广东高考生物真题24_真题分类 第24章 基因工程高考二轮专题

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(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案 B 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B错误;质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,因此应更换为正常质粒DNA,C正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。
(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.cli连接酶或T4连接酶
答案 B由于引物只能引导子链从5'到3'合成,分析图中扩增获得的DNA片段可知,其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确;根据三种限制酶的识别序列和酶切后的DNA片段左右侧的黏性末端可知,步骤①所用的酶是NheⅠ和CfⅠ,B错误;用步骤①的两种酶对载体进行酶切,至少切断2处,切割之后至少获得了2个片段,C正确;图中形成的是黏性末端,E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端,T4 DNA连接酶对平末端和黏性末端均可连接,D正确。
(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案 D DNA的粗提取与鉴定实验中,通过研磨破碎细胞,使细胞裂解释放DNA等物质,A正确;粗提取的DNA中可能会含有蛋白质、多糖、RNA等杂质,通过分离可以去除混合物中的杂质,B正确;根据DNA和蛋白质等在95%的冷酒精中的溶解度不同,可反复多次沉淀来提高DNA的纯度,C正确;DNA鉴定时,DNA溶液加入二苯胺试剂后,需要沸水浴加热才会变蓝,D错误。
(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案C 为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验时使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理,但移液器不需要,A错误;在将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时,应先加样,然后接通电源,B错误;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,因此取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后,析出的白色丝状物即粗提取的DNA,C正确;鉴定DNA时,需要把白色丝状物溶解在2 ml·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂进行沸水浴,D错误。
(2023辽宁,19,3分)(不定项)基质金属蛋白酶MMP2和MMP9是癌细胞转移的关键酶。MMP2和MMP9可以降解明胶,明胶可被某染液染成蓝色,因此可以利用含有明胶的凝胶电泳检测这两种酶在不同条件下的活性。据图分析,下列叙述正确的是( )
A.SDS可以提高MMP2和MMP9活性
B.10 ℃保温降低了MMP2和MMP9活性
C.缓冲液用于维持MMP2和MMP9活性
D.MMP2和MMP9降解明胶不具有专一性
答案B 由题意知,MMP2和MMP9能降解明胶,明胶可被某染液染成蓝色,所以白色条带越细,酶的分解能力越弱,与37 ℃保温+缓冲液组相比,SDS+37 ℃保温+缓冲液组MMP2和MMP9对应的白色条带变细,说明MMP2和MMP9活性降低,A错误;据图可知,10 ℃保温下,白色条带最细,说明MMP2和MMP9活性降低,B正确;缓冲液是为了维持电泳系统pH相对稳定,C错误;MMP2和MMP9降解明胶专一性的检测缺乏其他酶或底物的对照,不能证明有无专一性,D错误。
(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B 由于在低温条件下DNA酶的活性较低,因此过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A正确;DNA存在于上清液中,离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,B错误;沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C正确;并非所有蛋白质都可溶于冷酒精,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质,D正确。
(2022北京,13,2分)下列高中生物学实验中,对实验结果不要求精确定量的是( )
A.探究光照强度对光合作用强度的影响
B. DNA的粗提取与鉴定
C.探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D.模拟生物体维持pH的稳定
答案 B 教材实验中,探究光照强度对光合作用强度的影响需利用盛圆形小叶片的烧杯与光源的距离来调节光照强度,观察并记录同一时间段内各实验装置中圆形小叶片浮起的数量,A不符合题意;利用95%的冷酒精将DNA与蛋白质分离,可粗提取DNA,用二苯胺试剂定性鉴定DNA,B符合题意;探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度需要精确定量生长素类调节剂的浓度,C不符合题意;模拟生物体维持pH的稳定实验中,需准确测定加入酸或碱后不同实验材料pH的变化,D不符合题意。
(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 ml/L
答案 A 加入适量的木瓜蛋白酶能分解滤液中的主要杂质——蛋白质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,A符合题意;37~40 ℃达不到破坏蛋白质所需的温度,所选温度应该是60~75 ℃,此温度能够破坏滤液中主要杂质蛋白质的结构,进而去除这些杂质,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,B不符合题意;与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精是题干中的“特定试剂”,C不符合题意;加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 ml/L,经过以上处理后DNA析出,过滤后DNA主要存在于纱布上的过滤物中,在滤液中含量极少,经过D项处理后应过滤去除溶液中的杂质,再用物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液溶解DNA,有助于提高白色丝状物的DNA相对含量,D不符合题意。
(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.cli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.cli DNA连接酶连接
答案 C 酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部,酶切后会破坏标记基因,D不符合题意;酶3切割后产生平末端,E.cli DNA连接酶仅能连接黏性末端,故E.cli DNA连接酶无法连接酶3切割产生的平末端,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4 DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,C符合题意。
(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B 94 ℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72 ℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;72 ℃ ,1 min的后延伸过程可使目的基因的扩增更充分,B正确;由于Taq DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全后才可推广上市,D错误。
(2021浙江6月选考,20,2分)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入受精卵的Y染色体上,获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配,通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是( )
A.基因编辑处理的受精卵在体外培养时,不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B.基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期,须将其植入同期发情小鼠的子宫,才可获得表达EGFP的小鼠
C.分离能表达EGFP的胚胎干细胞,通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D.通过观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
答案 B 受精卵在体外培养时,由于不同发育阶段的胚胎细胞所需的环境有所不同,因此需要更换不同成分的培养液,A正确;进行胚胎移植的早期胚胎通常为发育到8细胞以上的胚胎,如早期囊胚,B错误;利用胚胎干细胞通过核移植等技术来获得转基因小鼠时,可在短时间内获得大量的转基因小鼠胚胎,再通过胚胎移植技术大量培养转基因小鼠,C正确;根据题干信息可知,EGFP基因被定点插入Y染色体上,而Y染色体只有雄性才具有,因而观察早期胚胎的荧光,能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎,D正确。
(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcRⅠ识别并切割双链DNA,用EcRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C 根据题干信息可知,限制性内切酶EcRⅠ的识别位点是由6个碱基对构成的,若用EcRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,则理论上得到DNA的的平均长度(碱基对)约为46碱基对,即约为4 000碱基对。故选C。
(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案 D PCR反应中出现非特异性条带的主要原因是引物与模板DNA出现了非特异性结合,模板DNA不纯或过多易出现非特异性结合,A错误;延长热变性时间与非特异性条带无直接关系,B错误;延长延伸时间易出现非特异性结合,C错误;复性温度偏低易出现非特异性结合,故提高复性温度可减少反应中非特异条带的产生,D正确。
(2021山东,4,2分)我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”,成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物的多种生物的DNA中识别并分离出来,用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是( )
A.“引子”的彻底水解产物有两种
B.设计“引子”的DNA序列信息只能来自核DNA
C.设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列
D.土壤沉积物中的古人类双链DNA可直接与“引子”结合从而被识别
答案 C 根据题意,“引子”是利用现代人的DNA序列设计并合成的,其本质是DNA或RNA,DNA的彻底水解产物有磷酸基团、脱氧核糖、四种碱基,RNA的彻底水解产物有磷酸基因、核糖、四种碱基,A错误;人的细胞核、线粒体中均有DNA,故设计“引子”的DNA序列信息可以来自核DNA和线粒体DNA,B错误;设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列,“引子”是利用现代人的DNA序列设计的,C正确;双链DNA解旋成单链后才能与“引子”序列发生碱基互补配对,从而被识别,D错误。
(2020山东,15,2分)新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是( )
A.抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理
B.感染早期,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况
C.患者康复后,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况
D.感染该病毒但无症状者,因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测
答案 D 抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理,A正确;感染早期,新冠病毒的核酸已进入机体,但机体可能尚未进行体液免疫产生抗体,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况,B正确;患者康复后,体内留有记忆细胞和抗体,而新冠病毒已被机体清除,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况,C正确;感染该病毒但无症状者,其体内会发生体液免疫产生抗体,适用抗体检测法检测,D错误。
(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制酶,该酶会破坏重组质粒的结构,不利于重组质粒在受体中保持结构稳定,A错误;抗除草剂基因转入某抗盐植物获得的2个稳定遗传品系中有抗除草剂不抗盐的品系,抗盐性的改变可能与抗除草剂基因的转入有关,B错误;在DNA检测均含目的基因的条件下,抗性鉴定为抗除草剂说明目的基因完成了表达,抗性鉴定为不抗除草剂说明目的基因可能完成了转录而没有翻译成蛋白质,还有可能是目的基因没有转录,C错误;因为质粒为环形,用某限制酶完全酶切后出现3条带,说明酶切后的产物中有3种不同分子量的DNA,可以推测出质粒上至少有3个位置被该酶切开,D正确。
(2018北京理综,5,6分)用XhⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
图1 酶切位点图
图2 电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案 D 本题通过对酶切位点图和电泳结果示意图的分析,考查基因工程工具酶的相关知识,以及观察图示、分析推理的能力,试题通过两种图示的分析体现了对科学思维素养中的演绎与推理要素的考查。图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道①②电泳结果知,泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。
(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A.用限制性核酸内切酶EcRⅠ和连接酶构建重组质粒
B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞
D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案 C 本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcRⅠ的酶切位点,因此,可采用限制酶EcRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。
[2022福建,21(一)]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是 (填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图1所示。用XhⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是 。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
答案 (一)(1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) 解析 (一)(1)PCR扩增过程中,引物链的延伸方向为5'→3'。(2)两种酶虽然能切出相同的黏性末端,但正向连接的重组DNA,限制酶的识别序列没有变,仍能用原来的两种酶进行酶切;反向连接的重组DNA,不存在XhⅠ和SalⅠ两种限制酶的识别序列,无法再进行酶切。
(2021全国乙,38,15分)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能 ;质粒DNA分子上有 ,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是 。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指 。
答案 (1)EcRⅠ、PstⅠ EcRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 限制酶切割位点 将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
解析 (1)E.cli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。
(2021全国甲,38,15分)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 (用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是 。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步, 其中复性的结果是 。
(3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
答案 (1)④②③① (2)DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
解析 (1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①。(2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到55~60 ℃,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是 。
答案 (1)SalⅠ EcRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析 (1)观察图示可知,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切割位点,分别是MunⅠ、EcRⅠ和XhⅠ的切割位点,但因为用EcRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhⅠ切割载体,切割后载体的部分序列如图所示:
扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhⅠ限制酶切割位点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的片段连接起来。由题图中终止子及基因的位置可知,F1~F7末端添加序列后应与XhⅠ切割的末端相连,R末端添加序列后应与MunⅠ切割的末端相连。由于调控序列及启动子中有XhⅠ限制酶切割位点,所以需寻找切割后的末端能与XhⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,SalⅠ符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;由于调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点,所以需寻找切割后的末端能与MunⅠ限制酶切割后的末端连接且调控序列及启动子中无其切割位点的限制酶,EcRⅠ符合这一要求,所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcRⅠ。扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:
本实验中,用EcRⅠ和SalⅠ切割扩增产物,用MunⅠ和XhⅠ切割载体,故从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq酶、SalⅠ、EcRⅠ、XhⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导P发挥作用,使BCL11A基因表达。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无BCL11A蛋白的结合位点(荧光蛋白基因能表达),由此可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
(2019课标全国Ⅰ,38,15分)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括 和 。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
答案 (1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90~95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析 本题借助目的基因的获取考查基因工程中的PCR技术以及考生对生物学问题进行科学解释的能力;试题通过PCR技术与体内DNA复制的比较,体现了对科学思维中归纳与概括要素的考查。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)体内DNA复制时,需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋,而PCR扩增目的基因时,是借助高温加热至90~95 ℃使DNA变性解旋。(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在70~75 ℃,则应使用耐高温的DNA聚合酶,即Taq酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
(2018课标全国Ⅰ,38,15分)回答下列问题:
(1)博耶(H. Byer)和科恩(S. Chen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了 (答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的 方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与 组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是 。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加 的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
解析 本题主要考查基因工程的相关知识,试题通过三问并列的命题方式考查基因工程的原理与操作程序,考查考生的识记、理解能力,涉及科学思维素养中归纳与概括、演绎与推理等思维过程。本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。
[2018浙江4月选考,32(二),7分]回答与基因工程和植物克隆有关的问题:
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI 121均用限制性核酸内切酶EcR Ⅰ酶切,在切口处形成 。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI 121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成 ,获得重组质粒。
(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 ,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。
(3)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行 ,然后接种到培养基中培养,幼胚发生 形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及 。(答出2点即可)。
答案 (1)粘性末端 磷酸二酯键
(2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
(3)消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数
解析 (1)用限制性核酸内切酶EcR Ⅰ酶切含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体PBⅠ121,可在切口处形成粘(黏)性末端,通过DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成磷酸二酯键,从而获得重组质粒。(2)经CaCl2处理过的农杆菌,成为感受态细胞,与重组质粒混合,使重组质粒进入细胞,从而完成转化实验。将其置于摇床慢速培养一段时间,目的是使经CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。(3)田间获取的水稻幼胚,需要先进行消毒处理,后接种培养,经脱分化形成愈伤组织,并进行继代培养。影响愈伤组织能否再生出植株的因素,除了培养条件,还有水稻本身的基因型这一内因,也跟继代培养次数有关。
易错警示 影响愈伤组织再生出植株的因素,题干中给出了外界培养条件,所以应从内因考虑。同时,一些植物在多次继代培养后也会丧失细胞全能性的表达能力,所以也跟继代培养次数有关。
(2017课标全国Ⅰ,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是 。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用 作为载体,其原因是 。
(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有 (答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是 (填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是 。
答案 (1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体 (5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析 本题主要涉及基因文库与cDNA文库的差异、基因工程的步骤、基因工程产物的检测方法等知识,意在考查考生提取知识、分析和归纳知识的能力。 (1)真核生物和原核生物的基因结构不同,真核生物的基因中存在内含子等不能编码蛋白质的序列,原核生物的基因中不存在内含子。真核生物在基因表达时,转录出的RNA需要将内含子对应的RNA序列切除后才可进行翻译。从人的基因组文库中获得的基因 A 中含有内含子,而作为原核生物的大肠杆菌不能切除内含子对应的RNA序列,故基因 A 在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。 (2)病毒对宿主细胞的侵染具有特异性,噬菌体是专门侵染细菌的病毒,不能侵染家蚕细胞,故可选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。 (3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点,因此在基因工程中常用原核生物作为受体细胞。(4)检测基因A 是否翻译出蛋白A,一般用抗原—抗体杂交的方法,即用蛋白 A 的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是 S型菌的 DNA 进入 R 型菌体内,并可在 R 型菌体内完成表达,这证明了 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因工程奠定了理论基础。
(2017课标全国Ⅱ,38,15分)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分,几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内,可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题:
(1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA,常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料,原因是 。提取RNA时,提取液中需添加RNA酶抑制剂,其目的是 。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA,其原理是 。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是 (答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键是 。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高,根据中心法则分析,其可能的原因是 。
答案 (1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目的基因无复制原点;目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常
解析 本题主要考查基因工程的相关知识,考查学生获取知识,分析与归纳知识等能力。(1)从植物体中提取mRNA需要破碎组织细胞,嫩叶比老叶的组织细胞易破碎,mRNA提取效率高。由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解,所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低RNA酶的活性,保护提取的RNA不被分解。(2)cDNA是在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板,按照碱基互补配对的原则合成的。(3)由于目的基因无复制原点,也无基因表达所需的启动子和终止子,所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中,但是转基因植株抗真菌病的能力没有提高,说明转基因植株体内不存在抗菌活性蛋白,即几丁质酶基因的转录或翻译过程出现异常,从而导致几丁质酶基因没有正常表达合成抗菌活性蛋白。
(2015海南单科,31,15分)在体内,人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链,此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原,进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后,产生A、B两条肽链,再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前,利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题:
(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是 ,合成胰高血糖素的细胞是 。
(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的 序列,用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成 的基因工程菌。
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,则用该工程菌进行工业发酵时,应从 中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。
答案 (1)胰岛B细胞 胰岛A细胞(每空3分,共6分)
(2)DNA 胰岛素原(每空3分,共6分)
(3)菌体(3分)
解析 (1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞,合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。(2)蛋白质工程生产胰岛素时,需根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因),然后再构建胰岛素原基因重组表达载体,导入细菌细胞内,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗原—抗体检测法检测胰岛素原时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。
(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是( )
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案 A DNA的提取过程中可以不使用离心机,可将研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,直接取上清液放入烧杯中,A正确,B错误;鉴定过程需要沸水浴加热,DNA分子在高温下会解螺旋,双螺旋结构会发生改变,C错误;加热是唯一变量,设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。
PCR和电泳
(2024黑、吉、辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是( )
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案 A 琼脂糖凝胶浓度太高会影响DNA片段的迁移,浓度太低则会导致分辨率降低,因此琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小,A正确;凝胶载样缓冲液中的指示剂可避免DNA分子迁移出凝胶,起到指示电泳进程的作用,不能指示DNA分子的具体位置,B错误;DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在同一电场作用下,DNA片段不一定向负极迁移,一般情况下,DNA片段越长移动速率越慢,C错误;凝胶中的DNA分子通过染色后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。
(2024广东,4,2分)关于技术进步与科学发现之间的促进关系,下列叙述正确的是( )
A.差速离心法的应用促进对细胞器的认识
B.电子显微镜的发明促进细胞学说的提出
C.光合作用的解析促进花期控制技术的成熟
D.RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明
答案 A 利用差速离心法可分离出不同细胞器,促进了对细胞器的认识,A正确;光学显微镜的发明促进细胞学说的提出,B错误;人工控制花期的主要途径有温度处理(通过调控温度促进或抑制花芽发育等)、光照处理(控制光照时间长短)、植物生长调节剂处理及栽培措施处理等,花期控制与光合作用的解析无关,C错误;耐高温的DNA聚合酶的发现促进PCR技术的成熟,D错误。
(2024河北,13,2分)下列相关实验操作正确的是( )
A.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果
C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板
D.将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落
答案 B PCR利用了DNA复制的原理,DNA的单体是脱氧核糖核苷酸,配制PCR反应体系时,扩增原料不能为4种核糖核苷酸,A错误;琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合,凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,B正确;将配制的酵母培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌并冷却至50 ℃左右时,在酒精灯火焰旁倒平板,C错误;将接种环烧红,待冷却后(避免菌种被烫死),迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落,D错误。
(2024湖南,15,4分)（不定项）最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢
C.5'-CTACCCGTGAT-3',为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
答案 AC 利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确;电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误;分析电泳结果,以对照个体的一条链为模板复制的子链序列为5'-CTACCCGTGAT-3',模板链序列为5'-ATCACGGGTAG-3',同理患者的子链序列为5'-CTACCTGTGAT-3',模板链序列为5'-ATCACAGGTAG-3',对比可知,患者该段序列中某位点的碱基G突变为A,C正确,D错误。
(2024新课标,5,6分)某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1,F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测,产物的电泳结果如图所示,其中①~⑧为部分F2个体,上部2条带是一对等位基因的扩增产物,下部2条带是另一对等位基因的扩增产物,这2对等位基因位于非同源染色体上,下列叙述错误的是( )
A.①②个体均为杂合体,F2中③所占的比例大于⑤
B.还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带
C.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同
D.①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2
答案 D 由题意可知,电泳结果中,上部2条带为一对等位基因的扩增产物(假设依次为A、a),下部2条带为另一对等位基因的扩增产物(假设依次为B、b),这两对等位基因位于非同源染色体上,则可推知F1基因型为AaBb,AaBb自交所得F2中,①的基因型为AaBB,②的基因型为Aabb,二者均为杂合体,③基因型为AABb,占比为1/8,⑤基因型为AABB,占比1/16,A正确;④⑥⑦⑧的基因型分别为aaBB、AAbb、aabb和AaBb,故F2中还有一种基因型为aaBb的个体,其PCR产物电泳结果有3条带,B正确;③(AABb)与⑦(aabb)杂交子代的基因型为AaBb和Aabb,其中Aabb对应图中的②,AaBb对应图中的⑧,C正确;①(AaBB)自交子代(1/4AABB、1/2AaBB和1/4aaBB)的PCR产物电泳结果与④(aaBB)电泳结果相同的占1/4,D错误。
(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( )
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
答案 D 反应管②和④虽然只有一种单链,但是单链含回文序列,可以同种单链之间发生互补,四个反应管中单链DNA互补配对情况如图所示:
由图分析可知,D正确。
阅读下列材料,完成第8、9题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病,可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查,区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者,以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列,设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物,用于扩增目的片段,如图甲所示。为选出正确和有效的引物,以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR,产物的电泳结果如图乙所示。


(2024浙江6月选考,19,2分)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述,错误的是( )
A.F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B.F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C.F2为无效引物,没有扩增功能,无法使用
D.R2引物可用于特异性地扩增目的片段
答案 D 结合图甲、图乙可知,F1-R1引物扩增产物只有一条条带,F1-R2引物扩增产物有三条条带(扩增出的产物不止一种),说明F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段,F1-R2引物不能特异性地扩增目的片段,且R2引物不可用于特异性地扩增目的片段,A、B正确,D错误;F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段,而F2-R1引物扩增后无产物,说明F2为无效引物,C正确。
(2024浙江6月选考,20,2分)为了筛查疟原虫感染者,以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样,处理后进行PCR。产物用限制酶ApⅠ消化,酶解产物的电泳结果如图所示。

1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是( )
A.1号和6号 B.2号和4号
C.3号和5号 D.1号、2号、4号和6号
答案 B

由电泳图可知,2号、4号只有一条条带,故为氯喹抗性患者,B符合题意。
(2024浙江1月选考,22,13分)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜,具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能,在克隆M、N基因基础上,转化锌吸收缺陷型酵母,进行细胞学鉴定。
回答下列问题:
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增,PCR每个循环第一步是进行热变性处理,该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时,DNA分子因为含 而带负电荷,凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口;当2个PCR产物相对分子质量接近时,若延长电泳时间,凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段,连接至克隆载体,转化大肠杆菌,测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,然后利用 连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,直接在固体培养基进行 培养,活化后接种至液体培养基,采用 以扩大菌体数量,用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平,无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6,然后各取10 μL菌液。用涂布器均匀涂布在固体培养基上,培养2天,菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测:转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是 ,依据是 。
注: OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高;空载体为未插入M或N基因的表达载体。
答案 (1)根 解旋酶 磷酸基团 变长 (2)DNA连接酶 热变性使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出 (3)划线 振荡培养 (4)梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多
解析 (1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达,说明锌转运蛋白基因在该种植物根部细胞可转录出mRNA,再以mRNA为模板翻译出锌转运蛋白,所以进行锌转运蛋白基因M、N克隆时,可以该植物根为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。PCR中热变性处理时温度超过了90 ℃,双链DNA解旋为2条单链,该处理的效果类似于生物体内解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基团故带负电荷。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小等有关,当2个PCR产物相对分子质量接近时,电泳时间过短会导致2个PCR产物分离不完全,而延长电泳时间可使2个PCR产物即凝胶中相应2个条带之间的距离变长。(2)构建重组表达载体时,先分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,以得到相同的黏性末端或平末端,再利用DNA连接酶连接。将得到的重组表达载体转化大肠杆菌,用PCR快速验证重组转化是否成功,此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是若转化成功,则大肠杆菌的DNA中含有M、N基因,热变性会使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出。(3)菌株一般低温保存于固体培养基上故取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,可直接在固体培养基上进行划线培养。有氧条件下,酵母菌可以大量繁殖,故活化后接种至液体培养基,可采用振荡培养以扩大菌体数量。(4)可采用梯度稀释法对菌液逐级稀释。该实验中阴性对照为锌吸收缺陷型酵母+空载体,其不含M、N基因。由“OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高”及题图中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6),锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组酶母菌数量明显多于锌吸收缺陷型酵母+M基因表达载体组,可知,转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是N。
(2024江苏,23,12分)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50以融合表达SOD-ELP50蛋白,过程如图1。其中ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序列-(CTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题:

(1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。
(2)步骤②转化时,科研人员常用 处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是 (从图2中的“A~D”中选填)。

(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。

(i)20 ℃时,加入NaCl后实验效果是 。
(ii)100 ℃时,导致各组中所有蛋白质都沉淀的原因是 。
(iii)据图分析,融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有
。
答案 (12分,特殊注明除外,每空1分)(1)EcRⅠ、HindⅢ (2)CaCl2 卡那霉素 S-F和E-R(2分) (3)启动子 C(2分) (4)(i)SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 (ii)高温使蛋白变性 (iii)低温下添加 NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持(2分)
解析 (1)目的基因应插入启动子和终止子之间,且题意为将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50,再结合图1可知,限制酶a和限制酶b分别是EcRⅠ、HindⅢ。(2)将目的基因导入大肠杆菌时常用CaCl2处理大肠杆菌,使其处于感受态。由图1可知,重组质粒中含有标记基因——卡那霉素抗性基因,因此转化后的大肠杆菌可采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有SOD和ELP50,用PCR技术筛选时,所设计的引物应能扩增出SOD和ELP50,结合图1中pET-SOD-ELP50可知,应选择引物S-F和E-R进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后,驱动转录。由图1可知,编码SOD-ELP50蛋白的基因长度为462+750=1 212(bp),理论上其可编码1 212÷3=404(个)氨基酸,已知蛋白中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,则融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11=44.44(kDa),电泳后应该为图2中的条带C。(4)(ⅰ)由图3可知,20 ℃时,与不加NaCl的SOD-ELP50组相比,加入NaCl后SOD-ELP50组纯化的蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时温度过高,导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃时,加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀中SOD-ELP50蛋白相对含量高,且大肠杆菌自身蛋白相对含量较低,说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,且低温有利于酶活性的保持。
(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
图2

A.ATGGTG------CAACCAC.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCATD.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
答案 (1)模板、PCR引物 反应时间 (2)CD (3)限制酶、DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳只能测定DNA长度,不能确定碱基序列是否产生突变
解析 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有:模板分别是片段F1、片段F2;引物分别是F1-R和F1-F、F2-R和F2-F,最主要的不同是反应时间(反应时间与模板长短有关)。(2)由题中信息,画出F1与F2片段相接的序列如图所示:
F2-F和F1-R应与F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1与F2片段相接处)相同或互补,C、D所给序列符合要求;而A项序列左右两端分别与F1片段上游序列和F2片段下游序列相同,B项序列左右两端分别与F2片段下游序列和F1片段上游序列互补,故A、B不符合要求。(3)重组酶可以依据PCR扩增序列和线性载体两端的同源序列进行同源重组,不需要使用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体。(4)该过程的目的不是计数,所以无需控制每个平板30~300个菌落,A错误;抗性平板上未长出菌落,一般因为没有导入含抗性基因的质粒,B错误;含有抗生素的培养基可筛选出成功转化的大肠杆菌,不会出现大量杂菌形成的菌落,C错误;单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物,在抗性平板上长出的单菌落一般无需进一步划线纯化,D正确。(5)EGFP长度为720 bp,AnB1长度为390 bp,二者的总长度为720 bp+390 bp=1 100 bp,用引物F1-F和F2-R进行PCR扩增,其长度接近于P1、P2的扩增产物,根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的长度,无法确定待检测DNA分子的碱基序列是否发生突变,因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。
(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
图Ⅰ
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcRⅤ位点插入片段)。请完成下表。
图Ⅱ
图Ⅲ
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,细胞膜的组成成分主要是脂质和蛋白质;在低等植物和动物细胞有丝分裂的前期,中心体发出星射线,形成纺锤体。(2)DNA在2.0 ml/L的NaCl溶液中溶解度很高,常用该浓度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是体外大量扩增DNA分子的技术,PCR过程需要Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶,可催化DNA子链的延伸)、引物(在PCR过程中为Taq DNA聚合酶提供3'-OH,使该酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)、四种游离的脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料)、缓冲液(提供液体环境及离子条件)、DNA母链(DNA复制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接结果如图:
用PCR鉴定是否为正向重组质粒Y-M,可选用引物a和引物b,目的产物约为1 100 bp。若M与载体质粒Y正确连接,则上游连接处含有Hind Ⅲ+EcR Ⅴ的识别序列,即5'…AAGCTT…GATATC…3',即Q4,下游含有EcR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,即5'…GATATC…GGATCC…3',即质粒测序正确的是Q4。本实验的目的是借助绿色荧光蛋白检测蛋白质X在细胞中的位置,则实验组导入的是质粒Y-M(M为X-GFP基因融合片段),表达X-GFP,对照组导入仅表达GFP的质粒Y-GFP,依据实验组绿色荧光集中在纤毛基部,而对照组整个细胞均有绿色荧光,可知蛋白X定位于纤毛基部。(4)提取细胞的总RNA,经逆转录获得cDNA,cDNA作为荧光定量PCR的模板。荧光定量PCR过程中,特定PCR循环次数下产物产生的荧光强度与模板量呈正相关,虽然限定了总cDNA模板量相等,但要注意由于健康人和病人基因Z的转录水平不同,相应的mRNA含量不同,因此基因Z的cDNA含量并不相同,设健康人基因Z的cDNA模板量为x,病人的为y,由“健康人Ct值为15,而病人Ct值为20”知,x×215=y×220,PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220)÷(x×215)=25=32倍。
知识拓展 在基因工程中常用绿色荧光蛋白基因作为标记基因或报告基因,用以检测目的基因是否完成表达,同时也可以检测目的蛋白在细胞中的分布及含量。
(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过 获得 用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ,而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表 ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有 (填序号:①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
答案 (8分)(1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 GC含量高 (5)②③
解析 本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
知识归纳 关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。
基因工程和蛋白质工程
(2024江西,12,2分)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.cliA,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.cliB。下列叙述正确的是( )
A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能
和E.cliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
答案 A 分析题意,从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB,然后利用PCR扩增目的基因,A正确;由题意知,L-谷氨酸钠是生产γ-氨基丁酸的底物,不能用来供能,B错误;将目的基因(gadB)导入菌株E.cliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.cliB,E.cliA和E.cliB均不能高效降解γ-氨基丁酸,C错误;选择限制酶时需考虑多重条件,如确保目的基因不被限制酶破坏、切割位点应精准位于启动子和终止子之间、避免对启动子和终止子造成任何损害等,同时在设计特异性引物时,还需要在其5'端设计限制酶酶切位点,以便构建重组质粒,根据题干提供的信息,无法推断出是否有其他酶能够替代NcⅠ和KpnⅠ,D错误。
(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D 用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而转录的方向是不变的,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。
(2024·浙江1月选考·1,2分)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是( )
A.试管动物的培育B.转基因食品的生产
C.治疗性克隆的研究D.生物武器的发展和生产
答案 D 我国禁止生物武器的发展和生产。
(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案B 根据题干信息,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起,如果两个基因中编码起始密码子和终止密码子的序列完整,将得到两条多肽,若想只表达出一条多肽,结合图可知,CD163基因编码起始密码子的序列需保留,编码终止密码子的序列需除去,使得CD163基因翻译结束后不停止,继续合成红色荧光蛋白RFP,即可得到一条多肽,B正确。
(2023浙江1月选考,2,2分)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述正确的是( )
A.试管婴儿技术应全面禁止
B.治疗性克隆不需要监控和审查
C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
答案 D 试管婴儿技术可以帮助不育夫妇解决生育问题,不应全面禁止,A错误;治疗性克隆也需要监控和审查,B错误;生殖性克隆存在伦理道德方面的风险,C错误;我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验,D正确。
(2022浙江1月选考,21,2分)羊瘙痒病是感染性蛋白粒子PrPSc引起的。某些羊体内存在蛋白质PrPc,但不发病。当羊感染了PrPSc后,PrPSc将PrPc不断地转变为PrPSc,导致PrPSc积累,从而发病。把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病。下列分析合理的( )
A.动物体内的 PrPSc可全部被蛋白酶水解
B.患病羊体内存在指导PrPSc合成的基因
C.产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc具有反馈抑制作用
D.给PrPc基因敲除小鼠接种PrPSc,小鼠不会发病
答案 D 感染性蛋白粒子PrPSc会将羊体内的PrPc不断转变为PrPSc,PrPSc在体内积累从而导致发病,可见动物体内的PrPSc并不会全部被蛋白酶水解,A错误;患病羊体内存在指导蛋白质PrPc合成的基因,而PrPSc并不是自身合成的,而是外界感染的,B错误;PrPSc在体内积累从而导致发病,说明产物PrPSc对PrPc转变为PrPSc不具有反馈抑制作用,C错误;把患瘙痒病的羊组织匀浆接种到小鼠后,小鼠也会发病,原因是患瘙痒病的羊组织匀浆含有感染性蛋白粒子PrPSc,小鼠体内含有PrPc,PrPc基因敲除小鼠不含PrPc,接种PrPSc后也不会发生使PrPc转变为PrPSc并积累PrPSc而致病的现象,D正确。
(2021北京,14,2分)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是( )
A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒
D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的
答案 A 高温加热可能会破坏食物中的一些维生素,A有科学依据;转基因抗虫棉能产生Bt抗虫蛋白,杀死害虫,但对人畜无害,B没有科学依据;消毒液能杀死人体皮肤表面的微生物,但不能用来清除人体内的新冠病毒,可通过药物增强人体的免疫能力,通过细胞免疫等清除人体内的新冠病毒,C没有科学依据;孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如父母的血型分别为A型(IAi)、B型(IBi),孩子是O型(ii),D没有科学依据。
(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D 根据题意可知,与N0相比,N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D错误。
(2018浙江4月选考,3,2分)将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中,培育成耐低温的西红柿新品种。这种导入外源基因的方法属于( )
A.杂交育种 B.转基因技术
C.单倍体育种 D.多倍体育种
答案 B 将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中培育出耐低温的西红柿新品种,突破了物种间生殖隔离的障碍,属于转基因技术。
(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
甲
乙
下列叙述正确的是( )
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
答案 B 从图甲可知GFP和Gata3基因使用同一个启动子,故Gata3基因的启动子同时控制GFP和Gata3基因的表达,A错误;由于启动子区在左侧,基因的编码区在右侧,因此转录的方向是从左到右,mRNA的5'端为Gata3基因,3'端为GFP基因,因此翻译时先合成Gata3蛋白,B正确;大片段为Gata3-GFP基因,小片段为Gata3基因,因此2号为Gata3-GFP基因纯合子,4号为野生型,C错误;若用引物1和引物3进行PCR,则Gata3基因无法扩增,不利于区分纯合子和杂合子,D错误。
(2024贵州,21,12分)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。
回答下列问题:
(1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时,需测定的指标是 (答出1点即可)。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与 (选填“T-DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 (选填“>”“=”或“ 与野生型相比,突变体是由T-DNA插入NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添而引起的,因此突变体相应基因的序列更长 (2)突变体 突变体的T-DNA上会存在相应的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测
解析 (1)据表中野生型菌株的两组结果对比分析可知,如果培养液中添加了蔗糖,NV基因就会表达形成NV酶,否则没有NV酶的形成,由此推测蔗糖诱导了NV基因表达。表中结果表明,当蔗糖和NV酶同时存在时,培养液中就会出现葡萄糖,由此说明NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。酶的活性可以用单位时间单位体积反应物的减少量或者生成物的增加量表示,因此NV酶的活性可以用单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或者蔗糖的减少量)表示。(2)根据题意,突变体是由T-DNA随机插入野生型菌株,使NV基因发生了突变产生的,说明T-DNA插入了NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添,即突变体中NV基因突变后的序列比野生型的NV基因序列更长,所以用与NV基因配对的引物进行扩增,扩增的结果是突变体扩增片段的长度更长。(3)为了进一步验证NV基因的功能,在突变体(NV基因突变)细胞中,转入NV基因,以便将转基因植株与突变体(NV基因突变)的结果进行对比。由于突变体的T-DNA上会存在原有的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测,因此在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因。
(2024湖南,21,13分)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题:
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用 去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用 (填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是 。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先选用 酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中 的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路: 。
答案 (1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2)花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3)①HindⅢ和BamHⅠ 交链格孢 ②利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL
解析 (1)植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。原生质体融合后形成杂种细胞,给予适宜的条件培养杂种细胞,并添加生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化,从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养;鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目,如果染色体数目为百合植株根尖有丝分裂中期的一半,则获得的植株为单倍体植株。(3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点,若要获得pL并将其连接到质粒上,可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切,以替换Ti质粒中的启动子,从而达到根据GUS酶活性反映病原微生物对启动子pL活性的影响的目的。根据图c的结果可知,交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高,可确定其诱导作用最强。②欲提高百合B中L基因的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。
(2024全国甲,38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在 (答出2点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是 。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是 。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是 。
答案 (1)变性 (2)避免质粒自身环化,防止目的基因反向连接到质粒上 T4 DNA连接酶 (3)能吸收周围环境中的DNA分子 根据目的基因的序列设计特异性引物,提取大肠杆菌的DNA进行PCR,将扩增产物进行电泳,若出现特异性条带,说明含有重组质粒 (4)甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸
解析 (1)PCR过程中,变性是通过高温破坏碱基之间的氢键,使双链DNA解聚为单链。(2)用酶a单酶切割目的基因和质粒时,目的基因与质粒两端形成的黏性末端相同,在连接时容易出现质粒自身环化及目的基因反向连接到质粒上的情况。用酶a和酶b双酶切目的基因和质粒时,目的基因及质粒两端形成的黏性末端不同,可避免质粒自身环化和防止目的基因反向连接到质粒上。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,由题图可知,酶c切割DNA产生的是平末端,故使用酶c单酶切构建重组质粒时应该用T4 DNA连接酶。(3)感受态细胞的通透性变大,处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。与普通质粒相比,重组质粒中含有目的基因,因此可以通过检验大肠杆菌中目的基因的存在与否,验证大肠杆菌中是否含有重组质粒。具体见答案。(4)形成肽链序列的推断过程如图:
(2024山东,25,12分)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲:载体信息
LB/RB:T-DNA的边界序列;Kanr:卡那霉素抗性基因;Ampr:氨苄青霉素抗性基因
图乙:目标基因L部分序列
图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越 (填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ,其中纯合的突变植株是 (填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
答案 (1)低 44 GTTT CAAT (2)卡那霉素 SacⅠ ④ (3)1/4
解析 (1)用PCR技术扩增目标基因时,引物长度过短会导致引物与模板DNA能互补的区域多,从而降低扩增产物的特异性。据图丙可知,用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA时,其产生的黏性末端为相连的四个任一脱氧核苷酸,理论上可产生的黏性末端最多有44种。分析图甲、图丙,载体的DNA序列中有两个BsaⅠ酶切割位点,切割情况如解析图所示:
由图可知载体上的黏性末端序列为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。(2)分析题图甲可知,卡那霉素抗性基因会随T-DNA导入大豆细胞,氨苄青霉素抗性基因在T-DNA外侧而不能导入,应使用卡那霉素筛选抗性植株。分析图乙、图丙可知,图乙中5'-…GAGCGC…-3'(目标序列)不能被SacⅠ识别(其PCR产物完全酶切后有一条电泳条带),但相应的突变序列5'-…GAGCTC…-3'可被SacⅠ识别(其PCR产物完全酶切后有两条电泳条带);又因为目标序列和突变序列均可被BamHⅠ和EcRⅠ酶切,故不选这两种限制酶而选SacⅠ。图丙中①~④被酶切后,出现了三种电泳条带情况,其中有三条条带的个体①③为杂合子(既含不能被SacⅠ酶切的目标序列,又含能被SacⅠ酶切的突变序列);②只有一条电泳条带,应不含突变序列;④含两条电泳条带,说明④为纯合突变植株。(3)由题意知,突变纯合体植株体细胞中只有一条染色体有T-DNA插入,同时导入了抗生素抗性基因,其同源染色体不含抗生素抗性基因,因此,其自交子代体细胞中不含抗生素抗性基因的植株为敏感植株,所占比例为1/4。
(2024广东,21,13分)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。
回答下列问题:
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2,载体的部分结构见图3)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①、②及③依次为 ,理由是 。
注:基因1编码酪氨酸酶,基因2编码T7RNAP N端-nMag,基因3编码pMag-T7RNAP C端。
图3
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为 (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
答案 (1)碳源、氮源 (2)PT7 、 PBAD 、PBAD 基因2、3可正常表达出无活性的TRNAP,蓝光照射时再激活基因1(或酪氨酸酶基因或目的基因)的表达 (3)选择含有重组质粒的驹形杆菌,杀死其他杂菌避免污染 (4)蓝光照射诱导nMag和pMag结合,激活T7RNAP,从而与特异型启动子PT7结合表达酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素 (5)将酪氨酸酶基因换成合成其他色素酶的基因,催化产生不同的色素
解析 (1)细菌培养基需要适宜的碳源、氮源,用于生长、繁殖,同时碳源、氮源会影响次级代谢物的合成。(2)依据图2 及题干信息可知,为实现蓝光控制染色,应该先合成无活性的T7RNAP,故编码两者的基因上游应连接通用型启动子。在蓝光诱导下合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素,实现蓝光控制染色。此过程中酪氨酸酶需要特异性合成,因此编码的基因上游应连接仅被T7RNAP识别的PT7 启动子。(3)将携带大观霉素抗性基因的光控表达载体导入驹形杆菌,会获得未成功导入的菌株和成功导入的工程菌株,长时间培养时也可能感染其他杂菌,在培养液中加入大观霉素(抗生素)可以筛选出工程菌株,同时也能抑制其他杂菌的生长,提高工程菌的生产效率。(4)详见答案。(5)为获得不同颜色图案的BC膜,可以利用题述光控基因表达载体,将酪氨酸酶基因换成控制合成其他色素酶的基因,催化产生不同的色素。
(2024黑、吉、辽,25,12分)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。
注:F1~F3,R1~R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是 ,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是 和 。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是 (单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1~1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
答案 (1)使蛋白质水解 使蛋白质等溶解在酒精中,DNA不溶于酒精而析出 (2)PCR 人工合成 (3)RNA聚合酶识别并结合的部位 使目的基因在植物细胞中高效表达(保证目的基因的高水平表达) (4)潮霉素B抗性 (5)F3 R2 (6)D
解析 (1)细胞中含有DNA、蛋白质等物质,在提取DNA时,加入蛋白酶可以使蛋白质水解,提高粗提取的DNA的纯度。DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质。(2)由图可知,从苏云金杆菌中利用PCR分离和扩增Bt基因,通过酶切获得1 363~1 848基因序列,通过人工合成的方法合成1~1 362基因序列。(3)启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位,驱动目的基因转录。将两个p35s启动子串联于目的基因上游,使其形成双启动子,可使目的基因在植物细胞中高效表达。(4)由图可知,在重组的穿梭质粒上只有HygBR(潮霉素B抗性基因)位于T-DNA上,其可以随T-DNA转移至棉花愈伤组织,并插入棉花细胞的染色体DNA上,故可以用含有潮霉素B的培养基初步筛选成功转化的棉花愈伤组织。(5)目的基因由人工合成的1~1 362基因序列和1 363~1 848天然序列拼接而成,扩增目的基因时所选引物需与扩增片段两端结合,且延伸方向相反,因此选用引物F3和R2。(6)蛋白质工程是通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质,由题干可知,将人工合成的1~1 362基因序列连接通过酶切获得的1 363~1 848天然序列,实现对原有的抗虫基因的改造,以获得改造的抗虫蛋白,属于蛋白质工程,D符合题意。
(2023天津,17)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一,为此设计表达载体,思路如下。
(1)外源基因的选择 纤维素常见生物降解途径如下。
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖,应向酿酒酵母转入图中三种酶的基因,并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为 (从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择 URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以图中方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在 的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
(4)表达载体的构建 综上,为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中,在构建表达载体时,A、B、C、C'、URA3和酶基因应采用图 的排布方式。


答案 (1)外 (2)P1和P6 (3)①不含尿嘧啶 ②2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶(只答含有5-氟乳清酸给2分) (4)4
解析 (1)据题意,酿酒酵母需利用纤维素作为生产乙醇的原料,但酿酒酵母菌株无法直接吸收利用纤维素等糖类,所以酶Ⅰ、酶Ⅱ和酶Ⅲ应为胞外酶,在细胞外催化纤维素生物降解为葡萄糖后,再被酿酒酵母吸收利用,故应在细胞外发挥作用。(2)同源重组需要在外源基因两端分别引入A和B,可通过PCR方法实现。引物对P3/P4只能扩增外源基因,引物对中含P2或P5则不能有效扩增,而引物P1(P6)同时包含A(B)和外源基因部分序列,可达到设计要求,故选用的一对引物为P1和P6。(3)①URA3作为标记基因,其表达产物可以合成细胞代谢所必需的尿嘧啶,所以在筛选被转化的受体细胞时,培养基中需不含尿嘧啶,无URA3(连同目的基因)的酵母细胞将无法存活,因此可筛选出含有目的基因及URA3的受体细胞。②如题图所示,方式1中URA3两侧C、C'是反向同源序列,方式2中URA3两侧C、C'是同向同源序列。在发生同源重组时,方式1只是导致URA3序列倒位,但不会切除URA3;而方式2将导致URA3以环状小分子形式被切除,并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失,故选方式2。此后,菌株1因不含URA3,可在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基上存活,而没有成功切除URA3的菌株,会将5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。(4)表达载体需要同时满足两个条件:一是需要将URA3标记基因与目的基因(酶基因)一起插入酿酒酵母基因组AB之间,所以A、B应位于标记基因与目的基因最外侧;二是需要利用C、C'片段切除URA3标记基因,同时不能影响酶基因,所以C、C'应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件的只有图4。
(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
(2023河北,22,15分)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体,转入硅藻细胞,以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题:
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的 差异获得硅藻粗提DNA,PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、 和 等。本研究中目的基因为 。
(3)PCR扩增时引物通过 原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物,对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测,扩增产物电泳结果见图2。其中,样品1为本实验的 组,样品2有特异性扩增产物,结果表明 。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析,相对于品系A,品系B的胞内脂质含量平均水平明显 。同时,还需测定 以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明,品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析,ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高, ,最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为 。(答出两点即可)
答案 (1)溶解度 (2)启动子 终止子(答案“启动子”和“终止子”不分顺序) 苹果酸酶基因(或“ME基因”) (3)碱基互补配对 对照 引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中(或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”) (4)增加 细胞数量 (5)有氧呼吸生成的ATP增多 (6)节约土地资源、不受季节和气候限制(或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”)
解析 (1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA和蛋白质。(2)基因表达载体除复制原点、目的基因、标记基因外,还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶(ME)基因。(3)对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板,而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。(4)硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知,相对于非转基因硅藻细胞品系A,转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时,还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量,以比较其繁殖速率。(5)细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶(ME)可催化苹果酸生成NADH。研究表明,品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知,ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高,NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP,最终促进细胞内脂质的合成。(6)相对于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为:能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。
(2022河北,24,15分)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPin1A)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。
回答下列问题:
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的 上,此方法的不足之处是 。
(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有 (写出两点即可)。
(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析 (填“NaPI”或“StPin1A”或“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其原因是 。

(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生 ,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是 (写出两点即可)。
答案 (1)抑制害虫胰蛋白酶活性,从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)基因表达载体的构建 (3)T-DNA 该方法一般不适用于单子叶植物 (4)PCR技术、抗原—抗体杂交技术 (5)接种试验 NaPI+StPin1A NaPI+StPin1A的转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多 (6)定向改变 昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;昆虫的胰蛋白酶基因发生突变,原有的胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用
解析 (1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道内的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性,使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质,从而达到抗虫的目的。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,可将Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞,并将其整合到受体细胞的染色体DNA上。故利用农杆菌转化法时,需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上。但农杆菌一般只感染双子叶植物和裸子植物,故其不足之处是该方法一般不适用于单子叶植物。(4)在分子水平上可通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上或检测目的基因是否转录出了mRNA;是否翻译出相应的蛋白质则需要使用抗原—抗体杂交技术。(5)抗虫基因导入植物细胞后,要鉴定其是否赋予植物抗虫特性,需要做抗虫接种试验。题图中,NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低,每株棉铃数最多,故其抗虫效果最佳。(6)昆虫种群本来就存在抗虫性强或弱的变异,在抗虫剂(蛋白酶抑制剂)的选择作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,使昆虫朝着一定的方向不断进化。蛋白酶抑制剂通过与害虫消化道内的蛋白酶结合使害虫不能消化蛋白质而死亡。昆虫具有抗胰蛋白酶抑制剂的能力可能是因为昆虫的胰蛋白酶发生突变,产生一种新胰蛋白酶,其不能与原有的胰蛋白酶抑制剂结合,使原有胰蛋白酶抑制剂不能发挥作用;也可能是昆虫在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力。
(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是
。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是 。
图甲
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;由②④组或③⑤组的差异推测,P△中缺失的特定序列的作用是 。
图乙
图丙
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是 。
答案 (1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
解析 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。PCR扩增时,耐高温的DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到引物的3'端,故限制酶识别序列应添加在引物的5'端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明在翻译P基因相应的序列时出错。图甲中,据DNA编码链与氨基酸序列可知,P基因编码链起始序列“ATGTGCA”中的第一个碱基A与EcRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致P基因mRNA的密码子被错位读取,从而导致P基因对应的氨基酸序列与P不同。要解决这个问题,可在引物中的EcRⅠ识别序列的3'端添加1个碱基,这样可使P基因转录出的mRNA正常翻译出正确的氨基酸序列。(3)(4)图乙中,①组仅添加UBC,用UBC抗体检测,不出现杂交带;②组添加UBC和FLAG-P,检测出现杂交带;③组添加UBC、药物A和FLAG-P,杂交带更加明显,说明药物A的作用是促进FLAG-P(或P)与UBC的结合。②④组都未添加药物A,二者的差异是添加FLAG-P或FLAG-P△;③⑤组都添加了药物A,二者的差异是添加FLAG-P或FLAG-P△。由①②③组结果的差异可以看出,加入药物A后检测出的UBC与其抗体结合的条带更宽,因此可以推测,药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合;由②④组和③⑤组的比较可以看出,P△不能与UBC结合,由此推测,P△中缺失的特定序列的作用是参与P与UBC的结合。
(2021辽宁,24,10分)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9 kb (1 kb=1 000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题:
(1)为获取phb2基因,提取该动物肝脏组织的总RNA,再经 过程得到cDNA,将其作为PCR反应的模板,并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用 (填 “E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
图1
相关限制酶的识别序列及切割位点
注:箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于 的生理状态,以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养,随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用(2)中选用的两种限制酶进行酶切,酶切产物经电泳分离,结果如图2, 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
图2
注: M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2 kb的DNA分子条带未出现
在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中,培养24小时后,检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量,统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 (填“G1”或“S”或“G2/M”)期。

答案 (1)反转录 (2)PvuⅡ EcRⅠ T4 DNA连接酶 (3)一种能吸收周围环境中DNA分子 (4)3 (5)G2/M
解析 (1)提取该动物肝脏组织的总RNA,可经反转录过程得到cDNA。(2)phb2基因应插入质粒的启动子与终止子之间,在质粒的启动子与终止子之间有PvuⅡ、KpnⅠ、EcRⅠ3个限制酶的切割位点,但KpnⅠ在终止子之外还有一个切割位点,据此推理,不能选用KpnⅠ进行切割,应选用PvuⅡ、EcRⅠ两种限制酶进行切割,所以在扩增的phb2基因两端应分别引入PvuⅡ、EcRⅠ两种不同限制酶的识别序列。用PvuⅡ切割质粒和目的基因后产生平末端,用EcRⅠ切割质粒和目的基因后产生黏性末端,T4 DNA连接酶既能连接平末端,也能连接黏性末端,所以应选用T4 DNA连接酶对目的基因和载体进行连接。(3)在将重组质粒导入大肠杆菌细胞之前,可用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,以提高转化效率。(4)含phb2基因的重组质粒被PvuⅡ、EcRⅠ切割后会产生2个片段,即质粒片段和phb2基因片段,这两个片段经电泳分离后会出现两个条带,已知phb2基因大小为0.9 kb,据此推理3号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。(5)观察图4,经PHB2蛋白处理后,G1期和S期的细胞百分比下降,而G2/M期的细胞百分比增加,据此推测PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的G2/M期。
(2020江苏单科,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcRⅠ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
答案 (1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
解析 (1)EcRⅠ是一种限制性核酸内切酶,它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点,使切割后的DNA片段带有相同的黏性末端。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成磷酸二酯键。在PCR循环中,升温到95 ℃是为了使DNA变性,DNA双链解旋为DNA单链,以作为DNA扩增的模板链。Taq DNA聚合酶以DNA单链为模板,以结合在特定DNA模板上的引物为出发点,将4种游离的脱氧核苷酸按5'→3'方向沿模板链顺序合成新的DNA子链,故其作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)片段F中,已知的DNA序列为
,要通过设计引物进行反向PCR,从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物(过程如反向PCR的原理示意图),则需要反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,因此要选择5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'和5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'这对引物。(4)据题图及反向PCR的原理示意图可知片段F的两端为EcRⅠ切割后的黏性末端,故正确选项为B。
(2019天津理综,9,12分)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如图实验。
据图回答:
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中 (单选)。
A.含B基因的染色体缺失 B.DNA聚合酶失活
C.B基因发生基因突变 D.B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或 中提取总RNA,构建 文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。
(3)在过程①、②转化筛选时,过程 中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程 在培养基中应加入卡那霉素。
(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是 (多选)。
A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明
。
答案 (1)D (2)精子 cDNA (3)② ① (4)BCD (5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
解析 本题借助基因工程相关知识,考查考生运用所学知识对某些生物学问题进行推理、解释,并作出合理判断或得出正确结论的能力;试题通过B基因表达对卵细胞的影响,体现了对科学思维素养中演绎与推理要素的考查。(1)B基因的启动子无法启动转录,会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取的总RNA,经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程①需将基因表达载体导入农杆菌,所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程②农杆菌感染水稻愈伤组织,农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因,正常植株也会出现杂交带,故A错误;B、D选项是检测Luc基因及其产物,B、D正确;C选项检测对象是卵细胞中mRNA,正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA,C正确。(5)一般情况下,水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚,而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚,说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
(2016课标全国Ⅰ,40,15分)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有 (答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是 ;并且 和 的细胞也是不能区分的,其原因是 。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有 的固体培养基。
(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自 。
答案 (1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长 四环素
(3)受体细胞
解析 本题借助图示模型考查基因工程的技术,考查考生是否具有针对特定生物学问题,运用模型分析、演绎与推理等科学思维方法展开探讨的能力。(1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自受体细胞。
评分细则 (1)能自我复制(具有复制原点,具有复制起始位点),具有标记基因(具有抗性基因),具有限制性核酸内切酶酶切位点(限制酶酶切位点),以上每个得分点2分,任选2个即可得4分,答出一点给2分。
(2)二者均不含氨苄青霉素抗性基因Ampr,在该培养基上均不生长(2分),不含抗性基因为关键词。含有质粒载体(2分),含插入了目的基因的重组质粒(含重组质粒)(2分),此两问不分先后顺序。二者均含氨苄青霉素抗性基因Ampr,在该培养基上均能生长(2分),含有抗性基因为关键词。四环素/Tet(1分),中英文均可得分。
(3)受体细胞/宿主细胞(2分)。
(2016课标全国Ⅲ,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有 和 ,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 。
答案 (1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分)
(2)甲和丙(2分) 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3分,其他合理答案可酌情给分)
(3)E·cliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给分)
解析 (1)分析图(a)可知,限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达,目的基因应插入在启动子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不符合要求,目的基因均不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·cliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
评分细则 (1)第一空答其他两种酶不给分。第二空答“两种酶切割后形成的黏性末端可互补”给全分。
(2)第二空原因答作“目的基因应插入至启动子与终止子之间”也给分。
(3)第一空、第二空顺序可颠倒,第三空答案唯一。
(2024北京,20,10分)学习以下材料,回答(1)~(4)题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因,对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近,没有组织特异性,本身不足以启动基因表达。 增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子,实际上包含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性,它们与特定蛋白结合后激活基本启动子,驱动相应基因在特定组织中表达(图A)。 基于上述调控机理,研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”(图B), 并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中,如果插入位点附近存在有活性的增强子,则会激活报告基因的表达(图C)。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后,研究者提取每个个体的基因组DNA,通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后,与相应的基因组序列比对,即可确定载体的插入位点,进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段,对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达,检测个体表型的改变,研究其在细胞分化和个体发育中的作用,从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中,来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化,分化是基因 的结果。
(2)对文中“增强子”的理解,错误的是 (单选)。
A.增强子是含有特定碱基序列的DNA 片段
B.增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C.一个增强子只能作用于一个基本启动子
D.很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼,观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后,发现位点附近有两个基因G和H,为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因,应检测 。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分,因而在绝大多数表达报告基因的个体中,增强子捕获载体的插入位点位于基因外部,不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造,期望改造后的载体随机插入基因组后,在“捕获”增强子的同时,也造成该增强子所调控的基因发生突变,以研究基因功能。请画图表示改造后的载体,并标出各部分名称。
答案 (1)稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)斑马鱼各组织细胞中是否存在G、H蛋白或mRNA
解析 (2)由图C可知,一个增强子可作用于报告基因的基本启动子和内源基因的基本启动子,C错误。(3)已观察到报告基因在心脏中特异表达,说明在该幼体的心脏组织中含有有活性的特异性增强子,而G、H基因在捕获载体插入位点附近,故可通过检测斑马鱼其他组织中是否含有G、H基因的表达产物来判断G、H基因是否为心脏特异表达的基因。(4)若去掉报告基因上游的基本启动子后报告基因仍能表达,说明其已插入内源基因内部,导致内源基因发生突变,故可通过对比报告基因表达的细胞与非转基因细胞的功能差异,推测内源基因的功能。改造后的载体图示详见答案。
(2024河北,22,2分)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为 启动子。Ns为终止子,其作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。
(2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测 ,通过 技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研究的原因是 。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的 细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的 免疫和 免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是 。(答出两点即可)
答案 (1)水稻胚乳细胞 终止转录HindIII EcRI (2)农杆菌转化 r2HNmRNA 抗原—抗体杂交 (3)1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4)CD8+T 体液 细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
解析 (1)利用水稻细胞培育能表达出r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器,水稻胚乳细胞启动子仅在水稻胚乳细胞中被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Ns为终止子,可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点,据图1分析知,为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间,则需要用限制酶HindⅢ和EcRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA。为检测是否翻译出r2HN蛋白,可从转基因水稻中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株(相当于杂合子)进行研究。杂合子自交,后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离,具有遗传的稳定性,因此选择纯合体进行后续研究。(4)据图2可知,实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高,说明实验组的鸡通过体液免疫产生了抗体,通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞,即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)见答案。
(2024甘肃,21,11分)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶,能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率,某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株,克隆表达降解纤维素的三种酶(如图),研究了三种酶混合的协同降解作用,以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。

(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X,能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时,刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ,该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞,使其处于一种 的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理,结果如表。表中协同系数存在差异的原因是 (答出两点)。


注:混1和混2表示三种酶的混合物。
答案 (1)只有能产纤维素酶,可利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量 (2)耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) (3)基因表达载体的构建 限制酶(或限制性内切核酸酶)、DNA连接酶 (4)繁殖能力强、结构简单、操作较容易等 能吸收周围环境中DNA分子 (5)不同生物质原料中含有的纤维素的种类不同、混合物中三种酶的比例不同
解析 (5)由表可知,混1、混2对不同生物质原料的协同系数不同,故推测不同生物质原料中含有的纤维素的种类不同导致同种混合物的协同系数不同。纤维素酶是一种复合酶,酶A、酶B、酶C的比例不同,其协同系数可能不同。
(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载体的农杆菌共培养幼苗→ 转化植株A
图1
植株B植株上半部分浸入含重组载体的农杆菌液植株长出毛状根阳性毛状根段幼苗→ 转化植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
答案 (1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用 (2)遗传特性 转基因种子 (3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上 (4)检测毛状根段是否有绿色荧光 植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增) 若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带) (5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便
解析 (1)外植体经过脱分化形成愈伤组织,愈伤组织经过再分化形成幼苗,再分化培养基需要有一定比例的生长素和细胞分裂素。叶绿素的形成需要光,故再分化过程中需要适宜的光照以诱导叶绿素的形成。(2)图1中,若不经过愈伤组织与含重组载体的农杆菌共培养环节,直接诱导培养植株,则获得的植株遗传物质全部来自植株A,这种无性繁殖的方式可以保持植株A的遗传特性。为遵守我国对农业转基因生物实行的标识制度,需对含有外源基因的转化植株A生产的种子的包装标注“转基因种子”。(3)见答案。(4)用含有重组载体的农杆菌液处理植株B后长出的毛状根中若含有基因编辑载体(阳性毛状根),则该基因编辑载体中的绿色荧光蛋白基因可以在毛状根中表达,故可通过观察其是否含有绿色荧光筛选阳性毛状根。若导入幼苗中的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶基因测序就会出现序列缺失,或用另一种方法,根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增,不会出现扩增条带。(5)对比图1与图2知,与常规转化法相比,用CDB法进行基因递送不需要进行植物组织培养,不需要无菌操作,操作简便。
(2023湖南,21,13分)某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题:
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌,培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H,其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好,若要确定其有抑菌效果的最低浓度,需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
注:“+”表示长菌,“-”表示未长菌
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体,转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中,传代多次后,生产条件未变,但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 (答出两点即可)。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官,可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体,如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 (答出两点)等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术? (填“是”或“否”)。
(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种耐药菌,严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型,来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体
②MRSA感染的肺类装配体
③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽
④生理盐水
⑤青霉素(抗金黄色葡萄球菌的药物)
⑥万古霉素(抗MRSA的药物)
答案 (1)淀粉、无机盐 (2)金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45 (3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失 (4)适宜的气体和无菌、无毒的环境 否 (5)②③④⑥
解析 (1)培养基的成分一般包含水、碳源、氮源和无机盐等营养成分,筛选分解淀粉的固氮细菌所需要的选择培养基中,除含水、无机盐外,还应含有淀粉,而不能含有有机氮。(2)从表中数据可以看出,抗菌肽浓度为3.45~55.20 μg·mL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无法存活,禾谷镰孢菌和假丝酵母在抗菌肽浓度为55.20 μg·mL-1时无法存活,而在抗菌浓度低于27.6 μg·mL-1(含)时可存活,故抗菌肽对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制效果较好。抗菌肽浓度为1.73 μg·mL-1时,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均能存活,而在3.45 μg·mL-1时均不能存活,所以若要确定抗菌肽有抑菌效果的最低浓度,应在1.73~3.45 μg·mL-1浓度区间进一步实验。(3)淀粉酶M基因发生突变或含有M基因的表达载体丢失时,菌株不能再产生淀粉酶M。(4)动物细胞培养除需要满足适宜的营养、温度、渗透压和pH条件外,还需要适宜的气体环境(95%空气和5%CO2)以满足代谢需求和维持培养液pH,以及无菌、无毒的环境防止其他微生物的污染和细胞代谢物的危害。肺类装配体形成过程涉及两种或多种细胞的共培养,但并未运用动物细胞融合技术。(5)若要探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力,需至少取三组MRSA感染的肺类装配体进行培养,第一组加入解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽,第二组加入万古霉素(作为有抗菌效果的对照),第三组加入等量生理盐水(作为无抗菌效果的对照),观察并比较三组肺类装配体的生长情况,若第一组肺类装配体生长情况明显好于第三组,且与第二组类似或好于第二组,说明该抗菌肽对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。
(2023全国甲,38,15分)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是
。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。
答案 (1)该疫苗不含乙肝病毒DNA,不会在人体细胞内增殖产生乙肝病毒 (2)作为标记基因筛选出转化成功的酵母细胞 RNA聚合酶 (3)基因组DNA 放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段 (4)从酵母细胞中提取蛋白质,用乙肝病毒表面抗原的特异性抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,说明酵母细胞中表达出目的蛋白。
解析 (1)只有乙肝病毒的DNA分子进入人体细胞,才能以其为模板进行DNA复制和外壳蛋白的表达,然后装配形成子代乙肝病毒。重组乙肝疫苗只含有乙肝病毒表面抗原,不含乙肝病毒DNA分子,不会在人体细胞内产生乙肝病毒。(2)载体上的抗生素抗性基因常作为标记基因,用于将成功导入重组基因表达载体的细胞筛选出来。细胞中的RNA聚合酶可识别载体中的启动子,并以目的基因的一条链为模板进行转录。(3)由于不能确定目的基因是否插入染色体中,需提取酵母细胞的基因组DNA,加热变性,用基因探针进行检测。该探针中需要含有目的基因中的特异性片段,且带有放射性同位素等标记。若受体细胞的染色体中含有目的基因,该探针就会与目的基因通过碱基互补配对结合在一起,从而在放射性等检测中观察到杂交带。(4)抗乙肝病毒表面抗原的抗体可与乙肝病毒表面抗原特异性结合,故可用该抗体与酵母细胞中提取出来的蛋白质进行抗原—抗体杂交,若出现杂交带,则可证明酵母细胞中表达出目的蛋白。
(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是 。
答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录 将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子的简并性 (4)获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光
解析 (1)见答案。(2)基因表达载体中,启动子和终止子分别位于目的基因的上游和下游,由图中GFP突变基因的转录方向可判断,位于目的基因上游的②为启动子,位于目的基因下游的①为终止子,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因的转录。氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,用于筛选含目的基因的受体细胞。(3)绝大多数氨基酸都有几个密码子,若突变后的基因转录出的mRNA中的密码子与原基因序列所对应的密码子编码的氨基酸相同,则性状不发生改变。(4)若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可用获得的YFP基因构建表达载体后导入真核细胞内,检验受体细胞能否发出黄色荧光。
(2023浙江6月选考,23,14分)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸,而人类主要食物中的赖氨酸含量很低,利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。
回答下列问题:
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时,能抑制合成过程中两种关键酶的活性,导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平,这种调节方式属于 。根据这种调节方式,在培养基中添加 ,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞,可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体,通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展,2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为:
①构建乳腺专一表达载体。 随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索 获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内,与BEF膜发生 ,表达载体最终进入细胞核,发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞,从牛卵巢获取卵母细胞,经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合,电融合的作用除了促进细胞融合,同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ,植入代孕母牛子宫角,直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测:利用PCR技术,以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照,以 为阳性对照,检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测:从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞,提取总RNA,对总RNA进行 处理,以去除DNA污染,再经逆转录形成cDNA,并以此为 ,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达,而不在牛耳组织细胞内表达,原因是什么? 。
答案 (1)(负)反馈调节 一定浓度的赖氨酸类似物 (2)①基因(序列)数据库 ②融合 ③受体细胞 激活 ④桑葚胚或囊胚 ⑤含酪蛋白基因的牛耳组织细胞 DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子,只能在乳腺细胞中启动转录,而在牛耳组织细胞中不能表达
解析 (1)一个系统工作的效果反过来抑制该系统的工作称为负反馈调节,基于此原理,若在培养基中加入一定浓度的赖氨酸类似物作为选择培养基,就可筛选获得抗赖氨酸类似物的细胞突变体。(2)①用化学方法合成目的基因时,需要已知其全部序列,所以可以通过基因(序列)数据库检索查询该序列。②利用膜融合的方式可将脂质体包裹的表达载体转入特定受体细胞。③核移植时常用的受体细胞为去核卵母细胞,携带转基因的BEF(核供体细胞)与受体细胞通过电融合法诱导融合,使供体核进入卵母细胞,形成重组细胞,同时电刺激还可激活重组细胞,使其完成细胞分裂和发育进程。④当重组细胞发育至桑葚胚或囊胚时进行胚胎移植。⑤阳性对照是指含有目的基因的细胞,所以用含酪蛋白基因的牛耳组织细胞作为阳性对照,通过对比判断目的基因是否导入转基因牛组织细胞中。可从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞中提取总RNA,对总RNA进行DNA酶处理,以除去细胞中的DNA,只剩下RNA,再通过逆转录形成cDNA,并以此为模板利用PCR技术扩增DNA检验基因是否表达。不同种类细胞中遗传信息的表达情况不同,含乳腺特异性启动子的表达载体只在乳腺细胞中表达。
(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
图1
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
图2
图3
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
解析 (1)野生型DA1基因为显性基因,若导入成功,转基因植株的种子大小应与野生型的一致。(2)用农杆菌转化法进行转基因需将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,所以需将二者用同种限制酶切割再用DNA连接酶连接。如要目的基因正常表达,其上游要有启动子驱动转录开始,下游要有终止子终止转录。(3)①能在选择培养基上萌发并生长的阳性个体说明其基因组中成功插入含有DA1基因的T-DNA片段。②T0代植株自交后所得的T1代种子若能在选择培养基上存活,则为导入了DA1基因和卡那霉素抗性基因的阳性种子,但导入的数量未知,故用T1代植株继续自交,若某T1代植株为基因组单一位点插入,则其产生的T2代种子在选择培养基上的存活率(阳性率)为75%。③目标转基因植株应为纯合阳性子代,T2代植株中存在杂合阳性和纯合阳性子代,应该用自交的方法筛选,若后代不再出现性状分离,即阳性率为100%,说明培养基中的幼苗为目标转基因植株。(4)野生型基因和突变型基因长度均为150 bp,野生型基因内部无限制酶X的酶切位点,突变型基因在50 bp处有一个限制酶X的酶切位点,所以酶切后野生型出现1个150 bp的条带,而突变型出现100 bp和50 bp两个条带。
(2022天津,15,10分)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因, 为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物 和 ,并在引物的 (5'/3')端引入XhⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含 (EcR Ⅰ/Hind Ⅲ/Xh Ⅰ)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为 。
A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C.卡那霉素和链霉素都敏感
D.卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案 (1)1 4(以上两空可调换) 5' (2)Xh Ⅰ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR(聚合酶链式反应,答案合理即可)
解析 (1)结合题图中载体1分析,要去除SacB区域,应扩增SacB区域外的DNA片段,所选择的两种引物应方向相反,且位于扩增部位两端,故应选引物1和4。由于PCR扩增时,子链从引物的3'端开始延伸,因此应在引物的5'端引入合适的限制酶识别序列。(2)根据题图中构建载体4的过程可知,从载体3扩增出的RpsL片段插入了载体2的XhⅠ位点,故以载体3为模板扩增RpsL时所需引物应包含XhⅠ酶识别序列。(3)因受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感,载体5上具有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因),故成功导入载体5的菌株链霉素敏感、卡那霉素不敏感,所以,为获得成功导入载体5的菌株,应利用含有卡那霉素的平板进行初步筛选,选择平板上出现的菌落即可。(4)P1基因整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失,所以该菌的表型依然是受体菌的表型,即链霉素不敏感、卡那霉素敏感,故B正确。(5)以受体菌拟核DNA为模板,采用P1基因特异性引物进行PCR扩增,若获得相应大小片段,即可表明该菌株成功整合了P1基因。
(2022重庆,26,15分)改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因,并开展了相关探索。
步骤Ⅰ:
步骤Ⅱ:
(1)花药培养能缩短育种年限,原因是 。在步骤Ⅰ的花药培养过程中,可产生单倍体愈伤组织,将其培养于含 的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。Ⅰ中能用于制造人工种子的材料是 。
(2)步骤Ⅱ中,eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库,原因是 ;在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株,需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后,应侵染Ⅰ中的 ,以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ,移栽后若发育为更高且丰产的稻株,则可望“禾下乘凉”。
答案 (1)花药培养获得的单倍体经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体 (2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌群而获得的,在cDNA文库中容易筛选获得目的基因 限制酶和DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术
解析 (1)花药离体培养可获得单倍体,再经秋水仙素处理后所得植株均为纯合子,后代不会发生性状分离,所以可以明显缩短育种年限。秋水仙素能抑制纺锤体的形成,从而引起细胞内染色体数目加倍,故将单倍体愈伤组织培养于含秋水仙素的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可分化形成根、芽,常用于制造人工种子。(2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌群获得的,而基因组文库包含了本物种的全部基因,在cDNA文库中容易筛选获得目的基因。在构建重组Ti质粒时,需使用一定的限制酶切割质粒,再使用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段,之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。重组Ti质粒中含有抗生素抗性基因,在培养基中添加抗生素可以筛选获得含重组Ti质粒的菌株。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,用含eui基因的农杆菌侵染愈伤组织,可将eui基因导入愈伤组织,获得转基因再生植株。可采取DNA分子杂交技术检测再生植株是否含有eui基因。
知识拓展 cDNA文库与基因组文库
cDNA是用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,这个受体菌群体称为cDNA文库。基因组文库是将某种生物的DNA全部提取出来,选用适当的限制酶切成一定范围大小的DNA片段,再将这些DNA片段分别与载体连接后导入受体菌群获得的。
(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 ,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是 ,终止子的作用是 。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是 ,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了 ,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于 ,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案 (1)引物 (2)便于筛选含有目的基因的受体细胞 使转录在所需要的地方停下来 (3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量 (4)废弃物的资源化 减少了碳排放
解析 (1)利用PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因两端的核苷酸序列,根据这一序列设计并合成一对引物。(2)抗生素抗性基因作为标记基因,作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯,位于基因的下游,可使转录在所需要的地方停下来。(3)酶蛋白的大量合成消耗大量的物质和能量,导致重组梭菌用于自身生长、繁殖的物质和能量减少,菌体生长迟缓。(4)该技术使一个系统产出的污染物,能够成为本系统或另一个系统的生产原料,从而实现了废弃物的资源化。从“碳中和”的角度看,该技术减少了碳排放。
(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是 。

(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
解析 (1)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。(3)由图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大。
[2022浙江1月选考,29(二),7分]我国在新冠疫情防控方面取得了显著的成绩,但全球疫情形势仍然非常严峻,尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎,更是威胁着全人类的生命健康。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是:以新冠病毒的单链 RNA 为模板,利用 酶合成DNA,经PCR扩增,然后在扩增产物中加入特异的 ,如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是:将腺病毒的复制基因敲除;以新冠病毒的 基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发特异性免疫反应。在此过程中,腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的 。将腺病毒复制基因敲除的目的是 。
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是:取免疫阳性小鼠的 细胞与骨髓瘤细胞混合培养,使其融合,最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比,杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分,如胰岛素和 。
答案 (二)(1)逆转录 核酸探针 (2)抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 (3)脾(B淋巴) 动物血清
解析 (二)(1)以新冠病毒的单链RNA为模板,在逆转录酶催化下可合成相应的DNA。经PCR扩增后的DNA,可利用特定的核酸探针进行检测。(2)制备腺病毒载体疫苗时需将以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原,从而引发人体的特异性免疫反应。因此,腺病毒相当于基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除,可使腺病毒失去复制能力,防止其在人体内增殖。(3)制备单克隆抗体时,要取免疫阳性小鼠的脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合,筛选获得特定的杂交瘤细胞。相比植物组织培养,动物细胞的培养需要动物血清等特殊成分。
(2022全国乙,38,15分) 新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是 ,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的 来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明 (答出1种情况即可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是 。
答案 (1)逆转录酶 (2)特异核苷酸序列 复性 (3)被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒 被检测者感染了病毒并产生了抗体 (4)获得目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA需要逆转录酶。(2)用PCR技术扩增新冠病毒RNA片段时,所需要的引物必须依据新冠病毒RNA中的特定核苷酸序列来进行设计。PCR过程每次循环分为变性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)和延伸(72 ℃左右)三个阶段,复性阶段温度最低。(3)同时进行核酸检测和抗体检测,若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明被检测者曾经感染过病毒,体内出现抗体但目前没有病毒;若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明被检测者感染了病毒并产生了抗体。(4)基因工程技术获得大量蛋白S的基本操作流程:目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
(2021广东,22,12分)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(图13),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。
图13
回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有 。
(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有 。 (答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有 。
(4)依图13所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是 。在分子水平上,可以通过改变 ,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
答案 (1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成 (2)蛋白酶水解法、盐析法、60~75 ℃恒温水浴法 (3)感受态 抗原—抗体杂交 (4)部分酶失活,无法获得肌醇 基因结构
解析 (1)目前获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。(2)制备高质量DNA模板时,可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质,而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,当盐浓度较高时,蛋白质的溶解度下降并析出,这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性,严格控制温度范围,使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性,可将DNA与蛋白质分离。(3)将表达载体导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法是首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。然后将重组DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白,可以从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已表达出蛋白质产品。(4)酶的作用条件较温和,在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活,不同酶的最适温度、最适pH一般不同,将4种酶放在同一体系中,控制温度、pH等条件一致,则部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活,不能达到实验目的,即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成,可以通过改造酶基因的结构,从而改变蛋白质的结构,进而实现对酶特性的改造和优化。
(2021河北,24,15分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为 。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是 。
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是 。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的 (填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

图1 图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于 (写出两点即可)。
答案 (1)基因文库 (2)限制酶和DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)农杆菌转化法 防止YCF1基因随花粉扩散,给生态系统带来风险 (4)耐性 叶 (5)转基因杨树液泡膜上的Cd转运蛋白可将细胞质基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响 乔木比草本生物量大,与外界物质交换能力强
解析 (1)将含有某种生物细胞不同基因的许多DNA片段与载体连接起来,导入受体菌的群体中并储存,每个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,这个群体称为基因文库。(2)构建基因表达载体时需要用限制酶切割DNA分子和质粒,然后用DNA连接酶使获取的目的基因与质粒连接起来。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,以便筛选出含有目的基因的细胞。(3)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等,其中农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物最常用的方法;不育株系可以防止基因在繁殖过程通过花粉在生态系统中扩散。(4)据图1可知,转基因植株的干重比野生型的大,表明转基因植株对Cd具有更强的耐性;据图2可知,叶片对Cd的富集作用最强,所以对叶进行后续处理对缓解土壤Cd污染最为有效。(5)转基因杨树液泡膜上有Cd转运蛋白,可以将细胞质基质中的Cd运入液泡进行贮存,降低Cd对细胞代谢的影响,野生型不具有这个功能。与草本植物相比,乔木植株更大,生物量更多,与外界物质交换能力更强,可以富集更多的Cd。
(2021浙江6月选考,29(二),15分)斑马鱼是一种模式动物,体外受精发育,胚胎透明、便于观察,可用于水质监测、基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
(1)由于人类活动产生的生活污水日益增多,大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体 ,使藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼,可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
(2)为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制,用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ,导入大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆,质粒载体应含有 (答出2点即可)。提取质粒后,采用 法,将该基因导入斑马鱼受精卵细胞中,培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
(3)为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选,可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团,取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ,以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
答案 (1)富营养化 (2)重组DNA分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射 (3)胰蛋白酶 原代 饲养层细胞
解析 (1)未经处理的生活污水中含有大量有机物,直接排放到水体中会引起水体富营养化,从而使得水体中藻类大量繁殖。(2)用一定的方法获取目的基因后,将目的基因和质粒载体相互连接从而形成重组DNA分子,再将重组DNA分子导入受体细胞。质粒载体应含有限制性核酸内切酶的识别序列以便连接目的基因,同时也应含有抗生素抗性基因以便筛选导入目的基因的受体细胞。将含有目的基因的载体导入动物细胞,通常选用的方法是显微注射法。(3)动物组织细胞之间的粘连物主要是蛋白质,一般选用胰蛋白酶将动物组织细胞分散开。分散的动物细胞作为初始材料进行的动物细胞培养是原代培养。为了提高动物细胞克隆的形成率,可用成纤维细胞作为饲养层细胞以支持细胞生长。
(2021天津,16,12分)乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图,图2为构建表达载体时所需的关键条件。

图1 图2
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下:
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,且能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和2。其中引物1的5'端序列应考虑 和 。
②将上述PCR产物和质粒重组后,导入大肠杆菌,筛选、鉴定,扩增重组质粒。
重组质粒上有 ,所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性,易被本物种的转录系统识别并启动转录,因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 (能/不能)在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株,在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母,并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源,利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵,结果既产生乳酸,也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量,下列措施中不合理的是 (单选)。
A.进一步优化发酵条件
B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种
答案 (1)细胞质基质 (2)①包含BamHⅠ的识别序列 将GTG改为ATG ②原核生物复制原点 不能 ③缺失尿嘧啶 (3)B
解析 (1)酿酒酵母为真核生物,其进行无氧呼吸的场所为细胞质基质,所以乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为细胞质基质。
(2)①因为扩增的目的基因的引物1对应5'端的序列的编码(非模板)链含有编码起始密码子的序列GTG,所以该引物5'端对应的序列含编码链的起始端,故该引物5'端序列需要满足两个条件:一是将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG改为真核生物偏好的ATG;二是引物5'端序列应加入BamHⅠ的识别序列(酶切位点),以便将扩增的目的基因以正确方向插入质粒。
②大肠杆菌为原核生物,若要在大肠杆菌内扩增,重组质粒上应有原核生物复制原点,以便被大肠杆菌的DNA聚合酶识别。因为插入的含乳酸脱氢酶基因的重组质粒没有大肠杆菌基因启动子,所以不能被大肠杆菌的转录系统识别并启动转录,无法在大肠杆菌中高效表达。
③实验所选的酿酒酵母菌株为尿嘧啶合成缺陷型,不能在缺失尿嘧啶的固体培养基上生长,若该菌株细胞中导入重组质粒,由于重组质粒中含有尿嘧啶合成酶基因,可使导入重组质粒的酿酒酵母恢复合成尿嘧啶的能力,因此可以用缺失尿嘧啶的固体培养基筛选出转基因酿酒酵母,并进行鉴定。
(3)若使用乳酸菌LDH基因自身的启动子,则不能被酿酒酵母的转录系统识别,所以不能提高其乳酸产量。
(2021北京,21,10分)近年来发现海藻糖-6-磷酸(T6P)是一种信号分子,在植物生长发育过程中起重要调节作用。研究者以豌豆为材料研究了T6P在种子发育过程中的作用。
(1)豌豆叶肉细胞通过光合作用在 中合成三碳糖,在细胞质基质中转化为蔗糖后运输到发育的种子中转化为淀粉贮存。
(2)细胞内T6P的合成与转化途径如下:
底物T6P海藻糖
将P酶基因与启动子U(启动与之连接的基因仅在种子中表达)连接,获得U-P基因,导入野生型豌豆中获得U-P纯合转基因植株,预期U-P植株种子中T6P含量比野生型植株 ,检测结果证实了预期,同时发现U-P植株种子中淀粉含量降低,表现为皱粒。用同样方法获得U-S纯合转基因植株,检测发现植株种子中淀粉含量增加。
(3)本实验使用的启动子U可以排除由于目的基因 对种子发育产生的间接影响。
(4)在进一步探讨T6P对种子发育的调控机制时,发现U-P植株种子中一种生长素合成酶基因R的转录降低,U-S植株种子中R基因转录升高。已知R基因功能缺失突变体r的种子皱缩,淀粉含量下降。据此提出假说:T6P通过促进R基因的表达促进种子中淀粉的积累。请从①~⑤选择合适的基因与豌豆植株,进行转基因实验,为上述假说提供两个新的证据。写出相应组合并预期实验结果。
①U-R基因 ②U-S基因 ③野生型植株 ④U-P植株 ⑤突变体r植株
答案 (10分)(1)叶绿体基质
(2)低
(3)在其他器官(过量)表达
(4)②⑤ 与突变体r植株相比,转基因植株种子的淀粉含量不变,仍皱缩
①④ 与U-P植株相比,转基因植株种子淀粉含量增加,为圆粒
②④ 与U-P植株相比,转基因植株种子R基因转录提高,淀粉含量增加,为圆粒(答出任意两条即可)
解析 (1)三碳糖合成的反应属于暗反应,故豌豆叶肉细胞光合作用合成三碳糖的场所为叶绿体基质。
(2)U-P基因使种子中P酶增加,促进了T6P转化为海藻糖,故U-P植株种子中T6P的含量比野生型植株低。
(3)通过题干信息可知,启动子U使与之相连的基因只在种子中表达,不在其他器官表达,故使用启动子U可排除目的基因在其他器官表达对种子发育产生的间接影响。
(4)U-S基因可使种子中T6P含量增多,将该基因转入突变体r植株(R基因功能缺失,种子皱缩),若假说成立,则转基因植株种子中U-S基因无法使种子中淀粉含量增加;U-P植株种子(皱缩)中R基因转录降低,将U-S基因转入U-P植株,若假说成立,则转基因植株种子中R基因转录升高,且淀粉含量增加,为圆粒;U-R基因可表达出生长素合成酶,将该基因转入U-P植株,若假说成立,则转基因植株种子中淀粉含量增加,为圆粒。
(2020山东,25,11分)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶是 ,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
(2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了 ,从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填:“发生”或“不发生”)改变,原因是 。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经 过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是 。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示,据图推测糯性最强的品系为 ,原因是 。
答案 (1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录(或:反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或:引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3 品系3的Wx mRNA最少,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强
解析 (1)构建重组载体所需的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶,重组载体进入受体细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录出mRNA,若启动子序列改变,将会影响RNA聚合酶与启动子的识别和结合,从而影响基因的转录;由题意知,3个突变品系发生改变的是Wx基因的启动子,而启动子位于基因的非编码区,编码直链淀粉合成酶的碱基序列(即编码区)中不含启动子,故3个突变品系合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列不发生改变,只是Wx基因的表达水平发生了改变。(3)检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经逆转录过程获得总cDNA。利用cDNA进行PCR扩增前需根据Wx基因的一段已知序列设计特定引物,从而专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,由于直链淀粉所占比例越小糯性越强,所以Wx基因表达量最少即Wx mRNA量最少的品系糯性最强,故品系3糯性最强。
(2020天津,16,10分)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原,能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱,从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验,使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原,为此构建重组表达载体,技术路线如下。
据图回答:
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达,需改造其编码序列。如图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析,转录形成的mRNA中,该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有 个。
(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列,确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是 (多选)。
A.引入短肽编码序列不能含终止子序列
B.引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C.引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D.引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中,SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体,可形成 种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现,信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测,信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是 。
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后,小鼠体内出现人胰岛素抗原,能够特异性识别它的免疫细胞有 (多选)。
A.B细胞 B.T细胞 C.吞噬细胞 D.浆细胞
答案 (共10分)(1)6 (2)ABCD (3)3 (4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 (5)AB
解析 (1)
据表及题图分析可知,转录形成的mRNA中,该段序列所对应的片段内共6个密码子发生了碱基替换。(2)对人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列后不应破坏其正常功能,若引入的短肽编码序列含有终止子序列,则会导致DNA转录提前结束,形成的mRNA过短,翻译成的多肽链将不完整而失效,A正确;如果引入的短肽编码序列含有终止密码子编码序列,则该mRNA的翻译过程将提前结束,氨基酸数目减少从而导致蛋白质失效,B正确;由题干分析可知,加入短肽编码序列的目的是使A、B肽链等比例表达,不能改变A、B肽链的氨基酸序列,更不能改变原人胰岛素的抗原性,C、D正确。(3)由重组表达载体图像分析可知,该环形DNA上有两个SacⅠ酶切位点和一个XbaⅠ酶切位点,则用这两种酶充分酶切重组表达载体后将产生三个短链(注意线形的DNA双链被限制酶充分酶切三个相应位点之后将形成4个DNA片段,而一个环形质粒被限制酶充分酶切三个相应的位点之后将形成3个DNA片段)。(4)由于乳酸菌为原核生物,没有细胞核且只有核糖体一种细胞器,再结合题意,所形成的蛋白质最终分布在细胞壁上,故综合分析可知,蛋白质在核糖体上合成,经细胞质基质后,先到达细胞膜再分布到细胞壁上。(5)根据免疫调节基础知识判断,能特异性识别抗原的细胞有B细胞、T细胞、效应T细胞、记忆细胞;吞噬细胞只有识别抗原的能力,但并不具有特异性识别抗原的能力;浆细胞没有识别抗原的能力,其分泌的抗体虽然有特异性识别抗原的能力,但是抗体是蛋白质,其不属于细胞结构。综合分析A、B选项正确。
[2019浙江4月选考,32(二),7分]回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题:
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原),可通过 技术获得特异性探针,并将 中所有基因进行表达,然后利用该探针,找出能与探针特异性结合的表达产物,进而获得与之对应的目的基因。
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达,应检测 (A.质粒载体 B.转录产物 C.抗性基因 D.病原微生物)
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生 ,可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入 ,并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用 培养建立的细胞系用于筛选,则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中,有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株,可采用的方法是 。
答案 (1)单克隆抗体 基因文库 (2)B (3)变异 高浓度致病真菌 花粉离体 (4)胚的离体培养
解析 (1)对于已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原),可通过单克隆抗体技术获得特异性探针,并将植株基因文库中所有基因进行表达,然后利用该探针,找出能与探针特异性结合的表达产物,进而获得与之对应的目的基因。(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达,应检测转录产物。(3)植物细胞在培养过程中往往会发生变异,可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入高浓度致病真菌,并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用花粉离体培养建立的细胞系用于筛选,则可快速获得稳定遗传的抗病植株。(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中,有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株,可采用的方法是胚的离体培养。
(2018课标全国Ⅱ,38,15分)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如图,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
↑E1 ↑E2 ↑E3 ↑E4
回答下列问题:
(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ,也是为了保证 。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。
(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 (填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
解析 本题综合考查基因工程与胚胎工程的相关知识,试题通过基因表达载体的构建、PCR技术的分析等考查考生能否根据文字或图示,运用演绎与推理等科学思维方法分析题意、展开探讨,得出答案。(1)构建基因表达载体时,使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的两种限制酶,可以防止自身环化,并且保证融合基因和质粒正确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光,说明L1基因已经表达,即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因,需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板,用PCR方法进行鉴定。
(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用 技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的 ,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与 连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的 进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加 的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。
特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是 (单选)。
A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶
C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起 免疫,增强免疫保护效果。
答案 (1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)细胞
解析 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。
(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的α-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备α-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题:
(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前,需先获得细菌的 。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的 端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是 。
(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中 的设定与引物有关, 的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间
⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列:
5'-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3'
图中虚线框内mRNA片段包含 个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有 种。
（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如表:
根据上述实验结果,初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为 。
答案 (8分)(1)基因组DNA (2)5' 使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连 (3)② ⑥ (4)8 13 (5)pH为8.5,缓冲液为50 mml/L Tris-HCl
解析 本题主要考查PCR技术、密码子分析、外界因素对酶活性的影响等知识,考查考生识记知识、理解图示、分析判断的能力。试题中的图示、表格分析,体现了对考生科学思维素养中的演绎与推理要素、科学探究素养中的结果分析要素的考查。(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α-淀粉酶基因,因此在扩增α-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3'端相连的,由此确定需在引物的5'端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制性酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5'端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子的第一个碱基已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为4×4=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:α-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mml/L Tris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。
(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。
(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取 合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是 (填写字母,单选)。
A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子
C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是 。
(4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比,选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是 。
(5)为证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与 的生物学功能一致。
答案 (1)总RNA(或mRNA)
(2)B
(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化
(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工
(5)HSA
解析 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的,所以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA复制,DNA复制时,两条子链的延伸方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达,需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞,使农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物,无内质网和高尔基体,不能对多肽进行高效加工,而水稻是真核生物,具有内质网和高尔基体,可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
易错警示 注意PCR技术的原理是DNA复制,DNA复制时,两条母链分别作为模板,新合成的两条子链延伸的方向相反,由此确定引物的位置及扩增方向。
(2015课标全国Ⅱ,40,15分)已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:
(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的 进行改造。
(2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括 的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即: 。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过 和 ,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分)
(2)P P1(每空2分,共4分) DNA和RNA(或遗传物质)(2分) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列(每空2分,共4分) 功能(1分)
解析 (1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括遗传信息的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
(2015课标全国Ⅰ,40,15分)HIV属于逆转录病毒,是艾滋病的病原体。回答下列问题:
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时,可先提取HIV中的 ,以其作为模板,在 的作用下合成 ,获取该目的蛋白的基因,构建重组表达载体,随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白,该蛋白作为抗原注入机体后,刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是 ,该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV,检测的原理是 。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见,但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分 细胞,降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有 癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷,易发生恶性肿瘤。
答案 (1)RNA 逆转录酶 cDNA(或DNA)(每空2分,共6分) (2)抗体(2分) 抗原抗体特异性结合(3分) (3)T(或T淋巴)(2分) (4)监控和清除(2分)
解析 本题以HIV为背景,主要考查了逆转录病毒的遗传信息流动、人体的免疫调节等。(1)HIV属于逆转录病毒,要获取目的蛋白的基因,可先从HIV中提取其RNA,再以其作为模板,在逆转录酶的作用下合成cDNA,此cDNA即含有该目的蛋白的基因。(2)目的蛋白作为抗原注入机体后,可启动机体的体液免疫,通过浆细胞产生抗体,而此抗体可与目的蛋白特异性结合。利用上述原理可检测受试者血清中是否含有HIV。(3)HIV致病的机理是HIV主要感染和破坏了患者的部分T细胞,降低了患者免疫系统的防卫功能。(4)人体的免疫系统有监控和清除癌细胞的功能。
(2015天津理综,8,16分)(16分)纤维素分子不能进入酵母细胞。为了使酵母菌能够利用环境中的纤维素为原料生产酒精,构建了含3种不同基因片段的重组质粒。下面是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。
据图回答:
(1)本研究构建重组质粒时可选用四种限制酶,其识别序列如下图。为防止酶切片段的自身连接,可选用的限制酶组合是 或 。
A.①② B.①③ C.②④ D.③④
(2)设置菌株Ⅰ为对照,是为了验证 不携带纤维素酶基因。
(3)纤维素酶基因的表达包括 和 过程。与菌株Ⅱ相比,在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有 。
(4)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,菌株 不能存活,原因是 。
(5)酵母菌生成酒精的细胞部位是 ,产生酒精时细胞的呼吸方式是 。在利用纤维素生产酒精时,菌株Ⅳ更具优势,因为导入的重组质粒含有 ,使分泌的纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,提高酶的利用率。
答案 (16分)(1)B(或C) C(或B) (2)质粒DNA和酵母菌基因组 (3)转录 翻译 内质网、高尔基体 (4)Ⅱ 缺少信号肽编码序列,合成的纤维素酶不能分泌到胞外,细胞无可利用的碳源 (5)细胞质基质 无氧呼吸 A基因片段
解析 本题借助新情境材料考查对照实验结果分析、基因工程、分泌蛋白表达、呼吸等相关知识,考查学生获取信息能力、实验能力、理解能力。(1)为防止酶切片段的自身连接,必须用不同限制酶切割,且酶切片段两端的黏性末端不相同(不存在碱基互补片段)。从图示看,符合要求的限制酶有以下组合:①③、①④、②③、②④,B、C正确。(2)分析对照实验首先要确定自变量,本题中自变量是导入含不同基因片段的重组质粒。菌株Ⅰ为空白对照,与其他三个组别比较,不难发现设置菌株Ⅰ的目的是验证质粒自身及酵母菌原基因组不携带纤维素酶基因。(3)基因表达包括转录和翻译两个过程。通过图示来看菌株Ⅱ中,纤维素酶只分布在细胞质基质中,而菌株Ⅲ和菌株Ⅳ的纤维素酶分布在内质网、高尔基体、囊泡、细胞外,所以菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有内质网、高尔基体。(4)菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行对比,不难发现信号肽的作用是引导多肽(纤维素酶)进入内质网加工,再经高尔基体分泌到胞外,这样纤维素酶可在胞外将纤维素水解为葡萄糖,供酵母菌吸收利用。而菌株Ⅱ纤维素酶在胞内无法水解纤维素,故在以纤维素为唯一碳源的培养基上,菌株Ⅱ不能存活。(5)酵母菌无氧呼吸生成酒精,场所为细胞质基质。菌株Ⅲ和Ⅳ均能水解纤维素产生酒精,两组进行对比,菌株Ⅲ的纤维素酶流失多,菌株Ⅳ因导入A基因片段使得纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,酶的利用率更高。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M
①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确
③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
检测用菌株
蔗糖
NV酶
葡萄糖(培养液中)
野生型
+
+
+
野生型
-
-
-
突变体
+
-
-
转基因菌株
+
+
+
氨基酸
密码子
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
亮氨酸
CUG
精氨酸
AGA
甘氨酸
GGC
丝氨酸
AGC
GGG
脯氨酸
CCA
终止
UGA
CCC
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列
PCR
引物
①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
生物质
原料
降解率(%)
协同系数
酶A
酶B
酶C
混1
混2
混1
混2
小麦秸秆
7.08
6.03
8.19
8.61
26.98
74.33
114.64
玉米秸秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉米芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
测试菌
抗菌肽浓度(μg·mL-1)
55.20
27.60
13.80
6.90
3.45
1.73
0.86
金黄色葡
萄球菌
-
-
-
-
-
+
+
枯草芽
孢杆菌
-
-
-
-
-
+
+
禾谷镰
孢菌
-
+
+
+
+
+
+
假丝酵母
-
+
+
+
+
+
+
改造前单
链
TTT
GTG
AAC
CAA
CAC
CTG
TGC
GGC
TCA
CAC
改造后单
链
TTT
GTC
AAC
CAA
CAT
TTA
TGT
GGA
TCA
CAT
对应密码
子改变
对应密码
子改变
对应密码
子改变
对应密码
子改变
对应密码
子改变
对应密码
子改变
启动子
L1基因
GFP基因
终止子