还剩52页未读，
继续阅读
所属成套资源：人教版（新课程标准）高二下学期生物选修3 同步课件
成套系列资料，整套一键下载
人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》专题1 基因工程1.2 基因工程的基本操作程序优质课件ppt
展开
这是一份人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》专题1 基因工程1.2 基因工程的基本操作程序优质课件ppt，共60页。PPT课件主要包含了基因表达的计算，PCR反应，构建表达载体等内容，欢迎下载使用。
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定
1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成
（一）从基因文库中获取目的基因
1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
补：原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。
：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
补：真核细胞的基因结构
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
真核细胞的 基因结构
外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
在真核生物中，对应的是 的碱基数
基因组文库与部分基因文库的关系
基因组文库和部分基因文库的比较
基因库是指某一生物群体中的全部基因。
基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。
基因组文库的构建模式图
通过对受体菌的培养而储存基因
2.基因文库的构建方法
（1） 鸟枪法（2） 反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法
以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。
（2）反转录法（cDNA文库的构建方法）
（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因
操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高
仅限于合成核苷酸对较少的简单基因
思考： 如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。
基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
PCR反应条件PCR过程PCR的特点
重复1~3步25~30轮
目的DNA片段扩增100万倍以上
DNA变性形成2条单链
① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。
③前提条件：_______________________； 原料：___________、___________ 、 __________________、 ________________。
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数）
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。
1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？
2×（2n-1）(n为循环次数)
（24-1）×2=30
模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
PCR体系基本组成成分
一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
40 50 60 70 80 90 100
100 80 60 40 20
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA在高温下变性解旋
根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
（三）化学方法人工合成目的基因
从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成
归纳：获取目的基因的方法
用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。
将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
重组DNA分子（重组质粒）
2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）
不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
3.基因表达载体的组成：
启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
思考2：终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
思考3：标记基因有什么作用？
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
三、将目的基因导入受体细胞
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法
①特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）
思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？
提纯含目的基因表达载体
微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
表达载体与感受态细胞混合
3.将目的基因导入微生物细胞
思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？
用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性
用Ca2+处理成感受态细胞
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（ ） A.将毒素蛋白注射到受精卵中 B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
四、目的基因的检测与鉴定
检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
（二）鉴定（个体生物学水平）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。
怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？
提示： ①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； ②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译
为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
报告基因（含荧光素分子）
DNA分子杂交（如检测SARS病毒等）
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。②检测是否转录出了mRNA，利用分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； ②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
DNA链末端合成终止法
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定
1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成
（一）从基因文库中获取目的基因
1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
补：原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。
：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质
②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
补：真核细胞的基因结构
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
真核细胞的 基因结构
外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
在真核生物中，对应的是 的碱基数
基因组文库与部分基因文库的关系
基因组文库和部分基因文库的比较
基因库是指某一生物群体中的全部基因。
基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。
基因组文库的构建模式图
通过对受体菌的培养而储存基因
2.基因文库的构建方法
（1） 鸟枪法（2） 反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法
以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。
（2）反转录法（cDNA文库的构建方法）
（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因
操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高
仅限于合成核苷酸对较少的简单基因
思考： 如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。
基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
PCR反应条件PCR过程PCR的特点
重复1~3步25~30轮
目的DNA片段扩增100万倍以上
DNA变性形成2条单链
① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。
③前提条件：_______________________； 原料：___________、___________ 、 __________________、 ________________。
②原理：__________
④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数）
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。
1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？
2×（2n-1）(n为循环次数)
（24-1）×2=30
模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
PCR体系基本组成成分
一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
40 50 60 70 80 90 100
100 80 60 40 20
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA在高温下变性解旋
根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
（三）化学方法人工合成目的基因
从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成
归纳：获取目的基因的方法
用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。
将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
重组DNA分子（重组质粒）
2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）
不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
3.基因表达载体的组成：
启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
思考2：终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。
思考3：标记基因有什么作用？
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
三、将目的基因导入受体细胞
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法
①特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力
②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）
思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？
提纯含目的基因表达载体
微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
表达载体与感受态细胞混合
3.将目的基因导入微生物细胞
思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？
用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性
用Ca2+处理成感受态细胞
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（ ） A.将毒素蛋白注射到受精卵中 B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
四、目的基因的检测与鉴定
检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
（二）鉴定（个体生物学水平）
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。
怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？
提示： ①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； ②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
归纳: 基因工程的基本操作程序
获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译
为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。
报告基因（含荧光素分子）
DNA分子杂交（如检测SARS病毒等）
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。②检测是否转录出了mRNA，利用分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； ②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。
DNA链末端合成终止法
相关课件
高中生物人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》1.1 DNA重组技术的基本工具公开课课件ppt： 这是一份高中生物人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》<a href="/sw/tb_c4539_t3/?tag_id=26" target="_blank">1.1 DNA重组技术的基本工具公开课课件ppt</a>，共30页。PPT课件主要包含了基因工程的概念，情境导入，磷酸二酯键，EcoRI，EcoRⅠ，黏性末端，SmaⅠ，相同点，T4DNA连接酶，大肠杆菌等内容，欢迎下载使用。
人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序完美版课件ppt： 这是一份人教版 (2019)选择性必修3第3章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序完美版课件ppt，共56页。
高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序集体备课课件ppt： 这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序集体备课课件ppt，共16页。PPT课件主要包含了材料用具，凝胶电泳原理示意图，结果分析，一条条带，结果分析与评价，pmi基因等内容，欢迎下载使用。
