2020版生物浙江高考选考一轮复习讲义：第29讲微生物的培养、利用及浅尝现代生物技术


知识内容展示
核心素养对接
1.大肠杆菌的培养和分离
2.分离以尿素为氮源的微生物
科学思维
分析培养基的成分及其作用，比较划线分离法和涂布分离法的异同
科学探究
设计实验探究微生物培养的条件
社会责任
关注有害微生物的控制及宣传健康生活
第29讲　微生物的培养、利用及浅尝现代生物技术
考点一　微生物的培养和利用

1.(2018·浙江11月选考)回答与微生物培养及应用有关的问题：
(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从________________________时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用________方式可较快地进行过滤灭菌。
(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加________的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白质胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是________。
(3)为筛选胞外α－淀粉酶分泌型菌种，一般从________(A.果园树下　B.肉类加工厂周围　C.米酒厂周围　D.枯树周围)获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个________比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取________用于检测酶活性。
解析　 (1)由于高压蒸汽灭菌锅的升温升压需要一定时间，而未达设定温度和压力将导致灭菌不彻底，因此对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基，如尿素培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中过滤灭菌，采用抽滤方式可加快过滤速度。(2)相比果醋制作中先利用葡萄糖进行酒精发酵，再进行醋酸发酵，以淀粉为原料制醋，需增加淀粉分解成糖的过程。醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是作为碳源。(3)结合生物具有适应性的规律，米酒厂周围的淀粉量相对较多，因此存在可分泌α－淀粉酶的分泌型菌种。分泌的α－淀粉酶活性越高，数量越多，菌落周围的透明水解圈越大。由于水解圈越大，表明淀粉分解量越多，因此水解圈直径与菌落直径比值大的菌落，分泌的酶活性较高。经液体培养基振荡培养进行扩增后，再将培养液离心，菌种会分布于沉淀，而分泌的胞外酶分布于上清液，可取上清液测定酶活性。
答案　 (1)达到设定的温度或压力值　抽滤
(2)将淀粉分解成糖　作为碳源
(3)C　水解圈直径与菌落直径　上清液
2.(2018·浙江4月选考节选)在淀粉分离生产工艺研究中，为促进淀粉絮凝沉降，添加生物絮凝剂(乳酸菌菌液)，其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用________，进行单菌落分离，然后将其________，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。
答案　划线分离法(或涂布分离法)　扩大培养
3.(2017·浙江11月选考节选)为了获得优良的酿酒红曲霉菌株，将原菌株的孢子诱变处理后制成较稀浓度的单孢子悬液，这样做的目的是在培养时有利于获得________。
答案　单菌落
4.(2017·浙江4月选考节选)回答与泡菜腌制和亚硝酸盐测定有关的问题：
制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用________蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是________。

解析　从酸奶中分离乳酸菌时，可采用划线分离法，方法是用接种环蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。图示的划线分离中B图方法是正确的，A图不分区划线，但划线太稀疏，分离效果很差，B、C、D都采用了分区划线，但C、D都没有注意除第一区外，之后每区划线的第一条线都需要从上一区划线的末端开始。
答案　接种环　B
5.(2016·浙江10月选考节选)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题：
(1)LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加________，灭菌备用。
(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用________灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗________________，故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。
(3)取适量含产脲酶细菌的10－4、10－5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48 h，推测固体培养基上生长的菌落数量最少的是________。
A.10－5稀释液＋尿素固体培养基
B.10－5稀释液＋LB固体培养基
C.10－4稀释液＋尿素固体培养基
D.10－4稀释液＋LB固体培养基
在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现________，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生________所致。
解析　(1)本实验中的LB培养基是要与尿素培养基作对比的，所以要用琼脂糖替换琼脂。(2)尿素培养基的灭菌要分开进行，除尿素外的其他成分仍用高压蒸汽灭菌，尿素溶液用G6玻璃砂漏斗过滤除菌，再将除菌的尿素加到已灭菌的其他成分中。G6玻璃砂漏斗由于孔径小，细菌不能滤过，可用于过滤除菌，但需要在使用前进行高压蒸汽灭菌。(3)由于在土壤中产脲酶的细菌远少于普通细菌，所以在尿素培养基上的菌落数相对少得多，另外稀释倍数高的土壤稀释液中细菌数量少，在培养基上菌落数也相对少。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现红色环带，这是因为脲酶催化尿素分解产生氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂在碱性下呈红色。
答案　(1)琼脂糖　(2)高压蒸汽　孔径小，细菌不能滤过
(3)A　红色环带　氨(或NH3)
本题组对应与选修一P19－28，微生物的利用。考查了微生物的培养和分离方法。
一、大肠杆菌的培养和分离
1.大肠杆菌
(1)特性：大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(代谢类型)的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但若进入人的__泌尿系统，就会对人体产生危害。
(2)用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。
2.实验内容和过程
(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面__培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。
(2)实验过程
培养基灭菌
↓
倒平板
↓
接种
↓
50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌
将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，在摇床上振荡培养12 h
划线分离
↓
培养观察
↓
菌种保存
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿
培养皿倒置(盖在下面)，放在37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落
在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24 h后，置于4__℃冰箱中保存

二、分离以尿素为氮源的微生物
1.菌种特点
含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。
2.培养基
用以尿素为唯一氮源的培养基培养，以LB全营养培养基为对照。
3.实验原理
(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。
(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。
4.实验过程

5.反应的鉴定
在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现红色的环带。

1.培养基
(1)培养基是指微生物生存的环境和营养物质，一般都含有五大营养要素：即：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子。一般来讲，“细菌喜荤、霉菌喜素”，大肠杆菌一般采用LB培养基，其主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水等，若要扩大培养，则采用LB液体培养基，若要分离获得纯种，则采用LB固体培养基，这两者的主要区别在于后者加入了琼脂。霉菌培养基一般用无机物配制成或添加蔗糖的豆芽汁。
(2)种类
划分标准
培养基种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产、扩大培养
半固体
培养基
加凝固剂，如琼脂
观察微生物的运动、分类、鉴定
固体培养基
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)
分类、鉴定
用途
选择培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物(如尿素固体培养基)
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物

(3)微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用
对照组
作用
现象
结论
未接种培养基
有无杂菌污染的判断
未接种的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
接种的LB全营养培养基
选择培养基筛选作用的确认
LB全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
2.无菌操作
(1)通常在超净台中进行，超净台使用前30 min，打开紫外灯和过滤风，注意打开紫外灯后人必须离开，使用时必须关闭紫外灯。
(2)消毒和灭菌：培养基、培养皿、试管、三角瓶、枪头、接种环、镊子等用具通常用高压蒸汽灭菌，这些用具通常需要用牛皮纸或报纸包好，其中容器先要用棉塞或封口膜封口再包好，放入灭菌锅中，在121 ℃(1__kg/cm2压力)下灭菌15 min。实验用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500 g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30 min。由于尿素加热会分解，只能用G6玻璃砂漏斗过滤除菌，但玻璃砂漏斗使用前也要在121 ℃下用纸包好灭菌，用后还需用1 mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。将培养基转移到三角瓶和试管中时必须用三角漏斗，以免培养基沾到三角瓶口和试管口，发生污染。
(3)消毒和灭菌比较

条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
紫外线消毒法
接种室、超净台
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器的灭菌
过滤除菌
不能加热灭菌的化合物，要用G6玻璃砂漏斗过滤

3.微生物接种的两种常用方法比较
比较
划线分离法
涂布分离法
工具
接种环
玻璃刮刀
原理
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落
将菌液用无菌水进行梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别用玻璃刮刀涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
特点
方法简单，但不适宜计数
单菌落更易分开，可用于计数，但操作复杂些
目的
使培养基上形成单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
4.菌种保存
选用固体斜面培养基，于4__℃冰箱中保存。用灼烧后的接种环从斜面取菌种时，往往要先使接种环接触培养基以达到冷却的目的，然后再取菌体。
5.接种完成后应将培养皿倒置培养，目的是：防止水蒸气凝结成的水滴落入培养基表面冲散菌落，影响单菌落的形成和分离。

角度　围绕微生物的利用考查科学实践的能力
1.(2018·浙江五校联考)某村庄有一条小溪，近几年由于上游几家乳胶厂不断向其中排放废水，小溪变得不再清澈。某同学想测定该溪水中的细菌含量情况。回答下列问题：
(1)先根据所学知识制备LB培养基。制备该培养基的步骤是：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，下列关于制备LB培养基的叙述，错误的是________。
A.培养基应先调pH再进行灭菌
B.培养基应先灭菌再分装到培养皿
C.溶化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦
D.灭菌时一般用高压蒸汽灭菌锅在121 ℃，500 g/cm2压力下灭菌15分钟
(2)该同学利用上述制备的培养基来检测水样中的细菌数量，他所选择的分离方法应是______；该同学在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________。接种在超净工作台
上进行，工作台上实验前一段时间需打开，实验中需关闭的是________(A.酒精灯　B.照明灯　C.紫外线　D.过滤风)
(3)值得注意的是，他所选择的这种方法统计的结果往往比实际细菌的数目要低，这是因为①_____________________________________________________
_____________________________________________________________
②_____________________________________________________________
________(不考虑实验操作原因引起的细菌数目的变化)
(4)该同学欲将所分离出的某种细菌临时保藏，应接种到试管的______培养基上，等菌落长成后，放入冰箱低温保藏。
解析　如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500 g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30 min，题中培养基为LB培养基，高压蒸汽灭菌锅在121 ℃，1 kg/cm2压力下灭菌15分钟；微生物的分离方法有划线分离法和涂布分离法，划线分离法不能计活菌数，涂布分离法只能计活菌数，所以统计的结果往往比实际细菌的数目要低，接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，可以检测灭菌是否彻底；菌种的保存应接种在斜面上，37 ℃培养24 h后，于4 ℃冰箱中保存。
答案　(1)D
(2)(稀释)涂布分离法　检查平板灭菌是否彻底　C
(3)①该方法只能统计样品中活菌的数目，死菌无法统计
②当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(4)斜面
2.(2018·金丽衢十二校联考)普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α－淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图1所示)

(1)图1中，为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以______作为唯一碳源。②③过程需重复几次，目的是___________________________________________
______________________________________________________________。
(2)某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图2所示。该同学的接种方法是________；推测该同学接种时可能的操作失误是________。
(3)上述工程酵母菌培养过程中，有关操作正确的是________。
A.玻璃刮刀用火焰灼烧进行灭菌
B.培养基分装到培养皿后进行灭菌
C.倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行
D.获得的菌种如果需要保存，可置于37 ℃恒温保存
解析　(1)为筛选得到高效利用淀粉的工程酵母菌菌种，固体培养基应以淀粉作为唯一碳源。多次重复筛选是为获得高效利用淀粉的工程酵母菌的纯化菌种。(2)由图2的结果表明，该同学采用的是涂布分离法，其操作的失误是涂布不均匀，造成平板上菌落未均匀分布。(3)涂布操作用的玻璃刮刀通常保存在70%酒精中，使用前引燃酒精，火焰熄灭后待其冷却后使用；培养基通常先灭菌，后趁热倒平板；保存菌种通常使用斜面培养基，在4 ℃冰箱中保存；倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行，这是无菌操作要求。
答案　(1)淀粉　筛选出真正高效利用淀粉的工程酵母菌菌种　(2)涂布分离法　涂布不均匀　(3)C
考点二　浅尝现代生物技术

(2015·浙江10月选考节选)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中，培育新花色的矮牵牛。请回答：
(1)取田间矮牵牛的幼嫩叶片，经自来水冲洗，先用70%________浸泡，再用5%次氯酸钠浸泡，最后用________清洗，作为转基因的受体材料。
(2)取出试管苗，在适宜的光照、温度和80%以上的________等条件下进行炼苗。
解析　(1)用作组培的外植体若取自自然环境则需要消毒，方法是外植体经自来水冲洗，先用70%酒精浸泡，再用5%次氯酸钠浸泡，最后用无菌水清洗，才能用于接种。(2)组培时，试管苗需经炼苗才能定植，炼苗时需将试管苗从培养瓶中取出，移栽至具适宜的光照、温度和较高湿度的环境中。
答案　(1)酒精　无菌水　(2)湿度
本题组对应选修一P59～P61，植物的组织培养
1.组织培养就是取一部分植物组织，如根、茎、花瓣、叶或花粉等，在无菌的条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的光照和温度，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽。组织培养必须在培养基中加入生长素和细胞分裂素。两者的摩尔浓度比决定组织是生根还是生芽。当细胞分裂素与生长素的比例高时，诱导芽的生成，两者比例大致相等时，愈伤组织继续生长而不分化；当细胞分裂素与生长素的比例较低时，会趋于生根。
2.本实验首先用细胞分裂素相对较多和生长素相对较少的发芽培养基进行培养，获得丛状苗；然后将丛状苗分株培养。分株后，再移入含较多生长素的生根培养基中，使其生根；将生根的苗从三角瓶中移至草炭土或蛭石中继续生长；苗健壮后再移至土中。

1.植物组织培养的原理
(1)理论基础：植物细胞具有全能性。
(2)植物组织培养的基本过程

(3)植物组织培养影响因素
①选材：菊花幼苗的茎段，每段至少带有一片叶。
②培养基：植物组织培养需要适宜的培养基，常用的是MS培养基，在配制好的培养基中，常常需要添加生长素和细胞分裂素两种植物激素。实验中使用的生长素类似物是萘乙酸(NAA)，细胞分裂素类似物是苄基腺嘌呤(BA)。
③其他条件：pH、温度和光照等条件对植物组织培养也很重要。
2.菊花组织培养过程


角度　围绕植物组织培养考查科学实践的能力
1.某愈伤组织在如下图甲所示的培养基中培养一段时间后得到如图乙所示的结构，经分析可知该培养基中(　　)

A.细胞分裂素多，生长素少
B.细胞分裂素少，生长素多
C.细胞分裂素和生长素用量相等
D.只有生长素
解析　从图乙中可知该培养基有利于生根且抑制芽的形成，所以可推断该培养基中生长素多，细胞分裂素少，B正确。
答案　B
2.(2018·温州模拟节选)菊花组织培养的部分过程如下图所示：

(1)过程①利用________(填“较高”或“较低”)渗透压，使原生质体产量大幅提高，但存活率却因此而降低，分析降低的原因可能是________________。过程②细胞壁形成后，可逐渐________________渗透压。
(2)幼苗带有芽结构，也就有了________组织，所以不通过________阶段就可直接形成丛状苗。过程③应在________(从具体功能角度)培养基中进行，全过程对光照要求是________。
A.早期每天24 h光照，后期每天24 h黑暗
B.每天一定时长的光照
C.早期每天24 h黑暗，后期每天24 h光照
D.每天24 h黑暗
解析　植物原生质体的获得方法是：在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液环境(较高渗透压)下用纤维素酶和果胶酶混合液处理，外界溶液浓度高于细胞液浓度，细胞失水，形成细胞壁后，应降低渗透压。植物的顶芽具有分生组织，不需要脱分化就可以形成丛状苗，植物组织培养是在无菌条件下，取一部分植物的组织接种在琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽，全过程需要光照。
答案　(1)较高　细胞失水死亡　降低
(2)分生　脱分化　发芽　B

生长素和细胞分裂素用量比例与根、芽的分化
生长素和细胞分裂素比值
结果
比值高时
促进根的分化，抑制芽的形成
比值低时
促进芽的分化，抑制根的形成
比值适中
促进愈伤组织的生长
【特别提醒】
1.菊花茎段至少带有一片叶的原因：①易区分形态学上端和下端；②腋芽处有分生组织，不经过脱分化就可以形成丛状苗。
2.植物组织培养用人工合成的激素类似物而不是天然的植物激素的原因： 植物体内存在使天然激素分解的酶，天然激素的作用和存在时间较短。而植物体内没有使人工合成的激素类似物分解的酶，所以存在时间长，作用效果明显。
课后限时训练
(时间：30分钟　分数：100分)

1.(2018·宁波模拟节选)研究小组从土壤中筛选以多环芳烃(PAHs)为碳源和能源的细菌，用以降解工业废水和生活污水中的PAHs。请回答：
(1)为了从土壤中筛选PAHs降解菌，需配制以________________为唯一碳源的培养基，培养基经________[A.121 ℃(5 00 g/cm2压力)，15 min　 B.90 ℃(5 00 g/cm2压力)，15 min　C.121 ℃(1 kg/cm2压力)，15 min　D.90 ℃(5 00 g/cm2压力)，30 min] 高压蒸汽灭菌，待冷却至60 ℃后倒平板。
(2)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，目的是________________________。在倒平板的过程中，如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则这个平板不能用来培养PAHs降解菌，原因是________________________。
(3)制备土壤稀释液，用__________法接种于固体培养基表面，培养时，需将培养皿______并放在37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
(4)用划线法纯化PAHs降解菌的过程中，在第二次及其后的划线操作时，须从上次划线的末端开始划线，原因是___________________________________。
解析　(1)为了从土壤中筛选PAHs降解菌，应以PAHs为唯一碳源。一般情况下高压蒸汽灭菌法灭菌的条件为：121 ℃(1 kg/cm2压力)，15 min。但倘若培养基成分中含有葡萄糖，相应条件更改为：90 ℃(5 00 g/cm2压力)，30 min。(2)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，目的是防止杂菌污染。倒平板时，为避免杂菌污染，要严格遵循无菌操作流程。(3)由于土壤预先进行了稀释，因此相应接种方法为涂布分离法。同时为防止冷凝水滴落造成分离失败，培养皿需要倒置培养。(4)考查划线分离法纯化菌种的原理。
答案　(1)PAHs　 C　(2)防止杂菌污染　空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生　(3)涂布分离　倒置　(4)使细菌数随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落
2.(2018·浙江十校模拟节选)回答与微生物的培养和利用有关的问题：
(1)微生物在试管中培养时通常加棉塞，周围没有皱褶和缝隙，容易拔出，但用手提着棉塞时，试管又不能落下。棉塞的作用有两个：一是__________________；二是保证通气良好。制作棉塞所用的棉花不能用脱脂棉，原因是____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)测定微生物生长曲线的方法有很多，有血细胞计数板法、平板________计数法、__________法等。制作生长曲线时，以______________作纵坐标，____________作横坐标。
(3)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，一般要将 pH 调至______ ，以利于细菌的生长繁殖。
解析　(1)微生物培养时，试管加塞的目的是防止杂菌污染，棉质塞的原因是保证通气良好。由于脱脂棉易吸水，而吸水后容易引起杂菌污染，因此制作棉塞的棉花不能使用脱脂棉。(2)测定微生物数量的方法可参考必修三P71～74以及选修一P20，可归纳得出血细胞计数板法、平板菌落计数法和比浊法等计数方法。由于微生物种群数量增长较快，因此制作生长曲线时，可以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标。(3)由于“细菌喜荤，霉菌喜素”，此外细菌要求在中性偏碱性条件下生长，因此细菌培养时常采用牛肉膏蛋白胨培养基，并将pH 调至中性偏碱。
答案　(1)防止杂菌污染　脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染
(2)菌落　 比浊法　细菌数的对数　生长时间
(3)中性偏碱
3.(2018·宁波十校联考节选)某同学用新鲜的泡菜汁为实验材料分离纯化出乳酸菌，用来生产酸奶。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。
(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用__________对泡菜汁进行梯度稀释，然后采用__________法进行分离，可获得乳酸菌的单菌落。
(2)推测分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有__________和________。分离纯化时应挑选出__________的菌落作为候选菌。
(3)获得纯化的乳酸菌后，可以利用纯牛奶作为原料制作酸奶，发酵常在__________(A.有氧＋常温　B.无氧＋常温　C.有氧＋低温　D.无氧＋低温)条件下进行。如果使用的是加了某些抗生素的纯牛奶作原料制酸奶，很有可能会发酵成怪味“酸奶”，其原因可能是_______________________________________。
解析　(1)涂布分离法相比划线分离法操作稍微复杂些，为防止引入杂菌，需要用无菌水稀释。(2)根据题干信息“分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，”因此推测培养基中加入碳酸钙具有鉴别乳酸菌和中和乳酸的作用，且候选菌的菌落周围应出现透明圈。(3)乳酸菌为严格的厌氧型微生物，其厌氧呼吸会产生乳酸，并且低温会抑制与厌氧呼吸有关酶的活性，加入抗生素具有杀菌作用。
答案　(1)无菌水　涂布分离
(2)鉴别乳酸菌　中和产生的乳酸(或酸)　具有透明圈
(3)B　抗生素具有杀菌作用，会杀死乳酸菌，导致乳酸发酵不能顺利进行
4.青蒿素是从黄花蒿茎叶中提取的抗疟疾药物。通过组织培养获得青蒿素的途径如图所示。

请回答：
(1)图中①和②分别表示黄花蒿组织培养过程中细胞的________________和____________过程。
(2)配制发芽培养基时生长素比细胞分裂素的比值应较________(填“高”或“低”)，配制培养基时通常加入凝固剂______，配制后还须用__________法对培养基进行灭菌。外植体在接种前通常可用体积分数为__________的酒精进行消毒。
(3)为了得到高产细胞系，通常要用酶解法获得原生质体，用____________酶和__________酶在0.5～0.6 mol/L的__________溶液环境(较高渗透压)下去壁。
(4)科研人员利用转基因技术用细菌作为工程菌获得青蒿素的前体青蒿酸，先将目的基因与含有抗青霉素基因的质粒形成________，再与细菌菌液混合导入目的基因。用玻璃刮刀将稀释后的菌液用________法接种到含______的固体培养基上，经培养形成__________，再进一步筛选和培养。若最终能从细菌中提取到____________，则说明转基因成功。
解析　(1)植物组织培养的关键过程包括脱分化和再分化。(2)图中培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值低时，有利于芽的分化。加入琼脂形成固体培养基。对培养基彻底灭菌时，应采用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，外植体在接种前通常可用体积分数为70%的酒精进行消毒。(3)在获得植物原生质体时，需在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液环境(较高渗透压)下用纤维素酶和果胶酶混合液处理实验材料，将细胞壁消化除去，获得球形的原生质体。(4)基因工程过程中，先将目的基因与含有抗青霉素基因的质粒形成重组质粒，再与细菌菌液混合导入目的基因。用玻璃刮刀将稀释后的菌液用涂布法接种到含青霉素的固体培养基上，经培养形成单菌落，再进一步筛选和培养。若最终能从细菌中提取到青蒿酸，则说明转基因成功。
答案　(1)脱分化　再分化　(2)低　琼脂　高压蒸汽灭菌　70%　(3)果胶　 纤维素　甘露醇　(4)重组质粒(重组DNA分子)　涂布分离　青霉素　单菌落　青蒿酸
5.以野生菊花为材料进行的组织培养步骤如图所示：
愈伤组织生芽―→生根―→Y―→定植
请回答：
(1)按照菊花的需求量，MS培养基由大量元素、微量元素和____________组成。MS培养基含有十几种化合物，配制不方便也难以准确称量，可将培养基中的各种成分扩大5～10倍分别称量，配成________，用时稀释。
(2)步骤X中的野生菊花一般选择________。
A.开过花的老枝
B.未开花植株的茎上部新萌生的侧枝
C.正在开花的枝条
D任何枝条均可
(3)野生菊花外植体在接种前要用70%________和5%________溶液进行表面消毒。
(4)过程A在无菌的条件下把消毒后的野生菊花外植体接种在三角瓶的琼脂培养基上，给予一定的温度和______ ，使之产生愈伤组织。过程B要在______培养基上进行培养，使之长出较多的丛状苗。植物组织培养实验用人工合成的植物生长调节剂，而不用植物中存在的天然激素的原因是_________________________
___________________________________________________________________。
(5)步骤Y表示______，再移植到土中培养(定植)，即可长成植株并开花。
解析　本题考查植物组织培养技术。以野生菊花为材料进行的组织培养，应选取较为幼嫩的组织，通过70%乙醇和5%次氯酸钠溶液消毒，先用发芽培养基，再用生根培养基，培养到一定阶段再移植到土壤中定植。
答案　(1)有机成分　母液　(2)B　(3)乙醇　次氯酸钠 (4)光照　发芽(或细胞分裂素多于生长素)　 人工合成的植物生长调节剂在植物中没有相应分解的酶，作用时间长，效果明显(意思合理即可)　(5)移栽锻炼

6.(2018·绿色联盟适应性考试节选)已知某细菌的两种突变类型细菌Ⅰ和细菌Ⅱ的营养条件和菌落特征都相同，但细菌Ⅰ能分解有机物A而不能分解有机物B，细菌Ⅱ能分解有机物B而不能分解有机物A。现有这两种类型细菌的混合液样品，要将其分离，有人设计了一种方案，部分操作步骤如下图。

(1)步骤一使用的是________培养基，其中含有细菌生长所需的水、无机盐、碳源和氮源等营养物质，此外还必须加入________，以利于对不同菌种进行分离操作。
(2)步骤一采用________法接种，此接种法可使接种细菌逐渐稀释，经适宜条件培养，可形成单个、独立的________，最终可能得到纯种的细菌；要进行上述接种操作，必须在________及酒精灯火焰附近进行，以避免杂菌污染。
(3)步骤三中，若对其中某瓶培养液中A、B两种有机物含量进行测定，当培养液中检测出如下的实验结果，其中能说明培养液只有细菌Ⅰ的是________。
A.化合物A与B含量都明显下降
B.化合物A含量明显下降，B含量基本不变
C.化合物A含量基本不变，B含量明显下降
D.化合物A、B含量都基本不变
解析　(1)从图中不难知道步骤一是为了分离菌种，分离细菌通常采用固体培养基，需要向培养基中添加凝固剂(琼脂)。(2)从图中“蛇形线”描述中可知步骤一采用的是划线分离法，通过划线可以获得单个菌落，从而纯化菌种。(3)由于已知细菌Ⅰ能分解有机物A而不能分解有机物B，所以当培养液中化合物A含量明显下降，B含量基本不变时，可以确定培养液只有细菌Ⅰ没有细菌Ⅱ，B正确。
答案　(1)LB固体　琼脂　(2)划线分离　(单)菌落　超净台　(3)B
7.(2018·浙江名校联考节选)请回答野生酵母的培养和分离及果酒制作实验的有关问题：
(1)从葡萄多年生长的环境中获取少量土样，配制成土壤稀释液，然后取0.1 mL稀释液加入到________培养基中，用________(工具)进行________分离，最后培养得到野生酵母菌。将分离获得的菌种进行诱变培养后，根据不同菌株的________特征，分别筛选出高产谷胱甘肽酵母菌(甲)和低产硫化氢的酵母菌(乙)。实验结束后，使用过的培养基应进行灭菌处理才能倒掉，目的是______________________。
(2)成熟的紫葡萄，常用________(A.高锰酸钾　B.次氯酸钠　C.乙醇　D.无菌水)溶液浸泡约5 min，然后制成匀浆放入发酵罐中，并接种相应菌株，发酵获得高品质的葡萄酒。若向发酵罐中加入一定量的________，可获得酒精含量和糖含量较高的果酒。
解析　(1)在进行涂布分离微生物时，需要将稀释的样液0.1 mL加到固体培养基上，再用玻璃刮刀均匀涂布，然后进行培养。菌种进行诱变培养后，可根据不同菌株的菌落特征筛选出目的菌株。微生物实验结束后，要对使用过的培养基进行灭菌处理才能倒掉，这是因为培养基中残留的微生物可能污染环境。(2)酿制葡萄酒时，需要用高锰酸钾溶液浸泡约5 min，起到消毒的作用；若向发酵罐中加入一定量的蔗糖，可获得酒精含量和糖含量较高的果酒。
答案　(1)固体　玻璃刮刀　涂布　菌落　防止造成环境污染　(2)A　蔗糖
8.(2018·衢丽湖舟四地模拟节选)请回答黄花蒿植物组织培养的有关问题：
(1)黄花蒿的植物组织培养研究在我国已有数年历史。选取黄花蒿的茎段后，通常用体积分数为70%的酒精等药品对茎段进行________，然后再放入________溶液中浸泡，最后用无菌水冲洗。若外植体不慎被细菌感染，采用划线分离法纯化细菌，在4个区域内划线需要将接种环灼烧灭菌________次。
(2)植物组织培养的培养基可采用________灭菌。形成愈伤组织的过程中，除需无菌、营养和激素外，________等外界条件也很重要。
(3)2～3周后将生长健壮的丛状苗在________(A.LB培养基＋适宜浓度BA　B.LB培养基＋适宜浓度NAA　C.MS培养基＋适宜浓度BA　D.MS培养基＋适宜浓度NAA)上继续生根，形成完整植株。定植前，还需逐渐________进行炼苗。
解析　(1)植物组织培养时，需对外植体消毒，方法是先后用70%的酒精和5%次氯酸钠溶液浸泡，再用无菌水冲洗。采用划线分离法纯化细菌，在4个区域内划线需要将接种环灼烧灭菌5次，在每区划线前都需要灼烧接种环，而最后划线完成后还要灼烧接种环，才能结束分离操作。(2)植物组织培养的培养基可采用高压蒸汽灭菌法灭菌。在形成愈伤组织的过程中，除需无菌、营养和激素外，光照、温度等外界条件也很重要。(3)健壮的丛状苗需在生根培养基上继续生根培养，形成完整植株。生根培养基成分为MS培养基＋适宜浓度NAA，BA可以不加，D正确。定植前，还需逐渐降低湿度进行炼苗。
答案　(1)消毒　5%次氯酸钠　5　(2)高压蒸汽灭菌法　光照、温度(任写一个也可)　(3)D　降低湿度
9.幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：
→→→→
请回答下列问题：
(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有________，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现________色环带。
(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是________灭菌。
A.高压蒸汽 B.紫外灯照射
C.70%酒精浸泡 D.过滤
(3)步骤X表示________。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液________到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得________菌落。
(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在________中，若不倒置培养，将导致________。
(5)临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的________分解为NH3和14CO2。
解析　(1)幽门螺杆菌(Hp)含有脲酶，能以尿素为氮源，在加入尿素和酚红指示剂的培养基中培养Hp，由于尿素经脲酶的降解可产生碱性的NH3，NH3能使培养基中的酚红由红黄色变成红色，故菌落周围会出现红色环带。(2)由于尿素加热会分解，对尿素溶液进行灭菌最好用G6玻璃砂漏斗过滤。(3)微生物的分离和培养步骤：配制培养基→灭菌、倒平板→接种→培养。为获得单菌落，接种操作前应先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上即可。(4)微生物培养时需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，则无法形成单菌落。(5)幽门螺杆菌能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，故临床上常用14C呼气试验检测人体内幽门螺杆菌的存在。
答案　(1)脲酶　红　(2)D　(3)接种　涂布　单　(4)恒温培养箱　无法形成单菌落　(5)尿素
10.自生固氮菌是土壤中能利用空气中的氮气进行独立固氮的细菌，它对于增加土壤中的氮素有重要意义。某研究小组按照下图所示的实验方案从土壤中分离自生固氮菌株。

(1)制备土壤悬浮液时，在无菌条件下将1 g土样加到有________的三角瓶中振荡10 min。即成10－2 土壤悬浮液。
(2)按功能分，Ⅰ号培养基称为________培养基；该培养基中应有的营养成分(仅列出碳源和氮源)为________。
A.葡萄糖、硫酸铵 B.葡萄糖
C.酵母提取物、蛋白胨 D.酵母提取物
(3)图中第一次接种到Ⅰ号培养基的方法是_______________________________。
(4)接种后的平板放在37 ℃恒温箱培养1～2天，通过观察________的特征可统计自生固氮菌的种类，但培养时间不宜过长，原因是_________________________。
解析　(2)实验需要从土壤中分离自生固氮菌株，因此按功能分培养基属于选择培养基；由于该细菌能够独立进行固氮，因此选择培养基中不应该加入氮源，硫酸铵、酵母提取物、蛋白胨中均含有氮源，故选B；(4)接种后的平板放在37 ℃恒温箱培养1～2天，通过观察菌落的特征可统计自生固氮菌的种类；由于自身固氮菌的菌落会分泌含氮化合物，引起杂菌生长，因此培养时间不宜过长。
答案　(1)99 mL无菌水　(2)选择　B　(3)涂布分离法
(4)菌落　菌落会分泌含氮物质，引起杂菌生长