2020版高考新创新一轮复习生物新课改省份专用学案：选修模块I-3第1讲发酵工程

第1讲 发酵工程

一、微生物的实验室培养
1．培养基

2．无菌技术

3．大肠杆菌的纯化培养


二、微生物的分离与计数
(一)土壤中分解尿素的细菌的分离

(二)分解纤维素的微生物的分离
1．实验原理

2．实验流程

三、传统发酵技术的应用
(一)果酒和果醋的制作
1．制作原理

菌种
反应
果酒
酵母菌
有氧条件，大量繁殖：
C6H12O6＋6O26CO2＋6H2O　
无氧条件，产生酒精：　
C6H12O6　2C2H5OH＋2CO2　　　
果醋
醋酸菌
氧气、糖源都充足时：糖→醋酸
缺少糖源时：乙醇→乙醛→醋酸
C2H5OH＋O2 CH3COOH＋H2O
2．实验设计与操作


(二)腐乳的制作
1．制作原理

2．实验流程及影响因素


(三)泡菜的制作
1．泡菜制作流程
　
2．学会测定亚硝酸盐的含量
(1)亚硝酸盐与人体健康的关系：当摄入总量较多时，可引起中毒或死亡；在特定条件下可转化为致癌物——亚硝胺。
(2)检测方法：比色法。
(3)检测原理
①有关反应：NO＋对氨基苯磺酸→反应物；
反应物＋N­1­萘基乙二胺盐酸盐→玫瑰红色染料。
②判断方法：观察样品颜色变化，并与标准显色液比较，然后计算亚硝酸盐含量。亚硝酸盐溶液的浓度高，颜色深些；溶液浓度低，颜色浅些。
(4)检测步骤：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。
[基础微点全练]
1．判断正误
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐(√)
(2)培养基分装到培养皿后才能进行灭菌(×)
(3)消毒的原则是既能杀死材料表面的微生物，又要减少消毒剂对细胞的伤害(√)
(4)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧(√)
(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就可在培养基表面形成单个菌落(√)
(6)在葡萄酒制作中，采摘的葡萄应反复冲洗，且要先除枝梗再冲洗(×)
(7)在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，要向发酵装置通入空气(×)
(8)在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右(√)
(9)将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量(×)
(10)配制泡菜盐水时，盐与水的质量比为4∶1(×)
(11)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件(×)
(12)果酒、果醋和腐乳的制作中，腐乳制作所需要的适宜温度最高(×)
2．下列有关微生物培养的叙述，错误的是(　　)
A．测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数
B．在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌
C．酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
解析：选B　在对微生物进行培养前，需要对培养基进行灭菌，不能对所培养的微生物进行灭菌。
3．下列关于统计菌落数目方法的叙述，错误的是(　　)
A．采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的菌落数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布3个平板，若3个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
解析：选C　当两个或多个活菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30～300的平板计数，密度过大会使计数结果偏小，影响结果的准确性。至少涂布3个平板，作为重复组，取其平均值计数能增强实验的说服力和准确性。
4．下列关于制作果酒、果醋和腐乳的叙述，错误的是(　　)
A．在果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可延长
B．条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸
C．果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小
D．将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量
解析：选D　果酒发酵的后期，营养物质减少，酵母菌代谢减慢，产生的CO2量减少，可以间隔较长的时间再拧松瓶盖；糖源和氧气充足时，醋酸菌可以将葡萄糖分解成醋酸，糖源不足时，则将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸；果酒发酵过程中，葡萄糖分解会产生水，因此发酵液的密度逐渐减小；制作腐乳时，在摆放豆腐的同时，应逐层加盐，随层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。
5．回答下列微生物培养的问题：
(1)如表是某培养液的成分及含量，该培养液培养的微生物同化作用类型是________；若用此培养液培养固氮微生物，则应除去的成分是________，应加入的物质是________。
编号
①
②
③
④
⑤
⑥
成分
(NH4)HCO3
KH2PO4
CaSO4
FeCl2
维生素
水
含量
0.5 g
3.0 g
0.5 g
0.5 g
少许
1 000 mL

(2)下表为牛肉膏蛋白胨培养基的成分列表，据此回答：
成分
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
H2O
含量
0.5 g
1 g
0.5 g
100 mL
①牛肉膏、蛋白胨在培养基中的作用是提供__________、________、________等营养。
②要用表中所给材料配制观察细菌菌落状况的培养基，还需添加的成分是________。
③表中各成分含量确定的原则是___________________________________。
④培养基配制好后，分装前应进行的工作是___________________________________。
⑤从配制培养基直到培养完成，所采用的预防杂菌感染的方法是_____________、_____________、________________________________________________________________________等。
(3)微生物接种的方法很多，最常用的是______________和________________。
解析：(1)培养基中不含有机碳源，可判断培养的生物同化作用类型为自养型；若用此培养液培养固氮微生物，则应除去氮源(NH4)HCO3，但需加入有机物提供碳源。(2)根据所培养微生物对各营养成分的需要量配制培养基的成分，若要观察细菌菌落状况需用固体培养基，还需添加琼脂；微生物培养时需对培养基、接种工具进行灭菌处理，并进行严格的无菌操作。(3)常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
答案：(1)自养型　(NH4)HCO3(或①)　有机物　(2)①碳源　氮源　维生素(或磷酸盐等)　②琼脂(凝固剂)　③所
培养微生物对各营养成分的需要量　④调整pH　⑤高压蒸汽灭菌　灼烧接种环　酒精棉擦手(或棉塞塞试管口、在火焰旁接种)　(3)平板划线法　稀释涂布平板法
6．(2019·安阳一模)中央电视台《舌尖上的中国》栏目介绍了我国各地的美食，其中利用发酵技术制作的各类特色食品，如果醋、腐乳、泡菜等，很好的展现了广大人民群众的智慧。请回答下列问题：
(1)“天地一号”苹果醋是我国著名的果醋。工业上酿制苹果醋通常有两条途径，一条途径是向捣碎的苹果汁中直接接种________(填微生物名称)，经过一次发酵制成，在发酵过程中需要经常向发酵液中通入________；另一条途径需经过先后两次发酵获得，即________________________________________________________________________。
(2)“王致和”腐乳是我国的著名品牌，通过发酵，豆腐中营养物质的种类________(填“增多”或“减少”)。制作腐乳时加盐腌制后需要加入卤汤，若卤汤中的酒精含量过高，则会导致腐乳________________。
(3)泡菜具有独特的风味，在我国的泡菜品种中，东北酸菜和四川泡菜都非常有名，它们的制作过程基本类似，都是利用________(微生物名称)发酵。向坛中注入盐水前，煮沸所用盐水的目的是______________________。在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量的变化情况是________________________________________________________________________。
解析：(1)工业上常应用醋酸菌的有氧呼吸来制醋，在发酵过程中需要经常向发酵液中通入无菌空气维持有氧环境；还可以通过先接种酵母菌获得果酒，再在果酒中接种醋酸菌进一步获得果醋。(2)制作腐乳时通过发酵，豆腐中营养物质的种类会增加；若在腌制时卤汤中的酒精含量过高，则会使里面的微生物致死导致腐乳成熟时间延长。(3)制作泡菜利用的是乳酸菌发酵，向坛中注入盐水前，煮沸的目的是灭菌；在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量的变化情况是先增加后减少，故掌握腌制时间可以减少亚硝酸盐的含量。
答案：(1)醋酸菌　无菌空气　先接种酵母菌获得果酒，再在果酒中接种醋酸菌进一步获得果醋　(2)增多　成熟时间延长　(3)乳酸菌　杀灭细菌(或灭菌)　先增加后减少

　　　　　　　　一、培养基及微生物的纯化培养技术
[试考题·查欠缺]
1．(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。能耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min 或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，从而杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
答案：(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽
2．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。
(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

(3)右图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为__________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度(mg/L)





1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释______(填序号：①5　②10　③20)倍后，再进行比色。
解析：(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加琼脂作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。
答案：(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀释涂布　凝固剂　(3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8　③
[强知能·补欠缺]
1．培养基的配制原则、成分确定及种类
(1)培养基的配制原则
①目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
②营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
(2)培养基中营养物质的确定方法
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物(即碳源)，必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
(3)培养基的分类
①按物理状态分类
培养基种类
特点
用途
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂(如琼脂)
观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基(如琼脂)
加凝固剂
微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
②按功能分类
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品
产生特定的颜色或其他变化
鉴别不同种类的微生物
用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌

2.比较消毒和灭菌
项目
消毒
灭菌
条件
温和的物理或化学方法
强烈的理化因素
结果
仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用
方法
煮沸消毒法
巴氏
消毒法
化学药剂消毒法
灼烧
灭菌法
干热
灭菌法
高压蒸汽
灭菌法
使用
条件
100 ℃煮沸5～6 min
80 ℃煮15 min或在70～75 ℃煮30 min
70%酒精、氯气等
酒精灯火焰的外焰
干热灭菌箱，160～170 ℃，维持1～2 h
高压蒸汽灭菌锅，恒温121 ℃，维持15～30 min　
应用
范围
日常用品
不耐高温
的液体
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
接种工具
玻璃器皿、金属工具
培养基及容器

[练题点·全过关]
1．(2019·泰安统测)以下是制作酸奶的生物化学过程：将适宜的菌种接种到牛奶中，产生的乳酸使牛奶蛋白凝聚形成浓稠的酸奶。酸奶的发酵剂中含有基本等量的两种细菌(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)。保加利亚乳杆菌在无氧条件下分解牛奶中的乳糖产生乳酸，还产生多肽酶，将牛奶蛋白分解成多肽和氨基酸；这些反应会刺激嗜热链球菌生长，产生二氧化碳和甲酸，使得发酵液的pH降低，这又会促进保加利亚乳杆菌的生长和代谢。
(1)用于制作酸奶的牛奶原液首先必须进行高温处理，其目的是______________，以保证接种后的正常发酵；操作者的双手需进行清洁和________；操作间内静止空气中的细菌可用物理方法________杀灭，也可以用化学试剂________(列出两种)进行消毒。
(2)牛奶原料中不能含有抗生素，这是因为______________________________________
______________________。
(3)发酵剂中的两种细菌之间的关系属于______________________________________。
(4)包装的酸奶在2～4 ℃下保存，这样可使细菌存活但无活性，食用酸奶前不需要杀死细菌这是因为用于酸奶发酵的两种微生物________________，且能抑制人体中的某些有害菌群，因此不必灭菌即可食用。
解析：(1)用于制作酸奶的牛奶原液首先必须进行高温处理，其目的是灭菌，保证接种后的正常发酵；操作者的双手也需进行清洁和消毒；操作间内静止空气中的细菌可用物理方法紫外线杀灭，也可以用化学试剂食醋、苯酚、甲醛等进行消毒。(2)牛奶原料中不能含有抗生素，这是因为抗生素会抑制接种细菌的生长，使发酵受到抑制。(3)发酵剂中的两种细菌之间的关系属于共生。(4)包装的酸奶在2～4 ℃ 下保存，这样可使细菌存活但无活性，食用酸奶前不需要杀死细菌这是因为用于酸奶发酵的两种微生物对人体无害，且能抑制人体中的某些有害菌群，因此不必灭菌即可食用。
答案：(1)灭菌　消毒　紫外线　 食醋、苯酚、甲醛等
(2)抗生素会抑制接种细菌的生长，使发酵受到抑制
(3)共生　(4)对人体无害
2．(2019·汕头质检)中国家电研究院的洗衣机专家指出，洗衣机内部的环境非常潮湿，洗衣机使用时间越长，内部滋生微生物的机会就越大。看似干净的洗衣机，其内部隐藏着一个健康的隐形杀手。某生物兴趣小组的同学，利用内桶背面的污垢进行了相关实验。
(1)培养洗衣机内部微生物的培养基中一般含有_________________________________
______________________。
(2)该实验要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置。这样做的目的是________________________________________________________________________。
(3)以下各项中，需要消毒的是__________，需要灭菌的是__________。①培养细菌用的培养基与培养皿；②玻璃棒、试管、烧瓶和吸管；③实验操作者的双手。
(4)为了检测污垢中含有的微生物的情况，要将污垢制成水样稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________________________________________________________________。
下图所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是____________。用该方法统计菌落数时是否需要对照组？________。原因是_________________________________。

解析：(1)微生物的培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐等。(2)为了防止皿盖上凝结的水珠落入培养基造成污染，还可避免培养基表面的水分过快地挥发，在平板冷凝后，应该将平板倒置。(3)在操作过程中，实验操作者的双手应当进行消毒；培养细菌用的培养基与培养皿应当进行高压蒸汽灭菌；玻璃棒、试管、烧瓶和吸管等玻璃器皿应当进行干热灭菌。(4)题干所述方法为稀释涂布平板法。据图分析，A、B、C三个培养皿的菌落均匀，属于稀释涂布平板法得到的，D属于平板划线法接种得到的。用稀释涂布平板法统计样本菌落数时需要设置对照组，因为需要判断培养基是否被杂菌污染(或者需要判断培养基的灭菌是否合格)。
答案：(1)水、碳源、氮源和无机盐　(2)防止皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染，还可避免培养皿表面的水分过快地挥发　(3)③　①②　(4)稀释涂布平板法　D　需要
需要判断培养基是否被杂菌污染
　　　　　　　　二、微生物的筛选与计数
[试考题·查欠缺]
1．(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有__________________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物，加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉水解成麦芽糖，淀粉遇碘液变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
答案：(1)细菌　选择　(2)碳源、无机盐　蛋白质、核酸　(3)碘液　淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈　(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
2．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________；
然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是__________________________。
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。
解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数＝38×10×100×1 000＝3.8×107(个)。(2)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格　3.8×107
(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)B　(4)溶解氧　营养物质
[强知能·补欠缺]
1．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物

(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红，说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物
2．平板划线法和稀释涂布平板法的比较
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
适用范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
3．统计菌落数目的两种方法

间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大

[练题点·全过关]
1．(2019·新余期末)日前微博传言手机细菌比马桶多。如图，央视和北京卫视通过实验展示调査结果。回答下列相关问题：

(1)该实验需制备________(填“固体”或“液体”)培养基。在液体培养基中加入________可配制成固体培养基。
(2)据图，两电视台均采用______________法接种，接种前需要采用__________________法对培养基进行灭菌。
(3)通过观察菌落的________________可以初步鉴定手机屏幕和马桶按钮上的生物类群。两电台实验操作均正确且完全一致，但报道结果截然不同，你认为原因是：________________________。
解析：(1)从图示可知，在培养基上形成了菌落，故为固体培养基，通常固体培养基配制是在液体培养基中加入一定量琼脂。(2)从图示内容看，微生物均匀分布而不呈线状，说明采用的接种方法是稀释涂布平板法，接种前需要采用高压蒸汽法对培养基进行灭菌，并且要对实验室及操作台进行消毒处理。(3)通过观察菌落的形状、颜色、大小、隆起程度等可以初步鉴定手机屏幕和马桶按钮上的生物类群，实验结果不同的原因可能是手机的取样和马桶的取样都不相同，也可能是手机或马桶的处理手段不同。
答案：(1)固体　琼脂　(2)稀释涂布平板　高压蒸汽灭菌
(3)形状、大小、隆起程度和颜色等　手机的取样和马桶的取样都不相同
2．(2019·厦门一模)下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：
(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
(2)为了得到更加准确的结果，选用适宜的方法接种样品：如图是利用____________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意________________________________________________________________________。

(3)适宜温度下培养。
结果分析：
①甲同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为524个，那么每毫升样品中的细菌数是(接种时所用稀释液的体积为0.1 mL)____________个。
②用这种方法所得的数量比实际活菌数量要__________，因为________________________________________________________________________。
(4)乙、丙同学测定同一样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：乙同学在该浓度下涂布了1个平板，统计的菌落数为47；丙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为43、54、326，然后取其平均值141作为统计结果。请评价这两位同学实验结果的有效性。
①乙同学的结果___________，原因是________________________________________。
②丙同学的结果___________，原因是________________________________________。
(5)丁同学采用血细胞计数板计数(规格为16×25，0.1mm3)，统计4个中格中的细菌数，计算出每个小格所含细菌的平均数为2个，则每毫升样品中的细菌数是(稀释倍数为103)__________个。
解析：(2)由图可知，此接种方法为平板划线法，为达到稀释的目的，从第二次划线开始，接种环均要灼烧，冷却后从上一区划线末端开始划，首尾不能重叠。(3)根据公式每毫升样品中的细菌数＝524/0.1×105＝5.24×108，用这种方法所得的数量比实际活菌数量要少，因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的是一个菌落。(4)乙同学在该浓度下涂布了1个平板没设重复实验，所以结果无效；丙同学涂布的3个平板计数结果差距太大，应该存在操作失误，结果无效。(5)每毫升样品中的细菌数是(2×25×16)/0.1×103×103＝8×109。
答案：(2)平板划线　第二次及以后每次划线前接种环要灼烧，冷却后从上一区划线末端开始划，首尾区不重叠以便于分散菌种　(3)①5.24×108　②少　当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的是一个菌落　(4)①无效　没有设置重复实验，结果不具有说服力　②无效　一个平板上的菌落计数结果与另外两个相差太大　(5)8×109
　　　　　　　　三、传统发酵技术的应用
[试考题·查欠缺]
1．(2018·江苏高考)某高校采用右图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是(　　)
A．夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理
B．乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大
C．正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压
D．可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
解析：选B　利用酵母菌进行酒精发酵时，一般将温度控制在18～25 ℃，因此夏季生产果酒时，需要对发酵罐体进行降温处理；发酵过程中，进气口阀门应该关闭，以保证发酵罐的无氧环境，使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精；正常发酵过程中，由于酵母菌进行无氧呼吸产生CO2，所以发酵罐内的压力增大，高于大气压；葡萄酒的发酵过程消耗葡萄糖，所以可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵。
2．(2017·江苏高考)下列关于“腐乳的制作”实验，叙述正确的是(　　)
A．控制发酵温度的主要目的是腐乳调味
B．腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用
C．毛霉的主要作用是分解脂肪和淀粉
D．成品腐乳表面的粘性物质主要由细菌产生
解析：选B　控制发酵温度主要目的是利于菌种繁殖和代谢；腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用；毛霉的作用主要是分解蛋白质和脂肪；成品腐乳表面的粘性物质主要是毛霉产生的菌丝。
3．(2018·海南高考)葡萄酒是葡萄汁经酵母菌发酵而成的，酿制葡萄酒的两个简易装置如图所示。回答下列问题：

(1)试管中的X溶液有助于维持甲装置的瓶中气压相对稳定，与乙装置相比，用甲装置酿制葡萄酒的优点是_________________________________________________________
________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)葡萄汁装入甲装置时，要留有约1/3的空间，这种做法的目的是________________________________________________________________________
(答出两点即可)。


(3)某同学若用乙装置进行发酵，并设置两个不同处理组(乙A和乙B)，乙A装置中保留一定量的氧气，乙B装置中没有氧气。在其他条件相同且适宜的情况下，测得一段时间内乙A和乙B中酒精含量的变化趋势及乙A中氧气含量的变化趋势如曲线图所示。图中曲线①②③依次表示_________、___________、___________含量的变化趋势。
(4)从细胞呼吸类型看，酵母菌属于________生物；从同化作用的类型看，酵母菌属于________(填“自养”或“异养”)生物。
解析：(1)酿制葡萄酒的原理是酵母菌的无氧呼吸，而酵母菌无氧呼吸的产物除了酒精还有二氧化碳，所以酿酒装置要及时排出二氧化碳，图乙装置排出二氧化碳需要拧松瓶盖，在拧松瓶盖时会给杂菌污染培养液带来机会，但装置甲不会出现这些问题。(2)葡萄汁装入发酵瓶时，发酵瓶要留有大约1/3的空间，这样既可以为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气，又可以防止发酵旺盛时汁液溢出。(3)因乙A装置中保留一定量的氧气，所以在此装置中酵母菌先进行有氧呼吸消耗氧气，然后才进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，所以曲线①为乙A中的氧气，曲线③为乙A中的酒精；乙B装置中没有氧气，所以在此装置中的酵母菌从开始就进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，故曲线②为乙B中的酒精。(4)酵母菌的新陈代谢类型是异养兼性厌氧型。
答案：(1)不需要开盖放气；避免了因开盖引起的杂菌污染
(2)为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气；防止发酵旺盛时汁液溢出　(3)乙A中的氧气　乙B中的酒精　乙A中的酒精　(4)兼性厌氧　异养
[强知能·补欠缺]
(一)果酒和果醋的制作
1．果酒和果醋制作的发酵装置分析

该装置的使用方法：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口，制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气
　　2.果酒和果醋制作的原理及发酵条件

果酒制作
果醋制作
制作原理
反应
有氧条件下，大量繁殖：
C6H12O6＋6O2
6CO2＋6H2O
无氧条件下，酒精发酵：C6H12O6
2C2H5OH＋2CO2
氧气、糖源充足时：
C6H12O6＋2O2
2CH3COOH＋2CO2＋2H2O
缺少糖源、氧气充足时：
C2H5OH＋O2
CH3COOH＋H2O
发酵条件
温度
一般酒精发酵的最适温度为18～25 ℃，繁殖的最适温度为20 ℃左右
最适为30～35 ℃
空气
前期：需氧；
后期：不需氧
需要充足的氧气
时间
10～12 d
7～8 d

(二)腐乳的制作
1．腐乳制作的流程及注意事项

2．影响腐乳品质的因素
(1)水的控制：含水量约70%，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。
(2)盐的控制：盐浓度过高会影响腐乳的口味；盐浓度过低，腐乳易腐败变质。
(3)酒的控制：酒的含量一般控制在12%左右。酒精含量过高，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，杂菌繁殖快，豆腐易腐败。
(4)温度控制：温度为15～18 ℃，适合毛霉生长。
(5)发酵时间：控制在6个月左右。
(6)香辛料：具有调味和杀菌的作用，也会影响腐乳的风味或质量。
(三)泡菜的制作
1．泡菜制作的注意事项
(1)材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的细菌。
(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
(3)氧气需求
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(4)控制适宜的温度：以18～20 ℃为宜，温度偏高有害菌活动能力强，温度偏低不利于乳酸发酵。
2．泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
发酵
时期
乳酸菌
乳酸
亚硝酸盐
发酵
初期
少(有O2，乳酸菌活动受抑制)
少
增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵
中期
最多(乳酸抑制其他菌活动)
积累、增多、pH下降
下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵
后期
减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动)
继续增多，pH继续下降
下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
变化
曲线



注意：亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的
[练题点·全过关]
1．(2016·全国卷Ⅱ)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。回答下列问题：
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的____________中进行，其产物乙醇与________________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的________________中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度__________。

(2)第二阶段是在醋酸杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在____________条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度__________(填“低于”或“高于”)第二阶段的。
(4)醋酸杆菌属于__________核生物，其细胞结构中______(填“含有”或“不含有”)线粒体。
解析：(1)图中过程①和②是酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇的过程，无氧呼吸的场所是细胞质基质。乙醇可用酸性重铬酸钾试剂检测，颜色由橙色变为灰绿色。过程③为有氧呼吸的第二和第三阶段，场所为线粒体。在有氧条件下酵母菌进行有氧呼吸，产生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧条件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸杆菌是好氧型细菌，因此，在醋酸杆菌作用下，将乙醇转变为醋酸的过程需要在有氧条件下才能完成。(3)在生产过程中，第一阶段酵母菌产生乙醇的适宜温度为18～25 ℃，第二阶段醋酸杆菌产生醋酸的适宜温度为30～35 ℃，第一阶段的温度低于第二阶段的。(4)醋酸杆菌属于原核生物，原核细胞中的细胞器只有核糖体一种，不含线粒体。
答案：(1)细胞质基质　重铬酸钾　线粒体　快　(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有
2．(2019·太原模拟)腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成的，民间传统方法生产腐乳均为自然发酵，现代腐乳生产多采用优良的毛霉菌种进行发酵。现代化生产流程如下：

(1)毛霉的生长需要豆腐提供水、无机盐、______和________________________________________________________________________
等四大类基本营养物质。此外，还需要一定的温度、湿度等环境条件。
(2)传统方法制作腐乳时________(填“需要”或“不需要”)灭菌，发酵好的豆腐上布满了菌落，这些菌落________(填“属于”或“不属于”)同一物种。
(3)流程中扩大培养时使用的培养基与毛霉菌种分离时使用的培养基最大的区别是后者培养基中加入了________。
(4)当豆腐上长出毛霉后，对豆腐要进行________。腐乳制作的后期要加入酒精和多种香辛料配制的卤汤，酒精的浓度要控制在12%左右，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：(1)碳源　氮源　(2)不需要　不属于　(3)琼脂(凝固剂)　(4)加盐腌制　酒精浓度过高，则腐乳的成熟时间将会延长；酒精浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败
3．在泡菜的腌制过程中，腌制方法、时间长短和温度高低等都会影响亚硝酸盐的含量。回答下列问题：
(1)泡菜是乳酸菌发酵的产物，乳酸菌的代谢类型是________________。
(2)按盐与清水的一定比例配制盐水，将盐水煮沸冷却后，注入到装好原料的泡菜坛中，同时加入一定量的“老汁”(陈泡菜水)。将盐水煮沸冷却的目的是______________________________；加入“老汁”的作用是________________________________________________________________________。
(3)某校兴趣小组探究泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量，其实验数据如下表所示(mg/kg)：

封坛前
第2天
第4天
第6天
第8天
第10天
第12天
第14天
1号坛
0.16
0.26
0.60
0.40
0.20
0.16
0.10
0.10
2号坛
0.16
0.21
0.52
0.42
0.30
0.18
0.15
0.15
3号坛
0.16
0.32
0.70
0.48
0.30
0.25
0.20
0.20
该兴趣小组取3只坛的目的是_______________________________________；
实验中泡菜坛中产生的亚硝酸盐含量变化趋势是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：(1)异养厌氧型　(2)煮沸的目的是除去盐水中的空气和杀菌，冷却的目的是防止杀死原料中的乳酸菌　“老汁”中含有大量的乳酸菌，使其在短时间形成优势菌菌种
(3)减少实验误差，使结论更可靠　随着发酵时间的进行，亚硝酸盐含量会逐渐增加，当达到最高值后，亚硝酸盐含量会逐渐减少并趋于稳定
[课时跟踪检测]
1．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(　　)
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
解析：选D　在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
2．(2019·滨州模拟)微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(　　)
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
②接种操作要在酒精灯火焰附近进行
③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒
④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌
⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
A．①③　　　　　　　　　 B．②④
C．③⑤ D．④⑥
解析：选D　无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种操作要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。
3．(2019·乐山联考)下列关于有关传统发酵技术的叙述，正确的是(　　)
A．在果酒的制作过程中，应先去除葡萄的枝梗，再进行多次反复冲洗，这样才可以洗得彻底
B．果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳
C．豆腐上长满毛霉后，需加盐腌制8天左右，这样可以抑制微生物的生长，避免豆腐变质，又能使豆腐析出水分，使豆腐块变硬
D．制作泡菜时要选火候好、无裂纹、无砂眼、盖子吻合好的坛子，需要加水密封，目的是隔绝空气，抑制细菌繁殖
解析：选C　在果酒的制作过程中，应先冲洗葡萄，然后再去除葡萄的枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会；冲洗以洗去灰尘为目的，不能多次反复冲洗，以防洗去附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳。豆腐上长满毛霉后，需加盐腌制8天左右，这样可以抑制微生物的生长，避免豆腐变质，又能析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬。制作泡菜时需要加水密封，目的是隔绝空气，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境。
4．(2018·江苏高考)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：

(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的________，及时对培养基进行分装，并进行____________灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有________。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
解析：(1)配制培养基时，进行计算、称量、溶解、定容后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。(2)倒平板时的培养基温度约为50 ℃，冷凝后倒置培养。(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得耐受高甲醇的菌株。(4)酵母菌是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.1÷2＝0.05 (mm3)。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30(个)。
答案：(1)pH　高压蒸汽(湿热)　(2)50 ℃　(3)a、b、d
(4)氧气　无　30
5．(2019·广州调研)国家生活饮用水卫生标准规定：接种1 mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，经37 ℃、24 h培养后，所生长出的菌落总数不得大于100。某兴趣小组对某蓄水池进行细菌总数测定，以了解池水是否符合饮用水卫生标准。回答下列问题：
(1)用无菌三角瓶取水样前，水龙头需使用酒精棉擦拭消毒后，再通过____________灭菌。取水前的无菌操作的目的是____________________________________________________。
(2)该小组通过滤膜法测定细菌总数，将10 mL的水样进行过滤后，将滤膜放在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，培养时应将平板倒置，其原因是____________________。所用培养基中的牛肉膏除为微生物提供碳源和氮源外，还能提供磷酸盐和________________。在培养过程中，不同时间所观察到的平板上菌落特征的差异有________________(至少写出两点)。
(3)经过24 h培养，结果如下表：

平板1
平板2
平板3
菌落数(个)
41
35
38
据上表结果判断，所取水样测定结果________(填“符合”或“不符合”)饮用水的标准。
(4)该小组若想检测水样中大肠杆菌的数目，可将滤膜放在________培养基上，计算培养基上________(颜色)菌落的数目。
解析：(1)灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)，常用的方法主要有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。取水样前，水龙头需使用酒精棉擦拭消毒后，再通过灼烧灭菌；为防止杂菌污染自来水，所以取水前要进行无菌操作。(2)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法灭菌，在制备固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，应将平板倒置，目的是防止培养皿内壁上出现的冷凝水污染培养基；牛肉膏可以为微生物提供碳源、氮源和维生素等；鉴定菌种的依据通常包括菌落的形状、数目、大小、隆起程度和颜色等菌落特征。(3)经过24 h培养，10 mL的水样培养结果菌落数目为41、35和38，则1 mL的水样中菌落数小于100，符合饮用水的标准。(4)大肠杆菌在含有伊红美蓝的培养基上形成的菌落呈深紫色(黑色)，并有金属光泽，因此检测水样中大肠杆菌的数目用伊红美蓝培养基。
答案：(1)灼烧　防止外来杂菌污染　(2)防止冷凝水滴落污染培养基　 维生素　菌落大小、数目、形状、颜色等(合理即可)　(3)符合　(4)伊红美蓝　黑色
6．请回答下列有关微生物的培养与应用的问题：
(1)微生物的培养需要使用培养基，不同培养基的配方不同，但一般都具有________________________________________________________________________等；在配制从土壤中
筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入________作为唯一的碳源。
(2)如图中产生每个菌落的最初细菌数为________个才是最理想的。据图分析，在培养基上划线接种时，划线的顺序依次是________________________________________________
(用序号和箭头表示)。
(3)根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大概推测出样品中的活菌数。某同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为25.6，则每毫升样品中的活菌数是________(所用稀释液的体积为0.2 mL)。
(4)若要鉴别纤维素分解菌，可用________法；若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入________________。
解析：(1)微生物的培养需要使用培养基，不同培养基的配方不同，共有的成分是碳源、氮源、水和无机盐等；根据实验目的在配制培养基时需加入纤维素作为唯一的碳源。(2)图中产生每个菌落的最初细菌数为 1个才是最理想的。据图分析，在培养基上划线接种时，划线的顺序依次是②→③→①。(3)由题意可计算每毫升样品中的活菌数为：25.6÷0.2×104＝1.28×106。(4)若要鉴别纤维素分解菌，可用刚果红染色法；若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入酚红指示剂。
答案：(1)碳源、氮源、水和无机盐　纤维素　(2)1　②→③→①　(3)1.28×106　(4)刚果红染色　酚红指示剂
7．果胶酶普遍存在于细菌、真菌和植物中，为获得果胶酶高产菌株，科研人员进行了下列分离、筛选、保存工作。
(1)采用下表配方配制的培养液分离果胶酶产生菌时，该表X处的成分应是________(填“葡萄糖”或“果胶”)，不选另一种成分的原因是_________________________________。
K2HPO4
MgSO4
NaNO3
FeSO4
X
H2O
0.1 g
0.5 g
3 g
0.01 g
2 g
加至1 L
(2)科研人员将采集的果园土壤加入上述培养液中，振荡培养至培养液变混浊，再吸取一定量的培养液移入新的培养液中重复多次，这一培养过程称为________培养。
(3)吸取适量的培养液稀释涂布到固体培养基中培养，选择有菌落生长的培养基，加入刚果红溶液进行染色，在菌落周围会形成透明圈。应从中选出______________的菌落，挑选的理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)若需对获得的菌种进行长期保存，可采用的方法是
________________________________________________________________________。
解析：(1)分离果胶酶产生菌，必须以果胶作为唯一碳源，其他微生物不能利用，从而获得果胶酶产生菌。由于葡萄糖是大多数微生物的碳源和能源，不具有选择作用，无法分离果胶酶产生菌。(2)科研人员将采集的果园土壤加入上述培养液中，振荡培养至培养液变混浊，再吸取一定量的培养液移入新的培养液中重复多次，由于土壤中的微生物种类比较多，通过这样处理，经果胶唯一碳源的选择作用，使果胶酶产生菌更加纯化。(3)由于果胶酶产生菌合成分泌的果胶酶能将含有刚果红溶液进行染色的培养基中的果胶分解，在菌落周围形成透明圈，果胶酶越多，分解速度越快形成的透明圈越大。(4)对于微生物菌种的长期保存通常采取甘油管藏。
答案：(1)果胶　大多数微生物以葡萄糖为碳源，不具有选择作用　(2)选择　(3)透明圈直径较大　透明圈大的菌落表明产生果胶酶的量更多　(4)甘油管藏
8．(2018·柳州质检)下面是果酒和果醋制作的实验流程和发酵装置。根据图示回答下列问题：

(1)完成图1中的实验流程__________________________________________________。
(2)图2装置中的充气口在________过程中要关闭，否则可能发生使发酵液变酸的反应________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(写出该反应式)，
而排气口在该过程中应开放，排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，目的是________________________________________________________________________。
(3)葡萄酒呈现红色的原因是________________________________________________，
重铬酸钾在酸性条件下与酒精反应呈______色。
(4)果酒和果醋的制作分别利用了酵母菌和____________两种微生物的发酵原理，后者在结构上的主要特点是___________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：在酒精发酵阶段，充气口应关闭，否则醋酸菌会将乙醇氧化为醋酸，从而使发酵液变酸。酵母菌为真菌，属于真核生物，醋酸菌为细菌，属于原核生物，两者在结构上的主要区别是有无以核膜为界限的细胞核。
答案：(1)醋酸发酵　(2)酒精发酵　C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O　避免空气中其他微生物进入发酵装置(防止空气中的微生物污染)　(3)红色葡萄皮中的色素溶解在发酵液中　灰绿　(4)醋酸菌　无以核膜为界限的细胞核
9．(2019·西宁三校联考)王致和腐乳独具特色，它采用优质黄豆作为原料，经严格筛选后用传统工艺制成。请回答下列问题：
(1)在腐乳腌制过程中起主要作用的是毛霉，与细菌相比，毛霉在结构上的主要特点是________________________________________________________________________。
现代科学研究表明，除毛霉外，还有多种微生物参与了豆腐的发酵，如________________(写出两种即可)等。
(2)毛霉等多种微生物产生的__________酶和__________酶能使相关物质发生转化，使制作的腐乳更加鲜美且易于消化吸收。
(3)腐乳制作过程中需要加盐腌制8 d左右，加盐可以____________________，使豆腐块变硬，并且在接近瓶口表面的盐要铺厚一些，避免__________________，装瓶时加入的卤汤中的__________和__________也有相同的作用。
(4)当我们品尝腐乳时会发现腐乳的表面有一层致密的“皮”，它其实是__________________。
解析：(1)多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉属于真核生物，具有以核膜为界限的细胞核。(2)毛霉等微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将脂肪分解为甘油和脂肪酸，使腐乳味道鲜美，易于消化吸收。(3)加盐腌制时盐可以析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，还能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。卤汤中的酒和香辛料也具有防腐杀菌的作用。(4)腐乳表面的“皮”是前期发酵时在豆腐表面生长的毛霉的匍匐菌丝，它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。
答案：(1)有以核膜为界限的细胞核　青霉、酵母、曲霉(写出两种即可)　(2)蛋白　脂肪　(3)析出豆腐中的水分　豆腐块腐败变质(合理即可)　香辛料　酒　(4)毛霉的(匍匐)菌丝
10．(2019·合肥二模)利用发酵技术生产食品在我国有着悠久的历史，请回答以下问题：
(1)酿造葡萄酒的过程接种的酵母菌中含有醋酸菌，在酒精发酵旺盛时，醋酸菌__________(填“能”或“不能”)将果汁中的糖发酵为醋酸。理由是________________________________________________________________________。
(2)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是________________________________________________________________________
____________________。泡菜制作过程中，乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行____________的过程，该过程发生在乳酸菌细胞的__________中。
(3)如图是该生物活动小组记录的3种食盐浓度下泡菜中的亚硝酸盐含量与发酵天数的关系图。

据图分析选择__________浓度的食盐制作，且在________天以后食用较为适宜。
解析：(1)酿造葡萄酒时，接种的酵母菌需在无氧条件下发酵，而醋酸菌必须在有氧且氧气充足的情况下才能进行发酵生产醋酸，在酒精发酵旺盛时，醋酸菌不能将果汁中的糖发酵为醋酸。或醋酸菌需要在有氧且温度为30～35 ℃的条件下，才能将糖转化为醋酸，而此时发酵罐中的条件是无氧且温度是18～25 ℃。(2)制作泡菜利用的是乳酸菌发酵，盐水需煮沸的目的是除去溶解氧和杀灭杂菌。泡菜的制作过程利用的是乳酸菌无氧发酵，而乳酸菌是原核生物，无氧呼吸的场所是细胞质基质。(3)比较3条曲线，从亚硝酸盐含量变化分析，用5%的食盐溶液制作泡菜比较适合食用，但在发酵时间达11天以后食用比较适宜。
答案：(1)不能　醋酸菌是好氧细菌，而果酒发酵是无氧环境(或醋酸菌需要在有氧且温度为30～35 ℃条件下，才能将糖转化为醋酸，而此时发酵罐中的条件是无氧且温度是18～25 ℃)(合理即可)　(2)杀灭杂菌除去溶氧　无氧呼吸　细胞质基质　(3)5%　11