【生物】河南省光山县第二高级中学2025-2026学年高二下学期期中考试试卷（学生版+解析版）

这是一份【生物】河南省光山县第二高级中学2025-2026学年高二下学期期中考试试卷（学生版+解析版），共33页。试卷主要包含了本试卷分选择题和非选择题两部分，本卷命题范围等内容，欢迎下载使用。
考生注意：
1．本试卷分选择题和非选择题两部分。满分100分，考试时间75分钟。
2．答题前，考生务必用直径0.5毫米黑色墨水签字笔将密封线内项目填写清楚。
3．考生作答时，请将答案答在答题卡上。选择题每小题选出答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑；非选择题请用直径0.5毫米黑色墨水签字笔在答题卡上各题的答题区域内作答，超出答题区域书写的答案无效，在试题卷、草稿纸上作答无效。
4．本卷命题范围：人教版选择性必修3第1章～第3章第2节。
一、选择题：本题共20小题，每小题2分，共40分。每小题只有一个选项符合题目要求。
1. 下列有关微生物纯培养的叙述，错误的是（ ）
A. 需在酒精灯火焰附近进行平板划线接种
B. 接种后的平板应倒置培养，以避免杂菌污染
C. 稀释涂布平板法无法通过梯度稀释获得单菌落
D. 实验结束后废弃培养基需经严格灭菌处理后再丢弃
【答案】C
【详解】A、酒精灯火焰附近为无菌区域，平板划线接种在此处操作可避免空气中的杂菌污染培养基，A正确；
B、接种后的平板倒置培养，既可以防止皿盖的冷凝水滴落冲散菌落，也能减少杂菌沉降污染培养基，B正确；
C、稀释涂布平板法可通过梯度稀释将聚集的微生物分散为单个细胞，涂布后单个活细胞可在培养基表面增殖形成单菌落，因此该方法可以获得单菌落，C错误；
D、废弃培养基中仍含有存活的微生物，直接丢弃会造成环境污染，需经高压蒸汽灭菌等严格灭菌处理后才能丢弃，D正确。
2. 如图为传统发酵技术的部分制作装置示意图。下列叙述错误的是（ ）
A. 装置甲用于果酒发酵时，装置中的发酵液不能装满
B. 装置乙用于醋酸发酵时，需打开开关持续通入无菌空气
C. 装置丙用于泡菜发酵时，用水封坛的目的是为乳酸菌提供无氧环境
D. 装置甲与乙串联，可先通气在甲中制果醋，再密闭乙制果酒，以提升产物量
【答案】D
【详解】A、装置甲用于果酒发酵时，发酵液不能装满，因为要预留一定空间，一是为酵母菌初期有氧呼吸提供氧气，二是防止发酵液溢出，A正确；
B、醋酸菌是好氧菌，装置乙用于醋酸发酵时，需打开开关持续通入无菌空气，以满足醋酸菌有氧呼吸的需求，B正确；
C、乳酸菌是厌氧菌，装置丙用于泡菜发酵时，用水封坛的目的是为乳酸菌提供无氧环境，利于乳酸菌发酵，C正确；
D、装置甲与乙串联，应先密闭乙装置制果酒，因为酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，产生酒精；之后打开乙装置的开关，通入无菌空气，再在甲装置中制果醋，因为醋酸菌是好氧菌，需要有氧环境，而不是先通气在甲中制果醋，再密闭乙制果酒，D错误。
3. 为探究不同有机酸对泡菜品质的影响，科研人员以未添加有机酸的发酵液为对照组（CK），分别在陈泡菜水中添加适宜且相同浓度的乳酸、乙酸、柠檬酸制作泡菜，并在发酵0d和5d时测定泡菜的还原糖与亚硝酸盐含量，结果如图所示（泡菜发酵过程中，硝酸盐还原菌可将硝酸盐转化为亚硝酸盐）。下列叙述正确的是（ ）
A. 乳酸组发酵5d时还原糖几乎耗尽，说明此时乳酸菌种群数量已达到K值
B. 柠檬酸组发酵5d时亚硝酸盐含量低于乙酸组，推测柠檬酸对硝酸盐还原菌的抑制效果强于乙酸
C. 综合图示信息推测，乙酸组是提升泡菜发酵效率与食用安全性的最优处理组
D. 若继续延长发酵时间，各组还原糖将持续耗尽，亚硝酸盐含量则会持续升高
【答案】B
【详解】A、乳酸组5d时还原糖几乎耗尽，说明乳酸菌发酵的营养物质已经接近耗尽，此时乳酸菌因营养不足，种群数量会下降，不能说明乳酸菌种群数量达到K值，A错误；
B、题干明确说明亚硝酸盐是硝酸盐还原菌转化硝酸盐产生的，因此亚硝酸盐含量越低，说明对硝酸盐还原菌的抑制作用越强，由图2可知，5d时柠檬酸组亚硝酸盐含量低于乙酸组，可推测柠檬酸对硝酸盐还原菌的抑制效果强于乙酸，B正确；
C、发酵效率看还原糖的消耗速率，还原糖消耗越快，发酵效率越高。由图1可知，5d时乙酸组剩余还原糖远高于乳酸组、柠檬酸组，说明乙酸组发酵效率最低；且乙酸组亚硝酸盐含量高于柠檬酸组，安全性更低，因此乙酸组不是最优组，C错误；
D、泡菜发酵过程中，亚硝酸盐含量表现为先升高后降低，不会持续升高，延长发酵时间后，亚硝酸盐会逐渐被分解，含量下降，D错误。
4. 为治理因生活污水排放导致氨氮（）超标的湿地富营养化问题，科研团队拟筛选可高效完成两步硝化反应（→→）的硝化细菌净化水体。所用选择培养基配方为：NH4Cl、Na2CO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、琼脂、蒸馏水。下列叙述正确的是（ ）
A. 配制好培养基后需进行高压蒸汽灭菌，灭菌后应立即倒平板，以避免琼脂凝固
B. 培养基中的Na2CO3既可作为无机碳源，也可缓冲硝化反应导致的pH变化
C. 该培养基以NH4Cl作为唯一氮源，可筛选出依赖氨氮生长的硝化细菌
D. 若将该培养基中NH4Cl去除，仅通入氮气，则可同时筛选出硝化细菌和固氮菌
【答案】BC
【详解】A、高压蒸汽灭菌后的培养基需冷却至50℃左右再倒平板，若立即倒平板，培养基温度过高，不仅易烫伤操作者，还会导致平板冷凝后产生过多冷凝水，污染培养基，A错误；
B、硝化细菌为化能自养型微生物，可利用Na2CO3提供的无机碳合成有机物；硝化反应过程会产生硝酸、亚硝酸等酸性物质导致培养基pH下降，Na2CO3作为缓冲物质可中和酸性物质，维持pH相对稳定，B正确；
C、该培养基中NH4Cl是唯一氮源，只有能够利用氨氮作为氮源的微生物才能在该培养基上生长，因此可筛选出依赖氨氮生长的硝化细菌，C正确；
D、硝化细菌不能利用氮气作为氮源，去除NH4Cl仅通入氮气后，硝化细菌因缺乏可利用的氮源无法生长，该培养基仅能筛选出可利用氮气的固氮菌，D错误。
5. 为从腐败产生醋味的火龙果中筛选出优质醋酸菌，科研人员采用了如图所示流程（CaCO3可中和反应产生的酸）。下列叙述错误的是（ ）
A. 筛选中对富集培养物进行梯度稀释的目的是获得单菌落，便于后续检测和鉴定
B. 推测含革兰氏染色剂的鉴别培养基，可通过染色差异实现菌株的分类鉴定
C. 在含CaCO3的筛选培养基上，透明圈直径与菌落直径的比值越小，菌株产酸能力越强
D. 若某菌株对乙醇、高温及高浓度醋酸均具强耐受性，则其更适宜于工业发酵
【答案】C
【详解】A、梯度稀释的目的：通过逐步降低菌液浓度，使涂布到平板上的菌液中细菌分散，从而形成单菌落。 单菌落的作用：单菌落是由单个细胞繁殖而来的，可用于后续的纯化、检测和鉴定，A正确；
B、革兰氏染色的原理：根据细菌细胞壁结构的不同，革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）会呈现不同的颜色（紫色 / 红色）。 醋酸菌的分类：醋酸菌多为革兰氏阴性菌，通过革兰氏染色可以区分不同类型的菌株，实现分类鉴定，B正确；
C、醋酸菌产生的酸会溶解培养基中的 CaCO₃，从而在菌落周围形成透明圈。产酸能力越强，溶解的 CaCO₃越多，透明圈就越大。产酸能力强 → 透明圈大 → 透明圈直径 / 菌落直径的比值大，C错误；
D、工业发酵的特点：通常需要较高的乙醇浓度、较高的温度，且发酵后期醋酸浓度也会升高。 耐受性的意义：菌株对这些条件的耐受性越强，越能适应工业发酵的复杂环境，发酵效率和稳定性越高，D正确。
6. 科研人员从废水活性污泥中筛选可降解抗生素氧氟沙星（OFLX）的菌株过程如图所示。统计过程Ⅲ中三个平板中菌落数量分别为145个、163个、154个，据此推测图中a的细菌数量约为1.54×109个/mL。下列叙述错误的是（ ）
A. 用移液管稀释菌液时，吹吸三次的目的是使菌液与无菌水充分混匀
B. 过程Ⅱ中的总稀释倍数为106，推测实际活菌数比统计结果多
C. 过程Ⅲ中，可每隔24h统计一次菌落的数目，选菌落数目稳定时的记录作为结果
D. 若过程Ⅲ中平板菌落的形态、大小和颜色等一致，可初步判断为同一种OFLX降解菌株
【答案】D
【详解】A、稀释菌液时，反复吹吸是为了让菌液和稀释液（无菌水）充分混合，保证稀释均匀，避免局部浓度过高 / 过低，影响计数准确性，A正确；
B、已知三个培养基中长出的菌落数量分别是145、163、154，平均值为(145 + 163+154)/3 = 155，推测A中细菌的数量为1.54×109个/mL，根据公式C/V×M（C是平均菌落数，V是涂布平板时所用的稀释液的体积，M是稀释倍数），这里C = 154，V=0.1mL，1.54×109=154/0.1×M，解得M = 106，过程Ⅱ中的总稀释倍数为107，稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细菌连在一起时，平板上只形成一个菌落，因此统计的菌落数往往比实际活菌数少，即实际活菌数比统计结果多，B正确；
C、统计菌落数目时，不同细菌的生长周期不同，过早计数可能导致部分菌落未长出，计数偏低；而菌落数目稳定时，说明所有可培养的活菌都已形成菌落，此时的结果更准确。因此，通常每隔 24h 统计一次，选稳定时的记录作为结果，C正确；
D、实验最终筛选出的菌株不一定属于同一物种，只要能够降解OFLX就可能被筛选出来，D错误。
7. 与传统发酵技术相比，发酵工程的产品种类更加丰富，产量和品质均明显提高。下列叙述正确的是（ ）
A. 发酵工程生产的单细胞蛋白需经过提取、分离和纯化才能获得
B. 可通过诱变育种或基因工程改造酵母菌，以提高啤酒产量与风味
C. 啤酒生产中大部分糖的分解和代谢物的生成均在后发酵阶段完成
D. 利用发酵工程生产的根瘤菌肥作为微生物农药可以促进植物生长
【答案】B
【详解】A、单细胞蛋白是发酵获得的微生物菌体本身，仅需通过过滤、沉淀收集菌体即可，不需要提取、分离和纯化，只有发酵产品为微生物代谢产物时才需要提纯操作，A错误；
B、诱变育种可通过诱导基因突变获得酵母菌优良突变株，基因工程可定向改造酵母菌的性状，二者都能优化酵母菌的发酵性能，进而提高啤酒的产量与风味，B正确；
C、啤酒生产中大部分糖的分解和代谢物的生成是在主发酵阶段完成的，后发酵阶段主要是在低温下缓慢发酵，改善啤酒风味和澄清度，C错误；
D、根瘤菌肥属于微生物肥料，通过固氮作用为植物提供氮素营养促进生长，不属于微生物农药，微生物农药的功能是防治病虫害，D错误。
8. 草莓为二倍体。科研人员通过花药离体培养技术培育脱毒草莓植株，流程如下：取草莓花蕾，经蒸馏水冲洗后在4°C条件下预处理5天；随后用酒精、次氯酸钠溶液等进行消毒，获取花药作为外植体。将花药接种于适宜培养基诱导形成愈伤组织；愈伤组织经诱导生芽和生根，最终获得脱毒苗。已知该愈伤组织细胞易发生染色体自然加倍。下列叙述错误的是（ ）
A. 草莓花蕾用酒精和次氯酸钠溶液消毒后应立即用蒸馏水冲洗
B. 愈伤组织细胞分裂旺盛，若有丝分裂后期纺锤体形成受阻，染色体可能自然加倍
C. 若由花粉发育而来的愈伤组织染色体自然加倍，则加倍后的细胞发育得到的植株为二倍体
D. 选用花药作为外植体培育脱毒苗的原因可能是其细胞中病毒含量极低
【答案】A
【详解】A、酒精和次氯酸钠属于消毒剂，消毒后立即用无菌水冲洗可洗去外植体表面残留的消毒剂，避免消毒剂伤害植物细胞，A错误；
B、纺锤体形成于有丝分裂前期，若前期纺锤体形成受阻，后期着丝点分裂后产生的子染色体无法被牵引移向细胞两极，细胞不能完成胞质分裂，会导致染色体数目自然加倍，B正确；
C、植株由花粉（雄配子）发育而来，即使愈伤组织染色体发生加倍，是二倍体，C正确；
D、植物的花药细胞分裂旺盛，病毒难以侵染，病毒含量极低甚至不含病毒，因此可作为培育脱毒苗的外植体，D正确；
9. 科研人员以雄性不育温州蜜柑（二倍体）的愈伤组织和沙田柚（二倍体）叶肉细胞通过植物体细胞杂交培育出“华柚3号”。检测得出其核基因组与叶绿体基因组均来自沙田柚，线粒体基因组来自温州蜜柑，植株表现为二倍体雄性不育。下列分析错误的是（ ）
A. 诱导两种细胞融合前需用纤维素酶和果胶酶去除两者的细胞壁
B. 可依据核与细胞器基因组的来源差异筛选目标杂种细胞
C. 该技术可实现不同物种间细胞质性状的转移，为育种提供新途径
D. 可将“华柚3号”作为父本，与其他沙田柚品种杂交，培育雄性不育的沙田柚新品种
【答案】D
【详解】A、植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，诱导植物细胞融合前，需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体，才能进行原生质体融合，A正确；
B、目标杂种细胞的核基因组、叶绿体基因组来自沙田柚，线粒体基因组来自温州蜜柑，基因组来源存在明显差异，可通过检测不同基因组的来源筛选获得目标杂种细胞，B正确；
C、植物体细胞杂交可克服远缘杂交不亲和的障碍，该实例中实现了温州蜜柑的线粒体控制的雄性不育这一细胞质性状转移到沙田柚的核背景中，为作物育种提供了新途径，C正确；
D、“华柚3号”表现为雄性不育，无法产生可育的雄配子，不能作为父本进行杂交；且雄性不育由线粒体基因控制，属于细胞质遗传，表现为母系遗传，即使作为父本，其细胞质基因也无法传递给子代，D错误。
10. 直肠癌是全球高发恶性肿瘤之一。为探究直肠癌细胞通过微环境诱导肝星状细胞分化，进而促进肿瘤生长转移的机制。科研人员开展相关实验进行探究，已知实验细胞均为贴壁生长型，所用培养基中添加500μL青链霉素（抗生素组合）。下列叙述错误的是（ ）
A. 细胞培养时，贴壁细胞生长至相互接触时需用胰蛋白酶处理后分瓶培养
B. 培养基中的青链霉素可避免杂菌产生的毒素影响实验细胞生长
C. 实验中需定期更换培养液以便清除代谢废物，同时补充新鲜营养与青链霉素
D. 为排除青链霉素对肝星状细胞增殖的影响，需设置等量只用无菌水培养的肝星状细胞为对照组以排除干扰
【答案】D
【详解】A、动物细胞培养时，贴壁生长的细胞增殖到相互接触时会出现接触抑制现象，需用胰蛋白酶处理使细胞分散，再进行分瓶传代培养，A正确；
B、青链霉素属于抗生素，可抑制培养基中细菌等杂菌的生长，避免杂菌产生的毒素或杂菌竞争营养影响实验细胞的正常生长，B正确；
C、细胞培养过程中会消耗营养物质，同时积累的代谢废物会对细胞产生毒害，因此需要定期更换培养液，清除代谢废物，补充新鲜营养物质和青链霉素，C正确；
D、要排除青链霉素对肝星状细胞增殖的影响，实验的单一变量为是否添加青链霉素，对照组应设置为用不含青链霉素、其余成分与实验组完全相同的培养基培养的肝星状细胞，若用无菌水培养，细胞缺乏必要的营养物质无法正常存活，无法达到对照目的，D错误。
11. 科研人员利用化学重编程系统在短时间内将成体细胞转化为多能干细胞（hCiPS）。该系统对15个供体细胞系的诱导成功率达100%，主要机制是通过擦除体细胞的表观遗传记忆，显著降低重编程过程中的表观遗传屏障。下列叙述正确的是（ ）
A. 与成体细胞相比，hCiPS细胞的全能性恢复，细胞分化程度提高
B. 擦除体细胞表观遗传记忆过程的本质是改变体细胞DNA序列的过程
C. hCiPS与胚胎干细胞均可分化为成体所有组织和器官，且无致癌风险
D. 该技术可将患者自身体细胞重编程为hCiPS，理论上用它移植回病人体内治疗疾病可避免免疫排斥反应
【答案】D
【详解】A、细胞分化程度越高，全能性越低。hCiPS为多能干细胞，与成体细胞相比分化程度更低，全能性更高，且多能干细胞不具备发育为完整个体的全能性，并未实现全能性恢复，A错误；
B、表观遗传的本质是DNA序列不发生改变的前提下，基因表达发生可遗传变化，擦除体细胞表观遗传记忆不会改变体细胞DNA序列，B错误；
C、hCiPS与胚胎干细胞均为多能干细胞，可分化为成体所有组织和器官，但诱导分化过程中若出现增殖失控，存在致癌风险，C错误；
D、患者自身体细胞重编程得到的hCiPS，遗传物质与患者自身完全一致，细胞表面组织相容性抗原相同，移植回体内不会被免疫系统识别为异物，理论上可避免免疫排斥反应，D正确。
12. 犬类卵母细胞的细胞质脂肪含量高，呈黑色不透明状态，难以清晰观察到细胞核。2025年2月，青岛农业大学利用AI辅助去核技术成功克隆出马尔济斯幼犬，突破了犬类体细胞克隆的技术瓶颈。下列叙述正确的是（ ）
A. 体细胞核移植的成功，证明了动物体细胞仍具有发育成完整个体的能力
B. 克隆犬的核遗传物质与供核个体一致，其表型也与供体完全相同
C. 推测AI辅助去核技术能精准去除卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物
D. 获得的重构胚需要在胚胎移植后用Ca2+载体、乙醇等激活
【答案】C
【详解】A、体细胞核移植的成功证明的是动物体细胞的细胞核具有全能性，动物体细胞本身全能性受限制，不具备发育为完整个体的能力，A错误；
B、克隆犬的核遗传物质与供核个体一致，但细胞质遗传物质来自提供卵母细胞的个体，同时表型还会受环境因素影响，因此表型不会与供体完全相同，B错误；
C、犬类卵母细胞不透明难以观察细胞核，AI辅助去核技术的作用就是精准定位并去除处于减数第二次分裂中期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物（即核遗传物质所在结构），实现高效去核，C正确；
D、重构胚需要用Ca²⁺载体、乙醇等激活处理后，才能进行胚胎移植，激活操作在胚胎移植前完成，D错误。
13. 中国科学院团队利用细胞工程与基因编辑技术，成功培育出首例双母来源孤雌小鼠与双父来源孤雄小鼠，实现哺乳动物同性繁殖，流程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 经基因编辑的phESC与ahESC均属于成体干细胞
B. 据图分析可知，只依赖雄性小鼠即能得到孤雄小鼠
C. 图中甲、乙均处于早期胚胎的囊胚阶段，囊胚中的内细胞团将来发育成胎儿的各种组织
D. 不考虑致死，孤雌小鼠和孤雄小鼠的性染色体组成分别为XX、XY
【答案】C
【详解】A、胚胎干细胞（ESC）是由早期胚胎（囊胚内细胞团）或原始性腺中分离出来的，属于胚胎干细胞，而不是成体干细胞。成体干细胞是指存在于成体组织中的干细胞（如造血干细胞）。因此，phESC 和 ahESC 本质是胚胎干细胞，A错误；
B、图 2 中，培育孤雄小鼠的过程需要去核的卵细胞作为核移植的受体细胞，卵细胞来自雌性小鼠，因此不能 “只依赖雄性小鼠” 得到孤雄小鼠，B错误；
C、图中甲、乙均为早期胚胎，处于囊胚阶段。囊胚分为滋养层和内细胞团： 内细胞团将来发育成胎儿的各种组织； 滋养层将来发育为胎膜和胎盘，C正确；
D、孤雌小鼠（双母源）：其遗传物质均来自雌性小鼠的卵细胞，卵细胞的性染色体为 X，因此孤雌小鼠的性染色体组成为XX。 孤雄小鼠（双父源）：其遗传物质均来自雄性小鼠的精子，精子的性染色体为 X 或 Y，孤雄小鼠的性染色体组成分别为XX、XY或YY，D错误。
14. 杜泊羊具有生长速度快、肉质好等优点。研究人员欲利用胚胎工程快速繁殖杜泊羊，流程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 为加快体外受精进程，将获取的精子直接用于受精
B. 胚胎移植前需对代孕的普通绵羊进行同期发情处理
C. 胚胎移植时，需将早期胚胎移植到代孕母羊的卵巢中继续发育
D. 对早期胚胎进行分割时，应选择原肠胚期的胚胎进行均等分割
【答案】B
【详解】A、在进行体外受精时，获取的精子需要经过获能处理后才能用于受精，不能直接用于受精，A错误；
B、胚胎移植前需对代孕的普通绵羊进行同期发情处理，使供、受体处于相同的生理状态，B正确；
C、胚胎移植时，需将早期胚胎移植到代孕母羊的子宫中继续发育，而不是卵巢中，C错误；
D、对早期胚胎进行分割时，应选择桑葚胚或囊胚期的胚胎进行均等分割，而不是原肠胚期，D错误。
15. 甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，但繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率。下列叙述正确的是（ ）
A. 用适当的酶处理藏羊胚胎的滋养层，可获得大量胚胎干细胞
B. 同期发情和超数排卵的处理目的以及处理对象均存在差异
C. 胚胎体外培养过程中需要利用相关技术去除早期胚胎外的透明带
D. 利用动物胚胎分割技术得到的个体基因型相同，表型也完全相同
【答案】B
【详解】A、胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，滋养层细胞将来分化为胎膜和胎盘，无法从中获得胚胎干细胞，A错误；
B、同期发情的目的是使供体、受体生殖器官的生理状态一致，为胚胎移入提供相同的生理环境，处理对象为供体和受体母羊；超数排卵的目的是让供体母羊排出更多卵子，处理对象仅为供体母羊，二者处理目的和对象均存在差异，B正确；
C、透明带对早期胚胎有保护作用，胚胎体外培养过程中无需人为去除，囊胚阶段胚胎会自行发生透明带破裂完成孵化，C错误；
D、胚胎分割得到的个体来自同一个受精卵，基因型相同，但表型由基因型和环境共同决定，受环境因素影响，表型不一定完全相同，D错误。
16. 下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A. 质粒是原核细胞中只能在细胞质中进行自我复制的小型环状DNA分子
B. 在培育转基因抗虫棉时，可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞
C. 目的基因和质粒需用同一种限制酶切割，说明限制酶没有专一性
D. 基因工程的操作水平属于个体水平，其原理为基因重组
【答案】B
【详解】A、质粒不仅存在于原核细胞的细胞质中，部分真核生物（如酵母菌）也含有质粒，且质粒可在导入的宿主细胞（包括真核细胞）内复制，并非只能在原核细胞质中复制，A错误；
B、花粉管通道法是将目的基因导入植物受体细胞的常用方法之一，培育转基因抗虫棉时可采用该方法，B正确；
C、限制酶具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA，用同一种限制酶切割目的基因和质粒是为了获得相同的黏性末端便于连接，体现了限制酶的专一性，C错误；
D、基因工程的操作水平是分子水平，其原理为基因重组，D错误。
17. 如图为某质粒结构及四种限制酶切割位点示意图。某同学欲利用相关工具将目的基因（两端含有相应限制酶识别位点）与该质粒连接构建基因表达载体。下列叙述正确的是（ ）
A. 酶1、酶2、酶4切割产生的黏性末端只能用T4DNA连接酶连接
B. DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成氢键
C. 可用酶1和酶2切割质粒和目的基因，再用E.cliDNA连接酶连接
D. 用酶2和酶3切割质粒和目的基因后，可用E.cliDNA连接酶连接，但构建效率可能较低
【答案】D
【详解】A、E.cli DNA连接酶能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。酶1、2、4切割产生的都是黏性末端，因此两种连接酶都可以连接，并非只能用T4DNA 连接酶，A错误；
B、DNA 连接酶的作用是催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键，而氢键是碱基互补配对后自动形成的，不需要酶催化，B错误；
C、质粒上有两个酶1的切割位点，若同时用酶1和酶2切割质粒，会将质粒切成两段，破坏启动子或终止子，无法构建完整的表达载体；且酶1和酶2切割产生的黏性末端不同，虽能连接，但质粒被双酶切破坏，因此该方案不可行，C错误；
D、酶2和酶3切割质粒，只会在启动子和终止子之间切开，不会破坏标记基因和调控序列，质粒仍保持环状结构的完整性。使用酶2和酶3切割质粒和目的基因时，酶2 得到的是黏性末端，酶3得到的是平末端，黏性末端可用E. cli DNA连接酶连接，平末端需T4 DNA连接酶才能连接。若仅使用E. cli DNA连接酶，则平末端无法连接，导致部分分子未闭合，重组效率降低，D正确。
18. DNA的粗提取和鉴定实验用到了多种试剂，若以鸡血为实验材料，下列试剂与其作用或处理方式对应错误的是（ ）
A. 蒸馏水——向鸡血中加入蒸馏水，可使细胞吸水涨破，释放核内DNA
B. 2ml/L的NaCl溶液——溶解DNA，便于后续DNA的鉴定
C. 二苯胺试剂——在沸水浴条件下与DNA反应呈紫色，可用于鉴定DNA
D. 体积分数为95%的冷酒精——析出DNA，可去除溶于酒精的杂质
【答案】C
【详解】A、鸡血细胞没有细胞壁，向鸡血中加入蒸馏水后，细胞会渗透吸水涨破，可释放出核内的DNA，A正确；
B、DNA在2ml/L的NaCl溶液中溶解度较高，用该溶液溶解DNA可去除不溶于高浓度盐溶液的杂质，便于后续DNA的提纯与鉴定，B正确；
C、二苯胺试剂在沸水浴条件下与DNA反应呈蓝色，C错误；
D、DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精，而部分蛋白质等杂质可溶于酒精，因此加入冷酒精可以析出DNA，同时去除溶于酒精的杂质，D正确。
19. 如图是某兴趣小组将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果。下列叙述正确的是（ ）
A. 电泳过程中，DNA分子由b端向a端移动
B. 可推断1号和2号扩增的目的基因碱基序列相同
C. 若两个PCR产物分子大小接近，缩短电泳时间可提高条带的清晰度
D. PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后，再用微量移液器将其缓慢注入加样孔
【答案】D
【详解】A、DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，DNA分子越小，电泳速度越快，所以DNA分子应该由a端向b端移动，A错误；
B、电泳只能反映 DNA 片段的大小（碱基对数目），不能反映碱基序列。 1 号和 2 号条带位置相同，只能说明它们的分子量（bp 数）相同，但碱基序列不一定相同，B错误；
C、两个片段大小接近时，迁移速率差异很小，需要足够的电泳时间才能拉开距离，形成清晰的条带。 缩短电泳时间会导致两者无法分离，条带会重叠在一起，清晰度反而降低，C错误；
D、载样缓冲液的作用有两个： 增加样品密度，让样品沉入加样孔，不会飘出； 含有指示剂（如溴酚蓝），可以指示电泳进程。 操作时，必须先将 PCR 产物和载样缓冲液混匀，再用微量移液器缓慢注入加样孔，避免样品飘出或戳破凝胶，D正确。
20. 番茄在较低温运输或储存时会被冻坏。科学家利用基因工程技术将抗冻基因AFPs插入表达载体（Ti质粒）后，通过农杆菌转化法导入番茄幼苗。下列叙述错误的是（ ）
A. 用PCR扩增基因AFPs时添加的两种引物的碱基间不能互补配对
B. 构建重组Ti质粒时，需要将基因AFPs插入Ti质粒的T-DNA区域
C. 当农杆菌感染番茄细胞时，T-DNA会转移并整合到其染色体DNA上
D. 可通过抗原—抗体杂交技术检测农杆菌细胞中是否表达出抗冻蛋白
【答案】D
【详解】A、PCR扩增目的基因时，若两种引物的碱基互补配对，会导致引物之间结合形成引物二聚体，无法与模板DNA结合完成扩增，因此两种引物碱基间不能互补配对，A正确；
B、Ti质粒的T-DNA（可转移DNA）具备转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上的特性，因此构建重组Ti质粒时，必须将目的基因AFPs插入T-DNA区域，B正确；
C、农杆菌感染植物细胞时，Ti质粒上的T-DNA会转移到受体植物细胞内，并且整合到受体细胞的染色体DNA上，这是农杆菌转化法的核心原理，C正确；
D、本实验的目的是让抗冻基因在番茄细胞内表达，应通过抗原—抗体杂交技术检测番茄细胞中是否表达出抗冻蛋白，检测农杆菌细胞内是否表达抗冻蛋白无意义，D错误。
二、非选择题：本题共5小题，共60分。
21. 野生型大肠杆菌（E.cli）可通过图1途径合成色氨酸，在不含色氨酸的基本培养基上正常生长繁殖，其突变株因某步代谢途径受阻，无法合成色氨酸，需在添加色氨酸的完全培养基上才能生长。科研人员利用影印平板培养法（影印平板培养法是一种通过盖印章的方式，达到在一系列平板的相同位置上出现相同菌落的接种方法。如图3）筛选获得TrpB、TrpC、TrpE三种色氨酸合成缺陷型突变株，并通过互补生长实验（图2）定位其代谢受阻步骤。回答下列问题：
（1）图1中色氨酸的合成依赖三步连续酶促反应。若某突变株仅步骤①受阻，则在基本培养基中添加______（写1种，不能写色氨酸）这一物质后该突变株可恢复生长。
（2）图3中，用亚硝基胍处理E.cli的目的是______；该处理需在完全培养基中进行，为保证E.cli生长需将该培养基pH调至______。
（3）若原平板上某菌落在影印平板上无法生长，则要进一步纯化该突变株，需从______（填“原平板”或“影印平板”）上挑取对应位置的菌落，接种到______（填“基本”或“完全”）培养基中培养。
（4）将筛选获得的TrpB、TrpC、TrpE三种突变株分别划线接种于图2培养基的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区域，结果发现：
a．短时间内三个区域均有少量细菌生长增殖，结合突变株接种前的培养环境分析，其原因可能是________________________________________________________________________。
b．继续培养后发现Ⅰ区域两端和Ⅱ区域一端的菌株可继续生长，Ⅲ区域菌株不再生长，说明TrpB、TrpC、TrpE三种突变菌株分别对应图1中的______（填图1箭头上对应的数字）过程受阻；Ⅱ区域接近______（填“Ⅰ”或“Ⅲ”）一端的菌株能继续生长增殖，作出此判断的理由是________________________。
【答案】（1）邻氨基苯甲酸##吲哚
（2）①. 诱导大肠杆菌发生基因突变，获得色氨酸合成缺陷型突变株 ②. 中性或微碱性（约 7.0~7.5）
（3）①. 原平板 ②. 完全
（4）①. 突变株接种前在完全培养基中生长，菌体内部储存了一定量的色氨酸或其中间产物，短时间内可利用这些储存物质维持生长繁殖 ②. ②、①、③ ③. Ⅲ ④. Ⅱ区域的菌株缺陷发生在步骤②，需要吲哚才能合成色氨酸；而Ⅲ区域的菌株缺陷发生在步骤③，能合成并释放吲哚，为Ⅱ区域接近 Ⅲ 一端的菌株提供吲哚，使其可继续生长增殖
【解析】（1）步骤①受阻，说明突变株无法将分支酸转化为邻氨基苯甲酸，因此在基本培养基中添加邻氨基苯甲酸或吲哚，即可绕过受阻步骤，恢复生长。
（2）亚硝基胍是一种化学诱变剂，处理大肠杆菌的目的是诱导大肠杆菌发生基因突变，获得色氨酸合成缺陷型突变株。大肠杆菌生长的适宜pH为中性或微碱性（约 7.0~7.5），因此完全培养基的pH需调至中性或微碱性。
（3）若原平板上某菌落在影印平板上无法生长，说明该菌落是缺陷型菌株，要进一步纯化筛选该突变株，需从原平板上挑取对应位置的菌落，因为原平板上有该菌株的正常菌落。然后接种到完全培养基中培养，完全培养基能满足缺陷型菌株生长需求。
（4）a．突变株接种前在完全培养基中生长，菌体内部储存了一定量的色氨酸或其中间产物，短时间内可利用这些储存物质维持生长繁殖，因此三个区域均有少量生长。
b．Ⅲ 区域菌株不再生长，说明其缺陷发生在步骤③（色氨酸合成的最后一步，无法被其他菌株互补）； Ⅰ 区域两端菌株可继续生长，说明其缺陷发生在步骤①； Ⅱ 区域一端菌株可继续生长，说明其缺陷发生在步骤②。因此，TrpB、TrpC、TrpE 三种突变株分别对应②、①、③。Ⅱ区域接近Ⅲ一端的菌株能继续生长，判断理由是Ⅱ区域的菌株缺陷发生在步骤②，需要吲哚才能合成色氨酸；而 Ⅲ 区域的菌株缺陷发生在步骤③，能合成并释放吲哚，为 Ⅱ 区域接近 Ⅲ 一端的菌株提供吲哚，使其可继续生长增殖。
22. IVF杂交系统是一类高效的植物远缘杂交技术，其核心是在体外环境下对植物的雌雄配子（精子和卵细胞）进行精准操作与融合。该技术在克服种间生殖障碍、培育新型杂交植株以及拓宽植物可利用遗传资源等方面展现出重要的科学意义与应用前景。如图展示了小麦与水稻的IVF杂交具体流程。回答下列问题：
（1）配子融合过程与植物体细胞杂交中原生质体融合的原理______（填“相同”或“不同”），该过程可用______（写1种物理方法和1种化学方法）促进配子融合；与植物体细胞杂交的原生质体融合相比，IVF配子融合的特异性更强，原因是______________________________。
（2）配子融合之前需要将处理好的细胞放在______（填“低渗”“等渗”或“高渗”）溶液中培养。配子融合形成的合子需进行体外培养，培养体系中除需添加无机盐、蔗糖等营养物质外，还需加入启动细胞分裂、脱分化的关键激素______，才能诱导愈伤组织形成，其中蔗糖的作用是__________________（写2点）。
（3）植株再生过程中再分化阶段一般______（填“需要”或“不需要”）光照，原因是______；再分化的实质是______，若在该阶段发现，愈伤组织只分裂而不能分化出芽和根，则从培养基成分分析，最可能的原因是______________________________。
（4）图中再生植株的质基因来源是__________________。
【答案】（1）①. 相同 ②. 电融合法、聚乙二醇（PEG）融合法 ③. 配子之间存在特异性识别（或配子表面有特异性蛋白，能进行特异性结合）
（2）①. 等渗 ②. 生长素和细胞分裂素 ③. 提供碳源和调节渗透压
（3）①. 需要 ②. 叶绿素的形成需要光 ③. 基因的选择性表达 ④. 生长素与细胞分裂素的比例不合适（或生长素用量与细胞分裂素用量的比值偏高）
（4）小麦卵细胞的细胞质和水稻卵细胞的细胞质
【解析】（1）配子融合过程与植物体细胞杂交中原生质体融合的原理相同，均为细胞膜的流动性。 促进配子融合的物理方法有电融合法，化学方法有聚乙二醇（PEG）融合法。与植物体细胞杂交的原生质体融合相比，IVF配子融合特异性更强，原因是配子之间存在特异性识别（或配子表面有特异性蛋白，能进行特异性结合）。
（2）配子融合之前需要将处理好的细胞放在等渗溶液中培养，以维持细胞正常形态。配子融合形成的合子需进行体外培养，培养体系中除添加无机营养、蔗糖等营养物质外，还需加入启动细胞分裂、脱分化的关键激素生长素和细胞分裂素，才能诱导愈伤组织形成。其中蔗糖的作用是提供碳源和调节渗透压。
（3）植株再生过程中再分化阶段一般需要光照，原因是叶绿素的形成需要光。再分化的实质是基因的选择性表达。若在该阶段发现愈伤组织只分裂而不能分化出芽和根，从培养基成分分析，最可能的原因是生长素与细胞分裂素的比例不合适（或生长素用量与细胞分裂素用量的比值偏高）。
（4）由图示可知，图中再生植株的质基因来源是小麦卵细胞的细胞质和水稻卵细胞的细胞质。
23. 卡妥索单抗作为一种双特异性单克隆抗体，可用于治疗胃癌、卵巢癌引发的恶性腹水。它能同时结合肿瘤细胞表面的EpCAM抗原与T细胞表面的CD3受体，CD3受体在肿瘤细胞与T细胞结合部位聚集可有效激活T细胞，从而激活免疫系统杀伤肿瘤细胞，最终减少腹水生成。卡妥索单抗的制备流程如图1所示，其作用结构如图2所示，回答下列问题：
（1）制备原卡妥索单抗前，需向小鼠分别注射抗原a（EpCAM）和抗原b（CD3），目的是诱导小鼠体内产生____________的B淋巴细胞。
（2）筛选一需分别获得杂交瘤细胞a和杂交瘤细胞b，该过程可利用HAT选择培养基（只有杂交瘤细胞才可存活并增殖）进行筛选，获取杂交瘤细胞a（或b）后，需在培养基中培养一段时间，目的是____________；筛选二____________（填“可以”或“不可以”）再利用HAT选择培养基，原因是__________________，筛选出的杂交瘤细胞ab需进行__________________，最后从__________________中获取所需的抗体。
（3）卡妥索单抗治疗癌症的效果往往优于单克隆抗体EpCAM，原因是_____________；若卡妥索单抗的H链或L链发生突变，可能导致_____________。
（4）与化疗相比，结合卡妥索单抗的作用机理分析，卡妥索单抗疗法的优势是_____________。研究发现，利用卡妥索单抗对无胸腺患肿瘤的小鼠进行治疗，效果很差，可能的原因是_____________。
【答案】（1）能特异性识别EpCAM（能分泌抗体a）的B淋巴细胞和能特异性识别CD3（能分泌抗体b）
（2）①. 扩大培养，增加杂交瘤细胞的数量 ②. 不可以 ③. HAT选择培养基只能筛选淘汰骨髓瘤细胞和B淋巴细 胞，而对杂交瘤细胞无筛选作用，也无法分辨是否为已融合的双杂交瘤细胞（或两种杂交瘤细胞无论是否融合，均可在 HAT选择培养基中存活，达不到筛选的目的)（合理即可，2分）④. 克隆化培养和抗体检测 ⑤. 杂交瘤细胞ab的培养液中或小鼠腹水
（3）①. 卡妥索单抗使T细胞更精准接触到肿瘤细胞（或卡妥索单抗结构可同时结合两个靶点，拉近免疫细胞与肿瘤细胞的距离，合理即可）（1分）②. 抗体无法结合抗原或结合亲和力下降（合理即可）（1分）
（4）①. 靶向性（特异性）强，对正常细胞损伤小，从而副作用低（合理即可）（1分）②. 胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所， 无胸腺的小鼠无成熟T细胞，导致其细胞免疫和体液免疫能力均较低，卡妥索单抗无法通过激活T细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用
【解析】（1）制备原卡妥索单抗前，向小鼠注射抗原a和抗原b，目的是诱导小鼠体内产生能特异性识别EpCAM（能分泌抗体a）的B淋巴细胞和能特异性识别CD3（能分泌抗体b）的B淋巴细胞。
（2）获取杂交瘤细胞a（或b）后，在培养基中培养一段时间的目的是：杂交瘤细胞刚筛选出来时数量较少，需要在适宜的培养基中继续培养，使其充分增殖，形成足够数量的细胞群体，为后续的抗体检测、克隆化及大规模培养奠定基础。筛选二不可以再利用HAT选择培养基。原因是：HAT选择培养基的作用是筛选杂交瘤细胞，而杂交瘤细胞a和杂交瘤细胞b已经是杂交瘤细胞，融合后得到的未融合的亲本杂交瘤细胞、同种融合的杂交瘤细胞也能在HAT培养基上存活，无法筛选出同时具备两种抗体分泌能力的杂交瘤细胞ab。筛选出的杂交瘤细胞ab需进行克隆化培养和抗体检测，最后从体外培养的细胞培养液中获取所需的抗体。
（3）卡妥索单抗可同时结合肿瘤细胞表面的EpCAM抗原和T细胞表面的CD3受体，拉近免疫细胞与肿瘤细胞的距离，激活T细胞，从而激活免疫系统杀伤肿瘤细胞，而单克隆抗体EpCAM仅能结合肿瘤细胞，无法直接激活T细胞发挥免疫杀伤作用，因此卡妥索单抗的抗癌效果更强。卡妥索单抗的空间结构改变，导致其无法与EpCAM或CD3结合，失去治疗效果
（4）化疗会无差别杀伤正常细胞和肿瘤细胞，副作用大；卡妥索单抗可特异性结合肿瘤细胞，同时激活T细胞精准杀伤肿瘤细胞，对正常细胞损伤小，副作用小，且能激活自身免疫，抗癌效果更持久。胸腺是T细胞成熟的场所，无胸腺小鼠无法产生成熟的T细胞，卡妥索单抗无法通过激活T细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用，因此治疗效果差。
24. 实时荧光定量PCR（qPCR）可用于基因拷贝数分析、基因表达量分析等。它利用Taqman探针实现荧光实时监测：完整探针上的荧光报告基团R的荧光会被淬灭基团Q抑制，无荧光；PCR扩增时，TaqDNA聚合酶水解与目的基因结合的探针，使R与Q分离，R发出可检测的荧光。随着PCR循环次数增加，目的基因拷贝数增多，被水解的探针变多，荧光强度上升。如图为Taqman探针qPCR的原理示意图。回答下列问题：
（1）做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列设计____________。qPCR过程中除加入这些物质外，还需加入TaqDNA聚合酶、含Mg2+的缓冲液、_________（写1种）等，其中PCR缓冲液中加入Mg2+的目的是____________。
（2）扩增目的基因时，PCR反应中常使用TaqDNA聚合酶而不使用普通的DNA聚合酶，主要原因为_________。图中的Taq DNA聚合酶除具有DNA聚合酶活性外，还具有______（填“5′”或“3′”）核酸外切酶活性。
（3）结合题意与图示判断，若最初该反应体系中只有一个DNA分子，经n次循环后，则共需要消耗______个Taqman探针；实验中检测到的荧光强度与qPCR反应体系中DNA分子数呈______（填“正相关”或“反相关”）。
（4）已知与普通PCR相比，qPCR将延伸的温度降低为60℃，据图推测最可能的原因是___________________________，从而防止检测到的荧光强度偏低。
（5）若要利用qPCR检测目的基因的表达情况，需先提取出mRNA，将其转变为cDNA，故qPCR反应体系中还需添加的酶有____________。
【答案】（1）①. 引物和Taqman探针 ②. 四种脱氧核苷酸(或模板DNA ③. 激活TaqDNA聚合酶的活性
（2）①. TaqDNA聚合酶热稳定性高，普通DNA聚合酶会在PCR的高温变性步骤中失活 ②. 5′
（3）①. 2n−1 ②. 正相关
（4）较低温度有利于Taqman探针与目的基因模板链稳定结合，保证更多探针被水解
（5）逆转录酶#反转录酶
【解析】（1）PCR扩增前需要根据目的基因序列设计特异性引物，本实验的qPCR还需要特异性结合目的基因的Taqman探针，因此需要先根据目的基因的核苷酸序列设计引物和Taqman探针。PCR反应体系除上述物质外，还需要脱氧核苷酸作为DNA合成原料以及模板DNA；Mg²+的作用是激活TaqDNA聚合酶，维持酶的活性。
（2）PCR需要多次高温变性使DNA解旋，普通DNA聚合酶高温会失活，而TaqDNA聚合酶热稳定性高，适合PCR过程。Taq DNA聚合酶从5'向3'方向延伸子链时，水解结合在模板上的探针，说明它具有5'核酸外切酶活性。
（3）初始1个双链DNA，n次循环后得到2n个双链DNA，每合成1个DNA分子，就会水解消耗1个探针，因此总消耗2n−1个探针。根据题意，目的DNA拷贝数越多，被水解的探针越多，荧光强度越高，因此荧光强度与DNA分子数呈正相关。
（4）探针需要与模板稳定杂交才能被Taq酶水解，温度过高会导致探针无法结合模板，降低延伸温度可以促进探针与模板的特异性结合，增加被水解的探针数量，避免荧光强度偏低。
（5）以mRNA为模板合成cDNA是逆转录过程，需要逆转录酶催化，因此体系需要额外添加逆转录酶。
25. 羊痘是由羊痘病毒（GPV，一类双链DNA病毒）诱发的绵羊急性烈性传染病。该病毒的P32基因所编码的P32蛋白在病毒侵染宿主细胞、触发机体免疫应答过程中承担关键功能。将P32基因导入大肠杆菌中表达P32蛋白，为制备疫苗提供基础。图1为P32基因扩增示意图，图2为质粒上的酶切位点分布。回答下列问题：
（1）扩增P32基因应选择图1中的引物_________。若扩增P32基因时引物选择正确，PCR操作步骤正确，但对产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因：_____________________（写1点）。
（2）根据图2分析，构建正确重组质粒时，应选择限制酶______进行双酶切，选择双酶切的优点是____________。不选择质粒上其他两种限制酶的原因分别是____________。
（3）将重组质粒导入大肠杆菌前，一般需先用_________处理大肠杆菌，使其处于______的生理状态。
（4）将大肠杆菌培养在添加______的培养基上，可初步筛选得到转入重组质粒和普通质粒的大肠杆菌。为进一步验证P32基因与质粒成功连接且插入方向无误，进行PCR鉴定时应选用的引物为______。
（5）若将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养重组菌，诱导P32蛋白合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无P32蛋白，原因可能是__________________（写2点）。
【答案】（1）①. 引物2和引物3 ②. 复性温度过低，引物与模板的非特异性位点结合（或引物浓度过高引发非特异性扩增）
（2）①. MunⅠ和XmaⅠ ②. 防止质粒和目的基因自身环化，避免目的基因反向连接 ③. EcRⅠ的酶切位点位于启动子上，切割会破坏启动子；NheⅠ的酶切位点位于卡那霉素抗性基因（标记基因）上，切割会破坏标记基因
（3）①. CaCl2​（氯化钙）②. 感受态（能吸收周围DNA分子的状态）
（4）①. 卡那霉素 ②. 引物2和引物5
（5）P32蛋白形成包涵体留在大肠杆菌细胞内，离心后位于沉淀中；P32蛋白被大肠杆菌内的蛋白酶降解（或P32基因未成功表达，合理即可）
【解析】（1）DNA子链延伸方向为5′→3′，引物需要结合在目的基因两条模板链的3′端，图中P端为5'端，OH端为3'端，因此只有引物2和引物3能扩增出完整的P32基因。PCR出现非特异性条带，通常是因为复性温度低导致引物和模板非特异性位点结合（或引物浓度过高引发非特异性扩增）。
（2）根据图2，EcRⅠ的酶切位点在启动子内部，切割会破坏启动子；NheⅠ的酶切位点在卡那霉素抗性基因（标记基因）内部，切割会破坏标记基因，无法进行后续筛选；只有MunⅠ和XmaⅠ的酶切位点都位于启动子和终止子之间，且不破坏启动子和标记基因。双酶切产生不同的粘性末端，可以避免质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反向连接，实现定向插入。
（3）将重组质粒导入大肠杆菌前，需要用氯化钙处理大肠杆菌，使其处于能吸收周围DNA分子的感受态。
（4）质粒的标记基因是卡那霉素抗性基因，因此培养基中添加卡那霉素，可初步筛选出含有质粒（普通质粒/重组质粒）的大肠杆菌。验证插入方向时，若插入方向正确，质粒上的引物5和目的基因上的引物2可扩增出目的基因片段，插入方向错误则无法扩增，因此选择引物2和引物5。
（5）P32蛋白如果是胞内蛋白，会留在大肠杆菌细胞内，离心后菌体（蛋白）位于沉淀中；也可能是P32基因未成功表达，或表达后被大肠杆菌的蛋白酶降解，因此上清液中检测不到。