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高考生物（山东专用）复习专题22基因工程教学课件
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这是一份高考生物（山东专用）复习专题22基因工程教学课件，共58页。
考点1 重组DNA技术的基本工具一、限制性内切核酸酶(限制酶)
同尾酶:识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列,在构建基因表达载体 时,使切割位点的选择范围扩大。同尾酶切割后的连接如图所示:
小表达 限制酶不切割细菌本身DNA分子的原因可能是 。答案:细菌细胞内自身的限制酶识别位点进行了修饰(如DNA甲基化)
小表达 DNA连接酶与DNA聚合酶的作用有何不同: 。答案:DNA聚合酶以单链DNA为模板,只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末 端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶不需要模板,催化两个DNA片段之间形成 磷酸二酯键
易混易错 天然的质粒一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用作 基因工程载体。
考点2 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增与电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定
二、DNA片段的扩增——PCR扩增
小表达 1.利用PCR扩增目的基因时,需用两种不同引物的原因是 。2.PCR (填“可以”或“不可以”)扩增mRNA,原因是 。1.答案:每个DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成,PCR扩增时只能从各自模 板链的3'端开始,故需碱基序列不同的两种引物2.答案:不可以 PCR是以DNA双链为模板,不能直接用单链RNA进行PCR,必须把 mRNA逆转录成单链cDNA后才能进行PCR
三、DNA片段的电泳鉴定1.原理(1)琼脂糖凝胶电泳利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应(分子本身的大 小和构象),达到分离混合物的目的。(2)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。2.过程
3.注意事项(1)电泳时,电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜。(2)PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌
处理。(3)实验用到的酶、引物、模板DNA、4种脱氧核苷酸的混合液、扩增缓冲液等均需 分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出后放在冰块或PCR冷冻 冰盒上缓慢融化。
小表达 DNA的电泳鉴定实验中,影响DNA分子迁移速率的主要因素是 。答案:分子本身的大小和构象,DNA分子的迁移速率与其大小成反比
考点3 基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
易混易错 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的区分
知识拓展(1)诱导型启动子是指能被诱导表达的启动子。常见的诱导型启动子有Lac乳糖操纵 子。当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达。(2)根据基因表达载体上的标记基因可筛选出已成功转入基因表达载体的受体细胞和 未成功转入基因表达载体的受体细胞。(3)空载体和重组载体的分子大小有区别,可用限制酶酶切产物电泳的方法来鉴定[例 如,2021辽宁,24(4)]。
小表达 构建基因表达载体时,常使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒,该过程不 使用同一种限制酶的原因是 。
答案:防止目的基因自身环化和质粒自身环化,保证目的基因与质粒正确连接,因为同 种限制酶酶切产生的末端相同,会产生正连和反连的情况,增大筛选正确重组载体的 工作量, 正连和反连图示如下:
三、将目的基因导入受体细胞
小表达 农杆菌转化法中重组与导入的次数分别是几次,请简述重组与导入的内容: 。答案:重组和导入的次数都是两次,第一次重组是将目的基因重组到Ti质粒的T-DNA 上,第二次重组是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次 导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入是指含目的基因的T-DNA导入 受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
考点4 基因工程的应用及蛋白质工程一、基因工程的应用
小表达 利用乳腺生物反应器,构建基因表达载体时需要将 等调控元件重组在 一起,原因是 。答案:药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子 只有连接了乳腺蛋白基因的 启动子,才能保证相应的目的基因在雌性动物泌乳期时在乳腺细胞内得以表达
二、蛋白质工程1.概念
1.DNA的粗提取与鉴定
深挖教材(1)实验中涉及的主要试剂及作用(选择性必修3 P74)(2022江苏,24,12分)(2021山东,13, 2分)
(2)鉴定:在 条件下,DNA遇 呈现蓝色(选择性必修3 P74—75)(2023广东,11,2分)(2022山东,13,2分)。(3)该实验是定性实验。
真题演练 (2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离 →沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 ( )A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
2.基因工程的基本操作程序深挖教材(1)利用PCR获取目的基因:需要 作为原料,通过 方式打开 DNA双链,利用 催化合成DNA子链,同时要加入一对引物,引物的作用是 (选择性必修3 P77)(2022天津,15,10分)(2022江苏,24,12分)(2022山东,25,12分)(2022辽宁,12,2分)。
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(2)基因表达载体的构建:基因表达载体由目的基因、复制原点、 、启动 子、 等组成。启动子位于基因的 ,作用是 。诱导型启动子的作用是 (选择性必修3 P80)(2023广东,20,14分)(2023山东,25,10分)。
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录
当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达
(3)将目的基因导入受体细胞:植物常采用农杆菌转化法,需将目的基因插入Ti质粒的 中(选择性必修3 P81)(2023海南,20,13分)(2023广东,20,14分)。动物常采用显 微注射技术将目的基因导入 ;将目的基因导入大肠杆菌时需先用 处 理,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(选择性必修3 P82)。
(4)目的基因的检测与鉴定:分子水平的检测,常采用 等技术检测DNA和RNA,检 测是否表达出相应的蛋白质常采用 ;最终还要进行 水平的鉴定(选择性必修3 P82)(2023山东,25,10分)(2023全国乙,38,15分)(2022 山东,25,12分)(2022天津,15,10分)(2022江苏,24,12分)。
易混易错 标记基因用来判断目的基因的导入是否成功,目的基因表达与否用来判断 基因工程是否成功。
真题演练 (2022天津,15,10分)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关 键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。 (1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和
SacB两个标记基因, 为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物 和 , 并在引物的 (5'/3')端引入XhⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后 环化成载体2。(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含 (EcR Ⅰ/Hind Ⅲ/Xh Ⅰ)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高 效筛选载体4。(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变 造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载 体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为 。A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感C.卡那霉素和链霉素都敏感D.卡那霉素和链霉素都不敏感(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案 (1)1 4(以上两空可调换) 5' (2)Xh Ⅰ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR(聚合
酶链式反应,答案合理即可)
考法1 PCR技术的实际应用中的问题分析1.引物(1)概念及选择原则
(2)引物5'端修饰方法和作用
2.PCR和电泳(1)PCR①PCR参数设置
注意:扩增的DNA长度不同,延伸预设的时间也不同。
②PCR需要两种引物,两种引物分别与两条模板链的3'端互补,引物位于目的基因两 侧。
(2)PCR扩增后进行电泳时异常情况分析
例 (2023泰安学业仿真模拟,13)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定 点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不 能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物 2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是 ( )
A.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等B.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D.第2轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
解析 PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性),不需要加入解旋酶,A错误;第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个,而总DNA分子有8个,即占1/4,B 错误;引物中设计两种限制酶识别位点,可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载 体,C正确;第2轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因,其中 ②较短,D错误。
考法2 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9系统由Cas9(核酸内切酶)和人工设计的gRNA(向导RNA)构成。在 gRNA引导下,Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤 修复机制,将断裂上下游两端的序列连接起来,但通常会在断裂处造成少量核苷酸的 插入或缺失。当DNA双链断裂后,如果细胞中有DNA修复模板(由需要插入的目的基 因和靶序列上下游的同源序列组成),断裂部分可依据修复模板进行精确修复,从而将 目的基因插入指定位点(如图1)。
通过在Cas9基因中引入突变,获得了只有切割一条链活性的nCas9。将nCas9与胞 嘧啶脱氨酶(或腺嘌呤脱氨酶)融合,利用单碱基编辑技术,能够对靶位点进行精准的碱 基编辑,最终可以实现C—G→T—A(如图2)(或A—T→G—C)的转换。 该技术的目的是实现敲除、敲入、单碱基编辑、激活或抑制基因表达。
例 (2021海南,25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,Cas9基因表达的Cas 9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(sgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目 标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。(1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进 行酶切处理,然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是 。(2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。(3)过程③~⑤中,sgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标 DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是 。随后,Cas9蛋白可切 割 序列。(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/
Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基 因插入基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/ Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程: 。
解析 (1)将目的基因插入经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+ 处理法。(3)sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合遵循碱基互补配对原则;由图知, Cas9可切割目标DNA。(4)根据图示可知:CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内转录出 sgRNA和表达出Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标 DNA序列特异性结合,引导Cas9蛋白切割目标DNA序列,插入新的基因。
答案 (1)DNA连接酶 (2)Ca2+处理法 (3)碱基互补配对 目标(目的)DNA(基因) (4)表达Cas9蛋白和sgRNA,两者形成复合体;sgRNA识别并结合目标DNA序列;引导 Cas9蛋白切割目标DNA序列
考法3 基因工程中核酸序列阅读、分析1.核酸序列阅读、分析时核酸链的选择
2.移码突变构建融合基因表达载体时易发生移码突变,如图P基因与编码FLAG的序列形成一个融 合基因:编码链与mRNA中碱基排列顺序一致(只是mRNA中不含T只含U),起始密码子是AUG,
那么编码链核酸序列的阅读、分析就从ATG开始,三联体密码子阅读框架的改变会造 成翻译结果的改变。若发生移码突变应再插入一定数量碱基对,保持原基因编码的密 码子顺序不变。
3.核酸序列阅读、分析需要注意方向性
例 (2020北京,17节选)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向 为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因 时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。 图中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。
解析 由“C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”,知转录从DNA链的3'端开始,mRNA自身的延伸方向为5'→3',即沿B链从3'→5'方向转 录,即B链3'端为基因上游,结合质粒上启动子的方向分析,B链3'端应该用BamHⅠ进行 切割,而其5'端应该用SmaⅠ进行切割。
答案 BamHⅠ、SmaⅠ
考法4 不同基因工程载体的构建 一般基因表达载体由启动子和终止子、目的基因、标记基因和复制原点等组成, 但是在实际应用中,根据不同的需求,可以构建不同的基因工程载体。
例 (2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因 (GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白 质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交 配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结 果如图乙所示。
下列叙述正确的是 ( )A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
考点1 重组DNA技术的基本工具一、限制性内切核酸酶(限制酶)
同尾酶:识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列,在构建基因表达载体 时,使切割位点的选择范围扩大。同尾酶切割后的连接如图所示:
小表达 限制酶不切割细菌本身DNA分子的原因可能是 。答案:细菌细胞内自身的限制酶识别位点进行了修饰(如DNA甲基化)
小表达 DNA连接酶与DNA聚合酶的作用有何不同: 。答案:DNA聚合酶以单链DNA为模板,只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末 端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶不需要模板,催化两个DNA片段之间形成 磷酸二酯键
易混易错 天然的质粒一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用作 基因工程载体。
考点2 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增与电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定
二、DNA片段的扩增——PCR扩增
小表达 1.利用PCR扩增目的基因时,需用两种不同引物的原因是 。2.PCR (填“可以”或“不可以”)扩增mRNA,原因是 。1.答案:每个DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成,PCR扩增时只能从各自模 板链的3'端开始,故需碱基序列不同的两种引物2.答案:不可以 PCR是以DNA双链为模板,不能直接用单链RNA进行PCR,必须把 mRNA逆转录成单链cDNA后才能进行PCR
三、DNA片段的电泳鉴定1.原理(1)琼脂糖凝胶电泳利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应(分子本身的大 小和构象),达到分离混合物的目的。(2)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。2.过程
3.注意事项(1)电泳时,电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜。(2)PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌
处理。(3)实验用到的酶、引物、模板DNA、4种脱氧核苷酸的混合液、扩增缓冲液等均需 分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出后放在冰块或PCR冷冻 冰盒上缓慢融化。
小表达 DNA的电泳鉴定实验中,影响DNA分子迁移速率的主要因素是 。答案:分子本身的大小和构象,DNA分子的迁移速率与其大小成反比
考点3 基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
易混易错 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的区分
知识拓展(1)诱导型启动子是指能被诱导表达的启动子。常见的诱导型启动子有Lac乳糖操纵 子。当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达。(2)根据基因表达载体上的标记基因可筛选出已成功转入基因表达载体的受体细胞和 未成功转入基因表达载体的受体细胞。(3)空载体和重组载体的分子大小有区别,可用限制酶酶切产物电泳的方法来鉴定[例 如,2021辽宁,24(4)]。
小表达 构建基因表达载体时,常使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒,该过程不 使用同一种限制酶的原因是 。
答案:防止目的基因自身环化和质粒自身环化,保证目的基因与质粒正确连接,因为同 种限制酶酶切产生的末端相同,会产生正连和反连的情况,增大筛选正确重组载体的 工作量, 正连和反连图示如下:
三、将目的基因导入受体细胞
小表达 农杆菌转化法中重组与导入的次数分别是几次,请简述重组与导入的内容: 。答案:重组和导入的次数都是两次,第一次重组是将目的基因重组到Ti质粒的T-DNA 上,第二次重组是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次 导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入是指含目的基因的T-DNA导入 受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
考点4 基因工程的应用及蛋白质工程一、基因工程的应用
小表达 利用乳腺生物反应器,构建基因表达载体时需要将 等调控元件重组在 一起,原因是 。答案:药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子 只有连接了乳腺蛋白基因的 启动子,才能保证相应的目的基因在雌性动物泌乳期时在乳腺细胞内得以表达
二、蛋白质工程1.概念
1.DNA的粗提取与鉴定
深挖教材(1)实验中涉及的主要试剂及作用(选择性必修3 P74)(2022江苏,24,12分)(2021山东,13, 2分)
(2)鉴定:在 条件下,DNA遇 呈现蓝色(选择性必修3 P74—75)(2023广东,11,2分)(2022山东,13,2分)。(3)该实验是定性实验。
真题演练 (2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离 →沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 ( )A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
2.基因工程的基本操作程序深挖教材(1)利用PCR获取目的基因:需要 作为原料,通过 方式打开 DNA双链,利用 催化合成DNA子链,同时要加入一对引物,引物的作用是 (选择性必修3 P77)(2022天津,15,10分)(2022江苏,24,12分)(2022山东,25,12分)(2022辽宁,12,2分)。
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(2)基因表达载体的构建:基因表达载体由目的基因、复制原点、 、启动 子、 等组成。启动子位于基因的 ,作用是 。诱导型启动子的作用是 (选择性必修3 P80)(2023广东,20,14分)(2023山东,25,10分)。
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录
当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达
(3)将目的基因导入受体细胞:植物常采用农杆菌转化法,需将目的基因插入Ti质粒的 中(选择性必修3 P81)(2023海南,20,13分)(2023广东,20,14分)。动物常采用显 微注射技术将目的基因导入 ;将目的基因导入大肠杆菌时需先用 处 理,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(选择性必修3 P82)。
(4)目的基因的检测与鉴定:分子水平的检测,常采用 等技术检测DNA和RNA,检 测是否表达出相应的蛋白质常采用 ;最终还要进行 水平的鉴定(选择性必修3 P82)(2023山东,25,10分)(2023全国乙,38,15分)(2022 山东,25,12分)(2022天津,15,10分)(2022江苏,24,12分)。
易混易错 标记基因用来判断目的基因的导入是否成功,目的基因表达与否用来判断 基因工程是否成功。
真题演练 (2022天津,15,10分)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关 键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。 (1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和
SacB两个标记基因, 为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物 和 , 并在引物的 (5'/3')端引入XhⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后 环化成载体2。(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含 (EcR Ⅰ/Hind Ⅲ/Xh Ⅰ)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高 效筛选载体4。(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变 造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载 体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为 。A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感C.卡那霉素和链霉素都敏感D.卡那霉素和链霉素都不敏感(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案 (1)1 4(以上两空可调换) 5' (2)Xh Ⅰ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR(聚合
酶链式反应,答案合理即可)
考法1 PCR技术的实际应用中的问题分析1.引物(1)概念及选择原则
(2)引物5'端修饰方法和作用
2.PCR和电泳(1)PCR①PCR参数设置
注意:扩增的DNA长度不同,延伸预设的时间也不同。
②PCR需要两种引物,两种引物分别与两条模板链的3'端互补,引物位于目的基因两 侧。
(2)PCR扩增后进行电泳时异常情况分析
例 (2023泰安学业仿真模拟,13)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定 点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不 能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物 2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是 ( )
A.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等B.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D.第2轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
解析 PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性),不需要加入解旋酶,A错误;第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个,而总DNA分子有8个,即占1/4,B 错误;引物中设计两种限制酶识别位点,可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载 体,C正确;第2轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因,其中 ②较短,D错误。
考法2 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9系统由Cas9(核酸内切酶)和人工设计的gRNA(向导RNA)构成。在 gRNA引导下,Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤 修复机制,将断裂上下游两端的序列连接起来,但通常会在断裂处造成少量核苷酸的 插入或缺失。当DNA双链断裂后,如果细胞中有DNA修复模板(由需要插入的目的基 因和靶序列上下游的同源序列组成),断裂部分可依据修复模板进行精确修复,从而将 目的基因插入指定位点(如图1)。
通过在Cas9基因中引入突变,获得了只有切割一条链活性的nCas9。将nCas9与胞 嘧啶脱氨酶(或腺嘌呤脱氨酶)融合,利用单碱基编辑技术,能够对靶位点进行精准的碱 基编辑,最终可以实现C—G→T—A(如图2)(或A—T→G—C)的转换。 该技术的目的是实现敲除、敲入、单碱基编辑、激活或抑制基因表达。
例 (2021海南,25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,Cas9基因表达的Cas 9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(sgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目 标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。(1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进 行酶切处理,然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是 。(2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。(3)过程③~⑤中,sgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标 DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是 。随后,Cas9蛋白可切 割 序列。(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/
Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基 因插入基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/ Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程: 。
解析 (1)将目的基因插入经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+ 处理法。(3)sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合遵循碱基互补配对原则;由图知, Cas9可切割目标DNA。(4)根据图示可知:CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内转录出 sgRNA和表达出Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标 DNA序列特异性结合,引导Cas9蛋白切割目标DNA序列,插入新的基因。
答案 (1)DNA连接酶 (2)Ca2+处理法 (3)碱基互补配对 目标(目的)DNA(基因) (4)表达Cas9蛋白和sgRNA,两者形成复合体;sgRNA识别并结合目标DNA序列;引导 Cas9蛋白切割目标DNA序列
考法3 基因工程中核酸序列阅读、分析1.核酸序列阅读、分析时核酸链的选择
2.移码突变构建融合基因表达载体时易发生移码突变,如图P基因与编码FLAG的序列形成一个融 合基因:编码链与mRNA中碱基排列顺序一致(只是mRNA中不含T只含U),起始密码子是AUG,
那么编码链核酸序列的阅读、分析就从ATG开始,三联体密码子阅读框架的改变会造 成翻译结果的改变。若发生移码突变应再插入一定数量碱基对,保持原基因编码的密 码子顺序不变。
3.核酸序列阅读、分析需要注意方向性
例 (2020北京,17节选)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向 为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因 时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。 图中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。
解析 由“C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”,知转录从DNA链的3'端开始,mRNA自身的延伸方向为5'→3',即沿B链从3'→5'方向转 录,即B链3'端为基因上游,结合质粒上启动子的方向分析,B链3'端应该用BamHⅠ进行 切割,而其5'端应该用SmaⅠ进行切割。
答案 BamHⅠ、SmaⅠ
考法4 不同基因工程载体的构建 一般基因表达载体由启动子和终止子、目的基因、标记基因和复制原点等组成, 但是在实际应用中,根据不同的需求,可以构建不同的基因工程载体。
例 (2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因 (GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白 质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交 配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结 果如图乙所示。
下列叙述正确的是 ( )A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
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