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江苏省泰州市靖江市高级中学2023-2024学年高二下学期3月生物试题（Word版附解析）
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这是一份江苏省泰州市靖江市高级中学2023-2024学年高二下学期3月生物试题（Word版附解析），共36页。试卷主要包含了单项选择题，多项选择题，综合题等内容，欢迎下载使用。
（第Ⅰ卷）
一、单项选择题：本题共19个小题，每小题2分，共38分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是（ ）
A. 限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B. 在图1和图2中将分别产生4个和2个粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D. 图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
2. 下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通过E．cliDNA连接酶相互连接
B. DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C. 所有限制酶识别序列均由6个核苷酸组成
D. SmaI切割后产生的是黏性末端
3. T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是（ ）
A. T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B. T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C. ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D. T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
4. 科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、启动子、终止子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体
B. 利用正常小鼠DNA分子通过PCR克隆出β-珠蛋白基因的编码序列
C. 用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌
D. 将β-珠蛋白基因表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中
5. 如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ ）
A. 完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等
B. 筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞
C. 该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别
D. 图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术
6. 噬菌体展示技术是将编码某蛋白质的基因导入噬菌体的DNA中，使该外源基因随噬菌体外壳蛋白表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。以下对该技术分析正确的是（ ）
A. 噬菌体展示技术的遗传学原理是基因突变
B. 构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA酶
C. 需用营养成分齐全的培养基扩大培养噬菌体
D. 可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白
7. 将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用引物组合为（ ）
A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
8. 下图为采用“实时荧光定量RT-PCR(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)”技术检测2019nCV核酸的基本流程，1～2h内即可得到检测结果。有关说法正确的是（ ）
A. 过程①是逆转录过程，不属于中心法则的内容
B. 过程②表示扩增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 荧光标记法还可以用于探究DNA的复制方式
D. RT-PCR反应体系中加入的原料是脱氧核苷酸
9. 食物中的生物胺会引起胃肠道不适和过敏等不良反应，微生物来源的多铜氧化酶(MCO)能高效分解生物胺。科研人员采用PCR技术获得发酵乳酸杆菌的MCO基因，然后转入大肠杆菌中实现了高效表达。若目的基因MCO经限制酶切开后的末端如图甲，要MCO片段能与载体质粒pCLY15(图乙)高效连接，需用于切割的酶组合为（ ）
A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
10. 霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（ ）
A. 大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应
B. 该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体
C. 当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民
11. 科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的（ ）
A. 实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物
B. 含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C. 即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定
D. 西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
12. PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（ ）
A. 图示环节所需的温度比上一个环节的低
B. 引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高温Taq酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链
D. 1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
13. 幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A. Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组
B. 基因表达载体导入之前，可用Ca2+处理大肠杆菌
C. 培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素
D. 能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163基因中编码起始密码子的序列
B. CD163基因中编码终止密码子序列
C. RFP基因中编码起始密码子的序列
D. RFP基因中编码终止密码子的序列
二、多项选择题：本题共4小题，每小题3分，共12分。在每小题给出的四个选项中，有两个或两个以上选项符合题目要求。全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。
15. 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A. DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B. 限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C. E.cliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D. 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA
16. 人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①〜④表示相关的操作， EcR I 、BamHI为限制酶，它们的识别序列及切割位点如 下表所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作
B. 构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C. 过程③利用的是T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中
D. 过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化
17. RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。下图是RT-PCR过程示意图，①和②为逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A. 该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒
B. 该技术可用来检测组织细胞中基因是否转录
C. ①过程需要的酶是逆转录酶，③过程需要的酶是耐高温的DNA聚合酶
D. ③过程中DNA解链后，应升高反应体系温度使引物与模板结合
18. 科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A. 转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B. LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C. 标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D. 可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
（第Ⅱ卷）
三、综合题：共4题，每题15分，共60分。
19. 叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3基因作用机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆技术是构建表达载体的一种技术如图2。
（1）目的基因获取，在_____条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中_____，经_____获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增除了图1标出的物质以外，还需加入_____（至少写两种）。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用_____（选项中为引物部分序列，方向为5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成为目前研究的热点。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合酶在反应体系中没有添加dNTP情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP情况下具有5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。请结合图1和图2回答下列问题：
①LIC技术构建表达载体，图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和_____处理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____处理质粒。处理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcRⅤ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是_____，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到_____酶。
（3）导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经_____（过程）形成愈伤组织备用，用_____处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入_____植物组织培养基中培养，筛选出成功导入质粒的植物细胞。
20. CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。
（1）研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA___键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过___次DNA复制可以完成修复。
（2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是___。
（3）为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。
①PCR的一般过程为___，在变性之前通常有预变性，其目的是___。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及___来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有___（至少答两点）。
②写出His的基因编码链的碱基序列5′___3′。
③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′___3′。
21. 毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的长度为2200bp。科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如下，请回答：
注：重组质粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜带石斑鱼c型溶菌酶属于免疫系统的_______。相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过_______加工修饰，表达的蛋白具有天然生物学活性。
（2）为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中加入的模板是_______，引物应该选择以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，这一过程与传统构建重组质粒相比不需要_______酶。
（4）为了验证构建是否成功，利用限制性内切酶EcRI和SalI对提取出重组质粒2进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为_______（限制酶识别序列不计）的片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌的目的是_______。
（5）过程⑤培养毕赤酵母时加入_______作为唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因与宿主基因组染色体的交换方式包括单交换和双交换。含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，属于单交换；当发生基因取代时，含目的基因的载体与宿主染色体中AOX1基因区域发生交换，宿主AOX1基因编码区域被全部取代，属于双交换。以AOX1基因两端序列为依据设计引物，对三株重组酵母（编号1、2、3）进行菌液PCR、电泳后得到下图，根据结果推断目的基因与宿主基因组染色体发生单交换的酵母菌株有_______。
22. 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。
取三组实验等量的细胞裂解液，用_____法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据_____设计引物进行PCR，并用_____作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
（3）用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1．_____、2．_____。经用_____法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况是_____（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。
（4）欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有_____（至少写出两项）。限制酶
识别序列及切割位点
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
组别
主要操作
培养细胞后，使之破裂
对照组1
空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌
细胞培养72小时后，加入③_____，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2
含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①_____
实验组
②_____，接种等量的结核杆菌
江苏省靖江高级中学2023-2024学年第二学期阶段测试
高二生物试卷
（第Ⅰ卷）
一、单项选择题：本题共19个小题，每小题2分，共38分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是（ ）
A. 限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B. 在图1和图2中将分别产生4个和2个粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D. 图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程:目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
农杆菌转化法:取Ti质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转入农杆菌、将农杆菌导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
【详解】A、由图可知，产生的是黏性末端，所以可知限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开的，A正确；
B、由图可知，图1中含有酶1和酶2，能产生4个黏性末端，图2中含有酶2，能产生2个黏性末端，B正确；
C、限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；
D、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。
故选C。
2. 下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通过E．cliDNA连接酶相互连接
B. DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C. 所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D. SmaI切割后产生的是黏性末端
【答案】B
【解析】
【分析】1、限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
2、DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、限制酶Sma I和EcR V切割形成的是平末端，E.cliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误；
B、DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确；
C、并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列有4个或8个核苷酸组成，C错误；
D、SmaI切割后产生的是平末端，D错误。
故选B。
3. T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是（ ）
A. T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B. T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C. ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D. T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
【答案】C
【解析】
【分析】1、DNA连接酶分为E. cliDNA连接酶和T4DNA连接酶。DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
2、酶的特性：专一性、高效性和作用条件温和。
3、酶是催化剂，在催化反应前后性质不变。
【详解】A、T4DNA连接酶有专一性，A错误；
B、酶在催化反应前后性质不变，故T4DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；
C、ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连”可推测ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；
D、T4DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。
故选C。
4. 科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、启动子、终止子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体
B. 利用正常小鼠DNA分子通过PCR克隆出β-珠蛋白基因的编码序列
C. 用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌
D. 将β-珠蛋白基因表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中
【答案】D
【解析】
【分析】基因表达载体包括启动子、目的基因（β珠蛋白基因）、标记基因（抗四环素基因）、终止子等。抗四环素基因是标记基因，用于筛选导入重组质粒的受体细胞，因此受体细胞（大肠杆菌）不含有四环素抗性基因。导入重组质粒的大肠杆菌能抗四环素，因此可以用含有四环素的培养基筛选出已经导入β珠蛋白编码序列的大肠杆菌。
【详解】A、基因表达载体包括启动子、目的基因（β珠蛋白基因）、标记基因（抗四环素基因）、终止子等，A正确；
B、β珠蛋白基因属于目的基因，可以利用正常小鼠DNA分子为模板，利用PCR技术扩增，B正确；
C、标记基因是四环素抗性基因，因此用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌，C正确；
D、标记基因是四环素抗性基因，说明受体细胞大肠杆菌本身不具有四环素抗性，D错误。
故选D。
5. 如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ ）
A. 完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等
B. 筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞
C. 该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别
D. 图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的步骤：目的基因的获取，主要有三种方法：基因文库、PCR技术扩增、人工合成；基因表达载体构建，表达载体组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因；目的基因导入受体细胞，动物细胞（受体）采用显微注射技术导入，植物细胞（受体）采用农杆菌转化法或花粉管通道法导入，微生物细胞（受体）采用感受态细胞法导入；目的基因检测与鉴定，采用分子检测、个体生物学水平鉴定。
【详解】A、完成图中①过程需要构建基因表达载体，用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等，A正确；
B、将目的基因导入雌山羊的胚胎成纤维细胞，再筛选出含有目的基因的胚胎成纤维细胞，B正确；
C、图中的供体细胞细胞核来自雌性山羊，则胚胎移植后生出的小羊性别为雌性，因此并不需要进行性别鉴别，C错误；
D、图示流程中，②将重组质粒导入动物细胞用显微操作技术，④需要在显微镜下去核，⑤需要在显微镜下进行注入操作技术，D正确。
故选C。
6. 噬菌体展示技术是将编码某蛋白质的基因导入噬菌体的DNA中，使该外源基因随噬菌体外壳蛋白表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。以下对该技术分析正确的是（ ）
A. 噬菌体展示技术的遗传学原理是基因突变
B. 构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA酶
C. 需用营养成分齐全的培养基扩大培养噬菌体
D. 可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白
【答案】D
【解析】
【分析】题意分析，噬菌体展示技术离不开基因工程的支持。基因工程的操作步骤是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、题中技术的原理是将目标基因与噬菌体DNA重组，属于基因工程的范畴，其遗传学原理是基因重组，A错误；
B、构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA连接酶，而DNA酶会水解DNA，B错误；
C、噬菌体没有细胞结构，不能独立生活，必须用含有活细胞的培养基培养噬菌体，C错误；
D、抗原-抗体杂交可以检测特定的蛋白质，因此可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白，D正确。
故选D。
7. 将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为（ ）
A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
【答案】A
【解析】
【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使Taq酶沿引物的3'端延伸子链。
【详解】―端为DNA链的5'端，―OH端为DNA链的3'端。进行PCR时，引物与模板链的3'端结合，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5'-CTTGCATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'，A项符合题意，BCD不符合题意。
故选A。
8. 下图为采用“实时荧光定量RT-PCR(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)”技术检测2019nCV核酸的基本流程，1～2h内即可得到检测结果。有关说法正确的是（ ）
A. 过程①是逆转录过程，不属于中心法则的内容
B. 过程②表示扩增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 荧光标记法还可以用于探究DNA的复制方式
D. RT-PCR反应体系中加入的原料是脱氧核苷酸
【答案】D
【解析】
【分析】图中过程①表示以RNA为模板合成DNA为逆转录，过程②表示利用PCR扩增DNA片段。
【详解】A、过程①表示以RNA为模板合成DNA，表示逆转录过程，属于中心法则内容之一，A错误；
B、过程②表示利用PCR扩增DNA片段，需要用到的酶有TaqDNA聚合酶，B错误；
C、探究DNA的复制方式采用同位素标记法，不是荧光标记法，C错误；
D、逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，PCR是体外模拟DNA复制的技术，所以应加入的原料是4种脱氧核苷酸，D正确。
故选D
9. 食物中的生物胺会引起胃肠道不适和过敏等不良反应，微生物来源的多铜氧化酶(MCO)能高效分解生物胺。科研人员采用PCR技术获得发酵乳酸杆菌的MCO基因，然后转入大肠杆菌中实现了高效表达。若目的基因MCO经限制酶切开后的末端如图甲，要MCO片段能与载体质粒pCLY15(图乙)高效连接，需用于切割的酶组合为（ ）
A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
【答案】C
【解析】
【分析】题意分析，根据酶切位点分析，目的基因应位于启动子和终止子之间，为高效连接应选用黏性末端相同的酶，而不能选用平末端，故目的基因应使用Kpnl和Xmal切割。
【详解】KpnⅠ酶切后产生 5′−GTAC−3′的末端，XmaⅠ酶切后产生 5′−CCGG−3′的末端，刚好与目的基因的游离末端配对，因此，切割pCLY15的酶组合为KpnⅠ和XmaⅠ，C正确。
故选C。
10. 霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（ ）
A. 大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应
B. 该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体
C. 当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民
【答案】C
【解析】
【分析】通过基因工程技术可使大米合成“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体可引起人体产生特异性免疫，使机体产生针对相应抗原的记忆细胞和抗体。
【详解】A、大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应，使机体产生记忆细胞，A正确；
B、该项研究成功标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体，当相应抗原进入机体后，记忆细胞可增殖分化形成浆细胞，产生大量抗体，抗体与霍乱毒素结合，B正确；
C、抗体是浆细胞分泌的，C错误；
D、“大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，该“大米疫苗”生产简单、成本低廉且效果明显，可造福世界人民，D正确。
故选C。
11. 科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的（ ）
A. 实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物
B. 含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C. 即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定
D. 西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
【答案】B
【解析】
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、导入前目的基因需要对M基因扩增，PCR需要两种引物结合M基因的两条链合成相应子链，A正确；
B、含M的T-DNA插入到西红柿染色体DNA上，才能稳定存在和表达，而不是整个Ti质粒，B错误；
C、即使M在西红柿中成功表达，也必须在个体生物学水平鉴定，来确定实际效果，C正确；
D、西红柿种植容易，成本低且易储存，D正确。
故选B。
12. PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（ ）
A. 图示环节所需的温度比上一个环节的低
B. 引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高温Taq酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链
D. 1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
【答案】D
【解析】
【分析】1、PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在体外复制特定的DNA的核酸合成技术。
2、原理：DNA复制。
3、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Tag 酶）。
【详解】A、图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确；
B、引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保证其与已知模板能碱基配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；
C、子链是从5'-3'端延伸的，耐高温Tag 酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，C正确；
D、由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。
故选D。
13. 幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A. Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组
B. 基因表达载体导入之前，可用Ca2+处理大肠杆菌
C. 培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素
D. 能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1.目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】A、基因重组是指控制不同性状基因发生重新组合，主要发生在有性生殖过程中，但通过基因工程将不同来源的 DNA 拼接，可以赋予生物新的遗传特性，也属于基因重组的范畴，故利用基因工程将Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组，A正确；
B、原核细胞作为受体细胞时，可用Ca2+处理受体细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易将基因表达载体导入其中，B正确；
CD、该过程使用了限制酶 Xh I和Xba I切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印接种到含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基 B上生长，从而与培养基A（对照）相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，结合图示可知，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5，C错误，D正确。
故选C。
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163基因中编码起始密码子的序列
B. CD163基因中编码终止密码子的序列
C. RFP基因中编码起始密码子的序列
D. RFP基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【解析】
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。
【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。
故选B。
二、多项选择题：本题共4小题，每小题3分，共12分。在每小题给出的四个选项中，有两个或两个以上选项符合题目要求。全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。
15. 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A. DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B. 限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C. E.cliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D. 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA
【答案】BD
【解析】
【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制酶；②基因的 “针线”---DNA连接酶；③基因的运载体---质粒、噬菌体、动植物病毒等。
【详解】A、DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；
B、限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；
C、E·cli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；
D、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D正确。
故选BD。
16. 人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①〜④表示相关的操作， EcR I 、BamHI为限制酶，它们的识别序列及切割位点如 下表所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作
B. 构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C. 过程③利用的是T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中
D. 过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化
【答案】BC
【解析】
【分析】Ti质粒是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种核区DNA外的自主复制的环形双链DNA分子。是一种存在于根癌土壤杆菌中可引起双子叶植物根部致癌的质粒。细菌从双子叶植物的受伤根部侵入根部细胞后，最后在其中裂解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段会与植物细胞的核基因组整合。
【详解】A、结合图示可知，PCR的产物用EcR I和BamHI来酶切，因此在基因的引物两侧加上酶切位点G↓AATTC和G↓GATCC，A正确；
B、启动子负责与RNA聚合酶结合启动表达，终止子负责终止表达，因此构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行表达，B错误；
C、过程③是利用T-DNA的特性将目的基因导入到农杆菌中，农杆根瘤菌是原核生物，无染色体，C错误；
D、整个过程最终需要利用愈伤组织细胞生成干扰素，因此应控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化，D正确。
故选BC。
17. RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。下图是RT-PCR过程示意图，①和②为逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A. 该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒
B. 该技术可用来检测组织细胞中基因否转录
C. ①过程需要的酶是逆转录酶，③过程需要的酶是耐高温的DNA聚合酶
D. ③过程中DNA解链后，应升高反应体系温度使引物与模板结合
【答案】ABC
【解析】
【分析】PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般分为：变性（温度超过90°C）、复性（温度降至50°C左右）、延伸（温度上升到72°C左右）。
【详解】A、由图可知，RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增原理都是碱基互补配对原则，故该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒，A正确；
B、基因转录的产物是RNA，使用RT-PCR技术可用于检测细胞中的基因是否转录，B正确；
C、①和②为逆转录过程，需要逆转录酶参与；③过程为DNA的复制，需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；
D、③过程中DNA解链后，进行复性，温度降至50°C左右，两种引物与单链相应互补序列结合，D错误。
故选ABC。
18. 科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A. 转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B. LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C. 标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D. 可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
【答案】ABD
【解析】
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，从而获得乳酸乙酯高产菌株。
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；
B、LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段，即相同的黏性末端，B正确；
C、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；
D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
故选ABD。
（第Ⅱ卷）
三、综合题：共4题，每题15分，共60分。
19. 叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3基因作用机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆技术是构建表达载体的一种技术如图2。
（1）目的基因获取，在_____条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中_____，经_____获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增除了图1标出的物质以外，还需加入_____（至少写两种）。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用_____（选项中为引物部分序列，方向为5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成为目前研究的热点。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合酶在反应体系中没有添加dNTP情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP情况下具有5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。请结合图1和图2回答下列问题：
①LIC技术构建表达载体，图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和_____处理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____处理质粒。处理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcRⅤ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是_____，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到_____酶。
（3）导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经_____（过程）形成愈伤组织备用，用_____处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入_____植物组织培养基中培养，筛选出成功导入质粒的植物细胞。
【答案】（1） ①. 高温 ②. 总RNA（或“总mRNA”或“RNA”） ③. 逆转录 ④. Taq酶、缓冲液、dNTP、Mg2+ ⑤. AC
（2） ①. dGTP ②. 平 ③. dCTP ④. 终止T4 DNA聚合酶活性 ⑤. DNA聚合酶和DNA连接
（3） ①. 脱分化 ②. 氯化钙（或Ca2+） ③. 潮霉素
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
目的基因获取，在高温条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中总RNA，经逆转录获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增的条件有模板、引物、Taq酶、dNTP、能量等，除了图1标出的物质以外，还需加入Taq酶、缓冲液、dNTP、Mg2+。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中引物需要结合在模板链的3'，子链的延伸方向是沿引物的5'进行，结合图1和碱基互补配对原则，引物F（左侧）选用A、R（右侧）选用C。
【小问2详解】
①由题干信息可知，在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端，所以图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和dGTP处理。用EcR Ⅴ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得平末端，后加T4 DNA聚合酶和dCTP处理质粒。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcR Ⅴ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是终止T4 DNA聚合酶活性，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到DNA聚合酶和DNA连接酶。
【小问3详解】
导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经脱分化形成愈伤组织备用，用氯化钙（或Ca2+）处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入潮霉素植物组织培养基中培养，原因是重组质粒中含有潮霉素抗性基因，然后筛选出成功导入质粒的植物细胞。
20. CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。
（1）研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA___键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过___次DNA复制可以完成修复。
（2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是___。
（3）为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。
①PCR的一般过程为___，在变性之前通常有预变性，其目的是___。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及___来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有___（至少答两点）。
②写出His的基因编码链的碱基序列5′___3′。
③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′___3′。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯 ②. 2##两##二
（2）当其他DNA序列也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶
（3） ①. 变性→复性→延伸 ②. 增加模板DNA彻底变性的概率 ③. 宽度 ④. 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好 ⑤. CATCATCATCATCATCATTAG ⑥. B ⑦. XhⅠ ⑧. CTCGAGCTAATG
【解析】
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
【小问1详解】
Cas9切口酶相当于内切酶，催化双链DNA的磷酸二酯键水解，由图1可知需要把A-T碱基对修复为G-C碱基对，腺嘌呤脱氨酶把A变成次黄嘌呤核苷酸，第一次复制黄嘌呤核苷酸与C配对，第二次复制C-G配对，完成修复，所以至少通过2次DNA复制可以完成修复。
【小问2详解】
sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成，当其他DNA序列也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶；为了解决这个问题可以适当增加sgRNA的长度，提高其与目标基因识别的特异性程度。
【小问3详解】
①PCR的一般过程为：变性→复性→延伸，PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加模板DNA彻底变性的概率。可通过是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及宽度来评价扩增是否成功。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
②基因编码链的碱基序列，相当于把mRNA的序列中U改为T，His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG，所以His的基因编码链的碱基序列为5'CATCATCATCATCATCATTAG3'。
③欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，也就是在图中的右侧，所以要加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列需要在右侧，即用引物B；结合图示可知，限制酶应选用XhⅠ，所以增加的是His的基因编码链的互补链碱基序列和XhⅠ的识别序列：5'CTCGAGCTAATG3'。
21. 毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的长度为2200bp。科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如下，请回答：
注：重组质粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜带石斑鱼c型溶菌酶属于免疫系统的_______。相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过_______加工修饰，表达的蛋白具有天然生物学活性。
（2）为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中加入的模板是_______，引物应该选择以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，这一过程与传统构建重组质粒相比不需要_______酶。
（4）为了验证构建是否成功，利用限制性内切酶EcRI和SalI对提取出的重组质粒2进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为_______（限制酶识别序列不计）的片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌的目的是_______。
（5）过程⑤培养毕赤酵母时加入_______作为唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因与宿主基因组染色体的交换方式包括单交换和双交换。含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，属于单交换；当发生基因取代时，含目的基因的载体与宿主染色体中AOX1基因区域发生交换，宿主AOX1基因编码区域被全部取代，属于双交换。以AOX1基因两端序列为依据设计引物，对三株重组酵母（编号1、2、3）进行菌液PCR、电泳后得到下图，根据结果推断目的基因与宿主基因组染色体发生单交换的酵母菌株有_______。
【答案】（1） ①. （免疫）活性物质 ②. 内质网、高尔基体
（2） ①. 重组质粒1 ②. AB
（3）限制酶和DNA连接酶
（4） ①. 611bp、3493bp ②. 使得重组质粒2在大肠杆菌中稳定保存、准确复制、方便提取
（5） ①. 甲醇 ②. 诱导目的基因大量表达
（6）1、2、3
【解析】
【分析】1、PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；
2、PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【小问1详解】
免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质构成，溶菌酶属于免疫系统的免疫活性物质。原核细胞没有细胞核和众多细胞器，只有核糖体，真核细胞具有内质网、高尔基体等细胞器，因此相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过内质网、高尔基体。
【小问2详解】
重组质粒Ⅰ上既含有MEL基因又含有Ec-cLYZ，且两基因相连，因此重组质粒Ⅰ可作为过程①PCR反应体系中的模板，为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，且两端带有pPICZαA的同源序列，因此所设计的引物，一侧应包含pPICZαA和Ec-cLY的碱基序列，且连接处应含有限制酶EcRⅠ识别序列，又因为子链延伸的方向是5'→3'，因此，该侧引物序列应为5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’，即A选项；另一侧引物应包含MEL和pPICZαA，且连接处应含有限制酶SalⅠ识别序列，子链延伸的方向是5'→3'，因此，该侧引物序列应为5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’，即B选项。
综上所述AB正确，CD错误。
故选AB。
【小问3详解】
过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，在该过程中未用到限制酶和DNA连接酶。
【小问4详解】
由图可知，Ec-cLYZ基因片段长度为533bp，MEL基因片段长度为78bp，在重组质粒Ⅱ中两基因为融合基因，之间为限制酶识别序列，但在两端分别含有限制性内切酶EcRI和SalI识别序列，若用限制性内切酶EcRI和SalI对提取出的重组质粒2进行双酶切，得到的融合基因片段长度为533+78=611bp，另一片段为pPICZαA片段，长度为3493bp，因此利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为611bp、3493bp两种片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌可使得使得重组质粒2在大肠杆菌中稳定保存、准确复制、方便提取。
【小问5详解】
毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶，MEL和Ec-cLYZ融合基因存在于AOX1基因启动子和终止子之间，因此过程⑤培养毕赤酵母时加入甲醇作为唯一碳源，目的是诱导目的基因（MEL和Ec-cLYZ融合基因）大量表达。
【小问6详解】
由题可知，AOX1基因的长度为2200bp，发生单交换的含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，因此以AOX1基因两端序列为依据设计引物，若发生单交换，则扩增出来的片段大于AOX1基因本身的长度2200bp，若为双交换则AOX1基因编码区全部被替换，扩增出来的片段小于AOX1基因本身的长度2200bp，由图可知，三株重组酵母在大于2000bp的位置均有电泳条带，可知菌株1、2、3中目的基因与宿主基因组染色体发生单交换。
22. 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。
取三组实验等量的细胞裂解液，用_____法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据_____设计引物进行PCR，并用_____作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
（3）用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1．_____、2．_____。经用_____法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况是_____（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。
（4）欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有_____（至少写出两项）。
【答案】（1） ①. 接种等量的结核杆菌 ②. 含有融合基因与质粒构建的重组质粒的山羊肺泡吞噬细胞 ③. 等量蒸馏水 ④. 稀释涂布平板 ⑤. 组3的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量与组2接近，显著小于组1
（2） ①. 外显子3的（部分）序列 ②. BamHⅠ
（3） ①. L4序列 ②. MRS启动子 ③. 抗原抗体杂交技术 ④. 均降低（或不表达）
（4）体细胞核移植、动物细胞培养（早期胚胎培养）、胚胎移植
【解析】
【分析】基因工程中的操作工具及其作用：
①“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
②“分子缝合针”——DNA连接酶，E·cliDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合黏性末端和平末端。
③“分子运输车”——载体。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
【小问1详解】
实验目的是验证SP110基因的功能，同时验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，自变量是是否有SP110基因、是否有特异性启动子MSR，实验组是将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，构建成重组质粒后导入肺泡吞噬细胞，现在已经设置转入空质粒的山羊吞噬细胞为对照组（组1），还需要设置已经转入广泛表达小鼠SP110基因的重组质粒的山羊吞噬细胞（组3）作为对照组。构建重组质粒时，需要用限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起。分别接种等量的结核杆菌，经72h后需要使吞噬细胞破裂，应加入蒸馏水使其吸水膨涨破裂。取三组实验等量的细胞裂解液，用稀释涂布平板法培养，根据图1，实验组（组2）的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量和组3接近，显著小于1组，说明特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达。
【小问2详解】
由图可知，外显子3序列内部存在限制酶BamHⅠ识别序列，若利用基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除，则外显子3内部限制酶BamHⅠ识别序列被破坏，因此检测敲除是否成功可提取山羊成纤维细胞的DNA，根据外显子3的（部分）序列设计引物进行PCR，并用BamHⅠ作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
【小问3详解】
非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，为了降低非致病性朊蛋白的量，同时又能抗结核病，可设计用将MRS启动子与小鼠SP110基因形成的融合基因替换PRNP基因的第三外显子，据图2和图3，对山羊成纤维细胞L4与R1之间的序列实施定点敲除，将TALEN敲除载体与供体DNA载体（MRS启动子与小鼠SP110基因形成的融合基因）共转化幼羊成纤维细胞，将SP110基因定点敲入PRNP基因的第三外显子中。则图4中供体DNA表达载体中：1是L4序列（和第三外显子前的L4序列同源），2是MRS启动子，3是终止子（使SP110基因转录停止），4是R1序列（和第三外显子后的R1序列同源）。若想对山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况进行检测，则需要进行抗原抗体杂交技术。由于PRNP基因的第三外显子被敲除，非致病性朊蛋白基因不表达，由于成纤维细胞中特异性启动子MSR不能发挥作用，SP110基因也不表达。
【小问4详解】
若将TALEN敲除载体与供体DNA载体共转化幼羊成纤维细胞获得双抗羊，首先将该细胞细胞核移植到去核卵母细胞中，诱导卵母细胞分裂、分化，进行早期胚胎细胞培养，到适宜阶段进行胚胎移植，移入适宜的代孕母体。
限制酶
识别序列及切割位点
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
组别
主要操作
培养细胞后，使之破裂
对照组1
空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌
细胞培养72小时后，加入③_____，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2
含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①_____
实验组
②_____，接种等量的结核杆菌
（第Ⅰ卷）
一、单项选择题：本题共19个小题，每小题2分，共38分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是（ ）
A. 限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B. 在图1和图2中将分别产生4个和2个粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D. 图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
2. 下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通过E．cliDNA连接酶相互连接
B. DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C. 所有限制酶识别序列均由6个核苷酸组成
D. SmaI切割后产生的是黏性末端
3. T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是（ ）
A. T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B. T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C. ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D. T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
4. 科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、启动子、终止子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体
B. 利用正常小鼠DNA分子通过PCR克隆出β-珠蛋白基因的编码序列
C. 用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌
D. 将β-珠蛋白基因表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中
5. 如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ ）
A. 完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等
B. 筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞
C. 该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别
D. 图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术
6. 噬菌体展示技术是将编码某蛋白质的基因导入噬菌体的DNA中，使该外源基因随噬菌体外壳蛋白表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。以下对该技术分析正确的是（ ）
A. 噬菌体展示技术的遗传学原理是基因突变
B. 构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA酶
C. 需用营养成分齐全的培养基扩大培养噬菌体
D. 可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白
7. 将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用引物组合为（ ）
A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
8. 下图为采用“实时荧光定量RT-PCR(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)”技术检测2019nCV核酸的基本流程，1～2h内即可得到检测结果。有关说法正确的是（ ）
A. 过程①是逆转录过程，不属于中心法则的内容
B. 过程②表示扩增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 荧光标记法还可以用于探究DNA的复制方式
D. RT-PCR反应体系中加入的原料是脱氧核苷酸
9. 食物中的生物胺会引起胃肠道不适和过敏等不良反应，微生物来源的多铜氧化酶(MCO)能高效分解生物胺。科研人员采用PCR技术获得发酵乳酸杆菌的MCO基因，然后转入大肠杆菌中实现了高效表达。若目的基因MCO经限制酶切开后的末端如图甲，要MCO片段能与载体质粒pCLY15(图乙)高效连接，需用于切割的酶组合为（ ）
A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
10. 霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（ ）
A. 大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应
B. 该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体
C. 当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民
11. 科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的（ ）
A. 实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物
B. 含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C. 即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定
D. 西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
12. PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（ ）
A. 图示环节所需的温度比上一个环节的低
B. 引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高温Taq酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链
D. 1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
13. 幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A. Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组
B. 基因表达载体导入之前，可用Ca2+处理大肠杆菌
C. 培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素
D. 能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163基因中编码起始密码子的序列
B. CD163基因中编码终止密码子序列
C. RFP基因中编码起始密码子的序列
D. RFP基因中编码终止密码子的序列
二、多项选择题：本题共4小题，每小题3分，共12分。在每小题给出的四个选项中，有两个或两个以上选项符合题目要求。全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。
15. 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A. DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B. 限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C. E.cliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D. 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA
16. 人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①〜④表示相关的操作， EcR I 、BamHI为限制酶，它们的识别序列及切割位点如 下表所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作
B. 构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C. 过程③利用的是T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中
D. 过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化
17. RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。下图是RT-PCR过程示意图，①和②为逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A. 该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒
B. 该技术可用来检测组织细胞中基因是否转录
C. ①过程需要的酶是逆转录酶，③过程需要的酶是耐高温的DNA聚合酶
D. ③过程中DNA解链后，应升高反应体系温度使引物与模板结合
18. 科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A. 转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B. LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C. 标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D. 可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
（第Ⅱ卷）
三、综合题：共4题，每题15分，共60分。
19. 叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3基因作用机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆技术是构建表达载体的一种技术如图2。
（1）目的基因获取，在_____条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中_____，经_____获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增除了图1标出的物质以外，还需加入_____（至少写两种）。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用_____（选项中为引物部分序列，方向为5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成为目前研究的热点。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合酶在反应体系中没有添加dNTP情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP情况下具有5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。请结合图1和图2回答下列问题：
①LIC技术构建表达载体，图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和_____处理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____处理质粒。处理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcRⅤ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是_____，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到_____酶。
（3）导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经_____（过程）形成愈伤组织备用，用_____处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入_____植物组织培养基中培养，筛选出成功导入质粒的植物细胞。
20. CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。
（1）研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA___键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过___次DNA复制可以完成修复。
（2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是___。
（3）为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。
①PCR的一般过程为___，在变性之前通常有预变性，其目的是___。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及___来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有___（至少答两点）。
②写出His的基因编码链的碱基序列5′___3′。
③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′___3′。
21. 毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的长度为2200bp。科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如下，请回答：
注：重组质粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜带石斑鱼c型溶菌酶属于免疫系统的_______。相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过_______加工修饰，表达的蛋白具有天然生物学活性。
（2）为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中加入的模板是_______，引物应该选择以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，这一过程与传统构建重组质粒相比不需要_______酶。
（4）为了验证构建是否成功，利用限制性内切酶EcRI和SalI对提取出重组质粒2进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为_______（限制酶识别序列不计）的片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌的目的是_______。
（5）过程⑤培养毕赤酵母时加入_______作为唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因与宿主基因组染色体的交换方式包括单交换和双交换。含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，属于单交换；当发生基因取代时，含目的基因的载体与宿主染色体中AOX1基因区域发生交换，宿主AOX1基因编码区域被全部取代，属于双交换。以AOX1基因两端序列为依据设计引物，对三株重组酵母（编号1、2、3）进行菌液PCR、电泳后得到下图，根据结果推断目的基因与宿主基因组染色体发生单交换的酵母菌株有_______。
22. 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。
取三组实验等量的细胞裂解液，用_____法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据_____设计引物进行PCR，并用_____作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
（3）用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1．_____、2．_____。经用_____法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况是_____（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。
（4）欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有_____（至少写出两项）。限制酶
识别序列及切割位点
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
组别
主要操作
培养细胞后，使之破裂
对照组1
空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌
细胞培养72小时后，加入③_____，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2
含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①_____
实验组
②_____，接种等量的结核杆菌
江苏省靖江高级中学2023-2024学年第二学期阶段测试
高二生物试卷
（第Ⅰ卷）
一、单项选择题：本题共19个小题，每小题2分，共38分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是（ ）
A. 限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B. 在图1和图2中将分别产生4个和2个粘性末端
C. 限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D. 图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程:目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
农杆菌转化法:取Ti质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转入农杆菌、将农杆菌导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
【详解】A、由图可知，产生的是黏性末端，所以可知限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开的，A正确；
B、由图可知，图1中含有酶1和酶2，能产生4个黏性末端，图2中含有酶2，能产生2个黏性末端，B正确；
C、限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；
D、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。
故选C。
2. 下图是几种限制酶的切割位点，下列说法正确的是（ ）
A. 限制酶SmaI和EcRV切割形成的末端，可通过E．cliDNA连接酶相互连接
B. DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C. 所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
D. SmaI切割后产生的是黏性末端
【答案】B
【解析】
【分析】1、限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
2、DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、限制酶Sma I和EcR V切割形成的是平末端，E.cliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误；
B、DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确；
C、并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成，有些限制酶的识别序列有4个或8个核苷酸组成，C错误；
D、SmaI切割后产生的是平末端，D错误。
故选B。
3. T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是（ ）
A. T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B. T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C. ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D. T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
【答案】C
【解析】
【分析】1、DNA连接酶分为E. cliDNA连接酶和T4DNA连接酶。DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
2、酶的特性：专一性、高效性和作用条件温和。
3、酶是催化剂，在催化反应前后性质不变。
【详解】A、T4DNA连接酶有专一性，A错误；
B、酶在催化反应前后性质不变，故T4DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；
C、ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连”可推测ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；
D、T4DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。
故选C。
4. 科研人员以抗四环素基因为标记基因，通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白，治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计，不合理的是（ ）
A. 用β-珠蛋白基因、启动子、终止子、抗四环素基因等元件来构建基因表达载体
B. 利用正常小鼠DNA分子通过PCR克隆出β-珠蛋白基因的编码序列
C. 用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌
D. 将β-珠蛋白基因表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中
【答案】D
【解析】
【分析】基因表达载体包括启动子、目的基因（β珠蛋白基因）、标记基因（抗四环素基因）、终止子等。抗四环素基因是标记基因，用于筛选导入重组质粒的受体细胞，因此受体细胞（大肠杆菌）不含有四环素抗性基因。导入重组质粒的大肠杆菌能抗四环素，因此可以用含有四环素的培养基筛选出已经导入β珠蛋白编码序列的大肠杆菌。
【详解】A、基因表达载体包括启动子、目的基因（β珠蛋白基因）、标记基因（抗四环素基因）、终止子等，A正确；
B、β珠蛋白基因属于目的基因，可以利用正常小鼠DNA分子为模板，利用PCR技术扩增，B正确；
C、标记基因是四环素抗性基因，因此用含有四环素的培养基筛选出已经导入β-珠蛋白编码序列的大肠杆菌，C正确；
D、标记基因是四环素抗性基因，说明受体细胞大肠杆菌本身不具有四环素抗性，D错误。
故选D。
5. 如图表示利用现代生物工程技术制备山羊乳腺生物反应器的流程图，目的是从转基因山羊的乳汁中获得人乳铁蛋白。已知细胞甲是来自雌山羊的胚胎成纤维细胞，下列相关叙述错误的是（ ）
A. 完成图中①过程用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等
B. 筛选出的细胞乙是含有目的基因的胚胎成纤维细胞
C. 该重构胚发育至囊胚时需要进行DNA分析以鉴定性别
D. 图示流程中，②④⑤过程都用到了显微操作技术
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的步骤：目的基因的获取，主要有三种方法：基因文库、PCR技术扩增、人工合成；基因表达载体构建，表达载体组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因；目的基因导入受体细胞，动物细胞（受体）采用显微注射技术导入，植物细胞（受体）采用农杆菌转化法或花粉管通道法导入，微生物细胞（受体）采用感受态细胞法导入；目的基因检测与鉴定，采用分子检测、个体生物学水平鉴定。
【详解】A、完成图中①过程需要构建基因表达载体，用到了质粒、限制酶和DNA连接酶等，A正确；
B、将目的基因导入雌山羊的胚胎成纤维细胞，再筛选出含有目的基因的胚胎成纤维细胞，B正确；
C、图中的供体细胞细胞核来自雌性山羊，则胚胎移植后生出的小羊性别为雌性，因此并不需要进行性别鉴别，C错误；
D、图示流程中，②将重组质粒导入动物细胞用显微操作技术，④需要在显微镜下去核，⑤需要在显微镜下进行注入操作技术，D正确。
故选C。
6. 噬菌体展示技术是将编码某蛋白质的基因导入噬菌体的DNA中，使该外源基因随噬菌体外壳蛋白表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。以下对该技术分析正确的是（ ）
A. 噬菌体展示技术的遗传学原理是基因突变
B. 构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA酶
C. 需用营养成分齐全的培养基扩大培养噬菌体
D. 可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白
【答案】D
【解析】
【分析】题意分析，噬菌体展示技术离不开基因工程的支持。基因工程的操作步骤是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、题中技术的原理是将目标基因与噬菌体DNA重组，属于基因工程的范畴，其遗传学原理是基因重组，A错误；
B、构建目的基因表达载体时需使用限制酶和DNA连接酶，而DNA酶会水解DNA，B错误；
C、噬菌体没有细胞结构，不能独立生活，必须用含有活细胞的培养基培养噬菌体，C错误；
D、抗原-抗体杂交可以检测特定的蛋白质，因此可利用抗原—抗体杂交技术筛选目标蛋白，D正确。
故选D。
7. 将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱海水稻新品种。下图PCR扩增OsMYB56时需要添加引物，应选用的引物组合为（ ）
A. 5'—CTTGGATGAT一3和5'一TCTGTTGAAT一3'
B. 5'一CTTGGATGAT一3和5'一TAAGTTGTCT一3'
C. 5'一ATTCAACAGA一3'和5'一ATCATCCAAG一3'
D. 5'一ATTCAACAGA一3'和5—GAACCTACTA—3'
【答案】A
【解析】
【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3'端特异性结合，使Taq酶沿引物的3'端延伸子链。
【详解】―端为DNA链的5'端，―OH端为DNA链的3'端。进行PCR时，引物与模板链的3'端结合，因此在扩增OsMYB56时需要添加的引物是5'-CTTGCATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'，A项符合题意，BCD不符合题意。
故选A。
8. 下图为采用“实时荧光定量RT-PCR(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)”技术检测2019nCV核酸的基本流程，1～2h内即可得到检测结果。有关说法正确的是（ ）
A. 过程①是逆转录过程，不属于中心法则的内容
B. 过程②表示扩增DNA片段，需使用RNA聚合酶
C. 荧光标记法还可以用于探究DNA的复制方式
D. RT-PCR反应体系中加入的原料是脱氧核苷酸
【答案】D
【解析】
【分析】图中过程①表示以RNA为模板合成DNA为逆转录，过程②表示利用PCR扩增DNA片段。
【详解】A、过程①表示以RNA为模板合成DNA，表示逆转录过程，属于中心法则内容之一，A错误；
B、过程②表示利用PCR扩增DNA片段，需要用到的酶有TaqDNA聚合酶，B错误；
C、探究DNA的复制方式采用同位素标记法，不是荧光标记法，C错误；
D、逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，PCR是体外模拟DNA复制的技术，所以应加入的原料是4种脱氧核苷酸，D正确。
故选D
9. 食物中的生物胺会引起胃肠道不适和过敏等不良反应，微生物来源的多铜氧化酶(MCO)能高效分解生物胺。科研人员采用PCR技术获得发酵乳酸杆菌的MCO基因，然后转入大肠杆菌中实现了高效表达。若目的基因MCO经限制酶切开后的末端如图甲，要MCO片段能与载体质粒pCLY15(图乙)高效连接，需用于切割的酶组合为（ ）
A. BspHI和 Nt IB. BsrGI和Xma I
C. Kpn I和 Xma ID. KpnI和SmaI
【答案】C
【解析】
【分析】题意分析，根据酶切位点分析，目的基因应位于启动子和终止子之间，为高效连接应选用黏性末端相同的酶，而不能选用平末端，故目的基因应使用Kpnl和Xmal切割。
【详解】KpnⅠ酶切后产生 5′−GTAC−3′的末端，XmaⅠ酶切后产生 5′−CCGG−3′的末端，刚好与目的基因的游离末端配对，因此，切割pCLY15的酶组合为KpnⅠ和XmaⅠ，C正确。
故选C。
10. 霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（ ）
A. 大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应
B. 该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体
C. 当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合
D. “大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民
【答案】C
【解析】
【分析】通过基因工程技术可使大米合成“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体可引起人体产生特异性免疫，使机体产生针对相应抗原的记忆细胞和抗体。
【详解】A、大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应，使机体产生记忆细胞，A正确；
B、该项研究成功标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体，当相应抗原进入机体后，记忆细胞可增殖分化形成浆细胞，产生大量抗体，抗体与霍乱毒素结合，B正确；
C、抗体是浆细胞分泌的，C错误；
D、“大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，该“大米疫苗”生产简单、成本低廉且效果明显，可造福世界人民，D正确。
故选C。
11. 科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿，被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是：将乙肝抗原基因M导入农杆菌，然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿，体内产生了抗乙肝病毒的抗体，下列叙述错误的（ ）
A. 实验用PCR技术对M基因进行扩增，需要两种引物
B. 含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C. 即使M在西红柿中成功表达，也要做个体生物学水平鉴定
D. 西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
【答案】B
【解析】
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、导入前目的基因需要对M基因扩增，PCR需要两种引物结合M基因的两条链合成相应子链，A正确；
B、含M的T-DNA插入到西红柿染色体DNA上，才能稳定存在和表达，而不是整个Ti质粒，B错误；
C、即使M在西红柿中成功表达，也必须在个体生物学水平鉴定，来确定实际效果，C正确；
D、西红柿种植容易，成本低且易储存，D正确。
故选B。
12. PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（ ）
A. 图示环节所需的温度比上一个环节的低
B. 引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C. 耐高温Taq酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链
D. 1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
【答案】D
【解析】
【分析】1、PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在体外复制特定的DNA的核酸合成技术。
2、原理：DNA复制。
3、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Tag 酶）。
【详解】A、图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确；
B、引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保证其与已知模板能碱基配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；
C、子链是从5'-3'端延伸的，耐高温Tag 酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，C正确；
D、由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。
故选D。
13. 幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶Xh I和Xba I切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A. Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组
B. 基因表达载体导入之前，可用Ca2+处理大肠杆菌
C. 培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素
D. 能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1.目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】A、基因重组是指控制不同性状基因发生重新组合，主要发生在有性生殖过程中，但通过基因工程将不同来源的 DNA 拼接，可以赋予生物新的遗传特性，也属于基因重组的范畴，故利用基因工程将Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组，A正确；
B、原核细胞作为受体细胞时，可用Ca2+处理受体细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易将基因表达载体导入其中，B正确；
CD、该过程使用了限制酶 Xh I和Xba I切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印接种到含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基 B上生长，从而与培养基A（对照）相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，结合图示可知，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5，C错误，D正确。
故选C。
14. CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A. CD163基因中编码起始密码子的序列
B. CD163基因中编码终止密码子的序列
C. RFP基因中编码起始密码子的序列
D. RFP基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【解析】
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。
【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。
故选B。
二、多项选择题：本题共4小题，每小题3分，共12分。在每小题给出的四个选项中，有两个或两个以上选项符合题目要求。全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分。
15. 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A. DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B. 限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C. E.cliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D. 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA
【答案】BD
【解析】
【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制酶；②基因的 “针线”---DNA连接酶；③基因的运载体---质粒、噬菌体、动植物病毒等。
【详解】A、DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；
B、限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；
C、E·cli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；
D、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D正确。
故选BD。
16. 人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。①〜④表示相关的操作， EcR I 、BamHI为限制酶，它们的识别序列及切割位点如 下表所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 过程①所需的两种引物中分别加上GAATTC和GGATCC序列有利于后续操作
B. 构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C. 过程③利用的是T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA中
D. 过程④需控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化
【答案】BC
【解析】
【分析】Ti质粒是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种核区DNA外的自主复制的环形双链DNA分子。是一种存在于根癌土壤杆菌中可引起双子叶植物根部致癌的质粒。细菌从双子叶植物的受伤根部侵入根部细胞后，最后在其中裂解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段会与植物细胞的核基因组整合。
【详解】A、结合图示可知，PCR的产物用EcR I和BamHI来酶切，因此在基因的引物两侧加上酶切位点G↓AATTC和G↓GATCC，A正确；
B、启动子负责与RNA聚合酶结合启动表达，终止子负责终止表达，因此构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行表达，B错误；
C、过程③是利用T-DNA的特性将目的基因导入到农杆菌中，农杆根瘤菌是原核生物，无染色体，C错误；
D、整个过程最终需要利用愈伤组织细胞生成干扰素，因此应控制培养基中植物激素的种类和比例，以防止愈伤组织细胞发生再分化，D正确。
故选BC。
17. RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。下图是RT-PCR过程示意图，①和②为逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A. 该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒
B. 该技术可用来检测组织细胞中基因否转录
C. ①过程需要的酶是逆转录酶，③过程需要的酶是耐高温的DNA聚合酶
D. ③过程中DNA解链后，应升高反应体系温度使引物与模板结合
【答案】ABC
【解析】
【分析】PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般分为：变性（温度超过90°C）、复性（温度降至50°C左右）、延伸（温度上升到72°C左右）。
【详解】A、由图可知，RNA的逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增原理都是碱基互补配对原则，故该技术可用来检测新冠病毒等RNA病毒，A正确；
B、基因转录的产物是RNA，使用RT-PCR技术可用于检测细胞中的基因是否转录，B正确；
C、①和②为逆转录过程，需要逆转录酶参与；③过程为DNA的复制，需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；
D、③过程中DNA解链后，进行复性，温度降至50°C左右，两种引物与单链相应互补序列结合，D错误。
故选ABC。
18. 科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A. 转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B. LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C. 标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D. 可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
【答案】ABD
【解析】
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，从而获得乳酸乙酯高产菌株。
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；
B、LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段，即相同的黏性末端，B正确；
C、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；
D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
故选ABD。
（第Ⅱ卷）
三、综合题：共4题，每题15分，共60分。
19. 叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3基因作用机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆技术是构建表达载体的一种技术如图2。
（1）目的基因获取，在_____条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中_____，经_____获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增除了图1标出的物质以外，还需加入_____（至少写两种）。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用_____（选项中为引物部分序列，方向为5'→3'）。
A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA
（2）表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成为目前研究的热点。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合酶在反应体系中没有添加dNTP情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP情况下具有5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。请结合图1和图2回答下列问题：
①LIC技术构建表达载体，图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和_____处理。用EcRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____处理质粒。处理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcRⅤ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是_____，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到_____酶。
（3）导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经_____（过程）形成愈伤组织备用，用_____处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入_____植物组织培养基中培养，筛选出成功导入质粒的植物细胞。
【答案】（1） ①. 高温 ②. 总RNA（或“总mRNA”或“RNA”） ③. 逆转录 ④. Taq酶、缓冲液、dNTP、Mg2+ ⑤. AC
（2） ①. dGTP ②. 平 ③. dCTP ④. 终止T4 DNA聚合酶活性 ⑤. DNA聚合酶和DNA连接
（3） ①. 脱分化 ②. 氯化钙（或Ca2+） ③. 潮霉素
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
目的基因获取，在高温条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中总RNA，经逆转录获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增的条件有模板、引物、Taq酶、dNTP、能量等，除了图1标出的物质以外，还需加入Taq酶、缓冲液、dNTP、Mg2+。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中引物需要结合在模板链的3'，子链的延伸方向是沿引物的5'进行，结合图1和碱基互补配对原则，引物F（左侧）选用A、R（右侧）选用C。
【小问2详解】
①由题干信息可知，在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端，所以图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和dGTP处理。用EcR Ⅴ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得平末端，后加T4 DNA聚合酶和dCTP处理质粒。
②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcR Ⅴ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是终止T4 DNA聚合酶活性，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到DNA聚合酶和DNA连接酶。
【小问3详解】
导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经脱分化形成愈伤组织备用，用氯化钙（或Ca2+）处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入潮霉素植物组织培养基中培养，原因是重组质粒中含有潮霉素抗性基因，然后筛选出成功导入质粒的植物细胞。
20. CD3D严重联合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突变引起的，该突变阻止了T细胞生长发育所需的CD3D蛋白的合成。科研人员对第3代CRISPR/Cas9基因编辑系统进行改造，获得一种超精确的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），该系统主要由向导sgRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脱氨酶组成，作用机制如图1。利用该系统在CD3D-SCID患者的造血干细胞中可以更正约71.2%的致病突变。
（1）研究发现，Cas9切口酶催化双链DNA___键水解，腺嘌呤脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸转变成次黄嘌呤核苷酸，次黄嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸碱基互补配对，据此推测，至少通过___次DNA复制可以完成修复。
（2）sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成。sgRNA设计是否合理，对于CRISPR/Cas9基因编辑系统的切割有重要影响，否则会导致sgRNA脱靶，试分析其原因是___。
（3）为了对改造后的CD3D基因进行研究，把CD3D基因和His标签基因（His标签由6个组氨酸组成）连接起来构建融合基因，并构建重组基因表达载体，图2为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，已知组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG。
①PCR的一般过程为___，在变性之前通常有预变性，其目的是___。判断是否扩增出DNA片段，判断的依据是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及___来评价扩增的结果。如果电泳鉴定的结果不止一条条带分析可能的原因有___（至少答两点）。
②写出His的基因编码链的碱基序列5′___3′。
③为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物___（填“A”或“B”）的5′端增加限制酶___的识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′___3′。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯 ②. 2##两##二
（2）当其他DNA序列也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶
（3） ①. 变性→复性→延伸 ②. 增加模板DNA彻底变性的概率 ③. 宽度 ④. 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好 ⑤. CATCATCATCATCATCATTAG ⑥. B ⑦. XhⅠ ⑧. CTCGAGCTAATG
【解析】
【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
【小问1详解】
Cas9切口酶相当于内切酶，催化双链DNA的磷酸二酯键水解，由图1可知需要把A-T碱基对修复为G-C碱基对，腺嘌呤脱氨酶把A变成次黄嘌呤核苷酸，第一次复制黄嘌呤核苷酸与C配对，第二次复制C-G配对，完成修复，所以至少通过2次DNA复制可以完成修复。
【小问2详解】
sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续碱基组成，当其他DNA序列也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶；为了解决这个问题可以适当增加sgRNA的长度，提高其与目标基因识别的特异性程度。
【小问3详解】
①PCR的一般过程为：变性→复性→延伸，PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加模板DNA彻底变性的概率。可通过是在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及宽度来评价扩增是否成功。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
②基因编码链的碱基序列，相当于把mRNA的序列中U改为T，His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，终止密码子为UAG，所以His的基因编码链的碱基序列为5'CATCATCATCATCATCATTAG3'。
③欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端，也就是在图中的右侧，所以要加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列需要在右侧，即用引物B；结合图示可知，限制酶应选用XhⅠ，所以增加的是His的基因编码链的互补链碱基序列和XhⅠ的识别序列：5'CTCGAGCTAATG3'。
21. 毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶（AOX1），AOX1基因的长度为2200bp。科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZαA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如下，请回答：
注：重组质粒1是人工合成的包含MEL和Ec-cLYZ融合基因
（1）斜带石斑鱼c型溶菌酶属于免疫系统的_______。相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过_______加工修饰，表达的蛋白具有天然生物学活性。
（2）为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中加入的模板是_______，引物应该选择以下_______。
A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’
B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’
C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’
D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’
（3）过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，这一过程与传统构建重组质粒相比不需要_______酶。
（4）为了验证构建是否成功，利用限制性内切酶EcRI和SalI对提取出的重组质粒2进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为_______（限制酶识别序列不计）的片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌的目的是_______。
（5）过程⑤培养毕赤酵母时加入_______作为唯一碳源，目的是_______。
（6）目的基因与宿主基因组染色体的交换方式包括单交换和双交换。含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，属于单交换；当发生基因取代时，含目的基因的载体与宿主染色体中AOX1基因区域发生交换，宿主AOX1基因编码区域被全部取代，属于双交换。以AOX1基因两端序列为依据设计引物，对三株重组酵母（编号1、2、3）进行菌液PCR、电泳后得到下图，根据结果推断目的基因与宿主基因组染色体发生单交换的酵母菌株有_______。
【答案】（1） ①. （免疫）活性物质 ②. 内质网、高尔基体
（2） ①. 重组质粒1 ②. AB
（3）限制酶和DNA连接酶
（4） ①. 611bp、3493bp ②. 使得重组质粒2在大肠杆菌中稳定保存、准确复制、方便提取
（5） ①. 甲醇 ②. 诱导目的基因大量表达
（6）1、2、3
【解析】
【分析】1、PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；
2、PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【小问1详解】
免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质构成，溶菌酶属于免疫系统的免疫活性物质。原核细胞没有细胞核和众多细胞器，只有核糖体，真核细胞具有内质网、高尔基体等细胞器，因此相对于原核表达系统，毕赤酵母表达系统翻译出的蛋白可以经过内质网、高尔基体。
【小问2详解】
重组质粒Ⅰ上既含有MEL基因又含有Ec-cLYZ，且两基因相连，因此重组质粒Ⅰ可作为过程①PCR反应体系中的模板，为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，且两端带有pPICZαA的同源序列，因此所设计的引物，一侧应包含pPICZαA和Ec-cLY的碱基序列，且连接处应含有限制酶EcRⅠ识别序列，又因为子链延伸的方向是5'→3'，因此，该侧引物序列应为5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’，即A选项；另一侧引物应包含MEL和pPICZαA，且连接处应含有限制酶SalⅠ识别序列，子链延伸的方向是5'→3'，因此，该侧引物序列应为5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’，即B选项。
综上所述AB正确，CD错误。
故选AB。
【小问3详解】
过程②将PCR产物片段与线性化的pPICZαA混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，在该过程中未用到限制酶和DNA连接酶。
【小问4详解】
由图可知，Ec-cLYZ基因片段长度为533bp，MEL基因片段长度为78bp，在重组质粒Ⅱ中两基因为融合基因，之间为限制酶识别序列，但在两端分别含有限制性内切酶EcRI和SalI识别序列，若用限制性内切酶EcRI和SalI对提取出的重组质粒2进行双酶切，得到的融合基因片段长度为533+78=611bp，另一片段为pPICZαA片段，长度为3493bp，因此利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别得到大小约为611bp、3493bp两种片段。过程③将重组质粒2导入大肠杆菌可使得使得重组质粒2在大肠杆菌中稳定保存、准确复制、方便提取。
【小问5详解】
毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源时需要大量表达醇氧化酶，MEL和Ec-cLYZ融合基因存在于AOX1基因启动子和终止子之间，因此过程⑤培养毕赤酵母时加入甲醇作为唯一碳源，目的是诱导目的基因（MEL和Ec-cLYZ融合基因）大量表达。
【小问6详解】
由题可知，AOX1基因的长度为2200bp，发生单交换的含有目的基因的载体插入宿主染色体的AOX1基因的上游或下游，不影响AOX1基因的正常表达，因此以AOX1基因两端序列为依据设计引物，若发生单交换，则扩增出来的片段大于AOX1基因本身的长度2200bp，若为双交换则AOX1基因编码区全部被替换，扩增出来的片段小于AOX1基因本身的长度2200bp，由图可知，三株重组酵母在大于2000bp的位置均有电泳条带，可知菌株1、2、3中目的基因与宿主基因组染色体发生单交换。
22. 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患病。结核杆菌通常以气溶胶形式传播，气溶胶颗粒被肺泡吞噬细胞吞噬，吞噬细胞破裂导致结核杆菌在机体内进一步传播。羊痒病是由正常细胞的非致病性朊蛋白异构化为痒病朊蛋白所致。为研制既能抗结核病又能抗羊痒病的双抗羊，科学家进行了如下操作。
（1）小鼠SP110基因是目前发现的具有抗结核杆菌感染功能的基因。研究人员为了验证SP110基因的功能，同时也为了验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，设计了下表所示的三组实验。
取三组实验等量的细胞裂解液，用_____法培养，结果如下图1所示。由图可知小鼠SP110基因可用于双抗羊的研制，依据的实验现象是_____。
（2）非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，PRNP基因的结构如图2．研究人员用新型基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除。请根据上述信息，设计一个检测敲除是否成功的思路：提取山羊成纤维细胞的DNA，根据_____设计引物进行PCR，并用_____作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
（3）用TALEN敲除载体与供体DNA表达载体（图4）共同转化体外培养的幼羊成纤维细胞，可将融合基因定点敲入PRNP基因的外显子3部位，原理如图3．请指出图4中数字1和2的分别代表的结构：1．_____、2．_____。经用_____法检测，山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况是_____（填“两者均增加”或“两者均减少或不表达”或“前者减少、后者增加”或“前者增加、后者减少”）。
（4）欲用上述细胞获得双抗羊，需要用到的技术有_____（至少写出两项）。
【答案】（1） ①. 接种等量的结核杆菌 ②. 含有融合基因与质粒构建的重组质粒的山羊肺泡吞噬细胞 ③. 等量蒸馏水 ④. 稀释涂布平板 ⑤. 组3的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量与组2接近，显著小于组1
（2） ①. 外显子3的（部分）序列 ②. BamHⅠ
（3） ①. L4序列 ②. MRS启动子 ③. 抗原抗体杂交技术 ④. 均降低（或不表达）
（4）体细胞核移植、动物细胞培养（早期胚胎培养）、胚胎移植
【解析】
【分析】基因工程中的操作工具及其作用：
①“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
②“分子缝合针”——DNA连接酶，E·cliDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合黏性末端和平末端。
③“分子运输车”——载体。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
【小问1详解】
实验目的是验证SP110基因的功能，同时验证山羊吞噬细胞特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达，自变量是是否有SP110基因、是否有特异性启动子MSR，实验组是将MRS启动子与小鼠SP110基因形成融合基因，构建成重组质粒后导入肺泡吞噬细胞，现在已经设置转入空质粒的山羊吞噬细胞为对照组（组1），还需要设置已经转入广泛表达小鼠SP110基因的重组质粒的山羊吞噬细胞（组3）作为对照组。构建重组质粒时，需要用限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起。分别接种等量的结核杆菌，经72h后需要使吞噬细胞破裂，应加入蒸馏水使其吸水膨涨破裂。取三组实验等量的细胞裂解液，用稀释涂布平板法培养，根据图1，实验组（组2）的吞噬细胞裂解后释放的结核杆菌数量和组3接近，显著小于1组，说明特异性启动子MSR可以启动SP110基因在吞噬细胞内的表达。
【小问2详解】
由图可知，外显子3序列内部存在限制酶BamHⅠ识别序列，若利用基因敲除技术对体外培养的山羊成纤维细胞PRNP基因的外显子3序列实施定点敲除，则外显子3内部限制酶BamHⅠ识别序列被破坏，因此检测敲除是否成功可提取山羊成纤维细胞的DNA，根据外显子3的（部分）序列设计引物进行PCR，并用BamHⅠ作用于PCR产物后进行凝胶电泳，若仅获得一条电泳条带，说明定点敲除成功。
【小问3详解】
非致病性朊蛋白是由山羊13号染色体上的PRNP基因的第三外显子控制合成的，为了降低非致病性朊蛋白的量，同时又能抗结核病，可设计用将MRS启动子与小鼠SP110基因形成的融合基因替换PRNP基因的第三外显子，据图2和图3，对山羊成纤维细胞L4与R1之间的序列实施定点敲除，将TALEN敲除载体与供体DNA载体（MRS启动子与小鼠SP110基因形成的融合基因）共转化幼羊成纤维细胞，将SP110基因定点敲入PRNP基因的第三外显子中。则图4中供体DNA表达载体中：1是L4序列（和第三外显子前的L4序列同源），2是MRS启动子，3是终止子（使SP110基因转录停止），4是R1序列（和第三外显子后的R1序列同源）。若想对山羊成纤维细胞中非致病性朊蛋白基因和SP110基因的表达情况进行检测，则需要进行抗原抗体杂交技术。由于PRNP基因的第三外显子被敲除，非致病性朊蛋白基因不表达，由于成纤维细胞中特异性启动子MSR不能发挥作用，SP110基因也不表达。
【小问4详解】
若将TALEN敲除载体与供体DNA载体共转化幼羊成纤维细胞获得双抗羊，首先将该细胞细胞核移植到去核卵母细胞中，诱导卵母细胞分裂、分化，进行早期胚胎细胞培养，到适宜阶段进行胚胎移植，移入适宜的代孕母体。
限制酶
识别序列及切割位点
EcR I
G↓AATTC
BamHI
G↓GATCC
组别
主要操作
培养细胞后，使之破裂
对照组1
空质粒导入山羊肺泡吞噬细胞，接种适量结核杆菌
细胞培养72小时后，加入③_____，使吞噬细胞破裂，释放结核杆菌
对照组2
含有能广泛表达SP110基因的山羊肺泡吞噬细胞，①_____
实验组
②_____，接种等量的结核杆菌
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