：(1)图示②表示基因表达载体，其构建过程先要用同种限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来形成重组质粒。限制酶EcoR Ⅴ和SmaⅠ切割DNA后产生的是平末端，两平末端与目的基因连接后形成的重组质粒中不再存在这种限制酶的识别序列，因此所用的限制酶不能是EcoRⅤ或SmaⅠ。(2)将重组质粒导入微生物常用感受态细胞法，即用Ca2＋处理微生物细胞，使之成为感受态细胞，最终借助农杆菌的T­DNA将目的基因整合到人参细胞的染色体DNA上。(3)图中⑤过程在含有氨芐青霉素的培养基上培养，说明构建的重组质粒上含有的标记基因是氨芐青霉素抗性基因。过程⑤的目的是筛选出含有HBsAg基因的人参细胞。(4)该疫苗进入机体后可刺激机体产生能与乙肝病毒特异性结合的抗体，同时还能产生记忆细胞使机体长期对乙肝病毒具有免疫力。
答案：(1)DNA连接　两平末端连接后的重组序列不能再被EcoR Ⅴ和SmaⅠ识别(重组质粒无这种限制酶的识别序列)　(2)钙离子(Ca2＋)　T­DNA　(3)氨苄青霉素抗性基因　筛选出含有HBsAg基因的人参细胞　(4)抗体　记忆细胞
2．(2019·泉州质检)培育转基因普通小麦(六倍体)时，利用小麦幼胚、花药等作为目的基因的受体，经选育可获得小麦纯合子植株。请回答下列问题：
(1)在基因表达载体的构建过程中，需要依据目的基因、载体的核苷酸序列及限制酶的识别序列选择________(填“限制酶”或“DNA连接酶”)；相同限制酶分别切割目的基因和载体后通常会形成相同的________。
(2)导入目的基因的花药经离体培养获得的幼苗一般为________(填“六倍体”“三倍体”或“单倍体”)；该幼苗经________处理可以获得转基因纯合子植株。
(3)目的基因探针不能用于检测小麦转基因植株是否为纯合子，原因是________________________________________________________________________。
(4)与小麦花药作为受体相比，利用小麦幼胚作为受体获得转基因小麦纯合子植株的速度较________。
解析：(1)在基因表达载体的构建过程中，需要用同种限制酶来切割目的基因和载体，这样才能形成相同的末端，便于连接。(2)导入目的基因的花药经离体培养获得的幼苗一般为单倍体，因为花药是配子，由配子发育成的植株不管含几个染色体组都是单倍体。该幼苗需要经过秋水仙素或低温处理后，使植株染色体数目加倍，恢复其可育性，才能获得转基因纯合子植株。(3)目的基因探针检测时只要含有目的基因就会出现杂交带，所以目的基因探针不能用于检测小麦转基因植株是否为纯合子。(4)与小麦花药作为受体相比，利用小麦幼胚作为受体获得转基因小麦纯合子植株的速度较慢，因为还需要自交多次筛选出纯合子。
答案：(1)限制酶　黏性末端(或平末端或末端)　(2)单倍体　秋水仙素(或低温)　(3)无论转基因小麦是纯合子还是杂合子，都能检测到目的基因　(4)慢

四、DNA的粗提取与鉴定
[试考题·查欠缺]
1．(2018·江苏高考)关于还原糖、蛋白质和DNA的鉴定实验，下列叙述正确的是(　　)
A．在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色
B．在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色
C．提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液
D．将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色
解析：选D　甘蔗茎的组织样液富含蔗糖，而蔗糖属于非还原糖，且不能用斐林试剂检测，A错误；大豆种子中富含蛋白质，先后加入双缩脲试剂A液和B液摇匀后，液体由蓝色变为紫色，B错误；提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤纸上的粘稠物，留下滤液，C错误；将DNA粗提物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂并水浴加热，溶液由无色变为蓝色，D正确。

2．(2013·江苏高考)某同学用洋葱进行DNA粗提取和鉴定实验，操作错误的是 (　　)
A．加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨
B．用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA
C．加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌
D．加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热
解析：选A　加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和，否则会产生许多泡沫，不利于后续步骤的操作，A错误；蛋白酶能够分解蛋白质，因此能起到纯化DNA的目的，B正确；加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免引起DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀，C正确；DNA可与二苯胺试剂在沸水浴条件下作用显蓝色，D正确。
[强知能·补欠缺]
1．DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异
比较项目
DNA
蛋白质
溶
解性
2 mol/L NaCl溶液中
析出
溶解
0.14 mol/L NaCl溶液中
析出
溶解
酒精溶液中
析出
溶解
耐受性
蛋白酶
无影响
水解
高温
80 ℃以上变性
不能忍受60～80 ℃的高温
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、3、4”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂；
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤3次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；
②滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；
③过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；
②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；
③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；
④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
3.DNA粗提取实验中的三个注意点
(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
(2)因DNA容易被玻璃容器吸附，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，减少提取过程中DNA的损失。
(3)每次用玻璃棒搅拌时都要沿同一方向，防止打碎DNA分子。

[练题点·全过关]
1．(2019·石家庄质检)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。回答下列问题：

(1)图中实验材料A可以是______________等，研磨前加入的B应该是________________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后， 再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是____________________________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
1
研磨液中
搅拌研磨后过滤
滤液E
2
2 mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的95%的酒精溶液中
搅拌后过滤
滤液H
(4)DNA鉴定的原理是___________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨。(2)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小，向滤液中加入2 mol/L 的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质；向滤液中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出，除去溶解在低盐溶液中的杂质。(3)DNA不溶于冷酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA。(4)鉴定DNA 的原理是在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
答案：(1)洋葱、菜花　洗涤剂和食盐　(2)使DNA溶解　使DNA(溶解度下降而沉淀)析出　(3)H　(4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色
2．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，对DNA进行鉴定时，做如下操作：








　　
试管
步骤
A
B
1
加2 mol/L的
NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的
NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA
丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象


实验结论



(1)根据如图，完成表格空白处的实验内容。

(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液的颜色为___________________________
______________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是____________________，同时说明DNA对高温有较强的__________________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与_______________________________________
有关。
答案：(1)溶液不变蓝色　溶液变蓝色　DNA在沸水浴的条件下遇二苯胺会变成蓝色　(2)基本不变(不呈蓝色)　(3)加快颜色反应速度　耐受性　(4)对照
(5)DNA(丝状物)的多少

1．(2017·北京高考)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。

下列操作与实验目的不符的是(　　)
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C　目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上。
2．(2014·重庆高考)下图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　)

A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
解析：选D　构建重组质粒需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的T­DNA整合到受体细胞的染色体上，而不是重组Ti质粒整合到受体细胞的染色体上，导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状，⑤表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异。
3．(2014·江苏高考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
解析：选C　含DNA的生物材料都可用来提取DNA，只是选用DNA含量高的生物组织，成功的可能性更大；DNA在2 mol/L NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA；DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后溶液变蓝。
4．(2019·太原模拟)下面为“DNA的粗提取与鉴定”实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题：

(1)正确的操作顺序是______________________________。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是____________和__________________________________。
(3)图A步骤中所用酒精必须经过____________才能使用，该步骤的目的是______________________________。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加____________试剂，沸水浴，如果出现________，则该丝状物的主要成分为DNA。
解析：两次加入蒸馏水的作用：第一次是使鸡血细胞吸水涨破，DNA从细胞中释放出来进入滤液；第二次是使溶解于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，与杂质分离。本题还涉及DNA的鉴定，DNA可在沸水浴条件下与二苯胺试剂作用，被染成蓝色。
答案：(1)C→B→E→D→A　(2)加速鸡血细胞的破裂　降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出　(3)充分冷却　提取含杂质少的DNA　(4)二苯胺　蓝色
5．(2019·贵州模拟)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶基因对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是______________，该过程需要加入的酶是________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中________(填“存在的”或“不存在的”)，PCR定点突变技术属于________工程的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用____________________法将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR过程所依据的原理是DNA双链复制，该过程需要加入的酶是耐高温的DNA聚合酶。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是蛋白质空间结构较为复杂，改造困难。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中不存在的，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是植物细胞的全能性。
答案：(1)DNA双链复制　耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)　引物　(2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难　不存在的　蛋白质　(3)农杆菌转化　植物细胞的全能性
6．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有____________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是______________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原—抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A　(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕　(3)繁殖快、容易培养　(4)蛋白A的抗体　(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
7.(2017·全国卷Ⅲ节选)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图所示。回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是______________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。
解析：(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。(2)使用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、dNTP作为原料。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG(TAC)，转录出的mRNA无起始密码子　(2)模板　dNTP(脱氧核苷酸)
8．(2018·常德一模)真核生物基因中通常含有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。如图表示从基因文库提取胰岛素基因的过程。回答下列问题：

(1)从基因结构分析，与基因组文库中的基因相比，cDNA文库中获得的目的基因少了____________________________________________等结构(至少写两个)。
(2)将获得的胰岛素基因导入受体菌内，并在受体菌内维持稳定和表达的过程，在基因工程中称为________。
(3)过程⑤需将纤维素膜上的细菌裂解，释放出________，再用32P标记的________作为探针进行杂交。依据杂交结果，应选取培养基上________(填字母)菌落继续培养，才能获得含有胰岛素基因的受体菌。
(4)经过目的基因的检测和表达，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是________________________________________________。
(5)与从基因组文库获取目的基因相比，图示方法获得的目的基因在受体菌中更容易表达，原因是___________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)cDNA文库是由mRNA经逆转录而来，成熟的mRNA已经切除了内含子对应的碱基序列，且mRNA不含有启动子、终止子对应的碱基序列，因此cDNA文库中获得的目的基因少了启动子、终止子、内含子等结构。(2)将获得的胰岛素基因导入受体菌内，并在受体菌内维持稳定和表达的过程，在基因工程中称为转化。(3)过程⑤用32P标记的目的基因(或胰岛素基因)单链作为探针检测受体菌中是否含有目的基因，首先需将纤维素膜上的细菌裂解，释放出DNA。培养基上a菌落对应位置出现杂交带，说明a菌落是由含有胰岛素基因的受体菌形成的。(4)大肠杆菌中没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对核糖体合成的肽链进行有效的折叠、加工，所以从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性。(5)cDNA文库中获得的目的基因没有内含子，转录出的RNA不需要经过加工，可直接作为合成蛋白质的模板，所以在受体菌中更容易表达。
答案：(1)启动子、终止子、内含子　(2)转化　(3)DNA　目的基因(或胰岛素基因)　a　(4)受体菌中基因表达获得的蛋白质未加工　(5)cDNA中不含有内含子，转录出的RNA不需要经过加工，可直接作为合成蛋白质的模板
9．(2019·昆明调研)科学家将拟南芥的抗寒基因(CBFl)，转入香蕉以获得抗寒的香蕉品种。如图是某质粒载体上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ四种限制酶的切割位点示意图。据图回答问题：

(1)在该实验中为构建基因表达载体，用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后，对质粒载体进行切割的限制酶是_______________________，理由是_____________________________。
(2)连接CBFl基因到该质粒载体后，作为基因表达载体的组成还必须有____________________________________________。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是__________________________。
(3)为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含______________的培养基进行筛选。
(4)科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行______________处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果__________________________，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。
解析：(1)在基因工程中，用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端，所以和含目的基因的DNA一样，质粒也应使用SacⅠ、XbaⅠ进行切割。(2)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、标记基因、目的基因等。香蕉细胞是植物细胞，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(3)据图分析可知，质粒上的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，所以为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。(4)根据题干信息已知目的基因是抗寒基因，所以科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行低温处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果实验组的抗寒能力明显高于对照组，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。
答案：(1)SacⅠ、XbaⅠ　用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端　(2)启动子和终止子　农杆菌转化法　(3)氨苄青霉素　(4)低温　实验组的抗寒能力明显高于对照组
10．(2019·大连模拟)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的菜花、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃，另一组置于－20 ℃条件下，保存24 h。
DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol/L的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如表所示：
材料保存温度
菜花
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是___________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少____________________________________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：________________________________________________________________。
②针对结论1，请提出合理的解释：_____________________________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：__________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
解析：(1)从题目实验步骤看出，该实验的课题是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。(2)在第二步中，为了防止DNA断裂，要用玻璃棒“缓缓地”搅拌。(3)从题表中结果看出，相同材料在低温保存下的DNA提取量大，这是由于低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢；在相同条件下，蒜黄组蓝色最深，说明相同条件下从蒜黄中提取的DNA量最大。(4)由于氯仿密度比水大，可使蛋白质变性沉淀，而与水和DNA均不相溶，故可将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液。
答案：(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响　(2)DNA断裂　(3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多　②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢　(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
11．干扰素是动物或人体细胞受到病毒感染后产生的一种糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖及抗肿瘤的作用。培育转干扰素基因马铃薯植株的大致流程如图所示。请回答下列问题：

(1)过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是________________，使用上述酶的优点是____________________________________(答两点)。
(2)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用________处理根瘤农杆菌，使其成为感受态细胞，最终使干扰素基因插入马铃薯细胞的________________上。
(3)在分子水平上检测转基因是否成功包括三个方面：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：据图分析可知，过程①表示构建基因表达载体，需要使用的工具酶有限制酶和DNA连接酶；过程②表示将重组质粒导入植物细胞，利用的是农杆菌转化法；过程③表示脱分化形成愈伤组织；过程④表示再分化形成胚状体，进而发育成完整植株的过程。(1)过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是PstⅠ、EcoRⅠ，分别使用这两种限制酶，可以防止目的基因被破坏，确保目的基因以唯一方式和质粒连接。(2)图中将重组质粒(含有目的基因)导入根瘤农杆菌时，常用Ca2＋处理根瘤农杆菌，使其成为感受态细胞，以便重组质粒的导入，最终使干扰素基因插入马铃薯细胞的染色体DNA上。(3)在分子水平上检测转基因是否成功包括目的基因、mRNA和蛋白质的检测，即检测转基因生物的DNA是否插入干扰素基因，检测干扰素基因是否转录出mRNA，检测干扰素基因是否翻译出干扰素。
答案：(1)PstⅠ、EcoRⅠ　可防止目的基因被破坏；确保目的基因以唯一方式和质粒连接　(2)Ca2＋　染色体DNA　(3)检测转基因生物的DNA是否插入干扰素基因，检测干扰素基因是否转录出mRNA，检测干扰素基因是否翻译出干扰素