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2021版浙江新高考选考生物一轮复习教师用书：第34讲 基因工程
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第34讲 基因工程
知识内容
考试要求
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1．工具酶的发现和基因工程的诞生
a
3.基因工程的应用
a
2．基因工程的原理和技术
b
4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案
c
基因工程的含义及操作工具
1．基因工程的诞生
(1)概念：基因工程是狭义的遗传工程。广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
(2)核心：构建重组DNA分子，早期也将基因工程称为重组DNA技术。
(3)诞生时间：20世纪70年代。
(4)理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。
(5)技术保障：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现和运用。
2．基因工程的核心及操作工具
(1)基因工程的核心是构建重组DNA分子。
(2)基因工程的操作工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
①限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。
②DNA连接酶可以将外源基因和载体DNA连接在一起。
③质粒是能够自主复制的双链环状DNA分子，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，含有抗生素抗性基因，是重组基因导入受体细胞的标志。
(1)限制酶也可以识别和切割RNA(×)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(×)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接粘性末端(×)
(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×)
(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(√)
(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×)
(8)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)
(选修3 P4图1－3改编)如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是____________，二者还具有其他共同点，如①______________________，②__________________(写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为__________；可使用__________把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是__________________________。
解析：(1)a代表的物质是拟核DNA分子，质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外的小型环状DNA分子，两者都能自我复制，并蕴含遗传信息。(2)质粒DNA分子的切割末端能够与目的基因切割末端发生碱基互补配对，可使用DNA连接酶将它们连接在一起。(3)质粒DNA分子上的氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，便于对重组DNA进行鉴定和筛选。
答案：(1)DNA 能够自我复制 具有遗传特性
(2) DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和选择
1．限制酶(限制性核酸内切酶)
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；如以为轴，两侧碱基互补对称。
(2)切割后末端的种类
(3)限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶，但要确保质粒(如图乙)上也有这两种酶的切点。
2．限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．作为载体的条件及作用
条件
作用
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限
制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的
标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
基因工程操作工具易错辨析
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的粘性末端。
(4)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的粘性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的粘性末端一般不相同。
(5)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(6)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
[题组冲关]
1．图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是( )
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．用PstⅠ和HindⅢ酶切，加入DNA连接酶后可得到1种符合要求的重组质粒
D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：选C。环状质粒被限制酶切割后会出现2个游离的磷酸基团；如果用BamHⅠ切割外源DNA后，会破坏目的基因；导入目的基因的大肠杆菌能否在含氨苄青霉素的培养基中生长，关键看限制酶的切割部位在哪里，如果用PstⅠ切割，由于Ampr基因被破坏，所以不能在含氨苄青霉素的培养基中生长。
2．啤酒酵母菌是啤酒生产上常用的典型的发酵酵母菌。除用于酿造啤酒及其他的饮料酒外，还可发酵面包。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料。科学家将大麦细胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操作过程如下：
(1)该技术定向改变了啤酒酵母菌的性状，这在可遗传变异的来源中属于________。
(2)为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内，所用的载体是________。
(3)要使载体与LTP1基因连接，首先应使用______________________进行切割。假如载体被切割后，得到的分子末端序列为，则能与该载体连接的抗病基因分子末端有____________(多选)，其中跟是同一种限制性核酸内切酶切割的是________。
(4)有C进入的啤酒酵母菌分别在含有青霉素、四环素的两种选择培养基上的生长情况是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)由图可知该技术属于基因工程，该变异属于基因重组。(2)据图可以看出，载体来自大肠杆菌，一定是质粒。(3)跟具有相同粘性末端的是A、B、C，它们能相互连接，但来自同一种限制性核酸内切酶切割的是A。(4)由于质粒上抗四环素基因被破坏，所以含有C的酵母菌在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活。
答案：(1)基因重组 (2)(大肠杆菌的)质粒
(3)限制性核酸内切酶 A、B、C A
(4)在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活
基因工程的原理和技术
基因工程的基本操作步骤
步骤一：获得目的基因
获取目的基因的办法有化学方法合成和PCR扩增或从基因文库中提取
步骤二：形成重组DNA分子
通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起
步骤三：将重组DNA分子导入受体细胞
常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等
步骤四：筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因的表达产物是筛选的标志，如含四环素抗性基因的受体细胞，可以在含四环素的培养基中生长
步骤五：目的基因的表达
目的基因在宿主细胞中表达，产生满足人们需要的功能物质
(1)基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表达(√)
(2)多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素(√)
(3)目的基因序列未知，可采用PCR扩增获得目的基因(×)
(4)构建基因文库时需包含目的基因(√)
(5)构建重组DNA分子时通常采用相同的限制性核酸内切酶和DNA连接酶(√)
(6)将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法(×)
(7)利用氯化钙处理农杆菌细胞，可以增加其细胞膜的通透性(×)
(8)在宿主细胞中检测到目的基因存在，说明转基因技术操作成功(×)
(选修3 P6图1－4改编)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是( )
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再对其进行扩增
B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞中
D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
解析：选A。如果所需要的目的基因的序列是完全未知的，往往就需要构建基因文库，然后从基因文库中获取目的基因，而在基因序列已知的情况下，获取目的基因通常用逆转录法或利用化学方法直接人工合成，因此，A项正确，B项错误；将目的基因与质粒连接起来的酶是DNA连接酶，而非DNA聚合酶，C项错误；目的基因必须与载体结合后导入受体细胞才能够自我复制和表达，且导入植物细胞常用的载体是农杆菌，而不是大肠杆菌，D项错误。
1．目的基因的获取
(1)直接分离法
(2)人工合成法
2．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的组成及作用
(2)基因表达载体的构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
生物
种类
植物
动物
微生物
常用
方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体
细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化
过程
将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
4.目的基因的检测与鉴定
通过检测受体细胞中是否有标记基因(载体上的某些基因如抗生素抗性基因)表达的产物，可以确定目的基因是否导入受体细胞。通过检测受体细胞中是否有目的基因的表达产物(如胰岛素基因可以表达出胰岛素)，可以确定目的基因在受体细胞中是否表达。
(1)误以为目的基因的插入位点是随意的。基因表达需要调控，至少目的基因不能插到RNA聚合酶识别的启动部位。
(2)误以为农杆菌转化法是将农杆菌的重组质粒直接导入到植物细胞中。农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(3)误以为动物受体细胞可以是动物所有细胞。动物受体细胞一般具有细胞全能性的特点，所以动物受体细胞一般是受精卵或卵裂后2～8个细胞。
(4)误以为基因工程的关键是筛选步骤。基因工程的关键是重组质粒的构建。
[题组冲关]
1．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C。目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上，D项正确。
2．(2018·浙江4月选考)回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切，在切口处形成__________。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成__________，获得重组质粒。
(2)已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成____________实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是____________________________________________________，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。
(3)取田间不同品种水稻的幼胚，先进行____________，然后接种到培养基中培养，幼胚发生______________形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及____________________________
____________(答出2点即可)。
解析：(1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ剪切得到的是粘性末端，DNA连接酶连接两个DNA片段之间形成的是磷酸二酯键。(2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。Ca2＋处理方法增加细菌细胞壁的通透性，使其处于感受态，以利于重组质粒导入，即实现了转化这一步。而细胞要正常表达相关基因，应让其恢复为正常状态，故在摇床上培养一段时间。(3)已分化的植物组织(幼胚)恢复为未分化的薄壁组织——愈伤组织的过程，称之为脱分化。
答案：(1)粘性末端 磷酸二酯键
(2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
(3)消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数
基因工程的应用及应用方案设计
1．基因工程与遗传育种
(1)转基因植物(如图为转基因工程育种的操作流程图)
(2)转基因动物：指转入外源基因的动物。
2．基因工程与疾病治疗
(1)常见的通过基因工程生产的药品有胰岛素、干扰素和乙型肝炎疫苗等。
(2)基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。
3．基因工程与生态环境保护：通过基因工程，可以培育出能降解污染物的细菌。
(1)转入外源基因的动物称成为转基因动物(√)
(2)转基因技术选育生物品种能够克服远缘杂交不亲和的障碍(√)
(3)土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组，然后将重组DNA分子导入植物受体细胞(×)
(4)从猪血液中提取的胰岛素属于基因工程药物(×)
(5)干扰素、乙型肝炎疫苗是常见的基因工程药物(√)
(6)基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因(×)
(7)科学家通过对自然界中存在的能够分解石油的细菌进行改造，大大提高其分解石油的能力(√)
(8)干扰素是动物或人体细胞受到侵染后产生的一种糖蛋白(物质)，干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染(√)
(9)基因治疗已有较多成功的案例，目前该技术已相对成熟(×)
(选修3 P9图1－5改编)我国科学家张道远先生通过从耐旱灌木白花柽柳中克隆得到TSOD基因，利用转基因技术转化到棉花中，获得了具备更强抗旱性的T4代转基因棉花株系。下图为转基因抗旱棉花的培育过程示意图，请据图回答下列问题：
(1)①过程表示用________扩增目的基因的方法。②过程用到的工具酶有______________________________。步骤③一般用__________________处理农杆菌，使其易吸收周围环境中的DNA分子。
(2)将重组质粒导入棉花细胞除步骤④所示的方法外，还可采用__________________。如果受体细胞是动物的受精卵，则一般采用的方法是____________。
(3)外植体培养成为试管苗的过程采用了__________________技术，利用了____________________的原理，步骤⑤⑥表示___________________________________。
(4)为了确定抗旱转基因棉花是否培育成功，可先用放射性同位素标记的________________作探针进行分子水平鉴定，再________________进行个体水平鉴定棉花植株的抗旱性。
答案：(1)PCR技术 限制性核酸内切酶、DNA连接酶 Ca2＋(或CaCl2)
(2)花粉管通道法(基因枪法) 显微注射法
(3)植物组织培养 植物细胞的全能性 脱分化、再分化
(4)抗旱基因(TSOD基因、目的基因) 移栽到干旱土地中
基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断
①方法：DNA分子杂交法(即DNA探针法)，该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
②步骤：抽取病人的组织或体液作为化验样品；将样品中的DNA分离出来；用化学法或热处理法使样品DNA解旋；将事先制作好的DNA探针引入化验样品中，这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补链，并与之结合(杂交)在一起，找不到互补链的DNA探针，则可以被洗脱。
这样通过对遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析，就能检出病人所得的病。
(2)基因治疗
①原理：利用正常基因纠正或补偿基因的缺陷，即把正常基因导入患者体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，而原有缺陷基因一般不作处理。
②方法：有体外基因治疗和体内基因治疗，体外基因治疗方法疗效好。如重度免疫缺陷症的体外基因治疗方法：
体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因。
基因工程应用中的易错分析
(1)Bt毒蛋白基因编码的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。
(2)青霉素是诱变后的高产青霉菌产生的，不是通过基因工程改造的工程菌产生的。
(3)动物基因工程主要为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。
[题组冲关]
1．北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是( )
A．过程①是获取抗冻基因的过程，用到的酶只有限制性核酸内切酶
B．在重组质粒上，抗冻基因首端和末端一定具有启动子和终止子，启动和终止翻译的进程
C．过程②用到的质粒是农杆菌的Ti质粒，要将重组质粒转入农杆菌才能进行筛选
D．根据抗冻基因制作的DNA探针，可以用来检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在
解析：选D。据题图可知，该转基因技术操作中，获取目的基因的方法是利用抗冻基因(目的基因)的mRNA进行人工化学合成，需要的酶是逆转录酶和限制性核酸内切酶，A项错误；目的基因首端和末端的启动子和终止子均是DNA片段，分别启动和终止转录的进程，B项错误；重组质粒转入农杆菌的目的是通过农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞中，C项错误；检测目的基因是否导入受体细胞，通常是用DNA探针进行检测，即所谓DNA分子杂交技术，D项正确。
2．(2020·浙江绍兴月考)基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的基因，改变其基因结构，令该基因功能丧失，从而对生物体造成影响，进而推测出该基因功能的一门技术。以下是制备APOE基因敲除小鼠的常规过程：
注：Neo基因是抗新霉素的抗药基因；APOE是指载脂蛋白E，参与脂蛋白的代谢与转化。
请回答下列问题：
(1)为了获得APOE基因，可以用__________或者PCR扩增。过程②中所需的工具酶有__________________。Neo基因除了破坏APOE基因外，还具有的作用最可能是____________。
(2)培养小鼠胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备饲养层，用作饲养层的细胞一般是__________。经过⑥克隆以后的细胞的后裔细胞群称为纯系，细胞纯系的特点是________________________，从而便于研究。
(3)纯合的APOE基因敲除小鼠____________(填“能”或“不能”)表达APOE，与正常小鼠相比表现出 ________________________性状。
解析：(1)为了获得APOE基因(目的基因)，可以用化学方法合成或者PCR扩增。过程②是形成重组质粒的过程，该过程中所需的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。Neo基因除了破坏APOE基因外，还具有的作用最可能是作为标记基因，便于筛选出能在含新霉素的培养基中生长的受体细胞。(2)培养小鼠胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备饲养层，用于饲养层的细胞一般是胚胎成纤维细胞。经过⑥克隆以后的细胞的后裔细胞群称为纯系，细胞纯系的特点是遗传性状均一，表现的性状相似，从而便于研究。(3)纯合的APOE基因敲除小鼠由于APOE基因结构被破坏，因而不能表达APOE，由于APOE参与脂蛋白的代谢与转化，因此与正常小鼠相比APOE基因敲除小鼠会表现出脂蛋白的代谢和转化异常性状。
答案：(1)化学方法合成 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 作为标记基因，便于筛选 (2)胚胎成纤维细胞 遗传性状均一，表现的性状相似 (3)不能 脂蛋白的代谢和转化异常
1．下列有关基因工程的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶能将碱基互补的两个粘性末端的碱基对连接起来
B．获得目的基因一定要使用限制性核酸内切酶
C．目的基因和受体细胞均可来自动植物或微生物
D．基因工程的产物都对人类有益
解析：选C。DNA 连接酶不连接碱基对形成氢键，而是连接相邻脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键；如果是采用化学方法合成目的基因，可以不用限制性核酸内切酶；基因工程的产物对人类不一定是有益的。
2．某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，来表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。 下列叙述正确的是( )
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．DNA连接酶和RNA聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶
C．可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D．在含氨苄青霉素培养基中不能生长，但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌
解析：选D。导入大肠杆菌的质粒不一定为重组质粒；DNA连接酶和限制性核酸内切酶是构建该重组质粒必需的工具酶；因为目的基因要插入到基因B(B是抗氨苄青霉素基因)中，所以不可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒，但可以用含链霉素的培养基来检测。
3．下面是获得抗虫棉的技术流程示意图。有关叙述错误的是( )
A．重组质粒构建过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶
B．图中愈伤组织分化产生的再生植株基因型一般都相同
C．卡那霉素抗性基因中含有相关限制性核酸内切酶的识别位点
D．转基因抗虫棉有性生殖的后代不能稳定保持抗虫性状
解析：选C。重组质粒构建过程中需要限制性核酸内切酶切出相同的粘性末端，再经DNA连接酶接合在一起形成重组质粒，故A正确；细胞分化的过程不会改变遗传物质，故形成的再生植株的基因型一般是相同的，故B正确；卡那霉素抗性基因是作为标记基因利用的，其中不可能含有相关限制性核酸内切酶的识别位点，故C错误；转基因抗虫棉植株相当于杂合子，其后代会发生性状分离，故D正确。
4．(2020·海宁质检)如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图。据图回答下列问题：
(1)图中细胞1是________细胞。过程②④需要的酶分别是________________。
(2)与人细胞中胰岛素基因相比，过程②获得的目的基因不含有非编码区和________。
(3)图中B的基本组成单位有________种；基因工程的核心步骤是________(填图中序号)。
(4)为便于重组DNA的鉴定和选择，图中C的组成必须有________；为使过程⑧更易进行，可用________处理大肠杆菌。
(5)若过程⑨发生了变异，则此变异为________。过程⑩得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌____________________________________。
解析：图中①为胰岛素基因转录出mRNA，②为逆转录获得目的基因，③④⑤为PCR技术扩增目的基因，⑥为限制酶切割载体，⑦为目的基因与载体结合构建重组DNA分子，⑧为将重组DNA分子导入受体细胞。只有胰岛β细胞中的胰岛素基因才能转录出mRNA。逆转录获得的目的基因不含非编码区和内含子。逆转录过程需要逆转录酶，PCR技术扩增DNA需要耐高温的Taq DNA聚合酶。大肠杆菌能发生的可遗传的变异只有基因突变，大肠杆菌细胞内没有内质网和高尔基体，不能将肽链加工成为有活性的胰岛素。
答案：(1)胰岛β 逆转录酶、Taq酶
(2)内含子 (3)4 ⑥⑦ (4)标记基因 Ca2＋(CaCl2)
(5)基因突变 没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质加工
5．(2019·浙江4月选考)回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的的基因。
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________。
A．质粒载体 B．转录产物
C．抗性基因 D．病原微生物
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入____________________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种的过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是________________________________________________________________________。
答案：(1)单克隆抗体 基因文库
(2)B
(3)变异 高浓度致病真菌 花粉离体
(4)胚的离体培养
1．(2020·义乌模拟)应用转基因技术可获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
(1)要获得抗虫基因，可采用________________________等方法，基因工程的核心是______________。
(2)如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是____________，原因是__________________。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为__________细胞。
(3)在培育转人生长激素基因牛的过程中，②过程常用的方法是______________。
(4)转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有__________。
解析：(1)获得目的基因的方法有从基因文库中获取目的基因、PCR技术扩增目的基因、人工合成目的基因等，基因工程的核心是形成重组DNA分子。(2)动物受精卵全能性最高，发育成完整个体最容易，要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是受精卵。(3)②是重组质粒导入动物细胞的过程，常用的方法是显微注射法。(4)基因表达载体的首端必须有启动子。
答案：(1)从基因文库中获得目的基因、PCR技术扩增目的基因、人工合成 形成重组DNA分子
(2)受精卵 动物受精卵全能性最高(动物不能像植物那样，利用一个除受精卵以外的独立的体细胞直接培养成完整的个体) 感受态
(3)显微注射法 (4)启动子
2．生物工程技术为人们获得需要的生物新品种或新产品提供了便利。如图为转基因牛和抗虫棉的培育过程，请回答：
重组DNA―→受精卵转基因牛
―→重组Ti质粒―→细菌M抗虫棉
(1)在培育转人生长激素基因牛的过程中，①过程需要的工具酶是__________________________。②过程中，应对代孕母牛进行________处理，以便早期胚胎的着床。若在②过程中培养到早期胚胎阶段采用________技术，可培育出多头相同的转基因牛。
(2)在抗虫棉培育过程中，重组Ti质粒先导入细菌M，细菌M的名称是________，③过程中的棉花细胞常采用愈伤组织细胞而不采用叶肉细胞，原因是愈伤组织细胞________，④过程中，愈伤组织细胞可通过________技术培养成单个胚性细胞，胚性细胞再分化形成的胚状体可发育成植株。
解析：(1)由图可知，①为构建重组DNA分子的过程，所以需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行处理。②过程中，应对代孕母牛进行同期发情处理，以便使早期胚胎着床。若在②过程中借助显微技术将早期胚胎采用胚胎分割技术，切割成几等份，再移植到代孕母牛子宫中发育，可培育出多头相同的转基因牛。(2)在培育抗虫棉过程中，将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，所以细菌M是农杆菌。愈伤组织是分化程度很低的细胞，易表达出细胞全能性，同时将含有愈伤组织培养物的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养技术培养成单个胚性细胞，继而发育成完整植株。
答案：(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 同期发情 胚胎分割 (2)农杆菌 全能性高 液体悬浮培养
3．(2020·嘉兴一中月考)利用基因工程技术将突变的IPA1基因转入水稻细胞中从而获得某水稻新品种。回答下列问题：
(1)培育该转基因水稻新品种的核心是构建________。该过程需要用到的工具酶有________________________________________________________________________。
在将重组DNA分子导入受体细胞过程中，常用氯化钙处理土壤农杆菌，以增加________的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
(2)在含目的基因的水稻细胞培育成植株的过程中可以将含有愈伤组织的培养物放在摇床上，通过__________培养分散成单细胞。其中培养过程正确的是________(A.配制只含有适当营养物质的培养基，倒在灭菌试管中凝固成半固体 B．从灭菌的根、茎或叶上切取一些小组织块，进行培养 C．这种单细胞具有细胞质丰富、液泡大、细胞核大的特征 D．水稻体细胞与这种单细胞的全能性表达程度大不相同)
(3)利用水稻细胞制备原生质体时，需在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液中进行处理，该溶液浓度与水稻细胞中的________浓度相当。
解析：(1)基因工程的核心步骤是构建重组DNA分子，该过程需要用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶；以土壤农杆菌为运载体，将重组DNA分子导入受体细胞时，常用氯化钙处理土壤农杆菌，以增加细胞壁的通透性，有利于使含有目的基因的重组质粒进入农杆菌细胞。(2)将含有愈伤组织的培养物放在摇床上，通过液体悬浮培养可将愈伤组织分散成单细胞。用来培养愈伤组织的培养基中应含有适当的营养物质和生长调节物质，A错误；外植体应从消毒的根、茎或叶上切取，B错误；愈伤组织细胞具有细胞质丰富、液泡小、细胞核大的特征，C错误；水稻体细胞属于高度分化细胞，全能性表达程度小于愈伤组织细胞，D正确。(3)为防止原生质体过度失水或吸水，在甘露醇溶液中制备原生质体时，甘露醇溶液的浓度应与细胞液浓度相当。
答案：(1)重组DNA分子 限制性核酸内切酶、DNA连接酶 细胞壁
(2)液体悬浮 D
(3)细胞液
4．科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意图，请分析回答：
(1)基因工程的核心步骤是__________________，重组Ti质粒上的潮霉素抗性基因属于____________。
(2)下列关于DNA连接酶的理解正确的是________。
A．其化学本质是蛋白质
B．DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键
C．它不能被反复使用
D．在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶
(3)为筛选出含重组Ti质粒的愈伤组织，应在培养基2中添加适量的________，图中由开花后水稻未成熟的胚转变为愈伤组织的过程为________。
(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻____________________。
解析：(1)基因工程的核心步骤是构建重组运载体，据题可知铁结合蛋白基因为目的基因，潮霉素抗性基因属于标记基因，便于筛选。(2)限制酶和DNA连接酶的化学本质都是蛋白质，A正确；DNA连接酶恢复的是DNA分子中的磷酸二酯键，B错误；限制酶和DNA连接酶能被反复利用，C错误；DNA聚合酶的功能是将单个脱氧核苷酸聚合形成DNA链，而DNA连接酶连接DNA片段，因此在基因工程操作中不可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶，D错误。(3)质粒上的标记基因为潮霉素抗性基因，因此为筛选出含重组质粒的愈伤组织，应在培养基2中添加适量的潮霉素。水稻未成熟的胚转变为愈伤组织的过程为脱分化。(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻种子中的铁含量。
答案：(1)形成重组DNA分子(构建重组运载体或构建重组DNA分子) 标记基因
(2)A
(3)潮霉素 脱分化
(4)种子中的铁含量(写出铁含量即可)
5．科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因，培育出了耐盐水稻新品系。如图是培育过程简图。
回答下列问题：
(1)阶段Ⅰ的核心步骤是________________，重组质粒b构建好后不能直接导入水稻细胞，需用________处理农杆菌，农杆菌入侵水稻细胞后将耐盐基因插入到水稻细胞的染色体，从而使耐盐基因在水稻细胞中能稳定存在和________。
(2)阶段Ⅱ过程中水稻细胞通过________和再分化得到水稻幼苗，此过程需要保持________条件，达到防止杂菌污染的目的。
(3)本实验得到的水稻植株需进行________处理，判断转基因成功与否。耐盐水稻培育成功的原理是______________________________________。
解析：(1)阶段Ⅰ表示将目的基因导入水稻细胞中，其核心步骤是形成重组DNA分子。需用氯化钙处理农杆菌，使农杆菌细胞壁通透性增大，利于重组质粒导入农杆菌内。耐盐基因插入到水稻细胞的染色体，从而使耐盐基因在水稻细胞中能稳定存在和复制。(2)阶段Ⅱ过程中水稻细胞通过脱分化和再分化得到水稻幼苗，此过程需要保持无菌条件，达到防止杂菌污染的目的。(3)本实验得到的水稻植株需进行盐碱地种植来判断转基因成功与否。耐盐水稻培育成功的原理是基因重组(阶段Ⅰ)和植物细胞全能性(阶段Ⅱ)。
答案：(1)形成重组DNA分子 氯化钙 复制 (2)脱分化 无菌 (3)盐碱地种植 基因重组和植物细胞全能性
6．(2020·湖州模拟)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。请回答下列问题：
(1)由①到②通常先用合适的______________酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA，然后借助____________酶连接以形成重组Ti质粒。若含抗虫基因的DNA序列已知，可用____________方法对其进行扩增。
(2)由④到⑤经过培养基中营养物质和____________的诱导，可发生类似受精卵发育成胚的过程，即从单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和________，最后再生出完整的植株。若⑤表现出________性状，则表明转基因成功。
(3)基因工程在多个领域具有广阔的应用前景，基因工程的应用不包括________(A.可以定向改变生物的性状 B．可以迅速使某种生物形成群落 C．可以生产人们需要的某些蛋白质 D．可以治疗人类的某些遗传病)。
解析：(1)构建重组DNA分子时，通常先用合适的限制性核酸内切酶分别切割载体DNA和含目的基因的DNA，然后用DNA连接酶连接以形成重组DNA分子。如果目的基因的序列是已知的，可以用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。(2)经过培养基中适当配比的营养物质和生长调节剂诱导，单个植物细胞可依次形成细胞团、球形胚、心形胚和胚状体，最后再生出完整的植株。若获得的转基因植株表现出抗虫性状，则表明转基因成功。(3)在农牧业上，可以利用基因工程技术让转入目的基因的生物获得某种优良性状，以达到定向改造生物的目的；在医药工业领域上，可以通过基因工程生产人们所需要的蛋白质；在医学上，可以通过基因治疗手段来治疗人类的遗传病。
答案：(1)限制性核酸内切 DNA连接 聚合酶链式反应(PCR) (2)生长调节剂 胚状体 抗虫 (3)B
7．(2020·浙江省名校考前押宝)金茶花是中国特有的观赏品种，但易得枯萎病，降低观赏价值。科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，用转基因技术培育出了抗枯萎病的新品种。据图回答：
(1)①和②结合能形成③，常用的酶有____________________________；其能结合形成③，最重要的原因是①和②经酶处理后具有____________________________________。
(2)经培养长成的植株⑦具备了抗病性，这说明__________________________。抗枯萎病金茶花的培育成功说明一种生物的基因表达系统能够识别来自另一种生物的DNA的________________。
(3)有人认为通过基因工程能培育出理想的抗虫植物，不仅能减轻农药造成的环境污染，而且又能降低生产成本。还有人认为抗虫植物一旦培育成功，其抗虫特性将会连续保持下去，可谓一劳永逸。对后一种观点，你是否赞成？请说明理由。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 相同的粘性末端
(2)目的基因(抗病基因)已经表达 脱氧核苷酸序列(遗传信息或碱基序列)
(3)不赞成，因为害虫经突变和自然选择而产生对抗虫植物的适应性等；因抗虫植物发生变异，使后代失去抗药性等。赞成，因为抗虫植物的抗虫特性是由基因控制的，是能够遗传的(开放性题)。
8．(2020·浙江绿色评估联盟高三考试)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种________________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________________以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是___________________________________
____________________。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是________。种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。
解析：(1)切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶，筛选细菌应使用选择培养基。(2)农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，Ti质粒上的TDNA片段能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。因为TDNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得TDNA片段的植物细胞。(3)植物组织培养过程中，可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量与细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输，促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。(4)在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状；抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。
答案：(1)限制性核酸内切 选择 (2)TDNA 筛选获得TDNA片段的植物细胞 (3)细胞分裂素浓度 芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化 (4)投放棉铃虫 农药
第34讲 基因工程
知识内容
考试要求
知识内容
考试要求
1．工具酶的发现和基因工程的诞生
a
3.基因工程的应用
a
2．基因工程的原理和技术
b
4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案
c
基因工程的含义及操作工具
1．基因工程的诞生
(1)概念：基因工程是狭义的遗传工程。广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
(2)核心：构建重组DNA分子，早期也将基因工程称为重组DNA技术。
(3)诞生时间：20世纪70年代。
(4)理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。
(5)技术保障：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现和运用。
2．基因工程的核心及操作工具
(1)基因工程的核心是构建重组DNA分子。
(2)基因工程的操作工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
①限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。
②DNA连接酶可以将外源基因和载体DNA连接在一起。
③质粒是能够自主复制的双链环状DNA分子，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，含有抗生素抗性基因，是重组基因导入受体细胞的标志。
(1)限制酶也可以识别和切割RNA(×)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(×)
(4)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接粘性末端(×)
(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×)
(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(√)
(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×)
(8)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)
(选修3 P4图1－3改编)如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是____________，二者还具有其他共同点，如①______________________，②__________________(写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为__________；可使用__________把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是__________________________。
解析：(1)a代表的物质是拟核DNA分子，质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外的小型环状DNA分子，两者都能自我复制，并蕴含遗传信息。(2)质粒DNA分子的切割末端能够与目的基因切割末端发生碱基互补配对，可使用DNA连接酶将它们连接在一起。(3)质粒DNA分子上的氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，便于对重组DNA进行鉴定和筛选。
答案：(1)DNA 能够自我复制 具有遗传特性
(2) DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和选择
1．限制酶(限制性核酸内切酶)
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；如以为轴，两侧碱基互补对称。
(2)切割后末端的种类
(3)限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶，但要确保质粒(如图乙)上也有这两种酶的切点。
2．限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．作为载体的条件及作用
条件
作用
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限
制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的
标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
基因工程操作工具易错辨析
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的粘性末端。
(4)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的粘性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的粘性末端一般不相同。
(5)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(6)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
[题组冲关]
1．图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是( )
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．用PstⅠ和HindⅢ酶切，加入DNA连接酶后可得到1种符合要求的重组质粒
D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：选C。环状质粒被限制酶切割后会出现2个游离的磷酸基团；如果用BamHⅠ切割外源DNA后，会破坏目的基因；导入目的基因的大肠杆菌能否在含氨苄青霉素的培养基中生长，关键看限制酶的切割部位在哪里，如果用PstⅠ切割，由于Ampr基因被破坏，所以不能在含氨苄青霉素的培养基中生长。
2．啤酒酵母菌是啤酒生产上常用的典型的发酵酵母菌。除用于酿造啤酒及其他的饮料酒外，还可发酵面包。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料。科学家将大麦细胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操作过程如下：
(1)该技术定向改变了啤酒酵母菌的性状，这在可遗传变异的来源中属于________。
(2)为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内，所用的载体是________。
(3)要使载体与LTP1基因连接，首先应使用______________________进行切割。假如载体被切割后，得到的分子末端序列为，则能与该载体连接的抗病基因分子末端有____________(多选)，其中跟是同一种限制性核酸内切酶切割的是________。
(4)有C进入的啤酒酵母菌分别在含有青霉素、四环素的两种选择培养基上的生长情况是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)由图可知该技术属于基因工程，该变异属于基因重组。(2)据图可以看出，载体来自大肠杆菌，一定是质粒。(3)跟具有相同粘性末端的是A、B、C，它们能相互连接，但来自同一种限制性核酸内切酶切割的是A。(4)由于质粒上抗四环素基因被破坏，所以含有C的酵母菌在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活。
答案：(1)基因重组 (2)(大肠杆菌的)质粒
(3)限制性核酸内切酶 A、B、C A
(4)在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活
基因工程的原理和技术
基因工程的基本操作步骤
步骤一：获得目的基因
获取目的基因的办法有化学方法合成和PCR扩增或从基因文库中提取
步骤二：形成重组DNA分子
通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起
步骤三：将重组DNA分子导入受体细胞
常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等
步骤四：筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因的表达产物是筛选的标志，如含四环素抗性基因的受体细胞，可以在含四环素的培养基中生长
步骤五：目的基因的表达
目的基因在宿主细胞中表达，产生满足人们需要的功能物质
(1)基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表达(√)
(2)多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素(√)
(3)目的基因序列未知，可采用PCR扩增获得目的基因(×)
(4)构建基因文库时需包含目的基因(√)
(5)构建重组DNA分子时通常采用相同的限制性核酸内切酶和DNA连接酶(√)
(6)将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法(×)
(7)利用氯化钙处理农杆菌细胞，可以增加其细胞膜的通透性(×)
(8)在宿主细胞中检测到目的基因存在，说明转基因技术操作成功(×)
(选修3 P6图1－4改编)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是( )
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再对其进行扩增
B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞中
D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
解析：选A。如果所需要的目的基因的序列是完全未知的，往往就需要构建基因文库，然后从基因文库中获取目的基因，而在基因序列已知的情况下，获取目的基因通常用逆转录法或利用化学方法直接人工合成，因此，A项正确，B项错误；将目的基因与质粒连接起来的酶是DNA连接酶，而非DNA聚合酶，C项错误；目的基因必须与载体结合后导入受体细胞才能够自我复制和表达，且导入植物细胞常用的载体是农杆菌，而不是大肠杆菌，D项错误。
1．目的基因的获取
(1)直接分离法
(2)人工合成法
2．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的组成及作用
(2)基因表达载体的构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
生物
种类
植物
动物
微生物
常用
方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体
细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化
过程
将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
4.目的基因的检测与鉴定
通过检测受体细胞中是否有标记基因(载体上的某些基因如抗生素抗性基因)表达的产物，可以确定目的基因是否导入受体细胞。通过检测受体细胞中是否有目的基因的表达产物(如胰岛素基因可以表达出胰岛素)，可以确定目的基因在受体细胞中是否表达。
(1)误以为目的基因的插入位点是随意的。基因表达需要调控，至少目的基因不能插到RNA聚合酶识别的启动部位。
(2)误以为农杆菌转化法是将农杆菌的重组质粒直接导入到植物细胞中。农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(3)误以为动物受体细胞可以是动物所有细胞。动物受体细胞一般具有细胞全能性的特点，所以动物受体细胞一般是受精卵或卵裂后2～8个细胞。
(4)误以为基因工程的关键是筛选步骤。基因工程的关键是重组质粒的构建。
[题组冲关]
1．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C。目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上，D项正确。
2．(2018·浙江4月选考)回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切，在切口处形成__________。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成__________，获得重组质粒。
(2)已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成____________实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是____________________________________________________，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。
(3)取田间不同品种水稻的幼胚，先进行____________，然后接种到培养基中培养，幼胚发生______________形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及____________________________
____________(答出2点即可)。
解析：(1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ剪切得到的是粘性末端，DNA连接酶连接两个DNA片段之间形成的是磷酸二酯键。(2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。Ca2＋处理方法增加细菌细胞壁的通透性，使其处于感受态，以利于重组质粒导入，即实现了转化这一步。而细胞要正常表达相关基因，应让其恢复为正常状态，故在摇床上培养一段时间。(3)已分化的植物组织(幼胚)恢复为未分化的薄壁组织——愈伤组织的过程，称之为脱分化。
答案：(1)粘性末端 磷酸二酯键
(2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
(3)消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数
基因工程的应用及应用方案设计
1．基因工程与遗传育种
(1)转基因植物(如图为转基因工程育种的操作流程图)
(2)转基因动物：指转入外源基因的动物。
2．基因工程与疾病治疗
(1)常见的通过基因工程生产的药品有胰岛素、干扰素和乙型肝炎疫苗等。
(2)基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。
3．基因工程与生态环境保护：通过基因工程，可以培育出能降解污染物的细菌。
(1)转入外源基因的动物称成为转基因动物(√)
(2)转基因技术选育生物品种能够克服远缘杂交不亲和的障碍(√)
(3)土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组，然后将重组DNA分子导入植物受体细胞(×)
(4)从猪血液中提取的胰岛素属于基因工程药物(×)
(5)干扰素、乙型肝炎疫苗是常见的基因工程药物(√)
(6)基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因(×)
(7)科学家通过对自然界中存在的能够分解石油的细菌进行改造，大大提高其分解石油的能力(√)
(8)干扰素是动物或人体细胞受到侵染后产生的一种糖蛋白(物质)，干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染(√)
(9)基因治疗已有较多成功的案例，目前该技术已相对成熟(×)
(选修3 P9图1－5改编)我国科学家张道远先生通过从耐旱灌木白花柽柳中克隆得到TSOD基因，利用转基因技术转化到棉花中，获得了具备更强抗旱性的T4代转基因棉花株系。下图为转基因抗旱棉花的培育过程示意图，请据图回答下列问题：
(1)①过程表示用________扩增目的基因的方法。②过程用到的工具酶有______________________________。步骤③一般用__________________处理农杆菌，使其易吸收周围环境中的DNA分子。
(2)将重组质粒导入棉花细胞除步骤④所示的方法外，还可采用__________________。如果受体细胞是动物的受精卵，则一般采用的方法是____________。
(3)外植体培养成为试管苗的过程采用了__________________技术，利用了____________________的原理，步骤⑤⑥表示___________________________________。
(4)为了确定抗旱转基因棉花是否培育成功，可先用放射性同位素标记的________________作探针进行分子水平鉴定，再________________进行个体水平鉴定棉花植株的抗旱性。
答案：(1)PCR技术 限制性核酸内切酶、DNA连接酶 Ca2＋(或CaCl2)
(2)花粉管通道法(基因枪法) 显微注射法
(3)植物组织培养 植物细胞的全能性 脱分化、再分化
(4)抗旱基因(TSOD基因、目的基因) 移栽到干旱土地中
基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断
①方法：DNA分子杂交法(即DNA探针法)，该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
②步骤：抽取病人的组织或体液作为化验样品；将样品中的DNA分离出来；用化学法或热处理法使样品DNA解旋；将事先制作好的DNA探针引入化验样品中，这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补链，并与之结合(杂交)在一起，找不到互补链的DNA探针，则可以被洗脱。
这样通过对遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析，就能检出病人所得的病。
(2)基因治疗
①原理：利用正常基因纠正或补偿基因的缺陷，即把正常基因导入患者体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，而原有缺陷基因一般不作处理。
②方法：有体外基因治疗和体内基因治疗，体外基因治疗方法疗效好。如重度免疫缺陷症的体外基因治疗方法：
体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因。
基因工程应用中的易错分析
(1)Bt毒蛋白基因编码的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。
(2)青霉素是诱变后的高产青霉菌产生的，不是通过基因工程改造的工程菌产生的。
(3)动物基因工程主要为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。
[题组冲关]
1．北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是( )
A．过程①是获取抗冻基因的过程，用到的酶只有限制性核酸内切酶
B．在重组质粒上，抗冻基因首端和末端一定具有启动子和终止子，启动和终止翻译的进程
C．过程②用到的质粒是农杆菌的Ti质粒，要将重组质粒转入农杆菌才能进行筛选
D．根据抗冻基因制作的DNA探针，可以用来检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在
解析：选D。据题图可知，该转基因技术操作中，获取目的基因的方法是利用抗冻基因(目的基因)的mRNA进行人工化学合成，需要的酶是逆转录酶和限制性核酸内切酶，A项错误；目的基因首端和末端的启动子和终止子均是DNA片段，分别启动和终止转录的进程，B项错误；重组质粒转入农杆菌的目的是通过农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞中，C项错误；检测目的基因是否导入受体细胞，通常是用DNA探针进行检测，即所谓DNA分子杂交技术，D项正确。
2．(2020·浙江绍兴月考)基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的基因，改变其基因结构，令该基因功能丧失，从而对生物体造成影响，进而推测出该基因功能的一门技术。以下是制备APOE基因敲除小鼠的常规过程：
注：Neo基因是抗新霉素的抗药基因；APOE是指载脂蛋白E，参与脂蛋白的代谢与转化。
请回答下列问题：
(1)为了获得APOE基因，可以用__________或者PCR扩增。过程②中所需的工具酶有__________________。Neo基因除了破坏APOE基因外，还具有的作用最可能是____________。
(2)培养小鼠胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备饲养层，用作饲养层的细胞一般是__________。经过⑥克隆以后的细胞的后裔细胞群称为纯系，细胞纯系的特点是________________________，从而便于研究。
(3)纯合的APOE基因敲除小鼠____________(填“能”或“不能”)表达APOE，与正常小鼠相比表现出 ________________________性状。
解析：(1)为了获得APOE基因(目的基因)，可以用化学方法合成或者PCR扩增。过程②是形成重组质粒的过程，该过程中所需的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。Neo基因除了破坏APOE基因外，还具有的作用最可能是作为标记基因，便于筛选出能在含新霉素的培养基中生长的受体细胞。(2)培养小鼠胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备饲养层，用于饲养层的细胞一般是胚胎成纤维细胞。经过⑥克隆以后的细胞的后裔细胞群称为纯系，细胞纯系的特点是遗传性状均一，表现的性状相似，从而便于研究。(3)纯合的APOE基因敲除小鼠由于APOE基因结构被破坏，因而不能表达APOE，由于APOE参与脂蛋白的代谢与转化，因此与正常小鼠相比APOE基因敲除小鼠会表现出脂蛋白的代谢和转化异常性状。
答案：(1)化学方法合成 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 作为标记基因，便于筛选 (2)胚胎成纤维细胞 遗传性状均一，表现的性状相似 (3)不能 脂蛋白的代谢和转化异常
1．下列有关基因工程的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶能将碱基互补的两个粘性末端的碱基对连接起来
B．获得目的基因一定要使用限制性核酸内切酶
C．目的基因和受体细胞均可来自动植物或微生物
D．基因工程的产物都对人类有益
解析：选C。DNA 连接酶不连接碱基对形成氢键，而是连接相邻脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键；如果是采用化学方法合成目的基因，可以不用限制性核酸内切酶；基因工程的产物对人类不一定是有益的。
2．某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，来表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。 下列叙述正确的是( )
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．DNA连接酶和RNA聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶
C．可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D．在含氨苄青霉素培养基中不能生长，但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌
解析：选D。导入大肠杆菌的质粒不一定为重组质粒；DNA连接酶和限制性核酸内切酶是构建该重组质粒必需的工具酶；因为目的基因要插入到基因B(B是抗氨苄青霉素基因)中，所以不可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒，但可以用含链霉素的培养基来检测。
3．下面是获得抗虫棉的技术流程示意图。有关叙述错误的是( )
A．重组质粒构建过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶
B．图中愈伤组织分化产生的再生植株基因型一般都相同
C．卡那霉素抗性基因中含有相关限制性核酸内切酶的识别位点
D．转基因抗虫棉有性生殖的后代不能稳定保持抗虫性状
解析：选C。重组质粒构建过程中需要限制性核酸内切酶切出相同的粘性末端，再经DNA连接酶接合在一起形成重组质粒，故A正确；细胞分化的过程不会改变遗传物质，故形成的再生植株的基因型一般是相同的，故B正确；卡那霉素抗性基因是作为标记基因利用的，其中不可能含有相关限制性核酸内切酶的识别位点，故C错误；转基因抗虫棉植株相当于杂合子，其后代会发生性状分离，故D正确。
4．(2020·海宁质检)如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图。据图回答下列问题：
(1)图中细胞1是________细胞。过程②④需要的酶分别是________________。
(2)与人细胞中胰岛素基因相比，过程②获得的目的基因不含有非编码区和________。
(3)图中B的基本组成单位有________种；基因工程的核心步骤是________(填图中序号)。
(4)为便于重组DNA的鉴定和选择，图中C的组成必须有________；为使过程⑧更易进行，可用________处理大肠杆菌。
(5)若过程⑨发生了变异，则此变异为________。过程⑩得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌____________________________________。
解析：图中①为胰岛素基因转录出mRNA，②为逆转录获得目的基因，③④⑤为PCR技术扩增目的基因，⑥为限制酶切割载体，⑦为目的基因与载体结合构建重组DNA分子，⑧为将重组DNA分子导入受体细胞。只有胰岛β细胞中的胰岛素基因才能转录出mRNA。逆转录获得的目的基因不含非编码区和内含子。逆转录过程需要逆转录酶，PCR技术扩增DNA需要耐高温的Taq DNA聚合酶。大肠杆菌能发生的可遗传的变异只有基因突变，大肠杆菌细胞内没有内质网和高尔基体，不能将肽链加工成为有活性的胰岛素。
答案：(1)胰岛β 逆转录酶、Taq酶
(2)内含子 (3)4 ⑥⑦ (4)标记基因 Ca2＋(CaCl2)
(5)基因突变 没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质加工
5．(2019·浙江4月选考)回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的的基因。
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________。
A．质粒载体 B．转录产物
C．抗性基因 D．病原微生物
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入____________________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种的过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是________________________________________________________________________。
答案：(1)单克隆抗体 基因文库
(2)B
(3)变异 高浓度致病真菌 花粉离体
(4)胚的离体培养
1．(2020·义乌模拟)应用转基因技术可获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
(1)要获得抗虫基因，可采用________________________等方法，基因工程的核心是______________。
(2)如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是____________，原因是__________________。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为__________细胞。
(3)在培育转人生长激素基因牛的过程中，②过程常用的方法是______________。
(4)转人生长激素基因牛可通过分泌的乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有__________。
解析：(1)获得目的基因的方法有从基因文库中获取目的基因、PCR技术扩增目的基因、人工合成目的基因等，基因工程的核心是形成重组DNA分子。(2)动物受精卵全能性最高，发育成完整个体最容易，要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是受精卵。(3)②是重组质粒导入动物细胞的过程，常用的方法是显微注射法。(4)基因表达载体的首端必须有启动子。
答案：(1)从基因文库中获得目的基因、PCR技术扩增目的基因、人工合成 形成重组DNA分子
(2)受精卵 动物受精卵全能性最高(动物不能像植物那样，利用一个除受精卵以外的独立的体细胞直接培养成完整的个体) 感受态
(3)显微注射法 (4)启动子
2．生物工程技术为人们获得需要的生物新品种或新产品提供了便利。如图为转基因牛和抗虫棉的培育过程，请回答：
重组DNA―→受精卵转基因牛
―→重组Ti质粒―→细菌M抗虫棉
(1)在培育转人生长激素基因牛的过程中，①过程需要的工具酶是__________________________。②过程中，应对代孕母牛进行________处理，以便早期胚胎的着床。若在②过程中培养到早期胚胎阶段采用________技术，可培育出多头相同的转基因牛。
(2)在抗虫棉培育过程中，重组Ti质粒先导入细菌M，细菌M的名称是________，③过程中的棉花细胞常采用愈伤组织细胞而不采用叶肉细胞，原因是愈伤组织细胞________，④过程中，愈伤组织细胞可通过________技术培养成单个胚性细胞，胚性细胞再分化形成的胚状体可发育成植株。
解析：(1)由图可知，①为构建重组DNA分子的过程，所以需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行处理。②过程中，应对代孕母牛进行同期发情处理，以便使早期胚胎着床。若在②过程中借助显微技术将早期胚胎采用胚胎分割技术，切割成几等份，再移植到代孕母牛子宫中发育，可培育出多头相同的转基因牛。(2)在培育抗虫棉过程中，将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，所以细菌M是农杆菌。愈伤组织是分化程度很低的细胞，易表达出细胞全能性，同时将含有愈伤组织培养物的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养技术培养成单个胚性细胞，继而发育成完整植株。
答案：(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 同期发情 胚胎分割 (2)农杆菌 全能性高 液体悬浮培养
3．(2020·嘉兴一中月考)利用基因工程技术将突变的IPA1基因转入水稻细胞中从而获得某水稻新品种。回答下列问题：
(1)培育该转基因水稻新品种的核心是构建________。该过程需要用到的工具酶有________________________________________________________________________。
在将重组DNA分子导入受体细胞过程中，常用氯化钙处理土壤农杆菌，以增加________的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
(2)在含目的基因的水稻细胞培育成植株的过程中可以将含有愈伤组织的培养物放在摇床上，通过__________培养分散成单细胞。其中培养过程正确的是________(A.配制只含有适当营养物质的培养基，倒在灭菌试管中凝固成半固体 B．从灭菌的根、茎或叶上切取一些小组织块，进行培养 C．这种单细胞具有细胞质丰富、液泡大、细胞核大的特征 D．水稻体细胞与这种单细胞的全能性表达程度大不相同)
(3)利用水稻细胞制备原生质体时，需在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液中进行处理，该溶液浓度与水稻细胞中的________浓度相当。
解析：(1)基因工程的核心步骤是构建重组DNA分子，该过程需要用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶；以土壤农杆菌为运载体，将重组DNA分子导入受体细胞时，常用氯化钙处理土壤农杆菌，以增加细胞壁的通透性，有利于使含有目的基因的重组质粒进入农杆菌细胞。(2)将含有愈伤组织的培养物放在摇床上，通过液体悬浮培养可将愈伤组织分散成单细胞。用来培养愈伤组织的培养基中应含有适当的营养物质和生长调节物质，A错误；外植体应从消毒的根、茎或叶上切取，B错误；愈伤组织细胞具有细胞质丰富、液泡小、细胞核大的特征，C错误；水稻体细胞属于高度分化细胞，全能性表达程度小于愈伤组织细胞，D正确。(3)为防止原生质体过度失水或吸水，在甘露醇溶液中制备原生质体时，甘露醇溶液的浓度应与细胞液浓度相当。
答案：(1)重组DNA分子 限制性核酸内切酶、DNA连接酶 细胞壁
(2)液体悬浮 D
(3)细胞液
4．科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。如图为培育转基因水稻过程示意图，请分析回答：
(1)基因工程的核心步骤是__________________，重组Ti质粒上的潮霉素抗性基因属于____________。
(2)下列关于DNA连接酶的理解正确的是________。
A．其化学本质是蛋白质
B．DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键
C．它不能被反复使用
D．在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶
(3)为筛选出含重组Ti质粒的愈伤组织，应在培养基2中添加适量的________，图中由开花后水稻未成熟的胚转变为愈伤组织的过程为________。
(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻____________________。
解析：(1)基因工程的核心步骤是构建重组运载体，据题可知铁结合蛋白基因为目的基因，潮霉素抗性基因属于标记基因，便于筛选。(2)限制酶和DNA连接酶的化学本质都是蛋白质，A正确；DNA连接酶恢复的是DNA分子中的磷酸二酯键，B错误；限制酶和DNA连接酶能被反复利用，C错误；DNA聚合酶的功能是将单个脱氧核苷酸聚合形成DNA链，而DNA连接酶连接DNA片段，因此在基因工程操作中不可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶，D错误。(3)质粒上的标记基因为潮霉素抗性基因，因此为筛选出含重组质粒的愈伤组织，应在培养基2中添加适量的潮霉素。水稻未成熟的胚转变为愈伤组织的过程为脱分化。(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻种子中的铁含量。
答案：(1)形成重组DNA分子(构建重组运载体或构建重组DNA分子) 标记基因
(2)A
(3)潮霉素 脱分化
(4)种子中的铁含量(写出铁含量即可)
5．科学家利用耐盐碱植物中的耐盐基因，培育出了耐盐水稻新品系。如图是培育过程简图。
回答下列问题：
(1)阶段Ⅰ的核心步骤是________________，重组质粒b构建好后不能直接导入水稻细胞，需用________处理农杆菌，农杆菌入侵水稻细胞后将耐盐基因插入到水稻细胞的染色体，从而使耐盐基因在水稻细胞中能稳定存在和________。
(2)阶段Ⅱ过程中水稻细胞通过________和再分化得到水稻幼苗，此过程需要保持________条件，达到防止杂菌污染的目的。
(3)本实验得到的水稻植株需进行________处理，判断转基因成功与否。耐盐水稻培育成功的原理是______________________________________。
解析：(1)阶段Ⅰ表示将目的基因导入水稻细胞中，其核心步骤是形成重组DNA分子。需用氯化钙处理农杆菌，使农杆菌细胞壁通透性增大，利于重组质粒导入农杆菌内。耐盐基因插入到水稻细胞的染色体，从而使耐盐基因在水稻细胞中能稳定存在和复制。(2)阶段Ⅱ过程中水稻细胞通过脱分化和再分化得到水稻幼苗，此过程需要保持无菌条件，达到防止杂菌污染的目的。(3)本实验得到的水稻植株需进行盐碱地种植来判断转基因成功与否。耐盐水稻培育成功的原理是基因重组(阶段Ⅰ)和植物细胞全能性(阶段Ⅱ)。
答案：(1)形成重组DNA分子 氯化钙 复制 (2)脱分化 无菌 (3)盐碱地种植 基因重组和植物细胞全能性
6．(2020·湖州模拟)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。请回答下列问题：
(1)由①到②通常先用合适的______________酶分别切割Ti质粒和含抗虫基因的DNA，然后借助____________酶连接以形成重组Ti质粒。若含抗虫基因的DNA序列已知，可用____________方法对其进行扩增。
(2)由④到⑤经过培养基中营养物质和____________的诱导，可发生类似受精卵发育成胚的过程，即从单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和________，最后再生出完整的植株。若⑤表现出________性状，则表明转基因成功。
(3)基因工程在多个领域具有广阔的应用前景，基因工程的应用不包括________(A.可以定向改变生物的性状 B．可以迅速使某种生物形成群落 C．可以生产人们需要的某些蛋白质 D．可以治疗人类的某些遗传病)。
解析：(1)构建重组DNA分子时，通常先用合适的限制性核酸内切酶分别切割载体DNA和含目的基因的DNA，然后用DNA连接酶连接以形成重组DNA分子。如果目的基因的序列是已知的，可以用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。(2)经过培养基中适当配比的营养物质和生长调节剂诱导，单个植物细胞可依次形成细胞团、球形胚、心形胚和胚状体，最后再生出完整的植株。若获得的转基因植株表现出抗虫性状，则表明转基因成功。(3)在农牧业上，可以利用基因工程技术让转入目的基因的生物获得某种优良性状，以达到定向改造生物的目的；在医药工业领域上，可以通过基因工程生产人们所需要的蛋白质；在医学上，可以通过基因治疗手段来治疗人类的遗传病。
答案：(1)限制性核酸内切 DNA连接 聚合酶链式反应(PCR) (2)生长调节剂 胚状体 抗虫 (3)B
7．(2020·浙江省名校考前押宝)金茶花是中国特有的观赏品种，但易得枯萎病，降低观赏价值。科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，用转基因技术培育出了抗枯萎病的新品种。据图回答：
(1)①和②结合能形成③，常用的酶有____________________________；其能结合形成③，最重要的原因是①和②经酶处理后具有____________________________________。
(2)经培养长成的植株⑦具备了抗病性，这说明__________________________。抗枯萎病金茶花的培育成功说明一种生物的基因表达系统能够识别来自另一种生物的DNA的________________。
(3)有人认为通过基因工程能培育出理想的抗虫植物，不仅能减轻农药造成的环境污染，而且又能降低生产成本。还有人认为抗虫植物一旦培育成功，其抗虫特性将会连续保持下去，可谓一劳永逸。对后一种观点，你是否赞成？请说明理由。
答案：(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 相同的粘性末端
(2)目的基因(抗病基因)已经表达 脱氧核苷酸序列(遗传信息或碱基序列)
(3)不赞成，因为害虫经突变和自然选择而产生对抗虫植物的适应性等；因抗虫植物发生变异，使后代失去抗药性等。赞成，因为抗虫植物的抗虫特性是由基因控制的，是能够遗传的(开放性题)。
8．(2020·浙江绿色评估联盟高三考试)将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种________________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________________以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是___________________________________
____________________。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是________。种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。
解析：(1)切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶，筛选细菌应使用选择培养基。(2)农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，Ti质粒上的TDNA片段能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。因为TDNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得TDNA片段的植物细胞。(3)植物组织培养过程中，可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量与细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输，促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。(4)在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状；抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。
答案：(1)限制性核酸内切 选择 (2)TDNA 筛选获得TDNA片段的植物细胞 (3)细胞分裂素浓度 芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化 (4)投放棉铃虫 农药
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