十年(2016-2025)高考生物真题分类汇编(全国通用)专题23基因工程(学生版+解析)

这是一份十年(2016-2025)高考生物真题分类汇编(全国通用)专题23基因工程(学生版+解析)，共12页。试卷主要包含了种子休眠是抵御穗发芽的一种机制，的菌种用于生产卡拉胶寡糖等内容，欢迎下载使用。

考点1基因工程的工具及其操作步骤
1．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xh Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2) 外源DNA 1 目的基因N大小为2.3kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xh Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xh Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xh Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有外源DNA污染。
（3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。
（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
2．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：

(1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。
A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2 B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头
(2)C
(3) 预冷的体积分数为95%的酒精 C 调控
(4) 基因数据库/序列数据库 表达载体
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。
（2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A不符合题意；
B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B不符合题意；
C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C符合题意；
D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D不符合题意。
故选C。
（3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1与P2的序列从左向右为3’→5’，与图中上边的DNA链部分序互补配对，引物P3与P4的序列从左向右为5’→3’，与图中下边的DNA链部分序互补配对。 以环形DNA为模板进行第二次PCR时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P1和P4，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。
（4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
3．（2025·河北·高考真题）T-DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。回答下列问题：
(1)基因内碱基的增添、缺失或 都可导致基因突变。
(2)以Aa植株为 （填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为 。
(3)为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，该植株会产生 种基因型的可育花粉，其中具有a基因的花粉占比为 。该植株自交得到F1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为 。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为 。
(4)实验中还获得了一个E基因被T-DNA插入突变为e基因的植株，e基因纯合的种子不能正常发育而退化。为分析基因E/e和A/a在染色体上的位置关系，进行下列实验：
①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出基因型为 的F1植株。
②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为0，E/e和A/a在染色体上的位置关系及染色体交换情况为 ；若两对基因位于非同源染色体，该类植株的占比为 。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因： 。
【答案】(1)替换
(2) 父本 1/2
(3) 3 1/3 2/3 a花粉不育，无法形成纯合aa植株
(4) AaEe E/e和A/a连锁且无交换，F₂中无同时含A和E的配子 1/6 若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6
【分析】自由组合定律的实质：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。
【详解】（1）基因突变是指DNA分子上碱基对增添、缺失或替换引起基因结构的改变。基因内碱基的增添、缺失或替换都可导致基因突变。
（2）据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T-DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失（a基因）会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0；若Aa植株作为母本，其卵细胞可育（含a基因），而野生型父本花粉（含A基因）可育，F1基因型为Aa（抗性）和AA（非抗性），比例为1：1，因此卡那霉素抗性植株占比为1/2。
（3）为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为Aa（2号染色体为Aa，3号染色体为A0）。该植株会产生4种基因型的花粉，即AA、A0、Aa、a0，其中a不育，即产生3种可育基因型的花粉，而具有a基因的花粉占比为1/3。该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0，均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型为AAAA：AAA0：AA00：AAAa：AAa0：AAaa：Aa00：Aa00=1∶2∶1∶2∶3∶1∶1∶1。利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR扩增出900bp（A）和600bp（a）条带。Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900bp条带。其中Ⅰ型植株占比为（2+3+1+1+1）/（1+2+1+2+3+1+1+1）=2/3。F1中没有检测到仅扩增出600bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株。
（4）①利用基因型为AaEE和AAEe的植株进行杂交，筛选出F1中AaEe植株（双杂合）。若E/e和A/a连锁且无交换，F2中无同时含A和E的配子（花粉或种子致死），正常植株占比为0。若两基因独立遗传（非同源染色体），F1植株（AaEe）产生雌配子为AE：Ae：aE：ae=1：1：1：1，均可育，而雄配子AE：Ae=1；1，aE和ae不可育，利用棋盘法可知，F2为AAEE：AAEe：AaEE：AaEe=1：2：1：2，其中只有AAEE的花粉和自交所结种子均发育正常，即正常植株（AAEE）占比为1/6。其他可能：若基因连锁但发生交换，正常植株占比介于0～1/6。
4．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
【答案】(1) 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等
(2)互利共生
(3) 上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
(4) 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段
(5)ab
【分析】生态系统中信息的种类(1)物理信息：生态系统中的光、声、温度、湿度、磁力等，通过物理过程传递的信息，如蜘蛛网的振动频率；(2)化学信息：生物在生命活动中，产生了一些可以传递信息的化学物质，如植物的生物碱、有机酸，动物的性外激素等；(3)行为信息：动物的特殊行为，对于同种或异种生物也能够传递某种信息，如孔雀开屏。
【详解】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。
（2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。
（3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。
（4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。
（5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确；
b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确；
c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误；
d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。
故选ab。
5．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路 。
【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
(2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中
(3)
设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测。
【分析】基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
【详解】（1） 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。
（2）PCR技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2000bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp质粒骨架 + 500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合的结果。
（3）设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。
6．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp
(2) 4 环化 测序和序列比对
(3)不能
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。
（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
7．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
【答案】(1) 4种脱氧核苷酸 延伸
(2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcRⅠ
(3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化
【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。
【详解】（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。
（2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcR I和Xba I的识别序列，而S基因内部含有Xba I、Nde I和BamH I的识别序列，要用BamH I、EcR I或Xba I切割载体，又不能用Xba I、Nde I或BamH I切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcR I切割载体，用BamH I的同尾酶Bgl Ⅱ和EcR I切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。
（3）T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
8．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是 （答出两点即可）。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有 （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
【答案】(1) 终止子、复制原点 P1 和 P3 782 重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解
(2) 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测
【分析】1基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminatr等，这是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。
【详解】（1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。
将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生沉淀，蛋白A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。
（2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。
②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
9．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。
【答案】(1)荧光
(2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGr在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解
(3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定
(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGr在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。
10．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.cliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。

限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。

【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）E.cliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
11．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。
野生动物个体识别的新方法
识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。
微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。
依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。

有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（如表）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。
两次采样所鉴定出的貉的个体编号
(1)图2中个体B的“基因型”为 。
(2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和 的数目决定的。
(3)科学家根据表1信息，使用了 法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为 。
(4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例 。
【答案】(1)174/174
(2)重复单位
(3) 标记重捕 根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。
(4)从现有 DNA 样品中，选择 Y 染色体上特有的微卫星 DNA 序列，设计特异性引物；对所有 DNA 样品进行 PCR 扩增；对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性，若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性；统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。
【分析】标记重捕法是一种用于估算动物种群数量的常用方法。其原理是在被调查种群的活动范围内，捕获一部分个体，做上标记后再放回原来的环境，经过一段时间后进行重捕，根据重捕到的动物中标记个体数占总个体数的比例，来估计种群密度。标记重捕法适用于活动能力强、活动范围大的动物，使用时需要满足一定条件，比如标记个体与未标记个体在重捕时被捕获的概率相等，在调查期间没有个体迁入、迁出、出生、死亡等。
【详解】（1）从图 2 中可知，个体 B 扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为 174 ，根据 “以片段长度命名” 等位基因进而确定基因型的规则，个体 B 的 “基因型” 为 174/174。
（2）根据题干信息 “每个位置的微卫星 DNA 可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体” 可知，使用微卫星 DNA 鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星 “基因” 的数目和重复单位的数目决定的。
（3）科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集 30 份粪便样品鉴定出 24 个不同个体（相当于标记数M=24），第二次采集 40 份粪便样品鉴定出 32 个不同个体（相当于重捕数n=32），其中两次都有的个体数为 10 个（相当于重捕中被标记的个体数m=10）。根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。
（4）从现有 DNA 样品中，选择 Y 染色体上特有的微卫星 DNA 序列，设计特异性引物。 对所有 DNA 样品进行 PCR 扩增。 对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性；若不能扩增出相应条带，则该个体为雌性。 统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。
12．（2025·四川·高考真题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcRI和BamHI完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1点即可）。
【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制
(2) 2 验证重组质粒是否构建成功
(3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻
(4) 目的基因发生突变或变异 发酵条件优化
【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。
（2）采用 EcRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。
（3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。
（4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。
13．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图丙。
回答下列问题：
(1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。
(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。
(3)基于图丙，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。
【答案】(1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点
(2) 稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升
(3) 高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。
【详解】（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。
（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。
（3）从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，诱导细菌死亡，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
14．（2024·北京·高考真题）我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构（类囊胚），为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系（如图）。相关叙述错误的是（ ）
A．实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B．实验过程中使用的培养基含有糖类
C．类囊胚的获得利用了核移植技术
D．可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
【答案】C
【分析】该过程利用胚胎干细胞创造出了类胚胎结构，并在体外培养至原肠胚时期，将类囊胚移植进雄猴体内后，成功引起了雌猴的早期妊娠反应有可能会产生新生个体，该过程属于无性生殖。
【详解】A、体外诱导食蟹猴胚胎干细胞， 形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，证实了食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能，A正确；
B、实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养提供能源物质，B正确；
C、类囊胚的获得利用了动物细胞培养技术，并没有进行核移植，C错误；
D、可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续胚胎发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。
故选C。
15．（2024·贵州·高考真题）生物学实验中合理选择材料和研究方法是顺利完成实验的前提条件。下列叙述错误的是（ ）
A．稀释涂布平板法既可分离菌株又可用于计数
B．进行胚胎分割时通常是在原肠胚期进行分割
C．获取马铃薯脱毒苗常选取茎尖进行组织培养
D．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端
【答案】B
【分析】胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
【详解】A、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌，A正确；
B、在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，B错误；
C、马铃薯顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，所以可以选取马铃薯茎尖进行组织培养获得脱毒苗，C正确；
D、不同的限制酶识别的DNA序列不同，但使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端，D正确。
故选B。
16．（2024·甘肃·高考真题）甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
【答案】B
【分析】胚胎移植基本程序主要包括：1、对供、受体的选择和处理。2、配种或人工授精。3、对胚胎的收集、检查、培养或保存。4、对胚胎进行移植。5、移植后的检查。
【详解】A、促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；
B、从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟（减数第二次分裂中期）后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；
C、在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使受体的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C正确；
D、后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。
故选B。
17．（2024·湖北·高考真题）研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如下表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是（ ）
A．实验结果说明甲抑制卵裂过程
B．甲浓度过高抑制第一极体的排出
C．添加1μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力
D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
【答案】A
【分析】据表可知，较对照组（甲浓度为0μg/mL）而言，甲浓度增大均使卵母细胞数量增多，对与第一机体排出个数、成熟率、卵裂数、卵裂率都呈先增加，后下降的趋势。
【详解】A、由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；
B、对照组第一极体排出个数为70个，甲浓度过高（＞10μg/mL，第一极体排出个数＜70）抑制第一极体的排出，B正确；
C、添加1μg/mL的甲，卵裂数增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确；
D、卵母细胞成熟的判断标准是第一极体的排出，D正确。
故选A。
18．（2024·湖北·高考真题）波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是（ ）
A．选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B．胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C．普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D．生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
【答案】D
【分析】胚胎移植的基本程序主要包括：①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。②配种或人工授精。③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来（也叫冲卵）。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑葚或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。④对胚胎进行移植。⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
【详解】A、选择遗传性状优良的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；
B、胚胎移植前，采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；
C、作为受体的杜泊母山羊只需具备健康的体质和正常繁殖能力即可，但山羊和绵羊是不同的物种，具有生殖隔离，不能将山羊的胚胎移植到绵羊子宫发育，即普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；
D、生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。
故选D。
19．（2024·江西·高考真题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E．cliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．cliB。下列叙述正确的是（ ）

A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．cliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．cliA和E．cliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法；
（4）目的基因的检测与鉴定：包括分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】 A、上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确。
B、题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．cliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E．cliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；
C、E．cliA中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E．cliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生产γ-氨基丁酸，C错误；
D、图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，但无法判断能否用其他酶代替，D错误。
故选A。
（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。

20．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
21．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。

1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A．1号和6号B．2号和4号
C．3号和5号D．1号、2号、4号和6号
【答案】7．D 8．B
【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
7．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；
B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；
C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；
D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。
故选D。
8．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。
故选B。
22．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。
【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；
C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；
D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
故选B。
23．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
【答案】D
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；
B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；
C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。
故选D。
24．（2024·广东·高考真题）关于技术进步与科学发现之间的促进关系，下列叙述正确的是（ ）
A．电子显微镜的发明促进细胞学说的提出
B．差速离心法的应用促进对细胞器的认识
C．光合作用的解析促进花期控制技术的成熟
D．RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明
【答案】B
【分析】差速离心法可以通过不同的离心速度将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，使得科学家能够单独对各种细胞器进行研究和分析，从而极大地促进了对细胞器的结构、功能等方面的认识。像线粒体、叶绿体、内质网等细胞器的详细研究，都得益于差速离心法的应用。
【详解】A、电子显微镜的发明是在细胞学说提出之后，细胞学说的提出主要基于光学显微镜的观察和研究，A 错误；
B、差速离心法可以通过不同的离心速度将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，促进对细胞器的认识，B正确；
C、 光合作用的解析主要是对植物的光合作用机制进行研究，而花期控制技术更多地涉及到植物激素、环境因素等方面的知识，光合作用的解析与花期控制技术的成熟关系不大，C 错误；
D、 PCR 技术的发明并非直接由于 RNA 聚合酶的发现，PCR 技术的关键在于热稳定的 DNA 聚合酶的应用，D 错误。
故选B。
25．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
【答案】B
【分析】PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。
【详解】A、PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误；
B、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确；
C、将配制的酵母培养基高压灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误；
D、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。
故选B。
26．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
【答案】A
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；
B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；
C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；
D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
故选A。
27．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
A．①②B．②③C．①④D．③④
【答案】D
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。
【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。
故选D。
28．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
故选A。
29．（2024·新课标卷·高考真题）某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，上部2条带是一对等位基因的扩增产物，下部2条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述错误的是（ ）
A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例大于⑤
B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占
【答案】D
【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
【详解】A、由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A/a为上部两条带的等位基因，B/b为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1为AAbb，P2为aaBB，F1为AaBb，F2中①AaBB②Aabb都为杂合子，③AABb占F2的比例为，⑤AABB占F2的比例为，A正确；
B、电泳图中的F2的基因型依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有3条带，B正确；
C、③AABb和⑦aabb杂交后代为Aabb、 AaBb，其PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同，C正确；
D、①AaBB自交子代为，AABB（）、AaBB（）、aaBB（），其PCR产物电泳结果与④aaBB电泳结果相同的占，D错误。
故选D。
30．（2023·浙江·高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
【答案】C
【分析】DNA分子复制的过程：①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链。③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构。从而形成2个与亲代DNA完全相同的子代DNA分子。
【详解】A、由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；
B、填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B正确；
C、DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；
D、癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。
故选C。
31．（2023·广东·高考真题）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA分子）通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。下列叙述错误的是（ ）
A．p53基因突变可能引起细胞癌变
B．p53蛋白能够调控细胞的生长和增殖
C．circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢
D．circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究
【答案】C
【分析】人和动物细胞中的DNA上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
【详解】A、p53基因是抑癌基因，这类基因突变可能引起细胞癌变，A正确；
B、p53基因是抑癌基因，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或促进细胞凋亡，B正确；
C、依据题意，circDNMT1通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，则circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变快，C错误；
D、circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究，D正确。
故选C。
32．（2023·湖南·高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）

A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【分析】分析题图：AT1蛋白通过抑制PIP2s蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1蛋白缺陷，可以提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；
C、结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。
故选B。
33．（2023·广东·高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14ml/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；
B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；
D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
故选D。
34．（2024·浙江·模拟预测）根据下图，正确的选项是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1需要 MII 期去核卵母细胞
C．过程2可以大幅改良动物性状
D．过程2为过程3提供了量产方式，过程3为过程1、2提供了改良性状的方式
【答案】D
【分析】动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。
【详解】A、子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无关，A错误；
B、核移植过程中需要处于MII中期的去核卵母细胞，而过程1是培育试管动物，需要培育到适宜时期（桑葚胚或囊胚等时期）进行胚胎移植，B错误；
C、过程2得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C错误；
D、过程2克隆技术可得到大量同种个体，为过程3提供了量产方式；过程3是转基因技术，转基因可导入外源优良基因，为过程1、2提供了改良性状的方式，D正确。
故选D。
35．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
故选D。
36．（2023·浙江·高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。

下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；
C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；
D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。
故选B。
37．（2023·山西·高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.cliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
故选C。
38．（2022·重庆·高考真题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（ ）
A．进入人体后需经高尔基体加工B．比人胰岛素多了2个肽键
C．与人胰岛素有相同的靶细胞D．可通过基因工程方法生产
【答案】A
【分析】基因工程只能生产已有的蛋白质，人工长胰岛素A链有氨基酸的替换，B链增加了两个氨基酸，需要通过蛋白质工程生产。
【详解】A、胰岛素作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误；
B、人工长效胰岛素比人胰岛素的B链上多了两个精氨酸，氨基酸与氨基酸之间通过肽键连接，故多2个肽键，B正确；
C、人工胰岛素和人胰岛素作用相同，都是降血糖的作用，故靶细胞相同，C正确；
D、人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。
故选A。
39．（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【分析】PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误；
B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；
C、延伸过程需引物参与，C错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误；
故选B。
40．（2022·北京·高考真题）下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（ ）
A．探究光照强度对光合作用强度的影响
B．DNA的粗提取与鉴定
C．探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D．模拟生物体维持pH的稳定
【答案】B
【分析】探究光照强度对光合作用强度的影响，自变量是光照强度，因变量是光合作用强度，需要精确测定不同光照强度下光合作用强度，要求精确定量。
【详解】A、探究光照强度对光合作用强度的影响，需要测定不同光照强度下光合作用强度，要求精确定量，A错误；
B、DNA的粗提取与鉴定属于物质提取与鉴定类的实验，只需观察是否有相关现象，不需要定量，故对实验结果不要求精确定量，B正确；
C、探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度，需要明确不同生长素类调节剂浓度下根的生长情况，要求定量，C错误；
D、模拟生物体维持pH的稳定，需要用pH试纸测定溶液pH值，需要定量，D错误。
故选B。
41．（2022·湖北·高考真题）灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（ ）
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
【答案】D
【分析】使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程称为灭菌，常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和湿热灭菌。消毒是指用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程。
【详解】A、动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；
B、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生素，B错误；
C、一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；
D、可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
故选D。
42．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
【答案】B
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；
B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；
C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；
D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
故选B。
43．（2022·浙江·高考真题）羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc，但不发病。当羊感染了PrPSc后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后，小鼠也会发病。下列分析合理的是（ ）
A．动物体内的PrPSc可全部被蛋白酶水解
B．患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C．产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D．给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc，小鼠不会发病
【答案】D
【分析】基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
【详解】A、由题干可知PrPSc可将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc在羊体内积累，说明PrPSc不会全部被蛋白酶水解，A错误；
B、患病羊体内不存在指导PrPSc合成的基因，但存在指导蛋白质PrPc合成的基因，PrPc合成后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而使羊发病，B错误；
C、由题干可知当羊感染了PrPSc后，PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc，导致PrPSc积累，从而使羊发病，说明产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用，C错误；
D、小鼠的PrPc基因敲除后，不会表达产生蛋白质PrPc，因此小鼠接种PrPSc后，不会出现PrPc转变为PrPSc，也就不会导致PrPSc积累，因此小鼠不会发病，D正确。
故选D。
（2021·天津·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
S蛋白是新冠病毒识别并感染靶细胞的重要蛋白，作为抗原被宿主免疫系统识别并应答，因此S蛋白是新冠疫苗研发的重要靶点。下表是不同类型新冠疫苗研发策略比较。
44．自身不含S蛋白抗原的疫苗是（ ）
A．灭活疫苗B．亚单位疫苗
C．核酸疫苗D．减毒流感病毒载体疫苗
45．通常不引发细胞免疫的疫苗是（ ）
A．腺病毒载体疫苗B．亚单位疫苗
C．核酸疫苗D．减毒流感病毒载体疫苗
【答案】31．C 32．B
【分析】1、体液免疫过程为：（1）除少数抗原可以直接刺激B细胞外，大多数抗原被吞噬细胞摄取和处理，并暴露出其抗原决定簇；吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞；（2）B细胞接受抗原刺激后，开始进行一系列的增殖、分化，形成记忆细胞和浆细胞；（3）浆细胞分泌抗体与相应的抗原特异性结合，发挥免疫效应。
2、细胞免疫过程为：（1）吞噬细胞摄取和处理抗原，并暴露出其抗原决定簇，然后将抗原呈递给T细胞；（2）T细胞接受抗原刺激后增殖、分化形成记忆细胞和效应T细胞，同时T细胞能合成并分泌淋巴因子，增强免疫功能；（3）效应T细胞发挥效应，激活靶细胞内的溶酶体酶使靶细胞裂解。
3、疫苗属于抗原，进入机体后会引起特异性免疫反应。常见的疫苗有减毒活疫苗、灭活病毒疫苗、重组蛋白疫苗、重组病毒载体疫苗、核酸疫苗等。
44．A、灭活疫苗是病毒经培养、增殖并用理化方法灭活后制成，会保留病毒的S蛋白抗原，A不符合题意；
B、亚单位疫苗是通过基因工程方法，在体外合成S蛋白制成，包含S蛋白抗原，B不符合题意；
C、核酸疫苗是将编码S蛋白的核酸包裹在纳米颗粒中制成，自身不含S蛋白抗原，C符合题意；
D、减毒流感病毒载体疫苗是利用减毒流感病毒作为载体，带S蛋白基因，并在载体病毒表面表达S蛋白制成，故该疫苗自身含S蛋白抗原，D不符合题意。
故选C。
45．A、腺病毒载体疫苗是利用改造后无害的腺病毒作为载体，携带S蛋白基因制成，腺病毒会引发细胞免疫，A不符合题意；
B、亚单位疫苗是通过基因工程方法，在体外合成S蛋白制成，只包含S蛋白抗原，不会引起细胞免疫，B符合题意；
C、核酸疫苗是将编码S蛋白的核酸包裹在纳米颗粒中制成，该疫苗会进入细胞内发挥作用，可能会引发机体的细胞免疫，C不符合题意；
D、减毒流感病毒载体疫苗是利用减毒流感病毒作为载体，带S蛋白基因，并在载体病毒表面表达S蛋白制成，流感病毒会引发细胞免疫，D不符合题意。
故选B。
46．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ ）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
【答案】D
【分析】将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A正确；
B、该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；
C、通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的，只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确；
D、获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。
故选D。
47．（2021·湖北·高考真题）限制性内切酶EcRI识别并切割双链DNA，用EcRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6B．250C．4000D．24000
【答案】C
【分析】限制性核酸内切酶能识别特定的DNA序列，切割特定的位点，在特定的碱基之间切割磷酸二酯键。
【详解】据图可知，EcRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。
故选C。
48．（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间D．提高复性的温度
【答案】D
【分析】多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。
【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；
BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；
D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
故选D。
49．（2021·辽宁·高考真题）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（ ）
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
【答案】D
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。
2、蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。
3、蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
【详解】A、在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；
B、蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；
C、N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；
D、酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。
故选D。
【点睛】
50．（2021·天津·高考真题）孟德尔说：“任何实验的价值和效用，取决于所使用材料对于实验目的的适合性。”下列实验材料选择不适合的是（ ）
A．用洋葱鳞片叶表皮观察细胞的质壁分离和复原现象
B．用洋葱根尖分生区观察细胞有丝分裂
C．用洋葱鳞片叶提取和分离叶绿体中的色素
D．用洋葱鳞片叶粗提取DNA
【答案】C
【分析】洋葱是比较好的实验材料：
①洋葱根尖分生区细胞观察植物细胞的有丝分裂；
②洋葱鳞片叶外表皮细胞，色素含量较多，用于观察质壁分离和复原；
③洋葱的绿叶做叶绿体中色素的提取和分离实验，叶肉细胞做细胞质流动实验。
④洋葱的内表皮细胞颜色浅、由单层细胞构成，适合观察DNA、RNA在细胞中的分布状况。
【详解】A、洋葱鳞片叶外表皮细胞的液泡为紫色，便于观察细胞的质壁分离和复原现象，A正确；
B、洋葱根尖分生区细胞分裂旺盛，可以用来观察细胞有丝分裂，B正确；
C、洋葱鳞片叶不含叶绿体，不能用来提取和分离叶绿体中的色素，C错误；
D、洋葱鳞片叶细胞有细胞核且颜色浅，可以用来粗提取DNA，D正确。
故选C。
二、多选题
51．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
【答案】AC
【分析】1、PCR技术：
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。
【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；
B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误；
C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确；
D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。
故选AC。
52．（2022·河北·高考真题）人染色体DNA中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电泳分离后可得到个体的DNA指纹图谱。该技术可用于亲子鉴定和法医学分析。下列叙述错误的是（ ）
A．DNA分子的多样性、特异性及稳定性是DNA鉴定技术的基础
B．串联重复序列在父母与子女之间的遗传不遵循孟德尔遗传定律
C．指纹图谱显示的DNA片段属于人体基础代谢功能蛋白的编码序列
D．串联重复序列突变可能会造成亲子鉴定结论出现错误
【答案】BC
【分析】1、基因的概念：基因是具有遗传效应的DNA片段，是决定生物性状的基本单位。
2、DNA分子的多样性：构成DNA分子的脱氧核苷酸虽只有4种，配对方式仅2种，但其数目却可以成千上万，更重要的是形成碱基对的排列顺序可以千变万化，从而决定了DNA分子的多样性（n对碱基可形成4n种）。
3、DNA分子的特异性：每个特定的DNA分子中具有特定的碱基排列顺序，而特定的排列顺序代表着遗传信息，所以每个特定的DNA分子中都贮存着特定的遗传信息，这种特定的碱基排列顺序就决定了DNA分子的特异性。
【详解】A、DNA分子的多样性、特异性及稳定性是DNA鉴定技术的基础，A正确；
B、串联重复序列在染色体上，属于核基因，在父母与子女之间的遗传遵循孟德尔遗传定律，B错误；
C、指纹图谱由串联重复序列扩增获得，串联重复序列是广泛分布于真核生物核基因组中的简单重复非编码序列，C错误；
D、串联重复序列突变后，分离得到的指纹图谱可能会发生改变，可能会造成亲子鉴定结论出现错误，D正确。
故选BC。
三、解答题
53．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因）
(1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。
(2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。
(3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。
【答案】(1) HhG+G- 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上
(2) HhG+G+、HhG+G- ④
(3) 乙 乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降。6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。
（2）由图2可知，③含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1和图2，①只含有h基因，仍正常表达H蛋白，②③都含有H基因，可正常表达H蛋白，④含有h基因和G基因，TM试剂激活G酶可剪切LX序列，使h基因异常，无法表达H蛋白，故检测H蛋白水平为0的是④。
（3）由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控，故选择H基因条件敲除鼠乙。
54．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。
【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）
(2) EcRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接）
(3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段 PCR
(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
（2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；
②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
（3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段；
②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。
（4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
55．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。
回答下列问题。
(1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“ T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列
(3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。
（2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。
（3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。
56．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。
【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达
(2)C
(3)各组织器官中G和H的mRNA
(4)
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。
（2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确；
C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误；
C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。
故选C。
（3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。
（4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下：
。
57．（2024·浙江·高考真题）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下：
筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X
回答下列问题：
(1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。
(2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。
(3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。
(4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。
【答案】(1) 外植体 过滤
(2) 克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害
(3) 丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X
(4) 器官 代谢途径 关键酶 发酵
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证：
【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。
（2）分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。
（3）由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X。
（4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以通过器官培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的代谢途径和关键酶。
58．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题：
(1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。
(2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。
(3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。
【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源
(2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒）
(3)诱变育种
(4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀
【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子；
2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。
【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。
（2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。
（3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。
（4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。
59．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题：
(1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。

(2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。
(3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。
(4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD与ccd2d2个体杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格：
【答案】(1)碱基对的缺失
(2) 3 1 1：1
(3)密码子具有简并性
(4) 9：7 有 有
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证：
【详解】（1）图示为在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物，c基因是C基因突变而来，c基因两侧的碱基序列与C基因相同，PCR扩增也能扩增c基因，由图可知，泳道1是突变体Cer1，则扩增c基因时两引物间的长度为1100bp，泳道2是野生型（WT，纯合体），则扩增C基因时两引物间的长度为2000bp，说明c基因比C基因长度变短，是碱基对的缺失引起的突变。
（2）突变体Cer1为cc，纯合野生型为CC，则F1为Cc，F1与突变体Cer1杂交后代中Cc：cc=1：1，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道3和泳道1中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1：1；
（3）编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是密码子具有简并性；
（4）由题意可知，C/c、D/d2基因遵循基因的自由组合定律，因此CCDD与ccd2d2个体杂交，F1为（CcDd2），表型为野生型，F1（CcDd2）自交，F2野生型与突变型的比例为C-D-：（ccD-+C-d2d2+ccd2d2）=9：7；Ccd2d2含有C基因无D基因，有16-羟基棕榈酸，由于不含D基因，因为16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需有D基因，故无颖壳蜡质；CCDd2含有C基因和D基因，有16-羟基棕榈酸，也有颖壳蜡质。
60．（2024·湖南·高考真题）色盲可分为红色盲、绿色盲和蓝色盲等。红色盲和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传，分别由基因L、M突变所致；蓝色盲属常染色体显性遗传，由基因s突变所致。回答下列问题：
(1)一绿色盲男性与一红色盲女性婚配，其后代的表型及比例为 或 ；其表型正常后代与蓝色盲患者（Ss）婚配，其男性后代可能的表型及比例为 （不考虑突变和基因重组等因素）。
(2)1个L与1个或多个M串联在一起，Z是L上游的一段基因间序列，它们在X染色体上的相对位置如图a。为阐明红绿色盲的遗传病因，研究人员将男性红绿色盲患者及对照个体的DNA酶切产物与相应探针杂交，酶切产物Z的结果如图b，酶切产物BL，CL、DL、BM、CM和DM的结果见下表，表中数字表示酶切产物的量。
①若对照个体在图a所示区域的序列组成为“Z+L+M+M”则患者甲最可能的组成为 （用Z、部分Z，L、部分L，M、部分M表示）。
②对患者丙、丁的酶切产物Z测序后，发现缺失Z1或Z2，这两名患者患红绿色盲的原因是 。
③本研究表明：红绿色盲的遗传病因是 。
【答案】(1) 正常女性∶红色盲男性=1∶1 正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1 红蓝色盲∶绿蓝色盲∶红色盲∶绿色盲=1∶1∶1∶1
(2) 部分Z+M+部分M Z发生突变，导致L、M基因无法表达 L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）根据题意分析，绿色盲男性的基因型为XLmY，红色盲女性的基因型为XlMXlM或XlMXlm，若该女性的基因型为XlMXlM，则后代的基因型及比例为XLmXlM∶XlMY=1∶1,表型及比例为正常女性∶红色盲男性=1∶1；若该女性的基因型为XlMXlm，则后代的基因型及比例为XLmXlM∶XLmXlm∶XlMY∶XlmY=1∶1∶1∶1，表型及比例为正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1。无论哪种情况，后代的正常个体只有女性，且基因型为XLmXlM，若同时考虑蓝色盲，其基因型为ssXLmXlM，而蓝色盲男性的基因型为SsXLMY，两者婚配，其男性后代的基因型及比例为SsXLmY∶SsXlMY∶ssXLmY∶ssXlMY=1∶1∶1∶1，表型及比例为绿蓝色盲∶红蓝色盲∶绿色盲∶红色盲=1∶1∶1∶1。
（2）①根据对照组的实验结果可知，对照组的序列组成为Z+L+M+M，患者甲的Z序列的电泳结果和对照组不同，且电泳距离更远，因此片段较小，只具有部分Z片段；患者甲BL、CL和DL均缺失，因此不含L片段；对照组含有两个M片段，其BM、CM和DM的量分别为45.5、21.3和66.1，而患者甲BM、CM和DM的量分别为21.9、10.9和61.4，其BM、CM的量为对照组的一半，而DM的量和对照组相差不大，因此患者甲含有一个完整的M片段和第二个M片段的DM区，因此其序列组成表示为部分Z+M+部分M。
②患者丙和患者丁的L和M片段的相关结果和对照组无差异，但缺失Z1或Z2，说明Z1和Z2的缺失会影响L和M基因的表达，从而使机体患病，因此其患病的原因是Z发生突变，导致L、M基因无法表达。
③结合①②的结果并分析甲、乙、丙和丁的检测结果可知，红绿色盲的遗传病因是L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变。
61．（2024·北京·高考真题）灵敏的嗅觉对多数哺乳动物的生存非常重要，能识别多种气味分子的嗅觉神经元位于哺乳动物的鼻腔上皮。科学家以大鼠为材料，对气味分子的识别机制进行了研究。
(1)嗅觉神经元的树突末梢作为感受器，在气味分子的刺激下产生 ，经嗅觉神经元轴突末端与下一个神经元形成的 将信息传递到嗅觉中枢，产生嗅觉。
(2)初步研究表明，气味受体基因属于一个大的基因家族。大鼠中该家族的各个基因含有一些共同序列（保守序列），也含有一些有差异的序列（非保守序列）。不同气味受体能特异识别相应气味分子的关键在于 序列所编码的蛋白区段。
(3)为了分离鉴定嗅觉神经元中的气味受体基因，科学家依据上述保守序列设计了若干对引物（图甲），利用PCR技术从大鼠鼻腔上皮组织mRNA的逆转录产物中分别扩增基因片段，再用限制酶HinfⅠ对扩增产物进行充分酶切。图乙显示用某对引物扩增得到的PCR产物（A）及其酶切片段（B）的电泳结果。结果表明酶切片段长度之和大于PCR产物长度，推断PCR产物由 组成。
(4)在上述实验基础上，科学家们鉴定出多种气味受体，并解析了嗅觉神经元细胞膜上信号转导的部分过程（图丙）。
如果钠离子通道由气味分子直接开启，会使嗅觉敏感度大大降低。根据图丙所示机制，解释少量的气味分子即可被动物感知的原因 。
【答案】(1) 兴奋/动作电位/神经冲动 突触
(2)非保守
(3)长度相同但非保守序列不同的DNA片段
(4)少量的气体分子通过活化的G蛋白、活化的C酶，在C酶的催化下合成大量的cAMP使Na+通道打开，Na+内流，神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）气味分子刺激感受器产生兴奋。嗅觉神经元轴突末端、神经元间隙与下一个神经元组成突触，包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。
（2）不同气味受体能特异性识别相应气味分子的关键在于蛋白质中结构不同的部分，由非保守序列编码。
（3）由图可知，PCR产物含保守序列和非保守序列，若非保守序列不同，酶切产物的长度可能不同，导致酶切片段长度之和大于PCR产物长度，因此PCR产物由长度相同但非保守序列不同的DNA片段组成。
（4）由图丙可知，少量的气体分子通过活化G蛋白使得C酶活化，在C酶的催化下，由ATP合成大量的cAMP ，促使Na+通道打开，Na+内流，导致神经元细胞膜上产生动作电位，气味分子被动物感知。
62．（2024·全国甲卷·高考真题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 ；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
【答案】(1) 变性 氢键
(2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶
(3) 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
(4)甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
（2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。
（3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
63．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
64．（2024·河北·高考真题）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为 启动子。Ns为终止子，其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测 ，通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。（答出两点即可）
【答案】(1) 胚乳特异表达基因的 终止转录 HindIII EcRI
(2) 农杆菌转化 r2HN是否转录 抗原抗体杂交
(3) 1/4 纯合体自交后代不发生性状分离
(4) 体液 细胞
(5)生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证：
【详解】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在水稻胚乳特异表达基因的的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Ns为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HN是否转录，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
（4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有生产成本低；转基因水稻易获得（或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”）等优点。
65．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④
(3)1/4
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
66．（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。
【答案】(1) 磷酸二酯键 片段甲含有启动子和终止子
(2)A-T、U-A
(3) 菌株B2的基因组DNA 无扩增产物
(4)实现废物利用，减少环境污染
【分析】信息获取与加工
【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子，保证N基因正常发表达。
（2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。
（3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组DNA；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3对应的模板序列未插入B1的基因组，实验结果是无扩增产物。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是实现废物利用，减少环境污染。
67．（2024·浙江·高考真题）小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f杂合子基因型用+f表示）
回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生 ，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了 而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行 和 。
(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第 泳道和第 泳道。
(3)g小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是 ，则g和f是非等位基因；若杂交结果是 ，则g和f是等位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g杂合子基因型用+g表示）
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型（++）、g杂合子（+g）和g小鼠（gg）的mRNA，反转录为cDNA后用（2）小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是 。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用 。
【答案】(1) 编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失
(2) 3 2
(3) 子代全为野生型 野生型：突变型=1：1
(4) 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。
（2）从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。
（3）据题意可知，野生型基因用++表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用+f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠（+f/++）与g小鼠（++/gg）杂交，后代为++/+g和+f/+g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠（+f）与g小鼠（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。
（4）据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。
68．（2023·湖南·高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：

(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是 。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为 ）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
【答案】(1) 常染色体隐性遗传病 1/32
(2) 5'-ATTCCA-3' 8、302和310
(3)0.4~1.0
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中。随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合
【详解】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1与I-2均表现正常，他们关于甲病的基因型均为+/-，而他们的女儿Ⅱ-4患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病，由I-1、I-2和Ⅱ-3关于乙病的基因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以I-1和I-2生出一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
（2）本题研究甲基因突变情况，二代1为杂合子，兼有正常甲基因和突变甲基因。目的基因为甲基因，扩增引物应与两基因共有的TAAGGT片段结合，应为ATTCCA。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供后续鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段为8和2+293+7=302bp，突变甲基因无法被酶切，大小为310bp。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测甲基因突变情况的目的。
（3）由题干可知“女性乙基因纯合时会增加胎儿患病风险”，而Ⅱ-1为杂合子，且其无NTDs生育史，故其叶酸补充量为0.4-1.0。
69．（2023高三·全国·专题练习）某植物四号染色体上面的A基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该种植物会死亡。现有A3-和A25-两种分别由A基因缺失3个和25个碱基对产生的基因，已知前者不影响植酸合成，后者效果未知。
(1)现有基因型为AA25-的植物，这两个基因是 基因。该植物自交后代进行PCR，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，PCR后进行电泳，发现植物全部后代PCR产物电泳结果均具有明亮条带，原因是 ，其中明亮条带分为较明亮和较暗两种，其中较明亮条带代表基因型为 的植物，比例为 。
(2)将一个A基因导入基因型为A3-A25-的植物的6号染色体，构成基因型为A3-A25- A的植物、该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是 。
(3)在某逆境中，基因型为A3-A3-的植物生存具有优势，现有某基因型为A3-A的植物，若该种植物严格自交，且基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，补齐下面的表格中，子一代基因频率数据（保留一位小数）：
基因频率改变，是 的结果。
【答案】(1) 等位 自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A和AA的个体由于都至少含有一个A基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带 AA 1/3
(2)1/5
(3) 48.8 51.2 自然选择
【分析】1、DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫做基因突变。
2、基因自由组合定律实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的， 在减数分裂形成配子的过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
3、突变和基因重组、自然选择及隔离是物种形成过程的三个基本环节。其中突变和基因重组产生生物进化的原材料，自然选择使种群的基因频率发生定向的改变并决定生物进化的方向，隔离是物种形成的必要条件。生物进化的实质在于种群基因频率的改变。
【详解】（1）由题干可知，A25-基因是由A基因缺失25个碱基对产生的基因，即A基因通过基因突变产生A25-基因，因此二者属于等位基因。基因型为AA25-的植物自交后代的基因型及其比例为AA：AA25-：A25-A25-=1:2:1。当对这些后代进行PCR时，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，可推知缺失这25个碱基对的A25-基因无法与正向引物配对从而不能扩增，因此只含有A25-基因的个体（即A25-A25-）不具有条带；含有这25个碱基对的A基因能与正向引物和反向引物都进行碱基互补配对从而扩增出条带，因此基因型为AA、AA25-的个体均具有条带，且A基因个数越多，扩增产物越多，条带越明亮，因此基因型为AA的个体具有较明亮的条带，基因型为AA25-的个体具有较暗的条带。由题干可知，该植物的全部后代都具有明亮条带，说明基因型为A25-A25-的个体无法存活，只有基因型为AA和AA25-的个体能够存活下来，并进行了PCR扩增产生了条带，因此较明亮条带代表基因型为AA，占比为1/3。
（2）已知基因A3-和A25-都在4号染色体上，再导入一个A基因至6号染色体上，由于它们位于非同源染色体上，故该植物在减数分裂产生配子时，遵循基因自由组合定律，产生配子的基因型为A3-A、A25-A、A3-、A25-，比例各自占1/4；该植物自交后代中基因型为A25-A25-=1/4×1/4=1/16的个体死亡，存活个体占1-1/16=15/16，含有A25-A25-的后代个体基因型有2种，分别是AAA25-A25-=1/4×1/4=1/16，AA25-A25-=1/4×1/4×2=2/16，二者共占3/16，因此该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是3/16÷15/16=1/5。
（3）基因型为A3-A的植物自交产生子一代的基因型及比例为AA=1/4，A3-A=1/2，A3-A3-=1/4，由题干可知，基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，则子一代中A3-A3-=1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代中AA：A3-A：A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10:20:11，可计算出三者的基因型频率分别是AA=10÷（10+20+11）=10/41，A3-A=20÷（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11÷（10+20+11）=11/41，可进一步计算出子一代中A基因频率=10/41+1/2×20/41=48.8%，A3-基因频率=11/41+1/2×20/41=51.2%。自然选择导致具有有利变异的个体存活并由更大几率产生更多后代，导致后代中决定有利变异的基因频率增大，而具有不利变异的个体则会被自然选择淘汰，因此决定不利变异的基因频率减小，因此基因频率的改变是自然选择的结果。
70．（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。

(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
【答案】(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
71．（2023·北京·高考真题）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
(1)我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是 。

(2)科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为 条。

(3)油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大规模种植成为可能。品系A1育性正常，其他性状与A相同，A与A1杂交，子一代仍为品系A，由此可大量繁殖A。在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来提高种子S的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1生产种子S的育种流程见图丙。

①图丙中，A植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1杂交，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为 。
②为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，简单易行的田间操作用 。
【答案】(1)黄化叶
(2) 用限制酶B处理 3
(3) 1/2 在开花前把田间出现的绿叶植株除去
【分析】基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变；如果发生在编码区，则可能因此基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列改变。
【详解】（1）野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，由此可以推测黄化叶是隐性性状。
（2）检测F2基因型的实验步骤为：：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳。野生型基因电泳结果有一条带，叶黄化的基因电泳结果有两条带，则F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
（3）①品系A1育性正常，其他性状与A相同，A与A1杂交，子一代仍为品系A，推测不育基因位于细胞质中，A植株的绿叶雄性不育子代仍为雄性不育，且为绿叶杂合子，与黄化A1（aabb）杂交，后代中一半黄化，一半绿叶，筛选出的黄化A植株（Aabb）占子一代总数的比例约为1/2。
②A不纯会影响种子S的纯度，为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，应在开花前把田间出现的绿叶植株除去。
72．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2
a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。
73．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。

回答下列问题。
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。
【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
(2) 遗传特性 转基因标识
(3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。
【详解】（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。
（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
74．（2023·浙江·高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
【答案】(1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA酶
PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
75．（2023·湖北·高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。

回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。

【答案】(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
76．（2023·浙江·高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】(1) 再生 叶
(2) 纤维素 细胞质基因和细胞核基因 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用
(3) 同一个杂种融合原生质体 ABD
(4) 再分化 根和芽
(5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。
【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质基因和细胞核基因失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
77．（2023·全国乙卷·高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。

(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
(2) 终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(3)密码子具有简并性
(4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。
②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
78．（2023·全国甲卷·高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2) 筛选 RNA聚合酶
(3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
79．（2022·福建·高考真题）7S球蛋白是大豆最主要的过敏原蛋白，三种大豆脂氧酶Lx-1，2，3是大豆产生腥臭味的原因。大豆食品深加工过程中需要去除7S球蛋白和三种脂氧酶。科研人员为获得7S球蛋白与三种脂氧酶同时缺失的大豆新品种，将7S球蛋白缺失的大豆植株与脂氧酶完全缺失的植株杂交，获得F1种子。F1植株自交得到F2种子。对F1种子和F2种子的7S球蛋白和脂氧酶进行蛋白质电泳检测，不同表现型的电泳条带示意如下图。

注：图中黑色条带为抗原一抗体杂交带，表示相应蛋白质的存在。M泳道条带为相应标准蛋白所在位置，F1种子泳道的条带待填写。
根据电泳检测的结果，对F2种子表现型进行分类统计如下表。
回答下列问题：
(1)7S球蛋白缺失型属于 （填“显性”或“隐性”）性状。
(2)表中①②的表现型分别是 、 。脂氧酶 Lx—1，2，3分别由三对等位基因控制，在脂氧酶是否缺失的性状上，F2种子表现型只有四种，原因是 。
(3)在答题卡对应的图中画出F1种子表现型的电泳条带 。
(4)已知Lx基因和7S球蛋白基因独立遗传。图中第 泳道的种子表现型为7S球蛋白与三种脂氧酶同时缺失型，这些种子在F2中的比例是 。利用这些种子选择并获得稳定遗传种子的方法是 。
(5)为提高大豆品质，利用基因工程方法提出一个消除野生型大豆7S球蛋白过敏原的设想。
【答案】(1)显性
(2) Lx-1，2缺失型 Lx-3缺失型 控制Lx-1，2的基因在同一对同源染色体上并且不发生互换，控制Lx-3的基因位于另一对同源染色体上
(3)
(4) 4 3/64 将这些种子长成的植株自交，对单株所得的所有种子进行蛋白质电泳检测，若某植株所有种子均不出现7S球蛋白条带，则该植株的种子能稳定遗传
(5)敲除7S球蛋白基因/导入7S球蛋白的反义基因，使7S球蛋白不能合成
【分析】1、基因自由组合定律的实质是:位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的;在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
2、分析电泳图时，可参考M泳道，与M泳道中相同蛋白质位于同一水平位置的，即表示能分离得到该蛋白质。
【详解】（1）由题意可知，将7S球蛋白缺失的大豆植株与脂氧酶完全缺失的植株杂交，获得F1种子，F1植株自交得到F2种子，由表中数据可知，F2种子中7S球蛋白缺失型与野生型的比例为3：1，可知7S球蛋白缺失型为显性性状。
（2）表中①②的表现型需结合杂交过程、表格中性状分离比及电泳条带分析，据电泳条带示意图可是，一共有四种类型：F2种子中泳道3和6表现为野生型，泳道4和5表现为Lx-1，2，3全缺失型，泳道1和8表现为Lx-1，2缺失型，泳道2和7表现为Lx-3缺失型，Lx-1，2始终表现在一起，说明控制脂氧酶Lx-1，2的基因位于一条染色体上，故图中的①②的表现型应为Lx-1，2缺失型、Lx-3缺失型；脂氧酶由三对等位基因控制，F2种子在脂氧酶的性状上表现型只有四种，结合表中四种表现型比例为9：3：3：1，说明控制Lx-1，2的两对等位基因在同一对同源染色体上并且不发生互换，控制Lx-3的一对等位基因位于另一对同源染色体上。
（3）根据题中的杂交育种过程分析，F1应为杂合子，表现出显性性状7S球蛋白缺失型及脂氧酶Lx-1，2，3野生型，电泳条带应为仅有Lx-1，2，3三条电泳条带，故可绘制电泳图如下：

（4）由电泳图可知，第4泳道没有电泳条带，说明其种子表现型为7S球蛋白缺失型与Lx-1，2，3全缺失型；由表格数据可知，7S球蛋白缺失型占3/4，Lx-1，2，3全缺失型占1/16，结合（1）结论，这些种子在F2中的比例是3/4×1/16=3/64；利用这些种子选择并获得稳定遗传种子的方法是：将这些种子长成的植株自交，对单株所得的所有种子进行蛋白质电泳检测，若某植株所有种子均不出现7S球蛋白条带，则该植株的种子能稳定遗传。
（5）利用基因工程方法，消除野生型大豆7S球蛋白条带过敏原，以提高大豆品质，可从7S球蛋白基因不存在或不表达方向思考，如敲除7S球蛋白基因或导入7S球蛋白基因的反义基因。
80．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入XhⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含 （EcRⅠ∕HindⅢ∕XhⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
【答案】(1) 1 4 5＇
(2)XhⅠ
(3)卡那霉素
(4)B
(5)PCR
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhⅠ酶识别序列。
（2）据图可知，载体4中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhⅠ酶识别序列，载体3中不含XhⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhⅠ酶识别序列。
（3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4）据题意可知，载体5导入的是链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，ACD错误。
故选B。
（5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。
81．（2022·重庆·高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1)花药培养能缩短育种年限，原因是 。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是 。
(2)步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是 ；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
【答案】(1) 单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体
(2) cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术
【分析】1、单倍体育种的原理是染色体变异，方法是用花药离体培养获得单倍体植株，再人工诱导染色体数目加倍；优点是纯合体自交后代不发生性状分离，因而能明显缩短育种年限。2、cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库，基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA片段的集合，它包含了该生物的所有基因。
【详解】（1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离，所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。
（2）cDNA文库又叫部分基因文库，是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，而基因组文库包含了本物种全部基因，基因工程中只需转录出编码蛋白质的基因部分就即可，故选cDNA文库。在构建重组Ti质粒时，必须使用限制性核酸内切酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti质粒中含有抗生素抗性基因，故应在培养基中添加抗生素，以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，即用含eu基因的农杆菌侵染愈伤组织，以便将eui基因导入愈伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui基因，可采取DNA分子杂交技术的方法。
82．（2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0ml/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
(2) 溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3'
(3) a、b 1100 Q4 X蛋白参与中心体的形成
(4) 逆转录 32
【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
（2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0ml/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0ml/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcR V+BamH I的识别序列，根据EcR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
（4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。
83．（2022·河北·高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有 （写出两点即可）。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是 。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是 （写出两点即可）。
【答案】(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的
(2)基因表达载体的构建/表达载体的构建
(3) T-DNA 该方法不适用于单子叶植物
(4)基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术
(5) 接种实验 NaPI＋StPinlA 两种抑制剂共同作用能够有效抑制棉铃虫的消化功能
(6) 定向改变
①某些害虫胰蛋白酶基因发生突变，使酶空间结构发生变化，抑制剂无法发挥作用；②某些害虫基因突变形成的新基因，能指导合成催化抑制剂水解的酶，使抑制剂失效
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。
（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。
（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用于单子叶植物。
（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。
（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的接种实验以鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI＋StPinlA转基因棉花的抗虫效果最佳，因为两种抑制剂共同作用能够有效抑制棉铃虫的消化功能。
（6）在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是①某些害虫胰蛋白酶基因发生突变，使酶空间结构发生变化，抑制剂无法发挥作用；②某些害虫基因突变形成的新基因，能指导合成催化抑制剂水解的酶，使抑制剂失效。
84．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
(2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子： 。
①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌）
Ⅱ.基因：
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。
【答案】(1)显微注射
(2)监测灵敏度更高
(3) ② D
(4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。
（2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。
（3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。
（4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。
（5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。
85．（2022·海南·高考真题）以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sx2／Nang／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。
(1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用 处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加 等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
(2)体外获取OSNL的方法有 （答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和 等。启动子是 识别和结合的部位，有了它才能驱动 。
(3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是 。
(4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是 。
(5)该实验流程中用到的生物技术有 （答出2点即可）。
【答案】(1) 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 动物血清
(2) PCR技术、人工合成法 终止子 RNA聚合酶 目的基因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质
(3)基因的选择性表达
(4)诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术
(5)基因工程、动物细胞培养
【分析】胚胎干细胞（ES细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞，即iPS细胞。
【详解】（1）动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，以获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中添加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。
（2）OSNL为目的基因，体外获取目的基因可通过PCR技术大量扩增或通过人工合成法来合成。基因表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
（3）据图可知，由iPS细胞诱导形成iPGCs细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没有改变，导致其细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。
（4）诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。
（5）由图可知，该实验流程中将OSNL基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。
86．（2022·湖北·高考真题）“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验；
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
(1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有 种。品系乙基因型为 。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为 。
(2)下图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有 。
(3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用 酶切割S基因的cDNA和载体。
(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是 。
(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有 （答出2点即可）。
【答案】(1) 7 aabb 1∶5
(2)①③
(3)XbaⅠ、HindⅢ
(4)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞
(5)单倍体育种、诱变育种
【分析】农杆菌转化法：取Ti质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转入农杆菌、将农杆菌导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
杂交育种：杂交→自交→选优；诱变育种：物理或化学方法处理生物，诱导突变；单倍体育种：花药离体培养、秋水仙素加倍；多倍体育种：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗；基因工程育种：将一种生物的基因转移到另一种生物体内。
【详解】（1）甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙杂交的F2基因型有3×3=9种，假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，F2中表现为甜的植株基因型有7种。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中不甜比例=1/3+2/3×3/4=5/6，F3中甜∶不甜比例为1∶5。
（2）不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，只有A导致不甜，当A与B同时存在时，表现为甜，故选①③。
（3）为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。
（4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。
（5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有单倍体育种、诱变育种。
87．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
5'端
(2) P基因编码链的第一个碱基与EcRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。
在引物中的EcRⅠ识别序列3'端添加1个碱基
(3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合
(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。
【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
（2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
（4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。
88．（2022·山东·高考真题）果蝇的正常眼与无眼是1对相对性状，受1对等位基因控制，要确定该性状的遗传方式，需从基因与染色体的位置关系及显隐性的角度进行分析。以正常眼雌果蝇与无眼雄果蝇为亲本进行杂交，根据杂交结果绘制部分后代果蝇的系谱图，如图所示。不考虑致死、突变和X、Y染色体同源区段的情况。
(1)据图分析，关于果蝇无眼性状的遗传方式，可以排除的是 。若控制该性状的基因位于X染色体上，Ⅲ-1与Ⅲ-2杂交的子代中正常眼雄果蝇的概率是 。
(2)用Ⅱ-1与其亲本雄果蝇杂交获得大量子代，根据杂交结果 （填“能”或“不能”）确定果蝇正常眼性状的显隐性，理由是 。
(3)以系谱图中呈现的果蝇为实验材料设计杂交实验，确定无眼性状的遗传方式。（要求：①只杂交一次；②仅根据子代表型预期结果；③不根据子代性状的比例预期结果）实验思路： ；预期结果并得出结论： 。
(4)若果蝇无眼性状产生的分子机制是由于控制正常眼的基因中间缺失一段较大的DNA片段所致，且该对等位基因的长度已知。利用PCR及电泳技术确定无眼性状的遗传方式时，只以Ⅱ-3为材料，用1对合适的引物仅扩增控制该对性状的完整基因序列，电泳检测PCR产物，通过电泳结果 （填“能”或“不能”）确定无眼性状的遗传方式，理由是 。
【答案】(1) 伴X染色体显性遗传、伴Y染色体遗传 3/8
(2) 不能 无论正常眼是显性还是隐性，子代雌雄果蝇中正常眼与无眼的比例均为1:1
(3) Ⅱ-2（或：Ⅱ-1；或：Ⅱ-4）与Ⅱ-3果蝇杂交，观察子代表型 若子代全为正常眼果蝇，则为常染色体显性遗传；若子代出现无眼雌果蝇，则为常染色体隐性遗传；若子代无眼果蝇全为雄性，则为伴X染色体隐性遗传
(4) 不能 无论是常染色体显性遗传还是伴X染色体隐性遗传，其PCR产物电泳后都仅出现一个条带，且对应的均为正常眼基因的长度
【分析】不考虑致死、突变和X、Y同源区段遗传，果蝇的有眼与无眼可能是常染色体显性或常染色体隐性或伴X染色体显性、伴X染色体隐性遗传。假设控制正常眼和无眼性状的基因由A/a控制。
【详解】（1）题干中已经排除了致死、突变和X、Y同源区段遗传，Ⅰ-1正常眼雌果蝇与Ⅰ-2无眼雄果蝇杂交，Ⅱ雌果蝇出现正常眼，说明该性状的遗传不可能为伴X显性遗传，如果是伴X显性遗传，雌果蝇均为无眼;Ⅰ-4正常眼雌果蝇与Ⅰ-3无眼雄果蝇杂交，Ⅱ-3雄果蝇出现正常眼，说明该性状的遗传不可能为伴Y遗传，如果是伴Y遗传，Ⅱ-3雄果蝇应为无眼。若控制该性状的基因位于X染色体上，则无眼为隐性性状，Ⅰ-2的基因型为XaY，Ⅱ-2的基因型为XAXa，Ⅱ-3基因型为XAY，则Ⅲ-2的基因型为1/2XAXA、1/2XAXa，Ⅲ-1基因型为XAY，两者杂交，卵细胞的基因型及比例为XA∶Xa=3∶1，精子的基因型及比例为XA∶Y=1∶1，后代正常眼雄果蝇的概率为3/4×1/2=3/8。
（2）图示无眼性状的遗传方式可能是伴X隐性遗传、常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传。如果无眼性状为隐性性状，基因位于X染色体上，Ⅰ-2的基因型为XaY，Ⅱ-1的基因型为XAXa，两者杂交，后代数量足够多，后代基因型及比例为XAXa： XaXa：XAY：XaY=1：1：1：1，表型为正常眼雌性：无眼雌性：正常眼雄性：无眼雄性=1：1：1：1；如果位于常染色体上，Ⅰ-2的基因型为aa，Ⅱ-1的基因型为Aa，两者杂交，后代数量足够多，后代基因型及比例为Aa：aa =1：1，表型为正常眼：无眼=1：1，雌雄比例为1:1，正常眼雌性：无眼雌性：正常眼雄性：无眼雄性=1：1：1：1；如果无眼性状为显性性状，基因只能位于常染色体上，Ⅰ-2的基因型为Aa，Ⅱ-1的基因型为aa，两者杂交，后代数量足够多，后代基因型及比例也为Aa：aa =1：1，表型为正常眼：无眼=1：1，雌雄比例为1:1，正常眼雌性：无眼雌性：正常眼雄性：无眼雄性=1：1：1：1，故不能判断无眼性状的显隐性关系。
（3）若要确定无眼性状的遗传方式，可通过测交或者杂交的方式判断，根据题干信息只杂交一次杂交、仅根据子代表型预期结果，不涉及子代性状分离比的条件，测交是在已知相对性状显隐性的条件下进行的，不适用于本题。故选择Ⅱ-2和Ⅱ-3杂交的方式来判断。如无眼性状的遗传为伴X隐性遗传，Ⅱ-2和Ⅱ-3的基因型为XAXa×XAY，后代雌果蝇均为正常眼、雄果蝇有正常眼和无眼，只有雄果蝇有无眼性状；如无眼性状为常染色体隐性遗传，Ⅱ-2和Ⅱ-3的基因型为Aa×Aa，后代雌蝇、雄蝇既有正常眼也有无眼；如无眼性状为常染色体显性遗传，Ⅱ-2和Ⅱ-3的基因型为aa×aa，后代雌蝇、雄蝇都只有正常眼。
（4）若无眼性状产生的分子机制是由正常眼基因缺失一段较大的DNA片段所致，则无眼基因的长度比正常眼基因短。若无眼性状的遗传为伴X隐性遗传，Ⅱ-3的基因型为XAY，PCR扩增后，产物只有一条显示带（A为正常基因）；若无眼性状的遗传常染色体显性遗传，Ⅱ-3的基因型为aa，PCR扩增后电泳的产物也有一条显示带（a为正常基因），两者位置相同；若无眼性状的遗传常染色体隐性遗传，Ⅱ-3的基因型为Aa，PCR扩增后电泳的产物有两条显示带，故根据电泳结果不能确定无眼性状的遗传方式。
89．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 。
【答案】(1) 氨基酸序列 mRNA 密码子的简并性
(2) 从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制
(3) 种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间
【分析】1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列；
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
【详解】（1）据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
（4）为比较不同物质的抗凝血活性差异，可以设计 向四组材料中分别加入等量改造后的水蛭素、用酶甲处理过的 水蛭蛋白酶解产物、用酶乙处理过的水蛭蛋白酶解产物、天然水 蛭素，相同条件下观察凝血需要的时间，凝血时间越长，抗凝血 活性越高。
90．（2022·湖南·高考真题）中国是传统的水稻种植大国，有一半以上人口以稻米为主食。在培育水稻优良品种的过程中，发现某野生型水稻叶片绿色由基因C控制。回答下列问题:
(1)突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死。突变型1连续自交3代，F3成年植株中黄色叶植株占 。
(2)测序结果表明，突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5＇-GAGAG-3＇变为5＇-GACAG-3＇，导致第 位氨基酸突变为 ，从基因控制性状的角度解释突变体叶片变黄的机理 。（部分密码子及对应氨基酸:GAG谷氨酸;AGA精氨酸;GAC天冬氨酸;ACA苏氨酸;CAG谷氨酰胺）
(3)由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳（电泳条带表示特定长度的DNA片段），其结果为图中 （填“I”“Ⅱ”或“Ⅲ”）。
(4)突变型2叶片为黄色，由基因C的另一突变基因C2所致。用突变型2与突变型1杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。能否确定C2是显性突变还是隐性突变? （填“能”或“否”），用文字说明理由 。
【答案】(1)2/9
(2) 243 谷氨酰胺 基因突变影响与色素形成有关酶的合成，导致叶片变黄
(3)Ⅲ
(4) 能 若C2是隐性突变，则突变型2为纯合子，则子代CC2表现为绿色，C1C2表现为黄色，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若突变型2为显性突变，突变型2（C2C）与突变型1（CC1）杂交，子代表型及比例应为黄∶绿=3∶1，与题意不符
【分析】（1）基因突变具有低频性，一般同一位点的两个基因同时发生基因突变的概率较低；
（2）mRNA中三个相邻碱基决定一个氨基酸，称为一个密码子。
【详解】（1）突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死，说明突变型1应为杂合子，C1对C为显性，突变型1自交1代，子一代中基因型为1/3CC、2/3CC1，子二代中3/5CC、2/5CC1，F3成年植株中黄色叶植株占2/9。
（2）突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5＇-GAGAG-3＇变为5＇-GACAG-3＇，突变位点前对应氨基酸数为726/3=242，则会导致第243位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺。叶片变黄是叶绿体中色素含量变化的结果，而色素不是蛋白质，从基因控制性状的角度推测，基因突变影响与色素形成有关酶的合成，导致叶片变黄。
（3）突变型1应为杂合子，由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。Ⅰ应为C酶切、电泳结果，II应为C1酶切、电泳结果，从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳，其结果为图中Ⅲ。
（4）用突变型2（C2_）与突变型1（CC1）杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若C2是隐性突变，则突变型2为纯合子，则子代CC2表现为绿色，C1C2表现为黄色，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若突变型2为显性突变，突变型2（C2C）与突变型1（CC1）杂交，子代表型及比例应为黄∶绿=3∶1，与题意不符。故C2是隐性突变。
91．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ，终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】(1)引物
(2) 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来
(3)酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足
(4) 工业废气资源化 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排
【分析】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术，该技术的关键是Taq酶可以从引物的3’端延伸子链。
（2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳的消耗。
【详解】（1）利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。
（2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。
（3）重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足，所以会导致生长迟缓。
（4）根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了工业废气资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
92．（2022·全国乙卷·高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
【答案】(1)逆转录酶/反转录酶
(2) 特异性核苷酸序列 退火/复性
(3) 曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者
(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。
（2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性（或退火）。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。
四、实验题
93．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。
【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素
(2) 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
(3) HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 设计引物利用PCR扩增野生百合的基因L及其pL；插入Ti质粒构建基因表达载体，利用农杆菌转化 法导入百合B的体细胞，经植物组织培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原体微 生物侵染转基因百合，检测其抗病能力（要体现基因工程的步骤和关键技术，最后要进行个体生 物学水平鉴定）
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证：
【详解】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。
（2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。
（3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL，具体思路：设计引物利用PCR扩增野生百合的基因L及其pL；插入Ti质粒构建基因表达载体，利用农杆菌转化 法导入百合B的体细胞，经植物组织培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原体微 生物侵染转基因百合，检测其抗病能力（要体现基因工程的步骤和关键技术，最后要进行个体生 物学水平鉴定）
94．（2024·湖南·高考真题）钾是植物生长发育的必需元素，主要生理功能包括参与酶活性调节、渗透调节以及促进光合产物的运输和转化等。研究表明，缺钾导致某种植物的气孔导度下降，使CO2通过气孔的阻力增大；Rubisc的羧化酶（催化CO2的固定反应）活性下降，最终导致净光合速率下降。回答下列问题：
(1)从物质和能量转化角度分析，叶绿体的光合作用即在光能驱动下，水分解产生 ；光能转化为电能，再转化为 中储存的化学能，用于暗反应的过程。
(2)长期缺钾导致该植物的叶绿素含量 ，从叶绿素的合成角度分析，原因是 （答出两点即可）。
(3)现发现该植物群体中有一植株，在正常供钾条件下，总叶绿素含量正常，但气孔导度等其他光合作用相关指标均与缺钾时相近，推测是Rubisc的编码基因发生突变所致。Rubisc由两个基因（包括1个核基因和1个叶绿体基因）编码，这两个基因及两端的DNA序列已知。拟以该突变体的叶片组织为实验材料，以测序的方式确定突变位点。写出关键实验步骤：① ；② ；③ ；④基因测序；⑤ 。
【答案】(1) O2和H+ ATP和NADPH
(2) 减少 缺钾会使叶绿素合成相关酶的活性降低；缺钾会影响细胞的渗透调节，进而影响细胞对Mg、N等的吸收，使叶绿素合成减少
(3) 分别提取该组织细胞的细胞核DNA和叶绿体DNA（取突变体叶片，提取DNA） 根据编码Rubisc的两个基因的两端DNA序列设计相应引物 利用提取的DNA和设计的引物分别进行PCR扩增并电泳 和已知基因序列进行比较
【分析】光合作用包括光反应和暗反应阶段：
1、光反应阶段是在类囊体的薄膜上进行的。叶绿体中光合色素吸收的光能将水分解为氧和H+，氧直接以氧分子的形式释放出去，H+与氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）结合，形成还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。还原型辅酶Ⅱ作为活泼的还原剂，参与暗反应阶段的化学反应，同时也储存部分能量供暗反应阶段利用；在有关酶的催化作用下，提供能量促使ADP与Pi反应形成ATP。
2、暗反应在叶绿体基质中进行，在特定酶的作用下，二氧化碳与五碳化合物结合，形成两个三碳化合物。在有关酶的催化作用下，三碳化合物接受ATP和NADPH释放的能量，并且被NADPH还原。一些接受能量并被还原的三碳化合物，在酶的作用下经过一系列的反应转化为糖类；另一些接受能量并被还原的三碳化合物，经过一系列变化，又形成五碳化合物。
【详解】（1）植物光反应过程中水的光解会产生O2和H+，H+和NADP+结合产生NADPH。该过程中光能转化为电能，电能再转化为储存在ATP和NADPH中的化学能。
（2）长期缺钾导致该植物的叶绿素含量降低，其原因是钾参与酶活性的调节，缺钾会降低叶绿素合成相关酶的活性；钾参与渗透调节，缺钾会影响细胞渗透压，进而影响细胞对Mg、N等的吸收，而Mg和N是合成叶绿素的原料，因此最终会影响叶绿素的合成。
（3）Rubisc由两个基因编码，这两个基因及两端的DNA序列已知，因此检测其是否突变的基本思路利利用PCR技术扩增突变体的相应基因，测序后和已知序列进行比较。其具体步骤为：①分别提取该组织细胞的细胞核DNA和叶绿体DNA；②根据编码Rubisc的两个基因的两端DNA序列设计相应引物；③利用提取的DNA和设计的引物分别进行PCR扩增并电泳；④基因测序；⑤和已知基因序列进行比较。
95．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
【答案】(1)碳源、氮源、无机盐
(2) PT7、PBAD 和PBAD 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达
(3)杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌
(4)蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
（2）题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，可杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌。
（4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达。
（5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
96．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
【答案】(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长
(2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
(3) 划线分离 振荡培养
(4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。
（2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于PCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
（4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
97．（2024高三下·全国·专题练习）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 (填“细胞内”或“细胞外”)。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质。
Ⅰ.导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便对UGA基因进行切除。C、C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
【答案】(1)细胞外
(2)P1和P6
(3) 缺乏尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸
(4)3
【分析】PCR技术：
①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；
②原理：DNA复制；
③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；
④方式:以指数的方式扩增，即约2n；
⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。
【详解】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息可知，当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同(都含有同源序列A、B)，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
（3）Ⅰ.选择了尿嘧啶合成基因(UGA)作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C′方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。Ⅱ.由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒的物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上筛选切去UGA基因的酵母菌，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C和C′的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
98．（2023·广东·高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。

①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。

【答案】(1)野生型
(2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3) DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
五、解答题组
99．（2022·福建·高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。

(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xh I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。
培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：

(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 ① 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是 ② 。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。
【答案】(1)5'→3'
(2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）
(3) CD14蛋白/CD14抗原 分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞
(4)能在体外无限增殖
(5) CD14蛋白 参与形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14抗体
(6)小鼠腹水
【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】（1）PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5'→3'。
（2）可进一步用限制酶XhⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）。
（3）步骤①是注射特定抗原，针对本实验目的可知，要获得抗CD14单克隆抗体，故应该注射CD14蛋白/CD14抗原；步骤⑤是将分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内培养，以获得大量单克隆抗体。
（4）步骤②所用的SP2/0细胞是骨髓瘤细胞，特点是能在体外无限增殖。
（5）根据抗原—抗体杂交原理，应该用CD14蛋白检测其中是否含抗CD14蛋白的抗体。因为形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类很多，因此有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体。
（6）从制备单克隆抗体的流程可知，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，最终要从小鼠的腹水中提取抗CD14抗体。
100．（2022·辽宁·高考真题）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。
Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1
(1)构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是 。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体 （填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。
(2)质粒在包装细胞内组装出由 组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2
(3)用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用 酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的 中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。
(4)用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行 培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集 ，提取单克隆抗体。
(5)利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成 ，实现特异性治疗。
【答案】(1) 检测目的基因是否成功导入受体细胞 双分子层中
(2)蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸
(3) 胰蛋白酶或胶原蛋白 CO2培养箱
(4) 克隆化 抗原抗体杂交 细胞培养液
(5)抗体-药物偶联物/ADC
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
【详解】（1）构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。
（2）由于目的基因为N蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。
（3）进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。
（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。
（5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。
101．（2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用 制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的 中保温一段时间，其目的是 。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的 过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用 显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过 后再筛选获得，或利用转基因、 等技术获得。
（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制 生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度 时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的 检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的 能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内 形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的 ，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和 长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为 时全能性表达能力最高。
【答案】(1) 无菌水 水浴 杀死不耐热微生物
(2) 分离 KI-I2
(3) 人工诱变 原生质体融合
(4) 农杆菌 过低 敏感性
(5) 再生 细胞核 形态特征和数量
(6) 培养时间 受精卵
【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
（二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【详解】（1）产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。
（2）将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
（3）要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
（4）野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。
（5）转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
（6）植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。
102．（2022·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：
(1)取红曲霉菌种斜面，加适量 洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得 菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、 ，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行 处理。
(2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是 。测定时需用 作空白对照。
(3)生产上提取红曲色素后的残渣，经 处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和 处理。
（二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
(4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用 酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的 ，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。
(6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和 。
【答案】(1) 无菌水 活化 离心 破碎
(2) 其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小 70%乙醇溶液
(3) 灭菌 资源化
(4) 逆转录 核酸探针
(5) 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力
(6) 脾 动物血清
【分析】1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
【详解】（1）防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。
（2）用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。
（3）生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。
（4）RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
（5）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
（6）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。
【点睛】本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论。
1．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ）
A．加入适量的木瓜蛋白酶
B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D．加入 NaCl 调节浓度至 2ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14ml/L
【答案】A
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；
B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；
C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；
D、加入 NaCl 调节浓度至 2ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14ml/L，DNA在0．14ml/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。
故选A。
【点睛】
（2020·天津·高考真题）阅读下列材料，回答下列小题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一：人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二：小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三：疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
2．目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是（ ）
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
3．在利用种间关系进行生物防治的措施中，下列分析错误的是（ ）
A．施用绿僵菌工程菌减少虫害，不改变绿僵菌与害虫之间存在寄生关系
B．引入Fhb7增强小麦的抗菌性，目的是调节真菌对植物的寄生能力
C．AS1工程菌分泌的多种表达产物不改变AS1与按蚊之间存在共生关系
D．使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是调节按蚊对人的寄生能力
【答案】2．B 3．D
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、生物的种间关系包括竞争、捕食、互利共生和寄生。互利共生是指两种生物共居一起，彼此创造有利的生活条件，较之单独生活时更为有利；相互依赖，相互依存，一旦分离，双方都不能正常地生活。寄生是指一种生物生活在另一种生物的体内或体表，并从后者摄取营养以维持生活的种间关系。前者称寄生物，后者称寄主。大都为一方受益，一方受害，甚至引起寄主患病或死亡。
2．A、目的基因可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或是人工合成，A错误；
B、资料一中神经毒素基因AalT导入绿僵菌中可以增强绿僵菌致死害虫的效应，资料二中Fhb7基因导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，资料三，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，因此上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B正确；
C、基因AalT导入绿僵菌中可用感受态细胞法，Fhb7基因导入小麦可用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中可用感受态细胞法，C错误；
D、要想达到生物防治的目的不一定要将目的基因导入防治对象，如资料一，可将目的基因导入能寄生在多种害虫体内的绿僵菌中，如资料三，可将目的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，这种方法同样可以达到生物防治的目的，D错误。
故选B。
3．A、导入AalT基因的绿僵菌只是增强了致死害虫的效应，没有改变绿僵菌与害虫之间存在的寄生关系，A正确；
B、Fhb7基因导入小麦后，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，调节了真菌对植物的寄生能力，B正确；
C、AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，并不会改变AS1与按蚊之间存在的共生关系，C正确；
D、使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是阻断疟疾的传播，不会改变按蚊对人的寄生能力，D错误。
故选D。
4．（2020·海南·高考真题）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
【答案】A
【分析】1.DNA粗提取与鉴定的原理1.DNA的溶解性：
（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14ml/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；
（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离；
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响；
3.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】A、羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误；
B、提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确；
C、预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据DNA蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确；
D、由分析可知，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，据此鉴定DNA的存在，D正确。
故选A。
【点睛】
5．（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③B．①+②C．③+②D．③+④
【答案】B
【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。
【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。
故选B。
6．（2020·北京·高考真题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。以下表述错误的是（ ）
A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测
B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术
C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合
D．可用抗原-抗体反应检测抗体基因表达产物
【答案】A
【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
【详解】A、单抗检测病毒是否存在的原理是抗原―抗体杂交，检测病毒蛋白；直接检测新冠病毒核酸是分子杂交，检测是否含有病毒的核酸，所以抗体不能直接检测核酸，A错误；
B、题意显示，我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，制备出全人源单克隆抗体。据此可推测，在该单抗制备过程中利用了基因工程技术，B正确；
C、针对新冠病毒表面抗原制备出的单抗，可与新冠病毒相应蛋白特异性结合，C正确；
D、抗体基因表达产物检测的方法是采用抗原―抗体杂交反应，若呈阳性，则说明已翻译出相应的蛋白质，D正确。
故选A。
7．（2020·江苏·高考真题）生物学实验常呈现“五颜六色”的变化。下列实验中溶液颜色变化的叙述正确的是（ ）
A．在新鲜的梨汁中加入斐林试剂，混匀后在加热条件下由无色变成砖红色
B．在厌氧发酵的果汁中加入酸性重铬酸钾溶液，混匀后由蓝色变成灰绿色
C．在DNA溶液中加入二苯胺试到，混匀后在沸水浴条件下逐渐变成蓝色
D．在氨基酸溶液中加入双缩脲试剂，混匀后逐渐变成紫色
【答案】C
【分析】高中生物学中的颜色反应：
1、斐林试剂检测可溶性还原糖：还原糖+斐林试剂→砖红色沉淀。
2、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ检测脂肪：苏丹Ⅲ+脂肪→橘黄色；苏丹Ⅳ+脂肪→红色
3、双缩脲试剂检测蛋白质：蛋白质+双缩脲试剂→紫色
4、碘液检测淀粉：淀粉+碘液→蓝色
5、DNA的染色与鉴定：DNA+甲基绿→绿色 DNA+二苯胺→蓝色
6、吡罗红使RNA呈现红色：RNA+吡罗红→红色
7、台盼蓝使死细胞染成蓝色
8、线粒体的染色：健那绿染液是专一性染线粒体的活细胞染料，可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色，而细胞质接近无色。
9、酒精的检测：橙色的重铬酸钾溶液在酸性条件下与酒精发生化学反应，变成灰绿色。
10、CO2的检测：CO2可以使澄清的石灰水变混浊，也可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄。
11、染色体（或染色质）的染色：染色体容易被碱性染料（如龙胆紫溶液或醋酸洋红溶液）染成深色。
【详解】A、斐林试剂为蓝色而非无色，A错误；
B、重铬酸钾溶液在酸性条件下与酒精发生化学反应，由橙色变成灰绿色，B错误；
C、DNA溶液中加入二苯胺在沸水浴条件下变为蓝色，C正确；
D、双缩脲试剂检测蛋白质，不能检测氨基酸，D错误。
故选C。
8．（2020·山东·高考真题）人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA；胚胎在发育过程中也会有细胞脱落破碎，其DNA进入孕妇血液中，称为cffDNA。近几年，结合DNA测序技术，cfDNA和cffDNA在临床上得到了广泛应用。下列说法错误的是（ ）
A．可通过检测cfDNA中的相关基因进行癌症的筛查
B．提取cfDNA进行基因修改后直接输回血液可用于治疗遗传病
C．孕妇血液中的cffDNA可能来自于脱落后破碎的胎盘细胞
D．孕妇血液中的cffDNA可以用于某些遗传病的产前诊断
【答案】B
【分析】1、基因治疗就是用正常基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。目的基因被导入到靶细胞内，他们或与宿主细胞染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得以表达，起到治疗疾病的作用。
2、产前诊断又称宫内诊断，是对胚胎或胎儿在出生前应用各种先进的检测手段，了解胎儿在宫内的发育情况，如胎儿有无畸形，分析胎儿染色体核型，检测胎儿的生化检查项目和基因等，对胎儿先天性和遗传性疾病做出诊断，为胎儿宫内治疗及选择性流产创造条件。
【详解】A、癌症产生的原因是原癌基因和抑癌基因发生突变，故可以通过检测cfDNA中相关基因来进行癌症的筛查，A正确；
B、提取cfDNA进行基因修改后直接输回血液，该基因并不能正常表达，不可用于治疗遗传病，B错误；
C、孕妇血液中的cffDNA，可能来自胚胎细胞或母体胎盘细胞脱落后破碎形成，C正确；
D、提取孕妇血液中的cffDNA，因其含有胎儿的遗传物质，故可通过DNA测序技术检测其是否含有某种致病基因，用于某些遗传病的产前诊断，D正确。
故选B。
【点睛】本题结合cfDNA和cffDNA的产生过程，考查癌症的产生原因、人类遗传病和产前诊断的相关内容，旨在考查考生获取题干信息的能力，并能结合所学知识灵活运用准确判断各选项。
9．（2020·天津·高考真题）在天花病毒的第四代疫苗研究中，可利用天花病毒蛋白的亚单位（在感染和致病过程中起重要作用的成分）制作疫苗。注射该疫苗可诱导机体产生识别天花病毒的抗体。下列分析错误的是（ ）
A．可通过基因工程途径生产这种疫苗
B．天花病毒蛋白的亚单位是该病毒的遗传物质
C．该方法制备的疫苗不会在机体内增殖
D．天花病毒蛋白的亚单位是疫苗中的抗原物质
【答案】B
【分析】1、基因工程的运用：
（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质；
（2）动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物；
（3）利用基因工程生产药物：细胞因子，抗体，疫苗，激素等。
2、天花病毒是DNA病毒。
3、疫苗可以作为抗原刺激机体产生免疫反应，使机体产生记忆细胞，当相同的抗原再次进入机体，刺激机体产生二次免疫，短时间内产生大量的抗体。
【详解】A、该疫苗的本质是蛋白质的亚单位，由基因控制合成，所以可以利用基因工程生产疫苗，A正确；
B、天花病毒的遗传物质是核酸（DNA），B错误；
C、疫苗的本质是蛋白质的亚单位，不会在细胞内增殖，C正确；
D、疫苗可以作为抗原刺激机体产生特异性免疫反应，D正确。
故选B。
【点睛】本题需要考生识记病毒的结构，理解疫苗的作用。
10．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
【答案】D
【分析】基因工程中通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按一定的程序进行操作，包括目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。
【详解】A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；
B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；
C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；
D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。
故选D。
11．（2019·江苏·高考真题）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
【答案】D
【分析】转基因技术的原理是基因重组。基因重组和基因突变、染色体变异均属于可遗传的变异。
基因治疗：指把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
【详解】将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。故选D。
12．（2019·江苏·高考真题）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
【答案】A
【分析】DNA粗提取选材的标准：DNA含量高，并且材料易得．由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不采用哺乳动物的血液。DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14ml/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】兔属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白后是非常容易断裂的,如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B正确；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大。如果用热的95%酒精会提高DNA的溶解度,不能完全使DNA沉淀，C正确；将析出的DNA溶解在2ml/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D正确。
13．（2019·北京·高考真题）甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种，以下对相关操作及结果的叙述，错误的是
A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞
B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定
C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株
D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体
【答案】D
【分析】由题意可知，同时抗甲、乙的植物新品种的培养过程为：把含抗甲的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗甲植株，同时把含抗乙的目的基因的重组质粒导入植物细胞，获得抗乙植株，通过杂交获得F1（二倍体植株），取F1的花粉经花药离体培养获得单倍体植株，用秋水仙素处理单倍体植株获得纯合的同时抗甲、乙的植物新品种（二倍体）。
【详解】要获得转基因的抗甲或抗乙植株，需要构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点），再把基因表达载体导入受体细胞中，A正确；对转基因植株进行检测时，可以通过抗病接种实验进行个体水平的检测，B正确；对F1的花粉进行组织培养时，需要经过脱分化和再分化过程，其中生长素/细胞分裂素比例高时利于根的分化，比例低时利于芽的分化，C正确；经花粉离体培养获得的植株是单倍体，D错误。因此，本题答案选D。
14．（2018·江苏·高考真题）关于还原糖、蛋白质和DNA的鉴定实验，下列叙述正确的是
A．在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色
B．在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色
C．提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液
D．将DNA粗提物溶解在2 ml/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色
【答案】D
【详解】【分析】生物组织中化合物的鉴定：（1）斐林试剂可用于鉴定还原糖，在水浴加热的条件下，溶液的颜色变化为砖红色（沉淀）；（2）蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应；（3）脂肪可用苏丹Ⅲ染液（或苏丹Ⅳ染液）鉴定，呈橘黄色（或红色）；（4）淀粉遇碘液变蓝；（5）甲基绿能使DNA呈绿色，吡罗红能使RNA呈绿色，二苯胺与DNA在水浴加热的条件下产生蓝色反应。
【详解】甘蔗茎的组织样液富含蔗糖，而蔗糖属于非还原糖，且检测还原糖的试剂是斐林试剂而不是双缩脲试剂，A错误；大豆种子中富含蛋白质，先后加入双缩脲试剂A液和B液摇匀后，液体由蓝色变成紫色，B错误；提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤纸上的粘稠物，留下滤液，C错误；将DNA粗提物溶解在2ml/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂并水浴加热，溶液由无色变成蓝色，D正确。
【点睛】解答本题的关键是注重平常的积累，识记常见的显色反应，明确不同的化合物可以用不同的显色剂进行鉴定，并注意不同的鉴定实验中的特别注意事项。
15．（2018·北京·高考真题）以下高中生物学实验中，操作不正确的是（ ）
A．在制作果酒的实验中，将葡萄汁液装满整个发酵装置
B．鉴定DNA时，将粗提产物与二苯胺混合后进行沸水浴
C．用苏丹Ⅲ染液染色，观察花生子叶细胞中的脂肪滴（颗粒）
D．用龙胆紫染液染色，观察洋葱根尖分生区细胞中的染色体
【答案】A
【详解】【分析】该题考查高中几个主要实验的材料选择、试剂选择、操作步骤等
【详解】在制作果酒的实验中，葡萄汁液不能装满发酵装置，要留出1/3的空间，A错误；在DNA鉴定实验中，DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，B正确；用苏丹Ⅲ染液可以把花生子叶细胞中的脂肪颗粒染成橘黄色，C正确；用龙胆紫染液能将细胞中的染色体染成深紫色，在洋葱根尖分生区细胞中能清晰地观察到，D正确，所以选A。
【点睛】注意题目中的“果酒”、“装满”
16．（2018·北京·高考真题）用XhI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）
A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
【答案】D
【详解】【分析】该题考查DNA的结构、限制酶的特点和功能等。DNA一般是双螺旋结构；限制酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割。
【详解】限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhI和SalI两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；Sal I将DNA片段切成4段，Xh I将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为Sal I，泳道②为Xh I，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误，所以选D。
【点睛】注意图1两种限制酶的识别位点数量，Sal I有3个识别位点，能将DNA片段切成4段，Xh I有2个识别位点，能将DNA片段切成3段。
17．（2018·浙江·高考真题）将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，这种导入外源基因的方法属于
A．杂交育种B．转基因技术C．单倍体育种D．多倍体育种
【答案】B
【分析】基因工程又叫转基因技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
【详解】将一种生物的基因导入另一种生物体内需要采用基因工程技术。因此，将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，需要采用转基因技术，这样可以培育出在冬天也能长期保存的西红柿。
故选B。
18．（2017·浙江·高考真题）若利用根瘤农杆菌转基因技术将抗虫基因和抗除草剂基因转入大豆，获得若干转基因植物（T0 代），从中选择抗虫抗除草剂的单株S1、S2 和S3 分别进行自交获得T1 代，T1 代性状表现如图所示。已知目的基因能1次或多次插入并整合到受体细胞染色体上。下列叙述正确的是
A．抗虫对不抗虫表现为完全显性，抗除草剂对不抗除草剂表现为不完全显性
B．根瘤农杆菌Ti质粒携带的抗虫和抗除草剂基因分别插入到了S2的2条非同源染色体上，并正常表达
C．若给S1 后代T1 植株喷施适量的除草剂，让存活植株自交，得到的自交一代群体中不抗虫抗除草剂的基因型频率为 1/2
D．若取S2 后代T1 纯合抗虫不抗除草剂与纯合不抗虫抗除草剂单株杂交，得到的子二代中抗虫抗除草剂的纯合子占 1/9
【答案】C
【详解】图中S3自交获得的T1代：抗虫抗除草剂：抗虫不抗除草剂：不抗虫抗除草剂：不抗虫不抗除草剂=9:3:3:1，因此说明抗虫对不抗虫表现为完全显性，抗除草剂对不抗除草剂为完全显性，A项错误；只有单株S3符合抗虫和抗除草剂基因分别插入到了2 条非同源染色体上，并正常表达，而S2自交后代T1代中，抗虫抗除草剂植株有70株，而抗虫不抗病和不抗虫抗除草剂植株都只有5株，说明分别有两个抗虫基因和两个抗除草剂基因插入在S2植株细胞的两对同源染色体上，B项错误；S1自交获得的T1代中，抗虫抗除草剂：抗虫不抗除草剂：不抗虫抗除草剂=2:1:1，设抗除草剂与不抗除草剂分别由A和a控制，抗虫与不抗虫由B和b基因控制，当S1植株的A基因与b基因在一条染色体上，B基因与a基因位于另一条同源染色体上，才会出现T1代的抗虫抗除草剂（AaBb）：不抗虫抗除草剂（AAbb）：抗虫不抗除草剂（aaBB）=2:1:1，喷施除草剂后，S1 后代T1 植株中抗虫不抗除草剂植株（aaBB）死亡，剩余的抗除草剂植株（2AaBb+1AAbb）自交一代获得的群体的基因型为：（AAbb+ AaBb+aaBB）+AAbb，其中不抗虫抗除草剂的基因型（AAbb）频率为×+=，C项正确；S2自交后代T1代中，抗虫抗除草剂植株有70株，而抗虫不抗病和不抗虫抗除草剂植株都只有5株，说明分别有两个抗虫基因与抗除草剂基因在S2植株细胞的两对同源染色体上，则T1 纯合抗虫不抗除草剂（AAAAbbbb）与纯合不抗虫抗除草剂（aaaaBBBB）单株杂交，得到的子二代均为抗虫抗除草剂（AAaaBBbb），没有纯合子，D项错误。
【点睛】解答此题的思路是：第一，根据S3的T1代判断出抗虫基因和抗除草剂基因分别导入两对同源染色体中的一条上，进而判断出抗虫基因和抗除草剂基因均为显性；第二，根据基因自由组合定律的子二代性状分离比情况，判断S1的T1代不遵循基因的自由组合定律，进一步推断出抗虫基因和抗除草剂基因分别导入同一对同源染色体的各一条染色体上；第三步，根据S2的T1代性状分离比，假设抗虫基因和抗病基因可能位于两对染色体的两条非同源染色体上，然后经过演绎得出假设是正确的；最后根据以上信息计算出C项和D项的概率。
19．（2017·北京·高考真题）为了增加牡丹的花色类型，研究者从某植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，
再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是
A．用限制性核酸内切酶EcRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染牡丹的愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加青霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
【分析】本题考查基因工程的相关知识，掌握基因工程操作流程及各个操作依据的原理是正确解答该题的关键。
【详解】A、用限制性核酸内切酶EcRI处理目的基因和质粒，可以使目的基因两侧和质粒产生相同的黏性末端，再用连接酶把切口连起来就能构建成重组质粒，A正确；
B、农杆菌转化法适用于双子叶植物或裸子植物，菊花属于双子叶植物，故可用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；
C、质粒中只有潮霉素抗性基因，被转化的菊花细胞只对潮霉素具有抗性，在培养基中添加青霉素，不能筛选被转化的菊花细胞，C错误；
D、检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，可采用DNA分子杂交技术，D正确。
故选C。
20．（2017·上海·高考真题）生物工程包含多项分支技术，就其产业化应用而言，生物工程的基本原理是
A．必须改造相关生物的基因B．以糖类物质作为主要原料
C．以活细胞作为生物反应器D．以原生物体的代谢物为产品
【答案】C
【详解】从产业化利用角度分析，生物工程的基本原理是以活细胞作为生物反应器，获得人类所需的细胞产物，故选C。
二、解答题
21．（2021·重庆·高考真题）为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。
(1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行 处理；子宫取出剪碎后，用 处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。
(2)培养基中营养物质应有 （填写两种）；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是 。
(3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是 。为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为 。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有 （填“抑制”或“促进”）作用。
【答案】(1) 灭菌 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
(2) 无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆（填写两种即可） 维持培养液的pH值
(3) RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA 基质细胞悬浮液、空载体和基质细胞的混合培养液 促进
【分析】1、构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因。
2、动物细胞培养的条件：
（1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌；②添加一定量的抗生素；③定期更换培养液，以清除代谢废物。
（2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。
（3）温度和pH：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。
（4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH）。
【详解】（1）为避免细菌污染，手术器具应进行灭菌处理；动物组织取出剪碎后，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一定时间，可获得分散的动物组织细胞。
（2）动物细胞培养时，培养基中营养物质应有无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆等；培养箱中为95%的空气和5%的CO2，其中5%的CO2的主要作用是维持培养液的pH值。
（3）启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA。为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为基质细胞悬浮液（空白对照）、空载体和基质细胞的混合培养液（排除空载体的作用）。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有促进作用。
22．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在 。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
【答案】(1) mRNA 蛋白M上不含tag标签 BC
(2) 黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处或基因m的内部
(3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误；
B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；
C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。
故选BC。
（2）①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
（3）①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行知识迁移，准确答题。
23．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9蛋白可切割 序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程： 。
【答案】(1)DNA连接酶
(2)感受态细胞法/Ca2+处理法
(3) 碱基互补配对 目标（目的）DNA（基因）
(4) DNA分子杂交技术 经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功
(5)表达Cas9蛋白和sgRNA，两者形成复合体；sgRNA识别并结合目标DNA序列；引导Cas9蛋白切割目标DNA序列
【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
（2）大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（3）根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
（4）可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功。
（5）根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列。
【点睛】本题以基因编辑技术为情境，考查DNA分子的结构、碱基互补配对、基因工程等相关知识，考查学生综合应用能力及科学思维的核心素养。
24．（2021·福建·高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用 酶将载体P切开，再用 （填“T4DNA或“E·cli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是 。
【答案】(1)引物1和引物4
(2) EcRV T4DNA 启动子 终止子 XhI和PstI 钙
(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
【分析】1、PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
（2）①MT基因的末端为平末端，故需要用EcR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入Xh I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcR Ⅴ将载体P切开；由于E·cli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhI和PstI酶，故可选用XhI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
（3）由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，解答本题的关键是分析题图，明确基因工程的工具，并根据限制酶的切割位点判断引物应该设计的碱基序列，结合题意明确检测基因表达载体的方法。
25．（2021·辽宁·高考真题）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．cliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】(1)逆转录
(2) EcRI PvitⅡ T4DNA连接酶
(3)感受态
(4)3
(5)G2/M
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
【详解】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
（3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
（5）比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
【点睛】本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，结合题干中目的基因的大小分析电泳图。
26．（2021·天津·高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑 和 。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】(1)细胞质基质
(2) 包含BamHI的识别序列 将GTG改为ATG 原核生物复制原点 不能 缺失尿嘧啶
(3)B
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
（2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。
②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
（3）A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；
B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；
C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；
D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
故选B。
【点睛】本题以获得能产生乳酸的工程菌株为背景，考查基因工程的相关内容，重点考查基因表达载体的构建，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，识记PCR技术的原理和过程，能结合所学的知识准确答题。
27．（2021·北京·高考真题）玉米是我国重要的农作物，研究种子发育的机理对培育高产优质的玉米新品种具有重要作用。
(1)玉米果穗上的每一个籽粒都是受精后发育而来。我国科学家发现了甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4。籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的 定律。上述果穗上的正常籽粒均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株所占比例约为 。
(2)为阐明籽粒干瘪性状的遗传基础，研究者克隆出候选基因A/a。将A基因导入到甲品系中，获得了转入单个A基因的转基因玉米。假定转入的A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，请从下表中选择一种实验方案及对应的预期结果以证实“A基因突变是导致籽粒干瘪的原因” 。
(3)现已确认A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA（见图1），使A基因功能丧失。甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株的基因型为 。
(4)为确定A基因在玉米染色体上的位置，借助位置已知的M/m基因进行分析。用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P与基因型为MM的甲品系杂交得F1，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒（F2）胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，如图2所示。
统计干瘪籽粒（F2）的数量，发现类型1最多、类型2较少、类型3极少。请解释类型3数量极少的原因 。
【答案】(1) 分离 2/3
(2)III ④/II ③
(3)Aa
(4)基因Aa与Mm在一对同源染色体上（且距离近），其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体/同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少。
【分析】1、基因分离定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子时，等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代；位于性染色体上的基因控制的性状的遗传总是和性别相关联，叫伴性遗传，伴性遗传也遵循分离定律。
2、基因突变：（1）DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。（2）基因突变的特点：普遍性、随机性、不定向性、多害少利性等。
【详解】（1）分析题干信息：“甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4”，即甲品系籽粒正常，其自交后代出现性状分离，且籽粒正常∶干瘪=3∶1，可知籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的分离定律。假设籽粒正常和干瘪这一对相对性状由基因A/a控制，则甲品系基因型为Aa。上述果穗上的正常籽粒基因型为1/3AA或2/3Aa，均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株基因型为Aa，所占比例约为2/3。
（2）分析题意可知，假定A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，由于转入的单个A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，则甲品系玉米基因型为Aa，野生型玉米的基因型为00AA（0表示没有相关基因），转基因甲品系玉米的基因型为A0Aa，且导入的A基因与细胞内原有的A/a基因之间遗传遵循自由组合定律，要证实该假设正确，应可选择方案III转基因玉米自交，依据自由组合定律可知，子代为④正常籽粒（9A-A-、3A-aa、300A-）：干瘪籽粒（100aa）≈15：1；或选择方案II转基因玉米A0Aa×甲品系00Aa杂交，子代为③正常籽粒（3A0A-、1A0aa、300A-）：干瘪籽粒（00aa）≈7：1。
（3）已知A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA，使A基因功能丧失，甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株中含有a基因，即其基因型为Aa。
（4）用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P（基因型为AAmm）与基因型为MM的甲品系（基因型为AaMM）杂交得F1，基因型为1/2AAMm、1/2AaMm，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒F2胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，基因型分别为aaMM、aaMm、aamm。若两对等位基因位于两对同源染色体上，则类型3的数量应该与类型1的数量同样多，而实际上类型3数量极少，原因可能是：由于基因Aa与Mm在一对同源染色体上（且距离近），其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体/同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少。
【点睛】本题结合基因工程考查基因分离定律和基因自由组合定律的应用，以及基因位置的判断的相关知识，思维含量较大，要求学生能够理解遗传定律的实质，依据题干信息准确分析，得出结论。
28．（2021·北京·高考真题）新冠病毒（SARS-CV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
(1)新冠病毒是RNA病毒，一般先通过 得到cDNA，经 获取S基因，酶切后再连接到载体。
(2)重组疫苗中的S基因应编码________。
A．病毒与细胞识别的蛋白B．与病毒核酸结合的蛋白
C．催化病毒核酸复制的酶D．帮助病毒组装的蛋白
(3)为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→ → →诱发特异性免疫反应。
(4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因 。
【答案】(1) 逆转录/反转录 PCR扩增
(2)A
(3) （重组腺病毒）进入细胞 表达抗原
(4)重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统。
【分析】重组腺病毒疫苗必须具备的条件：能够将新冠病毒抗原基因（目的基因）带入到受体细胞；在受体细胞中表达出抗原蛋白；不会导致疾病发生。
【详解】（1）新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。用cDNA扩增出目的基因——S基因，需要利用PCR扩增技术。
（2）重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的，所以重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。
故选A。
（3）重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫——细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫反应。
（4）接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA会不断表达出S蛋白，S蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。
【点睛】本题以新冠肺炎为问题情境，考查重组腺病毒疫苗和免疫的相关知识，考查考生运用所学知识解决实际问题的能力。
29．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
【答案】 SalI EcRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列；
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xh Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xh Ⅰ 、DNA连接酶；
（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。
30．（2021·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与甘蔗醋制作有关的问题：
（1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经 后加入3%体积的无水乙醇。然后将10 g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24 h。用 将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30 ℃培养48h。再挑取分离培养基上具有 的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的 培养基上培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
（2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中 含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有 （答出2点即可）等特点。
（3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经 后用于发酵。其固定化方法为 。
（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
【答案】 冷却 玻璃刮刀 较大透明圈 斜面 乙醇 耐酒精度高、耐酸高 灭菌 吸附法 富营养化 重组DNA分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射 胰蛋白酶 原代 饲养层细胞
【分析】1、涂布法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在固体培养皿表面，经培养后可形成单个菌落，是筛选高表达量菌株的常用方法；
2、基因工程的基本操作步骤为：获取目的基因、形成重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。
【详解】（一）
（1）高压蒸汽灭菌刚结束时，培养基温度较高，要等培养基冷却后再加入3%体积的无水乙醇。涂布分离法可用于单菌落分离，使用玻璃刮刀将待分离的菌液涂布到分离培养基的整个平面上。醋酸菌发酵产生的醋酸会使培养基中的CaCO3分解，形成透明圈。菌落小，透明圈大，代表着高产醋酸菌。菌种的贮存方法：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面培养基上，培养24h后，置于4℃冰箱中保存。
（2）醋酸发酵结束的标志性：产物不再增加（醋酸浓度不再上升）或原料消耗到最低值（乙醇含量达到最低）。优质菌种不光要产酸高，还要耐高酸，同时还要耐酒精（原料）等特点。
（3）我们在利用微生物时，常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此，在培养微生物时必须进行无菌操作，所以作为固定化介质的甘蔗渣需要经过灭菌处理。甘蔗渣类似果醋发酵装置中的锯末，可使醋杆菌吸附在甘蔗渣上进行发酵。
（二）
（1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华或赤潮。
（2）具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。
（3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO2培养箱、调节pH等。
【点睛】1、熟练掌握微生物的筛选、分离和保存，以及微生物固定化方法是解题的关键；
2、熟练掌握基因工程的基本操作步骤，并了解每一步的目的是解题的关键。
31．（2021·湖南·高考真题）M 基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M 基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M 基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
（1）在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是 ，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是 。
（3）与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是 。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为 （答出两点即可），功能上具有 。
（4）鉴定转基因动物：以免疫小鼠的 淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M 基因是否失活的实验思路 。
【答案】 限制性核酸内切酶（限制酶） 磷酸二酯键 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 细胞体积小，细胞核大，核仁明显（任选两点作答） 发育的全能性 B 取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、核移植：
（1）概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物；
（2）原理：动物细胞核的全能性；
（3）动物细胞核移植可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
【详解】（1）基因工程中切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶），故在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是限制性核酸内切酶（限制酶）。限制性内切核酸内切酶是作用于其所识别序列中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端。
（2）在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
（3）由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率低。胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
（4）先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，制备M蛋白的单克隆抗体；若要利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活，如果M基因已经失活，则克隆动物A中无法产生M蛋白的单克隆抗体，则可利用抗原—抗体杂交技术进行检测。故实验思路为：取动物A和克隆动物A的肝组织细胞，分别提取蛋白质进行抗原—抗体杂交。
【点睛】本题结合图示考查基因工程、核移植、胚胎移植、单克隆抗体的相关知识，涉及知识点较多，但难度不大，要求考生掌握基础知识，属于考纲中识记与理解层次。
32．（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为 。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是 。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的 （填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 （写出两点即可）。
【答案】 基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【分析】1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
33．（2021·广东·高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有 。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是 。在分子水平上，可以通过改变 ，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】 基因文库中获取、人工合成法 盐析法、酶解法或高温变性 感受态 抗原-抗体杂交技术 有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
34．（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是 。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】 ④②③① Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 病原菌的两条单链DNA 一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【分析】PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
【详解】（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【点睛】本题考查PCR技术及应用，难度较小，解答本题的关键是明确PCR技术的原理，具体反应过程，以及在临床病原菌检测中的应用。
35．（2021·全国甲卷·高考真题）用一段由放射性同位素标记的DNA片段可以确定基因在染色体上的位置。某研究人员使用放射性同位素32P标记的脱氧腺苷三磷酸(dATP，dA-Pα~Pβ~Pγ)等材料制备了DNA片段甲（单链），对W基因在染色体上的位置进行了研究，实验流程的示意图如下。
回答下列问题：
（1）该研究人员在制备32p标记的DNA片段甲时，所用dATP的α位磷酸基团中的磷必须是32P，原因是 。
（2）该研究人员以细胞为材料制备了染色体样品，在混合操作之前去除了样品中的RNA分子，去除RNA分子的目的是 。
（3）为了使片段甲能够通过碱基互补配对与染色体样品中的W基因结合，需要通过某种处理使样品中的染色体DNA 。
（4）该研究人员在完成上述实验的基础上，又对动物细胞内某基因的mRNA进行了检测，在实验过程中用某种酶去除了样品中的DNA，这种酶是 。
【答案】 dATP脱去β、γ位上的两个磷酸基团后，则为腺嘌呤脱氧核苷酸，是合成DNA的原料之一 避免RNA分子与DNA探针的结合
解旋 DNA酶
【分析】根据题意，通过带32p标记的DNA分子与被测样本中的W基因进行碱基互补配对，形成杂交带，可以推测出W基因在染色体上的位置。
【详解】（1）dA-Pα~Pβ~Pγ脱去β、γ位上的两个磷酸基团后，则为腺嘌呤脱氧核苷酸，是合成DNA的原料之一。因此研究人员在制备32p标记的DNA片段甲时，所用dATP的α位磷酸基团中的磷必须是32p。
（2）去除样品中RNA分子，避免了RNA分子与DNA探针的结合，使杂交条带仅为DNA探针与染色体上DNA结合产生的。
（3）DNA分子解旋后的单链片段才能与32p标记的DNA片段甲进行碱基互补配对，故需要使样品中的染色体DNA解旋。
（4）DNA酶可以水解DNA分子从而去除了样品中的DNA。
【点睛】本题考查知识点中对DNA探针法的应用，考生需要掌握DNA探针的原理，操作的基本过程才能解题。
36．（2021·全国乙卷·高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. cli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段最好用E. cli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段最好用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
【答案】 EcRI、PstI EcRI、PstI、 SmaI和EcRV 磷酸二酯键 自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】（1）限制酶EcRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcRV切割形成的是平末端，E. cli DNA连接酶来源于大肠杆菌，将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来的效率高，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，连接平末端效率较高。因此图中EcRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）最好用E. cli DNA连接酶连接，限制酶SmaI和EcRV切割后的DNA片段（平末端）最好用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
37．（2020·海南·高考真题）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。
回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是 。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计 ，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为 ；出现阴性反应者，胚胎为 。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是 ，检测的基本思路是 。
【答案】 雄性原核较大，更容易容纳外源DNA 引物 雄性小鼠 雌性小鼠 抗原-抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功
【分析】根据题意和图示分析可知：图示首先通过转基因技术将目的基因导入到成熟精子的染色体中，再通过体外受精作用将目的基因移入到受精卵中，再通过早期胚胎培养和胚胎移植，最终获得转基因鼠。
【详解】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
【点睛】本题结合胚胎工程考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节；识记体外受精技术的过程，掌握早期胚胎培养的条件及胚胎移植的生理学基础，能结合图中信息准确答题。
38．（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
（1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是 。
（2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。
（3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。
（4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。
（5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。（举一例）
【答案】 多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染
【分析】基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端；
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
图2中对照组2也可以将纤维素进行分解，但其分解能力较弱。
【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。
（2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。
（3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。
（4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1酶）。
（5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
【点睛】本题以基因工程为核心，考查表达载体的构建、工程菌的实验的知识，难点是分析基因表达时DNA的方向，mRNA与DNA的模板链互补；（4）中结合实验目的找到自变量。
39．（2020·江苏·高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcR I酶切为例）：
请据图回答问题：
（1）步骤I用的EcR I是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95℃是为了获得 ；TaqDNA聚合酶的作用是催化 。
（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 （从引物①②③④中选择，填编号）。
（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是 。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGC----------CGAGTAC-3′
【答案】 限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B
【分析】采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
【详解】（1）EcR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
【点睛】本题主要考查PCR的过程和应用，意在强化考生对PCR技术的理解，要求考生能分析题图提取有效信息，从引物碱基序列、延伸方向等方面进行分析和解答，对考生的理解和分析能力提出了较高要求。
40．（2020·山东·高考真题）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
（1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是 ， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
（2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了 ，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填：发生或不发生)改变，原因是 。
（3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经 过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是 。
（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为 ，原因是 。
【答案】 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合） 品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
【分析】基因工程的操作步骤：
1、获取目的基因（从基因组文库中获取、利用PCR技术扩增目的基因、化学合成法）；
2、基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；一个完整的基因表达载体包括：
（1）启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动目的基因的转录；（2）目的基因：编码蛋白质的基因；（3）终止子：位于基因的尾端，其作用使转录在需要的地方停止；（4）标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
3、将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
4、目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。
（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。
（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。
（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
【点睛】本题考查基因工程的知识点，要求学生掌握基因工程的操作工具和操作步骤是解决问题的关键。识记并理解基因工程中工具酶的种类和作用，把握基因表达载体构建的过程，理解启动子的功能和编码蛋白质的基因的结构，这是该题考查的难点；把握PCR扩增技术的操作过程和引物的作用，这是突破第（3）问的关键。
41．（2020·天津·高考真题）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。
据图回答：
（1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有 个。
（2）在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是 。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成 种DNA片段。
（4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是 。
（5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有 。
A．B细胞 B．T细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞
【答案】 6 ABCD 3 核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 AB
【分析】本题以自身免疫病和Ⅰ型糖尿病为背景，考查了基因工程的相关知识，乳酸菌是原核细菌，要表达人体的人胰岛素抗原，必须通过基因工程技术才能实现。图示中将人胰岛素编码序列进行了改造，再与一小段短肽编码序列结合形成重组人胰岛素编码序列，进而构成重组表达载体。
【详解】（1）从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。
（2）要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。
（4）乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。
（5）人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。
【点睛】本题综合考查细胞的结构和功能、免疫调节和基因工程等相关的知识点，考向灵活，各知识点联系紧密，需认真审题。
42．（2020·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：
（1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的 。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的 ，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值 的处理效果好。③对不同处理进行 ，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。
（2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成 ，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已 的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径 的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的 下降。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的 。
（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、 及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用 的转基因方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间 ，且不经历 过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。
（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加 ，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成 ，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如 （A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。
【答案】 澄清度 95%乙醇 较小 抽滤 细菌悬液 灭菌 较小 粘性 抗性基因 全能性表达充分 显微注射 短 脱分化 生长素 根的分生组织 B
【分析】发芽培养基：3000mLMS培养基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g琼脂，再加蒸馏水至4000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共100瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
生根培养基：1000mLMS培养基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g琼脂，再加蒸馏水至2000mL，混合均匀加热至琼脂融化后，通过三角漏斗分装至100mL，三角瓶中每瓶40mL，共50瓶三角瓶，加上封口膜后1kg压力下在灭菌锅内灭菌20分钟。
【详解】（一）（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测OD值，OD值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。
（2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌水配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。
（二）（1）设计重组质粒时，除了要含有可表达的目的基因，还需要有可表达的抗性基因（如抗生素抗性基因），在添加抗生素的培养基上，含重组质粒的宿主细胞能够生长，因而被筛选出来。
（2）转基因实验要求宿主细胞性状优良、遗传稳定性较高、全能性（细胞发育成个体的潜能）较高及易被农杆菌侵染等特点。若植物材料对农杆菌不敏感，可采用显微注射的方法。
（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程，比利用茎段诱导产生愈伤组织获得丛状苗的过程时间更短，因为不需要经历脱分化的过程，而且遗传性状稳定。植物器官的分化需要一定的营养物质及适宜的激素配比，配制丛状苗生根培养基需根据实际情况添加生长素，促进基部细胞形成愈伤组织，并进一步分化形成根的分生组织，最终形成根。比较发芽培养基和生根培养基可知MS培养基的浓度下降，因此可降低培养基的浓度促进生根。故选B。
【点睛】本题主要考查果胶的降解、基因工程及植物克隆知识，要求学生熟悉教材，并能将理论知识与实际应用相结合。
43．（2020·全国III卷·高考真题）W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。
（1）步骤①中需要使用的工具酶有 。步骤②和③所代表的操作分别是 和 。步骤④称为 。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的 （答出2点即可）的限制。
（3）一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息 （填相同或不同），原因是 。
（4）从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有 （答出2点即可）。
【答案】 限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 早期胚胎培养 胚胎移植 性别、年龄 相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵 体外受精、胚胎移植
【分析】1、膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易,不会对动物造成伤害。此外,该系统可从动物一出生就收集产物,不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显著的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
2、基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的获取；基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
3、分析题图可知，步骤①为将W基因与运载体结合，构建基因表达载体；步骤②为将重组表达载体导入受精卵，常用显微注射法；步骤③为早期胚胎培养；步骤④为胚胎移植。
【详解】（1）由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接黏性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为早期胚胎培养；步骤④为胚胎移植。
（2）与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物,不受动物的性别和年龄的限制。
（3）在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。
（4）由分析可知，步骤③为早期胚胎培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。
【点睛】本题考查基因工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的基本工具和操作步骤，掌握胚胎工程各项技术的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查。
（2019·上海·高考真题）肺囊性纤维化（CF）是一种遗传病。患者肺功能不完善，影响正常生活。图是某患者甲组遗传病系谱。
44．该遗传病是由 染色体上的 （显性/隐性）控制的。
45．不考虑基因突变，1-1可能不含有致病基因的细胞有 。
A．卵细胞B．初级卵母细胞C．第一极体D．次级卵母细胞
为了避免患者胎儿的出生，要做基因检测。已知CF基因有260对碱基。对该家族相关成员CF蛋白基因进行基因检测，用BSTvI酶来切割，结果如表2所示：
46．据表判断，CF上BSTvI的酶切位点有 个，Ⅱ-1基因型为 。
47．为了避免患病胎儿的出生，Ⅱ-6是否需要进一步做CF基因检测，为什么？ 。
48．从根本上治疗遗传病的方法是 。
A．加强锻炼B．摄入CF蛋白C．基因检测D．将CF基因导入肺部上皮细胞
【答案】44． 常 隐 45．ACD 46． 1 AA 47．不需要 由表 可知，Ⅱ-5基因型为AA，Ⅱ-6基因型不管为什么，后代肯定含有A基因，不患病，因此不需要做基因检测 48．D
【分析】识图分析可知，图中亲代Ⅰ-1和Ⅰ-2表现正常，而子代中Ⅱ-2女儿表现为患者，即“无中生有为隐性，且女病父正非伴性”，故该病为常染色体隐性遗传病。假设用A、a基因控制该性状，则亲代Ⅰ-1和Ⅰ-2的基因型都为Aa，患者的基因型都为aa。
44．根据以上分析可知，该病为常染色体上隐性基因控制的遗传病。
45．由上分析可知，该病为常染色体隐性遗传病，根据后代有隐性纯合子可知，Ⅰ-1肯定是杂合子，其初级卵母细胞一定含有等位基因，即一定有正常基因和致病基因，次级卵母细胞、第一极体和卵细胞不一定含有致病基因，综上所述，故B不符合题意，A、C、D符合题意。故选ACD。
46．根据题意可知，CF基因有260对碱基，分析表格数据可知，91bp和169bp是正常CF基因酶切的结果，故推测正常基因含有1个BSTvI酶切点。根据表格数据可知，Ⅱ-1的基因被酶切后只产生了91bp和169bp的片段，说明Ⅱ-1的基因只有正常的CF基因，即基因型为AA。
47．根据表中数据分析可知，表中Ⅱ-5的基因被酶切后只产生了91bp和169bp的片段，说明Ⅱ-5的基因只有正常的CF基因，即基因型为AA，那么Ⅱ-5与Ⅱ-6婚配，无论Ⅱ-6的基因型是为什么，后代都有A基因，则表现正常，因此Ⅱ-6不需要做基因检测。
48．基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段，因此将CF基因导入肺部上皮细胞属于基因治疗。综上所述，D正确，A、B、C错误。故选D。
【点睛】本题考查遗传病的知识点，要求学生掌握常见人类遗传病的类型和特点，能够正确分析系谱图判断遗传病的遗传方式，这是突破该题的关键，分析表中的数据获取有效信息，判断酶切的位点和相关个体的基因型，利用基因分离定律的知识点推导后代的基因型和发病情况，把握基因治疗的概念和意义，这是该题考查的重点。
（2019·上海·高考真题）接种疫苗是预防疾病的措施之一。图显示了某种DNA疫苗的制备与使用过程，人体内将产生抗r的抗体。
49．图所示抗原蛋白基因最可能是致病菌M的 。
A．特有致病基因B．特有不致病基因C．全部致病基因D．全部不致病基因
50．图所示的1-IV阶段中，需要使用DNA连接酶的是 阶段。筛选含有目的基因的受体细胞，发生在 阶段。
51．图所示的第V阶段，抗原蛋白r和抗r抗体的不同 。
A．基因来源的物种B．转录mRNA序列
C．表达两种蛋白的细胞D．翻译时tRNA所来源的物种
52．结合图及所学的知识，比较DNA疫苗和致病菌M，用“是”或“否”填写表相关内容。

【答案】49．B 50． Ⅰ Ⅳ 51．ABC 52．
【分析】1.基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
2.识图分析可知：某种DNA疫苗的制备与使用过程，其中Ⅰ表示从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体，Ⅱ表示将目的基因导入受体菌细胞，Ⅲ表示受体菌的扩增过程，Ⅳ表示筛选含有目的基因的受体菌，Ⅴ为基因疫苗的注射使用以及在人体细胞内表达出抗原蛋白的过程。
49．由于制备的疫苗往往是减毒或者灭活的，使其使其致病性但是具有抗原性的特点，因此推测图所示抗原蛋白基因最可能是致病菌M的特有不致病基因，制备成基因疫苗后表达的蛋白质具有抗原性，但是不具有致病性。综上所述，B符合题意，A、C、D不符合题意。故选B。
50．在如图所示的疫苗制备过程中，通常需要用到DNA连接酶的过程是Ⅰ表示从病菌或病毒中获取目的基因和质粒构建基因表达载体。根据以上分析可知，筛选含有目的基因的受体细胞，发生在Ⅳ阶段。
51．基因表达包含了转录和翻译，抗原蛋白r和抗r抗体属于两种不同的蛋白质，由不同的基因转录，故基因所来源的物种、转录出的mRNA碱基序列、翻译出的氨基酸序列都不同，翻译时tRNA所来源的物种相同。综上所述， A、B、C正确，D错误。故选ABC。
52．根据题意和识图分析可知，DNA疫苗是以致病菌M的特有不治病性基因为目的基因制成的，因此没有致病性。DNA疫苗以核苷酸式进入人体，在人体细胞内表达出相应的抗原蛋白，刺激机体发生特异性免疫。包括体液免疫和细胞免疫的过程，引起机体产生抗体和相应的记忆细胞，为二次免疫做好准备。致病菌M以病原体的形式进入人体，作为抗原被识别后引起机体发生体液免疫和细胞免疫，由于激发特异性免疫需要时间较长，因此初次免疫过程中会表现出明显的致病性。综上所述，表格内容如下：
【点睛】本题以DNA疫苗的制作为背景考查基因工程和免疫的知识点，要求学生掌握基因工程的操作步骤和操作工具酶的使用，能够正确识图判断图中的发生的生理过程，把握免疫学的应用中被动免疫的应用，理解疫苗的作用和疫苗的种类，通过题意和图示把握DNA疫苗与传统疫苗的区别和类型，利用所学的免疫学的知识点分析解决问题。
53．（2019·海南·高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取 作为模板，在 催化下合成cDNA，再利用 技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的 中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经 。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是 。
【答案】 mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【分析】基因工程的操作步骤：获取目的基因（基因文库获取、PCR、人工合成等）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（动物—显微注射法；植物—农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；微生物—钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平和个体水平）。
【详解】（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
【点睛】天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，即基因通过表达产生具有氨基酸序列的多肽链，加工后形成具有高级结构的蛋白质，进而行使生物功能。蛋白质工程与之相反，它是从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列来进行改造。
54．（2019·江苏·高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcRV酶切位点为，EcR V酶切出来的线性载体P1为 末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是 。
【答案】 平 胸腺嘧啶（T） DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接
【分析】基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞；EcRV酶为限制酶，其切割质粒后会破坏四环素抗性基因（tetr）。
【详解】（1）根据题意分析，EcRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。
（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶（EcRV酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤——构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。
55．（2019·北京·高考真题）光合作用是地球上最重要的化学反应，发生在高等植物、藻类和光合细菌中。
（1）地球上生命活动所需的能量主要来源于光反应吸收的 ，在碳（暗）反应中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2与RuBP（C5）结合，生成2分子C3，影响该反应的外部因素，除光照条件外还包括 （写出两个）；内部因素包括 （写出两个）。
（2）R酶由8个大亚基蛋白（L）和8个小亚基蛋白（S）组成。高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因编码并在 中由核糖体合成后进入叶绿体，在叶绿体的 中与L组装成有功能的酶。
（3）研究发现，原核生物蓝藻（蓝细菌）R酶的活性高于高等植物，有人设想通过基因工程技术将蓝藻R酶的S、L基因转入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人员将蓝藻S、L基因转入某高等植物（甲）的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。转基因植株能够存活并生长。检测结果表明，转基因植株中的R酶活性高于未转基因的正常植株。
①由上述实验能否得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测 ？请说明理由。
②基于上述实验，下列叙述中能够体现生物统一性的选项包括 。
a．蓝藻与甲都以DNA作为遗传物质
b．蓝藻与甲都以R酶催化CO2的固定
c．蓝藻R酶大亚基蛋白可在甲的叶绿体中合成
d．在蓝藻与甲的叶肉细胞中R酶组装的位置不同
【答案】 光能 温度、CO2浓度 R酶活性、R酶含量、C5含量、pH（其中两个） 细胞质 基质 不能 转入蓝藻S、L基因的同时没有去除甲的S基因，无法排除转基因植株R酶中的S是甲的S基因表达产物的可能性 a、b、c
【分析】本题主要考查光合作用、基因工程及基因对性状的控制的有关知识。影响光合作用的外界因素主要有光照、温度、水、无机盐和CO2浓度等，内部因素主要有色素的含量和种类、酶的含量及活性；要将新的基因转入，首先得将“原配”基因从受体植株的细胞核和它的叶绿体基因组中给敲除掉。然后导入目的基因，等待它们将老片段“替换”掉了之后，用专门的培养基筛选出只含有这种叶绿体的细胞，再通过组织培养最终获得R酶活性很高的转基因植株。
【详解】(1)地球上生物生命活动所需的能量来自有机物，有机物主要来自植物的光合作用，光合作用合成有机物需要光反应吸收光能，转化为ATP的化学能，然后ATP为暗反应中C3的还原提供能量，合成糖类。在暗反应中，RuBP 羧化酶(R酶)催化CO2与RuBP(C5)结合，生成2分子C3，这是光合作用的暗反应的二氧化碳的固定。暗反应的进行需要相关酶的催化，二氧化碳做原料，需要光反应提供[H]和ATP，光反应需要色素、酶、水、光照等，故影响该反应的外部因素有光照、温度、CO2浓度、水、无机盐等；内部因素包括色素含量及种类、酶的含量及活性等。
(2)高等植物细胞中L由叶绿体基因编码并在叶绿体中合成，S由细胞核基因通过转录成mRNA ，mRNA 进入细胞质，与核糖体结合，合成为S蛋白；因R酶是催化CO2与C5结合的，在叶绿体基质中进行，故S蛋白要进入叶绿体，在叶绿体的基质中与L组装成有功能的酶。
(3) ①据题设条件可知，将蓝藻S、L基因转入某高等植物(甲)的叶绿体DNA中，只去除甲的L基因，没有去除甲的S基因。因此，转基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除转基因植株中R酶是由蓝藻的L蛋白和甲的S蛋白共同组成。故由上述实验不能得出“转基因植株中有活性的R酶是由蓝藻的S、L组装而成”的推测。
②根据上述实验，可以看出蓝藻的基因能导入到甲的DNA中，说明蓝藻和甲植株都以DNA为遗传物质；蓝藻中 R酶的活性高于高等植物，说明两者都以R酶催化CO2的固定；由于蓝藻S、L基因均转入甲的叶绿体DNA中，且去除了甲的L基因，结果转基因植株合成了R酶，说明蓝藻R酶大亚基蛋白L在甲的叶绿体中合成，即蓝藻的基因在甲的叶绿体中可以表达，以上体现了生物界的统一性。在蓝藻中R酶组装是在细胞质基质，甲的叶肉细胞组装R酶是在叶绿体基质，则说明了不同生物之间具有差异性。因此，选abc。
【点睛】解答本题关键抓住“将蓝藻S、L基因转入某高等植物(甲)的叶绿体DNA中，同时去除甲的L基因。”这一条件，得知甲的S基因还在，可以合成S蛋白，故无法确定转基因植株中有活性的R酶完全是由蓝藻的S、L组装而成。
56．（2019·全国I卷·高考真题）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括 和 。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
【答案】 基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取（基因文库获取、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平—DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平—抗虫、抗病接种实验等）。
【详解】（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库(CDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。
（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。
【点睛】PCR的原理是DNA双链的复制，故类似于细胞内的DNA复制过程，需要模板、原料等条件。由于该过程中特殊的高温条件，需要用耐高温的DNA聚合酶。
57．（2019·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与果胶和果胶酶有关的问题：
（1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其原因除水果中果胶含量较高外，还因为 。
（2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分离或诱变后的微生物悬液进行 。
（3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量，其主要原因是果胶酶水解果胶使 。果汁生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓缩后再加入 。使之形成絮状物，然后通过离心、真空干燥等步骤获得果胶制品。
（4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点有 和可连续处理等。在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要有 和 。
（二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
（1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过 技术获得特异性探针，并将 中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
（2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测 （A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物）。
（3）植物细胞在培养过程中往往会发生 ，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入 ，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用 培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
（4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是 。
【答案】 腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多 涂布分离（或划线分离） 水果组织软化疏松及细胞受损 95%乙醇 提高果胶酶的稳定性 固定化的方法 固定化所用的介质 单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花粉离体 胚的离体培养
【分析】（一）果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散；果胶不溶于乙醇，是鉴别果胶的一种简易方法。
（二）目的基因表达产物在分子水平的检测包括DNA分子杂交、DNA-RNA分子杂交和抗原抗体杂交；生物变异在生产上应用时，可通过杂交育种、单倍体育种的方式获得稳定遗传的植株，单倍体育种的速度更快，相对的操作更加复杂。
【详解】（一）
（1）腐烂的水果通常细胞壁被分解较多，所以含有能产生果胶酶的微生物较多；
（2）获取单菌落的方式有划线分离法和涂布分离法两种，本题中两种方式均可；
（3）果胶酶的作用是水解果胶，果胶位于植物细胞壁中，故水解果胶会使得水果组织软化疏松及使细胞受损；果胶不溶于酒精，故提取回收果胶需要使用95%乙醇，使果胶形成絮状物回收；
（4）固定化的果胶酶在处理含果胶的污水时，可提高果胶酶的稳定性并可连续处理；在建立和优化固定化果胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的因素有固定化的方法和固定化所用的介质。
（二）
（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；
（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；
（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；
（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。
【点睛】本题考察①果胶和果胶酶的性质以及果胶酶的固定；②基因工程以及变异品种的筛选，考察学生对课本知识的理解和题干的阅读能力，考查理解能力和科学思维能力。在变异品种的筛选中，要求获得的是抗致病真菌能力强的细胞，则只加入致病真菌只能筛选具有抗致病真菌能力的细胞，需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，则需要添加高浓度的致病真菌，这对考查学生对筛选培养基的理解有一定的要求。
58．（2018·海南·高考真题）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜 （填“受伤的”或“完好的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是 。
（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中 已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1，则说明甜蛋白基因已经整合到 （填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。
（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用 作为外植体进行组织培养。
（4）通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为 。
【答案】 受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞 甜蛋白基因 核基因组 茎尖 按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
【分析】本题主要考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念及操作步骤，能根据基因工程的操作步骤归纳基因工程的概念。
【详解】（1）如果叶片受伤，伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞，故用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养。
（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，其子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1，根据基因分离定律，得知转基因黄瓜植株为杂合子，非转基因植株为隐性个体，为测交，故说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。
（3）要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，由于茎尖生长点的细胞分裂生长最为活跃，且容易分化成其他器官，这是其他分生区细胞所不具备的优点，另外取材方便，故应选用茎尖作为外植体进行组织培养。
（4）基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
【点睛】本题的难点在基因工程的概念，有助于考查考生使用生物学语言表达观点的能力，识记类考点，往往由于复习时的忽视，而成为考试的难点和失分点。
59．（2018·天津·高考真题）甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用 技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的 ，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与 连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的 进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加 的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是 。
A．病毒的DNA聚合酶
B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶
D．宿主的RNA聚合酶
（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起 免疫，增强免疫保护效果。
【答案】 PCR 多肽（或蛋白质） 载体 总RNA 非天然氨基酸（Uaa） D 细胞
【分析】本题以甲型流感病毒为素材，考查了基因工程、基因的表达、免疫调节的相关知识，意在考查学生的理解能力，综合运用所学知识解决问题的能力。可以改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力，此过程中需要用到PCR技术，然后通过基因工程构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。最后利用转基因宿主细胞制备疫苗，以预防该病毒再次侵染。
【详解】（1）PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，由于将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列，因此肽链合成提前终止，这样与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽（或蛋白质），因此不能产生子代病毒。
（2）基因工程的核心步骤为基因表达载体的构建，将该基因与载体连接后才能导入宿主细胞，检测目的基因是否成功表达上述tRNA时，利用核酸分子杂交技术，即用相应的DNA探针与宿主细胞的总RNA分子进行杂交鉴定，进而筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）因为设计的宿主细胞具有能合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa），因此可在补加非天然氨基酸（Uaa）的培养基中进行培养，筛选出宿主细胞。进而利用该宿主细胞，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。因为转录在宿主细胞内进行，且启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，因此需要使用宿主细胞的RNA聚合酶。故选D。
（4）不具侵染性的流感病毒灭活疫苗，不能侵入细胞内部，只能引起体液免疫，产生相应的抗体与记忆细胞，而该疫苗能够侵入细胞，引起的免疫属于细胞免疫。
【点睛】解答本题需要考生掌握基因工程的原理、操作步骤及其一些细节问题，同时还要熟练掌握有关基因的表达及免疫调节方面的问题。
60．（2018·北京·高考真题）水稻是我国最重要的粮食作物。稻瘟病是由稻瘟病菌（Mp）侵染水稻引起的病害，严重危害我国粮食生产安全。与使用农药相比，抗稻瘟病基因的利用是控制稻瘟病更加有效、安全和经济的措施。
（1）水稻对Mp表现出的抗病与感病为一对相对 。为判断某抗病水稻是否为纯合子，可通过观察自交子代 来确定。
（2）现有甲（R1R1r2r2r3r3）、乙（r1r1R2R2r3r3）、丙（r1r1r2r2R3R3）三个水稻抗病品种，抗病（R）对感病（r）为显性，三对抗病基因位于不同染色体上。根据基因的DNA序列设计特异性引物，用PCR方法可将样本中的R1、r1、R2、r2、R3、r3区分开。这种方法可用于抗病品种选育中基因型的鉴定。
①甲品种与感病品种杂交后，对F2不同植株的R1、r1进行PCR扩增。已知R1比r1片段短。从扩增结果（下图）推测可抗病的植株有 。

②为了在较短时间内将甲、乙、丙三个品种中的抗病基因整合，选育新的纯合抗病植株，下列育种步骤的正确排序是 。
a．甲×乙，得到F1
b．用PCR方法选出R1R1R2R2R3R3植株
c．R1r1R2r2r3r3植株×丙，得到不同基因型的子代
d．用PCR方法选出R1r1R2r2R3r3植株，然后自交得到不同基因型的子代
（3）研究发现，水稻的抗病表现不仅需要自身抗病基因（R1、R2、R3等）编码的蛋白，也需要Mp基因（A1、A2、A3等）编码的蛋白。只有R蛋白与相应的A蛋白结合，抗病反应才能被激活。若基因型为R1R1r2r2R3R3和r1r1R2R2R3R3的水稻，被基因型为a1a1A2A2a3a3的Mp侵染，推测这两种水稻的抗病性表现依次为 。
（4）研究人员每年用Mp（A1A1a2a2a3a3）人工接种水稻品种甲（R1R1r2r2r3r3），几年后甲品种丧失了抗病性，检测水稻的基因未发现变异。推测甲品种抗病性丧失的原因是 。
（5）水稻种植区的Mp是由不同基因型组成的群体。大面积连续种植某个含单一抗病基因的水稻品种，将会引起Mp种群 ，使该品种抗病性逐渐减弱直至丧失，无法在生产中继续使用。
（6）根据本题所述水稻与Mp的关系，为避免水稻品种抗病性丧失过快，请从种植和育种两个方面给出建议 。
【答案】 性状 性状是否分离 1和3 a、c、d、b 感病、抗病 Mp的A1基因发生了突变 （A类）基因（型）频率改变 将含有不同抗病基因的品种轮换/间隔种植；将多个不同抗病基因通过杂交整合到一个品种中
【详解】【分析】该题主要考查遗传定律的应用、基因、蛋白质与性状的关系及育种方法的有关知识。要获得纯合的新品种，结合题意，首先通过不同品种杂交，将不同的抗性结合到一起，再通过自交使之出现纯合子，最后用PCR技术筛选出纯合子植株作为稳定遗传的新品种。
【详解】（1）水稻的抗病与感病符合同一种生物的同一性状的不同表现型，是一对相对性状；通过观察自交子代是否发生性状分离来确定纯合子、杂合子的情况；
（2）①甲品种与感病品种杂交后，对不同植株的R1、r1进行PCR扩增。已知R1比r1片段短。从扩增结果分析，植株1只有和M的200bp的基因相同的基因，基因型为R1R1，植株3有和M相同的基因，基因型为R1r1，植株2只有和M的400bp的基因相同的基因，基因型为r1r1，所以1和3为抗病植株，2为感病植株；
②为了在较短时间内选育新的纯合抗病植株，先让甲、乙杂交得到子一代，再用子一代（R1r1R2r2r3r3）植株与丙（r1r1r2r2R3R3）杂交，得到四种不同基因型的子代，然后用PCR方法选出R1r1R2r2R3r3植株，然后自交得到9种不同基因型的子代， 最后用PCR方法选出R1R1R2R2R3R3植株；
（3）基因型为R1R1r2r2R3R3和r1r1R2R2R3R3的水稻被基因型a1a1A2A2a3a3为的Mp侵染，因只有R蛋白与相应的A蛋白结合，抗病反应才能被激活，基因型为R1R1r2r2R3R3的水稻没有R2蛋白与Mp的A2蛋白结合，抗病反应不能被激活；基因型为r1r1R2R2R3R3的水稻中有与A2蛋白结合的相应的R2蛋白，抗病反应能被激活，因此这两种水稻的抗病性表现依次为感病、抗病；
（4）每年用Mp（A1A1a2a2a3a3）人工接种水稻品种甲（R1R1r2r2r3r3.），几年后甲品种丧失了抗病性，由于水稻的基因没有变异，只能是 Mp（A1A1a2a2a3a3）的A1基因发生突变，使甲品种R1蛋白没有A1蛋白与之结合，抗病反应不能被激活，丧失抗性 ；
（5）由于Mp有多种不同基因型的个体，而单一抗病类型的水稻只对其中一种Mp有抗性，长期种植这一种类型将会引起Mp种群中其他类型的个体大量繁殖，其A基因频率升高，该品种不能对其他类型的Mp有抗性，导致其抗病性逐渐减弱直至丧失，无法再生产中继续使用；
（6）为避免单一抗病类型的水稻品种抗病性丧失过快，可以将不同水稻抗病品种（甲、乙、丙）混种；育种时培养同时含有多对抗性基因的纯合子品种（如R1R1R2R2R3R3）。
【点睛】其一要抓住“只有R蛋白与相应的A蛋白结合，抗病反应才能被激活”这一条件，才能判断感病和抗病类型；其二单一抗病类型的水稻客观上对Mp起到选择作用，导致其他类型的Mp留下来，其中的A基因频率升高，这种水稻对这些Mp没有抗性，在生产上就没有价值了。
61．（2018·全国II卷·高考真题）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ，也是为了保证 。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 （填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
【答案】 E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 转录 翻译 细胞核 去核卵母细胞 核DNA
【详解】【分析】本题以图文结合的形式综合考查学生对基因工程、核移植等相关知识的识记和理解能力。解答本题需熟记并理解核移植技术的过程、基因工程的基本操作程序，特别是明确PCR技术的原理和过程、基因表达载体的组成及其作用、限制酶的作用等相关知识并形成清晰的知识网络。在此基础上，结合问题情境，从题图中提取有效信息进行相关问题的解答。
【详解】（1）要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5ˊ末端而获得的L1-GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。
（2）构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白（GFP）”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。
（3）若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。
（4）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
【点睛】本题的难点在于对（1）的解答。解题的关键是：以题意“获得L1-GFP融合基因（简称为甲）”的过程为切入点，围绕“基因表达载体的组成及其作用”和图示呈现的“酶切位点的”信息进行综合分析。
62．（2017·江苏·高考真题）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过 获得 用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表 ，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有 （填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。
【答案】 逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 引物与模板 GC含量高 ②③
【详解】（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。
（2）构建重组质粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适量的限制酶位点。设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，不能与模板相连。
（3）图中步骤1、2、3分别表示变性、退火、延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）退火表示引物与模板链相连，若温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。由于G-C间三个氢键，A-T间两个键，所以G-C含量越高的引物，退火温度越高。
（5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连，或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。
【定位】基因工程，PCR技术。
【点睛】本题主要考查基因工程的相关知识，要求学生理解PCR的具体过程，以及引物的作用，学会分析引物或温度改变对PCR结果的影响。
63．（2017·天津·高考真题）（2017•天津卷）玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B具有高产、抗病等优良性质，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤I、II试验。
Ⅰ．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。
（1）为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是 。
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同
④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
A．①③ B．①④ C．②③ D．②④
（2）下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知，细胞脱分化时使用的激素是 ，自交系 的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
（3）农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织，需使用含 的选择培养基。
（4）转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织，出现蓝色的是 。
A．无农杆菌附着的未转化愈伤组织
B．无农杆菌附着的转化愈伤组织
C．农杆菌附着的未转化愈伤组织
D．农杆菌附着的转化愈伤组织
（5）组织培养获得的转基因植株（核DNA中仅插入一个G基因）进行自交，在子代含G基因的植株中，纯合子占 。继续筛选，最终选育出抗除草剂纯合自交系A。
II．通过回交使自交系B获得抗除草剂性状
（6）抗除草剂自交系A（GG）与自交系B杂交产生F1，然后进行多轮回交（下图）。自交系B作为亲本多次回交的目的是使后代 。
（7）假设子代生活力一致，请计算上图育种过程F1、H1、H2、H3各代中含G基因植株的比例，并在图1中画出对应的折线图。若回交后每代不进行鉴定筛选，直接回交，请在图2中画出相应的折线图。
（8）下表是鉴定含G基因植株的4种方法。请预测同一后代群体中，4种方法检出的含G基因植株的比例，从小到大依次是 。
对Hn继续筛选，最终选育出高产、抗病、抗除草剂等优良性状的玉米自交系。
【答案】 A 2，4-D 乙 除草剂 BD 1/3 积累越来越多自交系B的遗传物质/优良性状 X4，X3，X2，X1
【详解】（1）质粒作为将目的基因导入受体细胞的载体，每种限制酶的切割位点最好只有一个，否则切割后会导致基因缺失，影响基因的表达；限制酶的识别序列和切割位点位于DNA上，G基因编码的序列是蛋白质，没有限制酶的识别序列和切割位点；双酶切后，G基因和Ti质粒形成的两个黏性末端序列均不相同。故选A。
（2）细胞脱分化形成愈伤组织，由结果可知，使用2,4-D时愈伤组织形成率最高。比较4个自交系，甲自交系中芽的分化率比较低，丙自交系中根的诱导率比较低，丁自交系中愈伤组织形成率比较低，乙自交系中愈伤组织形成率、芽的分化率和根的诱导率都相对较高，故最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
（3）获得抗除草剂转基因玉米自交系A，则筛选转化的愈伤组织，需使用含除草剂的选择培养基。
（4）含有内含子的报告基因位于农杆菌Ti质粒的T-DNA中，无农杆菌附着的未转化愈伤组织不含内含子的报告基因，不会出现蓝色；不论有无农杆菌附着，转化愈伤组织中都含有Ti质粒，含内含子的报告基因，出现蓝色；农杆菌附着的未转化愈伤组织，含内含子的报告基因位于农杆菌中，农杆菌属于原核生物，其中的报告基因不能正确表达，不会出现蓝色。故选BD。
（5）由于转基因植株的核DNA中仅插入一个G基因，设基因型为GO，自交后代含G基因的植株基因型为GG或GO，比例为1:2，纯合子占1/3。
（6）回交是指杂交后代与自交系B杂交，会使后代积累越来越多自交系B的遗传物质/优良性状。
（7）自交系B不含抗除草剂基因，设基因型为OO，则自交系A（GG）与之杂交得F1，基因型为GO，都含有G基因，再与自交系B（OO）回交得H1，基因型为GO和OO，比例为1:1，含有G基因的植株占1/2，筛选去除基因型为OO的植株后，剩余的都是基因型为GO的植株，再回交，则与H1结果相同，含有G基因的植株占1/2。若不筛选，则1/2GO、1/2OO植株回交得H2，基因型为1/4GO、3/4OO，含有G基因的植株占1/4，1/4GO，3/4OO植株回交得H3，基因型为1/8GO、7/8OO，含有G基因的植株占1/8。
（8）G基因导入受体受体细胞后，不一定转录形成mRNA，转录形成的mRNA不一定翻译形成相应的蛋白质，翻译形成相应的蛋白质，不一定表现出抗除草剂性状，所以检测出含G基因植株的比例由小到大依次是X4，X3，X2，X1。
【点睛】本题主要考查基因工程和分离定律的相关知识。对于基因工程，要求学生理解双酶切的目的，同时理解农杆菌转化法。对于连续自交并筛选，要求学生根据分离定律写出连续四代个体的基因型及比例，难度比较大。
64．（2017·上海·高考真题）列关于遗传信息的传递与表达的问题
为了探究基因在高等动物体内不同发育阶段和不同类型的细胞中表达的持异性，通常以绿色荧光蛋白编码基因(GFP)作为目的基因构建转基因动物。
1. 得GFP基因的方法一般包括 和 。
2. 使用限制酶PstI(识别序列和切割位点如图A所示）切开GFP，其产生的末端应该为 。
3. 知图B所示质粒经EcRI和AatII联合酶切后形成1.0kb和3.2 kb (1kb = 1000对碱基）两种DNA片段，若将0.8 kb的单个基因插在质粒的PstI位点处，所形成的重组质粒用EcRI和AatII联合酶切后，能形成两种DNA片段，其大小应分别为 kb和 kb。
4. 上述重组质粒导入小鼠受精卵雄性原核中的常规方法是 。
5. 上述受精卵移植发育而成且头部发荧光的转基因小鼠中，全身各种组织或细胞均含有的物质是 。
①GFP基因 ②GFPmRNA ③GFP蛋白
A．① B．①② C．②③ D．①②③
【答案】 从相关生物细胞中分离 人工化学合成 D 1.8 3.2 显微注射 A
【解析】【小题1】获得目的基因的方法有从相关生物细胞中分离和人工化学合成。
【小题2】根据图20 A所给出的PstI识别序列和切割位点，使用限制酶PstI切开GFP，其产生的末端应该为与选项中D吻合，所以选D。
【小题3】根据图20 B和题意“质粒经EcRI和AatII联合酶切后形成1.0kb和3.2 kb两种DNA片段”可推知，其中所得到的1.0kb的DNA片段才是包含PstI酶切位点的片段。如果把目的基因（0.8kb）插入到PstI酶切位点处，则用EcRI和AatII联合酶切质粒后形成DNA片段大小分别为1.0+0.8=1.8kb和3.2kb。
【小题4】将目的基因导入动物受精卵的常用方法是显微注射法。
【小题5】转基因小鼠是由含GFP基因的受精卵发育而成，所以该转基因小鼠的全身各种组织或细胞均含有GFP基因，但由该基因控制合成的GFPmRNA和GFP蛋白却只在小鼠的头部特定细胞内才表达含有。
【点睛】本题中主要考查基因工程中基础知识，但有两个易错点：一是质粒被酶切后的DNA片段分析；二是目的基因在转基因动物体内的细胞中选择性表达的问题。
65．（2016·全国III卷·高考真题）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcR I、Sau3A I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH I酶切得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是 。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因是 。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 。
【答案】 Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能转录 ）E·cliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
【详解】（1）由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。
（3）常见DNA连接酶的有E·cliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
66．（2016·全国I卷·高考真题）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 （答出两点即可）。
而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 ；并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于
【答案】 能自我复制、具有标记基因 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 受体细胞
【详解】（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。（2）依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，而氨苄青霉素抗性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。 （3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞这的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳留在细胞外；在噬菌体的DNA指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可知，基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
【考点定位】基因工程的原理与技术
【名师点睛】本题以图文结合的形式，综合考查学生对基因工程技术的熟记和理解能力。解决此类问题的关键是，熟记并理解相关的基础知识、形成知识网络，从题图中挖掘出隐含的信息，据此结合每个问题情境进行图文转换、实现对知识的整合和迁移。
67．（2016·北京·高考真题）嫁接是我国古代劳动人民早已使用的一项农业生产技术，目前也用于植物体内物质转运的基础研究。研究者将具有正常叶形的番茄（X）作为接穗，嫁接到叶形呈鼠耳形的番茄（M）砧木上，结果见图1.
（1）上述嫁接体能够成活，是因为嫁接部位的细胞在恢复分裂、形成 组织后，经 ，形成上下连通的输导组织。
（2）研究者对X和M植株的相关基因进行了分析，结果见图2。由图可知，M植株的P基因发生了类似于染色体结构变异中的 变异，部分P基因片段与L基因发生融合，形成P—L基因（P—L）。以P—L为模板可转录出 ，在 上翻译出蛋白质，M植株鼠耳叶形的出现可能与此有关。
（3）嫁接体正常叶形的接穗上长出了鼠耳形的新叶。为探明原因，研究者进行了相关检测，结果见下表。
①检测P—L mRNA需要先提取总RNA，再以mRNA为模板 出cDNA，然后用PCR技术扩增目的片段。
②检测P—L DNA需要提取基因组DNA，然后用PCR技术对图2中 （选填序号）位点之间的片段扩增。
a. Ⅰ~Ⅱ b. Ⅱ~Ⅲ c. Ⅱ~Ⅳ d. Ⅲ~Ⅳ
（4）综合上述实验，可以推测嫁接体中P—L基因的mRNA 。
【答案】 愈伤 细胞分化 重复 mRNA 核糖体 逆转录 C 从砧木运输到接穗新生叶中，发挥作用，影响新生叶的形态
【分析】分析图2：与X植株的基因相比，M植株的部分P基因片段与L基因发生融合，即增加了部分P基因片段；
分析表格：M植株的叶含有P-L mRNA和P-LDNA，X植株的叶片两个都没有，接穗的新生叶上有P-L mRNA，却没有P-LDNA，说明P-L基因的mRNA可能会发生转移。
【详解】（1）嫁接之后，嫁接部位的细胞属于已经分化的细胞，需要经过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织通过再分化才能形成上下连通的疏导组织，从而使接穗成活下来。
（2）由图2可知，M植株的DNA上比X植株的DNA上多了一个片段P，由此可判断属于染色体变异中的重复，P-L基因转录可得到mRNA，蛋白质合成中的翻译过程在核糖体上进行。
（3）①以mRNA为模板合成DNA的过程叫逆转录。
②I～II片段和II～III的位点之间仅仅包含P基因片段，而III～IV的位点之间仅仅包含L基因片段，II～IV片段的位点之间包含了P基因和L基因片段，因此要检测到融合后的P-L基因，只能选择II～IV的位点之间的片段进行扩增。
（4）观察表格可知M植株同时含有P-LmRNA和P-LDNA，接穗新生叶含有P-LmRNA但不含P-LDNA，X植株叶两种物质均不含有，所以它的mRNA是在M植株中转录形成的，经嫁接部位运输到接穗的新生叶翻译出相关蛋白质从而使接穗上出现了鼠耳形的新叶。
【点睛】本题所考查的知识点：①嫁接与植物组织培养的相似之处；②染色体结构变异：重复、缺失、易位、倒位；③基因表达的过程：转录和翻译，转录是以基因的一条链为模板，合成mRNA，翻译在核糖体上进行。④逆转录；⑤实验分析：紧抓住单一变量进行分析即可。
68．（2016·海南·高考真题）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即 和从 中分离。
（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是 。
（3）在基因表达载体中，启动子是 聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是 。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有 和 颗粒。
【答案】 人工合成 自然界已有的物种 cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因 RNA 大肠杆菌（或答细菌） 金粉 钨粉
【详解】（1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。
（2）植物的成熟叶片中基因已选择性表达，因此由所有RNA逆转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。
（3）在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常用大肠杆菌（或细菌）。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。
69．（2016·江苏·高考真题）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用 两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过 酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于 态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加 ，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中 。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ，对于该部位，这两种酶 (填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得 种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ 连接 感受
（2）四环素 引物甲和引物丙
（3） 都不能
（4）7
【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、理解基因工程的概念：基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术操作环境 生物体外操作对象 基因操作水平 DNA分子水平基本过程 剪切→拼接→导入→表达结果 人类需要的基因产物。
3、获取目的基因的方法主要有两种：
（1）从供体细胞的DNA中直接分离基因，最常用的方法是“鸟枪法”又叫“散弹射击法“；
（2）人工合成基因，这种方法有两条途径，一是以目的基因转录的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，再在酶的作用下合成双链DNA，即目的基因；另一条途径是蛋白质的氨基酸序列，推测出信使RNA序列，再推测出结构基因的核苷酸序列，然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成。
【详解】（1）选择的限制酶在目的基因的两侧都应该有切割位点，又因为用BamHⅠ酶会将两个标记基因都破坏，所以构建基因表达载体时只能选择BclI和HindⅢ对质粒和目的基因进行切割，漏出两种不同的黏性末端，再利用DNA连接酶将两者定向连接。再将重组质粒导入感受态的大肠杆菌进行扩增。
（2）由于构建重组质粒的时候，氨苄青霉素抗性基因被破坏，而四环素的抗性基因没有被破坏，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。根据图2可知对目的基因进行扩增时的引物应该是引物甲和引物丙。
（3）根据表格中碱基分析，若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。
（4）根据表格分析可知Sau3A I可以切割BclI和BamH I的切割位点，所以若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤的相关细节，能结合所学的知识准确答题，旨在考查考生信息获取的能力与知识的迁移运用能力。
70．（2016·天津·高考真题）人血清白蛋白（HSA） 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取 合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是 （填写字母，单选）。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是 。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是 。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与 的生物学功能一致。
【答案】 总RNA（或mRNA） B 吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化 水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 HSA
【分析】本题结合生成rHSA的实例考查目的基因的获取、基因表达载体的构建、农杆菌转化法、受体细胞的选择、目的基因的检测与鉴定。解题关键是明确基因工程原理和操作程序等相关知识。
【详解】（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程获得。采用PCR技术扩增HSA时，母链的方向是3＇到5＇，子链的延伸方向是5＇到3＇，两条引物分别与模板链的5＇端互补配对结合，引导子链延伸，故两条引物延伸方向是相反的。
（2）根据启动子通常具有物种及组织特异性，在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA，需选择水稻胚乳细胞的启动子。
（3）农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中转化。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中。水稻是单子叶植物，不能产生上述的酚类化合物，故在农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需要添加酚类化合物，吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的转移。
（4）水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行加工才能形成正确的空间结构，获得的HAS才有活性，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有膜结构的细胞器，无法对初始rHSA多肽进行加工。
（5）为证明rHSA具有医用价值，需确认rHSA与天然的HSA的生物学功能是否一致。
三、解答题组
71．（2020·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生 ，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是 。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使 菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使 菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行 ，再用 的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有 ，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加 。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经 处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有 （答出2点即可）。
（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用 或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用 ，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中 ，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成 后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过 或器官发生的途径再生植株。
【答案】 果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质 喜好氧的 不耐酸的 稀释 涂布分离 酸碱指示剂 乙醇 过滤灭菌 染色法，渗透吸水或失水 化学合成 两种限制性核酸内切酶 扩增 细胞壁 胚胎发生
【分析】泡菜制作：
①菌种：假丝酵母和乳酸菌；②发酵原理：在无氧条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，还有亚硝酸。③亚硝酸盐的测定：亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。
【详解】（一）
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜时，为抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆，可用热水短时处理。同时，该处理也会使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质，从而使泡菜发酵时间缩短。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，形成无氧环境，会使喜好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，会使不耐酸的菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，又会抑制乳酸菌。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。为了便于观察是否产酸，该培养基必须含有酸碱指示剂。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。由于醋酸杆菌可以利用乙醇产生醋酸，若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇。
（二）
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经过滤灭菌处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。可采用染色法、渗透吸水或失水的方法测定该原生质体的活性。
（2）可采用人工合成或PCR的方法获得已知序列的抗病基因。对含目的基因的DNA片段进行处理，为使其两端形成不同的黏性末端，需要选择使用两种限制性核酸内切酶，对质粒也进行相同的处理，为了提高目的基因和质粒重组的成功率，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中扩增，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成细胞壁后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过胚胎发生或器官发生的途径再生植株。
【点睛】本题考查选修教材中的相关知识，在学习本部分内容时，要求考生对所学知识进行对比、归纳，然后建立知识间的联系，做到夯实基础，学会融会贯通。
四、实验题
72．（2019·天津·高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程 在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是 。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 。
【答案】 D 精子 cDNA ② ① BCD B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【分析】基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建:（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
3、将目的基因导入受体细胞:（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【详解】（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示用含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。
（5）转基因植株含有促进B基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
【点睛】本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能够识记基因工程的操作步骤；明确农杆菌转化法在植物基因工程中的应用；并能够掌握植物组织培养技术的过程等知识。
73．（2018·江苏·高考真题）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的 。
（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的 端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是 。
（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中 的设定与引物有关， 的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）
①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间
（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含 个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有 种。
（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为 。
【答案】 基因组DNA 5’ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 ② ⑥ 8 13 pH为8．5，缓冲液为50mml/LTris-HCl
【分析】据图分析，图示为利用基因工程大量制备α-淀粉酶的过程，目的基因是α-淀粉酶基因，与体构建基因表达载体，然后将目的基因导入大肠杆菌，接着对目的基因进行检测与鉴定，最后利用工程菌培养获得大量的α-淀粉酶产品。
【详解】（1）α-淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。
（2）目的基因与运载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3’端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5’端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
（3）进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。
（4）根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含24÷3=8个密码子；构成mRNA的碱基有4种，若虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有4×4-3=13种。
（5）根据表格数据分析可知，在pH为8.5，缓冲液为50 mml/L Tris-HCl的条件下，α-淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。
【点睛】解答本题的关键是基因工程的四个基本步骤以及PCR技术的过程、条件，回忆相关知识点和注意事项，结合提示分析答题。
74．（2018·全国I卷·高考真题）回答下列问题：
（1）博耶（H.Byer）和科恩（S.Cben）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了 （答出两点即可）。
（2）体外重组的质粒可通过Ca2+参与的 方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与 组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是 。
（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加 的抑制剂。
【答案】 体外重组DNA可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞 中表达 转化 外壳蛋白质（或噬菌体蛋白） 细菌 蛋白酶缺陷型 蛋白酶
【详解】【分析】本题考查基因工程中目的基因与质粒结合形成重组质粒后导入受体细胞的过程，目的基因进入受体细胞的方法，以及目的基因的检测与鉴定的方法。
【详解】（1）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
（2）体外重组的质粒可通过Ca2+处理，目的是以增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2+参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
（3）真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会
被降解,为防止蛋白质被降解,可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解,在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
【点睛】解答第（2）小题，要理清将目的基因导入受体细胞的方法，根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
75．（2018·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与果胶、淀粉等提取和利用有关的问题：
某植物富含果胶、淀粉、蛋白质和纤维素成分。某小组开展了该植物综合利用的研究。
(1)果胶提取工艺研究结果表明，原料先经过一段时间沸水漂洗的果胶得率（提取得到的果胶占原料质量的百分率）显著高于常温水漂洗的果胶得率，最主要原因是沸水漂洗 (A．有助于清洗杂质和去除可溶性糖 B．使植物组织变得松散 C．使有关酶失活 D．有利细胞破裂和原料粉碎制浆)。
(2)在淀粉分离生产工艺研究中，为促进淀粉絮凝沉降，添加生物絮凝剂（乳酸菌菌液），其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用 ，进行单菌落分离，然后将其 ，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。
(3)在用以上提取过果胶和淀粉后的剩渣加工饮料工艺研究中，将剩渣制成的汁液经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后，发现仍存在浑浊和沉淀问题,可添加 使果胶彻底分解成半乳糖醛酸，再添加 ，以解决汁液浑浊和沉淀问题。
(4)在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中，通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性，然后主要优化各固定化酶反应器中的 （答出2点即可）、反应液pH和酶反应时间等因素。其中，酶反应时间可通过 来调节。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题。
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcR I酶切，在切口处形成 。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接。在两个片段相邻处形成 ，获得重组质粒。
(2)已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成 实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是 ，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。
(3)取田间不同品种水稻的幼胚，先进行 ，然后接种到培养基中培养，幼胚发生 形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及 （答 2点即可）。
【答案】 C 划线分离法（或涂布分离法） 扩大培养 果胶酶和果胶甲酯酶 淀粉酶使淀粉分解 固定化酶的量、反应液温度 控制反应器液体流量（或体积） 黏性末端 磷酸二酯键 转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数
【详解】试题分析：熟记并理解酶的研究与应用、微生物的实验室培养与分离、基因工程的基本操作程序、植物组织培养技术等相关基础知识，形成清晰的知识网络。在此基础上，从题意中提取有效信息并对相关的问题情境进行作答。
（一）(1)沸水漂洗，因高温会破坏蛋白质的空间结构，进而使有关酶失活，C正确，A、C、D均错误。
(2)为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使用的菌液，采用划线分离法（或涂布分离法）进行单菌落分离，然后将其扩大培养，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。
(3)蛋白酶和纤维素酶可分别催化蛋白质和纤维素分解。在将以上提取过果胶和淀粉后的剩渣制成的汁液，经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后，仍存在浑浊和沉淀问题，说明该汁液中仍有少量的果胶和淀粉，可添加果胶酶和果胶甲酯酶使果胶彻底分解成半乳糖醛酸，再添加淀粉酶使淀粉分解，以解决汁液浑浊和沉淀问题。
(4)在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中，通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性，然后主要优化各固定化酶反应器中的固定化酶的量、反应液温度、反应液pH和酶反应时间等因素。其中，酶反应时间可通过控制反应器液体流最（或体积）来调节。
（二）(1) 用限制性核酸内切酶EcR I酶切含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121，可在切口处形成黏性末端。用DNA连接酶连接含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121，可在两个片段相邻处形成磷酸二酯键，获得重组质粒。
(2) 取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成转化实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是：使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。
(3)在进行植物组织培养时，取田间不同品种水稻的幼胚，先进行消毒，以清除其表面附着的微生物；然后接种到培养基中培养，幼胚发生脱分化形成愈伤组织，并进行继代培养。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及水稻的基因型、愈伤组织继代的次数等。
76．（2017·全国III卷·高考真题）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。回答下列问题：
（1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是 。
（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中,在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为 ，加入了 作为合成DNA的原料。
（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是 。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的C02浓度，C02的作用是 。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少 （填“A”“B”“C”“D”
或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖效果。
【答案】 在编码蛋白乙的基因中无可以翻译出起始密码子的序列
模板DNA 四种脱氧核苷酸 细胞培养 维持培养液中的pH C
【详解】（1）题干信息基因序列（TTCG……)，结合转录过程中的碱基配对原则，可知其转录出的mRNA上没有起始密码子AUG，也就是说在编码蛋白乙的基因中无可以翻译出起始密码子的序列。
（2）PCR需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、四种脱氧核糖核苷酸。
（3）①动物细胞培养中，细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，在培养中需要用胰蛋白酶处理贴壁的细胞并进行分瓶培养，分瓶后的培养称为传代培养；动物细胞培养过程中加入CO2，作用是维持培养液的pH。
②据图分析，丙与对照接近，甲和乙都有较大影响，在甲、乙中存在但在丙中不存在的片段是C，所以缺少C片段会降低效果。
【点睛】解题过程中，没有联想到“动物细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点”而误认为（3）①小题中细胞不能继续增殖的原因是缺乏营养。
77．（2017·全国I卷·高考真题）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是 。
（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有 (答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是 (填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是 。
【答案】 基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A 噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 繁殖快、容易培养 蛋白A的抗体 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物体
【分析】本题考查基因结构、原核生物与真核生物基因转录的不同、目的基因的检测等知识，要求考生能正确分析原核生物与真核生物基因转录的不同，掌握基因的结构、目的基因的检测方法。
【详解】（1）基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录来的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。
（2）由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。
（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养、遗传物质较少等特点，转入的基因受大肠杆菌遗传物质影响较小，短期内容易得到较多的基因表达的产物。
（4）检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。
78．（2017·全国II卷·高考真题）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是 。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是 。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是 。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是 （答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是 。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是 。
【答案】 嫩叶组织细胞易破碎 相应mRNA多抑制RNA被水解 逆转录过程的碱基互补配对 目的基因因缺少相应的启动子和终止子，缺少复制原点 磷酸二酯键 转录和翻译过程受影响
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）由于嫩叶组织细胞易破碎，因此在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止提取的mRNA被RNA酶分解。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，原因是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是：质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中含有复制原点等。
（4）DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
（5）基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或翻译异常。
【点睛】本题主要考查了基因工程等有关知识，旨在考查学生对基因工程操作步骤及细节的深层理解，综合性强，有一定的难度。
易错点为第一问，衰老叶片基因表达水平低，叶片不易研磨破碎，组织细胞不能充分裂解，RNA提取不充分，而且老叶富含多酚物质，当其氧化后，会使得RNA沉淀变成褐色，干扰了后续实验。第二问填写反转录的原理注意三点：酶、模板、碱基互补配对的原则。第三问考查不能直接将目的基因直接导入受体细胞的原因（目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子），学生需要注意对教材知识的深入理解，教师注意深挖教材。
考点2 生物技术伦理
1．（2024·浙江·高考真题）关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（ ）
A．试管动物的培育B．转基因食品的生产
C．治疗性克隆的研究D．生物武器的发展和生产
【答案】D
【分析】1、我国政府一再重申 四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
2、2010年，在第65 届联合国大会上，我国政府重申支持《禁止生物武器公约》的宗旨和目标，全面、严格履行公约义务，支持不断加强公约的约束力，并主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。
【详解】A、试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A正确；
B、我国目前不反对转基因的食品的生产，B正确；
C、中国政府禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆，C正确；
D、生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D错误。
故选D。
2．（2023·浙江·高考真题）以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是（ ）
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
【答案】D
【分析】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。两者有着本质的区别。
【详解】A、我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，A错误；
B、我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B错误；
C、生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误；
D、我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，D正确。
故选D。
3．（2022·辽宁·高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【分析】PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误；
B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；
C、延伸过程需引物参与，C错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误；
故选B。
4．（2021·北京·高考真题）社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是（ ）
A．长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B．转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C．消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒
D．如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的
【答案】A
【分析】血型分为四种，即A，B，AB，O。血型是指红细胞上所含的抗原不同而言，红细胞上只含A抗原的称A型，含有B抗原的称B型，既有A抗原又有B抗原的称为AB型，既没有A抗原也没有B抗原的称为O型。ABO血型受ABO三种基因控制，A基因控制A抗原产生，B基因控制B抗原产生，O基因控制不产生A和B两种抗原，而基因都是成对存在，控制ABO血型的基因可有六种不同组合，即AA，AO，BB，BO，AB，OO，而每个人只有其中一对。
【详解】A、维生素会受到高温破坏，加热、光照、长时间储存等都会造成维生素的流失和分解，A正确；
B、转基因抗虫棉对非靶标生物无毒性，B错误；
C、消毒液只能杀死表面的病毒细菌，但无法清除体内的病毒，C错误；
D、如果孩子的血型和父母都不一样，也可能是亲生的，如A型血和B型血的父母也可以生出O型血的孩子，D错误。
故选A。
5．（2020·北京·高考真题）生物安全是国家安全体系的组成部分。新冠肺炎疫情蔓延对我国生物安全防御体系建设提出了新的要求，引起了全社会对生物安全形势的高度关注。以下选项中不会给我国带来生物安全风险的是（ ）
A．人类及动植物中可能爆发的重大疫病
B．保护沿海滩涂红树林中的生物多样性
C．全球气候变暖导致生态环境发生改变
D．收集我国公民及生物资源的遗传信息
【答案】B
【分析】本题以“新冠肺炎疫情”为引，考查考生对生物安全的认识，涉及生态系统的稳定性、保护生态环境、生物技术的安全性等相关知识，要求考生掌握生物多样性在维持生态系统的稳定性中的作用、全球性生态环境问题对生物圈及人类的影响，以及生物技术可能带来的道德和伦理问题，然后分析选项进行判断。
【详解】A、人类及动植物中可能爆发的重大疫病，会影响生态环境以及人类的生存和发展，会给我国带来生物安全风险，A不符合题意；
B、保护沿海滩涂红树林中的生物多样性，有利于保护生态系统的稳定性，不会给我国带来生物安全风险，B符合题意；
C、全球气候变暖导致生态环境发生改变，会影响生物多样性，对生物圈的稳态也会造成严重威胁，影响到人类的生存和发展，会给我国带来生物安全风险，C不符合题意；
D、收集我国公民的遗传信息，可能会造成基因歧视，带来许多不公平的社会问题，遗传信息的滥用还会导致社会和政治事件的发生，会给我国带来生物安全风险，D不符合题意。
故选B。
二、实验题
6．（2024·广东·高考真题）遗传性牙龈纤维瘤病（HGF）是一种罕见的口腔遗传病，严重影响咀嚼、语音、美观及心理健康。2022年，我国科学家对某一典型的HGF家系（如图）进行了研究，发现ZNF862基因突变导致HGF发生。
回答下列问题：
(1)据图分析，HGF最可能的遗传方式是 。假设该致病基因的频率为p，根据最可能的遗传方式，Ⅳ2生育一个患病子代的概率为 （列出算式即可）。
(2)为探究ZNF862 基因的功能，以正常人牙龈成纤维细胞为材料设计实验，简要写出设计思路： 。为从个体水平验证ZNF862基因突变导致HGF，可制备携带该突变的转基因小鼠，然后比较 的差异。
(3)针对HGF这类遗传病，通过体细胞基因组编辑等技术可能达到治疗的目的。是否也可以通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传病？作出判断并说明理由 。
【答案】(1) 常染色体显性遗传病 （1+p）/2
(2) 将正常细胞分为甲乙两组，其中甲组敲除ZNF862基因，观察甲乙两组细胞表型从而探究该基因的功能 转基因小鼠和正常小鼠牙龈
(3)不可以，违反法律和伦理，且存在安全隐患。
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
（2）逻辑推理与论证：
【详解】（1）由图可知，该病男女患者数量相当，且代代遗传，因此该病最可能的遗传方式为常染色体显性遗传病；假设该病由基因A/a控制，则致病基因A的基因频率为p，正常基因a的基因频率为1-p，Ⅳ2的基因型为Aa，产生配子基因型为1/2A和1/2a，正常人中基因型为AA的概率为p2，基因型为Aa的概率为2p（1-p），基因型为aa的概率为（1-p）2，Ⅳ2与AA生育患病子代的概率为p2，与Aa生育患病子代的概率为2p(1-p)×3/4，与aa生育患病子代的概率为（1-p）2×1/2，故Ⅳ2生育一个患病子代的概率为p2+2p(1-p)×3/4+（1-p）2×1/2=（1+p）/2。（因IV2的基因型为Aa，其遗传A给后代的概率是1/2，此时无论父方如何，子代一定患病，故概率为1/2×1；其遗传a给后代的概率是1/2，在这种情形下，父方遗传A给后代，子代才患病，而其概率就等于A的基因频率即p，故子代患病概率为1/2*p；综上，子代患病概率为1/2+p/2=(1+p)/2。）
（2）从细胞水平分析，培养该细胞，敲除ZNF862基因，观察细胞表型等变化，通过比较含有该基因时的细胞表型从而探究该基因的功能，设计思路为：将正常细胞分为甲乙两组，其中甲组敲除ZNF862基因，观察甲乙两组细胞表型从而探究该基因的功能；从个体水平分析，通过比较转基因小鼠和正常小鼠牙龈差异可得出该基因的功能。
（3）一般不通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传，该方式违反法律和伦理，且存在安全隐患。
三、解答题
7．（2022·北京·高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
(2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子： 。
①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌）
Ⅱ.基因：
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。
【答案】(1)显微注射
(2)监测灵敏度更高
(3) ② D
(4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡
(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。
（2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。
（3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。
（4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。
（5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。
8．（2021·河北·高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为 。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是 。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的 （填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 （写出两点即可）。
【答案】 基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【分析】1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。
考点
十年考情（2016-2025）
命题趋势
考点1基因工程的工具及其操作步骤
（10年10考）
2025 黑吉辽蒙：PCR的原理、应用；浙江：PCR原理、目的基因的获取；河北：基因自由组合定律的实质和应用 基因突变 PCR扩增的原理与过程 基因连锁与交换定律；江苏：基因突变与基因工程；安徽：基因工程与发酵工程（PCR 扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；山东：基因工程与发酵工程（PCR 扩增、菌种筛选、发酵条件控制）；陕晋青宁：基因工程的操作程序综合；湖南：基因表达载体的构建；动物细胞融合与单克隆抗体的制备；北京：PCR技术的应用；
2024·北京：贵州：限制酶的作用特点；甘肃、湖北、江西：基因工程技术的基本步骤；浙江：引物、凝胶电泳；山东、安徽：DNA 粗提取与鉴定、PCR条件；河北：PCR的原理、条件；吉林：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；全国、重庆
2023·浙江：PCR技术；广东、湖南：基因工程培养抗逆性作物；山西、山东、湖北：构建基因表达载体；
2022· 重庆、辽宁、北京、湖北、
山东、浙江、河北、福建、
天津、江苏、湖南、广东、全国
2021·天津、江苏、湖北、辽宁、
北京、重庆、海南、福建、
山东、浙江、湖南、河北、广东、全国
2020·天津、海南、北京、
江苏、山东、浙江、全国
2019·天津、全国、北京、
江苏、海南、上海、浙江
2018·浙江、全国、北京、
天津、江苏、海南、上海
2017·全国、浙江、
天津、江苏、北京、上海
2016·天津、江苏、海南、北京、全国
从近10年全国各地的
高考试题来看， 基因工程专题常以科研为情景，注重运用教材的基础知识解决现有的问题，多考查基因工程的工具及其操作步骤、蛋白质工程和生物技术伦理。此部
分内容集中在非选择题部分考察。
考点2 生物技术伦理
（10年5考）
2024·浙江：设计试管婴儿、生物武器、试管动物、转基因产品的安全性；广东：基因编辑；
2023·浙江：试管婴儿、生殖性克隆
2022·辽宁、北京
2021·北京、河北
2020·北京
实验目的
简要操作步骤
释放DNA
在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA
离心后取① ，加入乙醇
②
在沉淀物中加入纯水
扩增DNA
将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲
液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号
N01
N02
N03
N04
N05
N06
N07
N08
N08
N09
N10
N11
N12
N12
N13
N14
N14
N15
N16
N17
N18
N18
N19
N20
N21
N22
N22
N23
N24
N24
第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号
N03
N04
N05
N08
N09
N09
N12
N14
N18
N23
N24
N25
N26
N26
N26
N27
N28
N29
N30
N30
N31
N32
N32
N33
N33
N33
N34
N35
N36
N37
N38
N39
N40
N41
N42
N43
N44
N44
N45
N46
甲的浓度（μg/mL）
卵母细胞（个）
第一极体排出（个）
成熟率（%）
卵裂数（个）
卵裂率（％）
0
106
70
66.0
28
40.0
1
120
79
65.8
46
58.2
10
113
53
46.9
15
28.3
100
112
48
42.8
5
10.4
反应管
加入的单链DNA
①
5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
②
5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③
5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④
5'-TTCACTGGCCAGT-3'
类型
研发策略
灭活疫苗
新冠病毒经培养、增殖，用理化方法灭活后制成疫苗。
腺病毒载体疫苗
利用改造后无害的腺病毒作为载体，携带S蛋白基因，制成疫苗。接种后，S蛋白基因启动表达。
亚单位疫苗
通过基因工程方法，在体外合成S蛋白，制成疫苗。
核酸疫苗
将编码S蛋白的核酸包裹在纳米颗粒中，制成疫苗。接种后，在人体内产生S蛋白。
减毒流感病毒载体疫苗
利用减毒流感病毒作为载体，带S蛋白基因，并在载体病毒表面表达S蛋白，制成疫苗。
题干关键信息
所学知识
信息加工
长期近亲交配导致小鼠后代生存和生育能力下降的遗传学原因
人类的遗传病及其预防
近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降
6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列
染色体结构变异
6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上
题干关键信息
所学知识
信息加工
启动子的基本组成单位
基因的结构
启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸
电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分
PCR及琼脂糖凝胶电泳
电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段
检测转入是否成功的技术
检测目的基因是都导入受体细胞的方法
在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA
检测用菌株
蔗糖
NV酶
葡萄糖（培养液中）
野生型
+
+
+
野生型
—
—
—
突变体
+
—
—
转基因菌株
+
+
+
题干关键信息
所学知识
信息加工
表中有蔗糖一组则有NV酶
蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶
测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示
表中有NV酶一组则有葡萄糖
NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖
表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得
野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物
扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功
题干关键信息
所学知识
信息加工
细胞分化
细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程
分化是基因选择性表达的结果
基因表达
包括转录和翻译
若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA
题干关键信息
所学知识
信息加工
获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群
细胞在外源激素或某些化学物质作用下，或营养缺乏时会停止在细胞周期的特定时期
分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群
X只在细胞生长停止后才能合成
观察图形
丙图细胞停止生长后，次生代谢产物才大量增加，符合X的合成特点
F2部分个体基因型
棕榈酸（填“有”或“无”）
16-羟基棕榈酸（填“有”或“无”）
颖壳蜡质（填“有”或“无”）
Ccd2d2
有
①
无
CCDd2
有
有
②
题干关键信息
所学知识
信息加工
基因突变类型判断
基因结构中碱基对增添、缺失及替换会导致基因结构改变
C基因碱基对数为1960pb，突变基因c碱基对数为1100pb，发生了碱基对缺失
利用C基因两侧设计的引物扩增F1与突变体Cer1杂交的后代
PCR的产物一般用琼脂糖凝胶电泳法检测和鉴定
突变体（cc）与纯合野生型(CC)杂交，F1全为野生型(Cc)，F1与突变体(cc)杂交，获得若干个后代(1Cc:1cc)
基因发生了碱基对的替换，但氨基酸序列没有改变的原因
密码子具有简并性，即不同密码子可编码同一种氨基酸
D基因突变成了d基因，但氨基酸序列未变，说明突变前后的碱基对应的mRNA上的密码子编码同种氨基酸
求F2中野生型与突变型的比例
位于非同源染色体上的非等位基因在遗传时符合基因的自由组合规律
D基因与C基因位于非同源染色体上，它们的遗传符合自由组合规律，且C基因突变为c，使棕构酸转化为16-经基棕桐酸受阻；16-经基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因，突受体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因ds，据此可推断CD表现野生型，其它基因型表现突变型
BL
CL
DL
BM
CM
DM
对照
15.1
18.1
33.6
45.5
21.3
66.1
甲
0
0
0
21.9
10.9
61.4
乙
15.0
18.5
0
0
0
33.1
丙
15.9
18.0
33.0
45.0
21.0
64.0
丁
16.0
18.5
33.0
45.0
21.0
65.0
题干关键信息
所学知识
信息加工
红色盲和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传
X染色体隐性遗传属于伴性遗传，基因位于X染色体上
X染色体隐性遗传病女患者的儿子和父亲一定患病，正常女性可能是携带者
酶切产物Z的结果
DNA分子的凝胶电泳
距离点样孔越近，DNA分子越大
蓝色盲属常染色体显性遗传
孟德尔的分离定律
常染色体显性遗传符合孟德尔的分离定律，有显性基因的个体患病
题干关键信息
所学知识
信息加工
感受器
接受刺激并产生兴奋
感受器接受刺激后产生兴奋，兴奋通过传入神经将兴奋传到神经中枢，在大脑皮层产生相应的感觉
PCR产物含保守序列和非保守序列
蛋白质功能不同，说明其结构不同
关键在于非保守序列所编码的蛋白区段
不同气味受体能特异识别相应气味分子
说明不同气味受体的蛋白质结构不同
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
题干关键信息
所学知识
信息加工
PCR过程打开成为单链的阶段
PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段
PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中变性时高温解旋，DNA双链打开成为单链的阶段是变性
双酶切的优点
基因工程的基本工具
双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化
感受态细胞的特点
目的基因导入受体细胞的方法
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
题干关键信息
所学知识
信息加工
启动子的类型的判断
启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动转录
载体中可人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。
将r2HN基因导入水稻愈伤组织的方法
可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞
水稻是植物细胞，可利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；可利用显微注射技术将目的基因导入动物细胞
病毒进入体内发生的免疫
特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫
根据图示，抗体和T细胞的数量都增加了，说明病毒进入体内既引发了体液免疫又引发了细胞免疫
题干关键信息
所学知识
信息加工
黏性末端的种类
基因工程的工具
BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序
抗生素筛选
目的基因的检测与鉴定
重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株
题干关键信息
所学知识
信息加工
向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对
RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C
向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A
利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆
产生废气少，分解后剩余的无机盐留在土壤中
实现废物利用，减少环境污染
题干关键信息
所学知识
信息加工
mRNA提前出现终止密码子
基因突变对性状的影响
基因的编码区插入DNA片段，引起基因产生编码序列错位，导致mRNA提前出现终止密码子，合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性
DNA片段位置判断
PCR及电泳
野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢
代
亲代
子一代
子二代
A基因频率
50%
%
46.9%
A3-基因频率
50%
%
53.1%
F2种子表现型
粒数
7S球蛋白
野生型
124
7S球蛋白缺失型
377
脂氧酶Lx-1，2，3
野生型
282
①
94
②
94
Lx-1，2，3全缺失型
31
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR目的产物约为 bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
杂交组合
F1表现型
F2表现型
甲×乙
不甜
1/4甜、3/4不甜
甲×丙
甜
3/4甜，1/4不甜
乙×丙
甜
13/16甜、3/16不甜
题干关键信息
所学知识
信息加工
去除细胞壁获得原生质体
植物体细胞杂交的过程
植物体细胞杂交的过程中需要先去除植物细胞的细胞壁，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，需要用相应的酶完成去壁的过程
获得单倍体植株
植物组织培养技术
通过植物组织培养技术，经过脱分化和再分化的过程，利用花药离体培养可获得单倍体
鉴定百合单倍体植株
有丝分裂的过程
单倍体植株是由配子发育而来，染色体数目减半，观察染色体的数目可判断是否是单倍体植株，有丝分裂中期的染色体形态固定，数目清晰，是观察染色体最佳时期
题干关键信息
所学知识
信息加工
锌转运蛋白基因M、N克隆
PCR技术扩增目的基因
PCR的原理是DNA分子的复制，包括变性、复性、延伸过程，变性过程类似于体内的解旋酶解旋的过程，利用高温将双链DNA解开
重组表达载体构建
基因表达载体的构建过程
利用限制性内切酶处理后的质粒和目的基因具有黏性末端或者平末端，用DNA连接酶进行连接
转基因酵母功能鉴定
目的基因的检测与鉴定
检测目的基因，需要区分出空白的受体细胞、导入目的基因的受体细胞和导入空白载体的受体细胞
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
实验方案
预期结果
I．转基因玉米×野生型玉米
II．转基因玉米×甲品系
III．转基因玉米自交
IV．野生型玉米×甲品系
①正常籽粒：干瘪籽粒≈1：1
②正常籽粒：干瘪籽粒≈3：1
③正常籽粒：干瘪籽粒≈7：1
④正常籽粒：干瘪籽粒≈15：1
DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′
Ⅰ-1
Ⅱ-1
Ⅱ-2
Ⅱ-5
91bp
√
√
√
169bp
√
√
√
260bp
√
√
核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
致病菌M
核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
是
是
是
否
致病菌M
否
是
是
否
核苷酸式入体
激发体液免疫
激发细胞免疫
较高致病性
DNA疫苗
是
是
是
否
致病菌M
否
是
是
否
方法 检测对象 检测目标 检出的含G基因植株的比例
PCR扩增 基因组DNA G基因 x1
分子杂交 总mRNA G基因转录产物 x2
抗原-抗体杂交 总蛋白质 G基因编码的蛋白质 x3
喷洒除草剂 幼苗 抗除草剂幼苗 x4
实验材料
检测对象
M植株的叶
X植株的叶
接穗新生叶
P—L mRNA
有
无
有
P—L DNA
有
无
无
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
缓冲液
50mml/LNa2HPO4-KH2PO4
50mml/LTris-HCl
50mml/LGly-NaOH
pH
6．0
6．5
7．0
7．5
7．5
8．0
8．5
9．0
9．0
9．5
10．0
10．5
酶相对活性%
25．4
40．2
49．8
63．2
70．1
95．5
99．5
85．3
68．1
63．7
41．5
20．8
题干关键信息
所学知识
信息加工
图中男女患病概率相当
常染色体遗传病，男女患病概率相当
该病很可能是常染色体上的遗传病
图中每代都有患者
显性遗传病的特点是代代相传
该病可能是显性遗传病
通过对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑来防治遗传
编辑生殖细胞或胚胎是违法行为，可能存在安全隐患
不能对人类生殖细胞或胚胎进行基因组编辑