2024届人教版高考生物一轮复习微生物的培养技术及应用学案

第 2 讲　微生物的培养技术及应用

1．培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。(√)

2．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。(√)

3．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(×)

4．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(×)

5．对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。(×)

6．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)

7．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使培养基的酸碱度降低。(×)

8．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(×)

系统学习(一)　培养基及微生物的纯培养技术(释疑点)

　　　　　基础知识·全面掌握

1．培养基的配制

(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。

(2)种类。

(3)成分。

各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。

2．无菌技术

(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。

(2)常用方法。

3.微生物的纯培养

(1)概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。

(2)过程：包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。

(3)常用方法：平板划线法和稀释涂布平板法。

(4)实例——酵母菌的纯培养。

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1．(选择性必修3 P10旁栏思考)无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？

提示：还能有效避免操作者自身被微生物感染。

2．(选择性必修3 P12“探究·实践”思考分析)

(1)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

提示：不能。因为空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。

(3)平板划线法在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？目的是什么？

提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，第二次以及其后的划线从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散以便获得单个菌落。

　　　　　　重难盲点·讲练疏通

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培养基及消毒和灭菌

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1．培养基营养成分的作用

2.比较消毒和灭菌

[对点练习]

1．大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，利用其代谢产物能与染料伊红-亚甲蓝反应，使菌落呈黑色的特性，从而将其鉴别出来。下表是其培养基配方，相关叙述错误的是(　 )

A.培养基配方中X的成分可以是琼脂

B．该培养基中蛋白胨提供的主要营养有碳源、氮源和维生素

C．可采用干热灭菌法对该培养基灭菌

D．可利用培养基上菌落的特征来判断和鉴别大肠杆菌的存在

解析：选C　对培养基进行灭菌应该采用高压蒸汽灭菌法，C错误。

2．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免细菌的污染。回答下列问题：

(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。

(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。

(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是______________________________________________________________。

解析：(1)干热灭菌是指将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃的热空气中维持2～3 h。能耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法灭菌。(2)与煮沸消毒法相比，巴氏消毒法或高温瞬时消毒法可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，从而杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。

答案：(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽

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微生物的纯培养与平板划线操作

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1．培养物、纯培养物、纯培养辨析

2.平板划线操作的注意事项

(1)灼烧接种环，待其冷却后才能蘸取菌液，以免温度过高杀死菌种。

(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。

(3)划线时最后一区不要与第一区相连。

(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。

(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：

[对点练习]

3．下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　 )

A．微生物培养基中并不都必须添加碳源或氮源

B．倒平板时，应将打开的培养皿皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上

C．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧

D．实验结束后，带菌的培养基必须经灭菌处理后才能倒掉

解析：选B　倒平板时，用左手拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20 mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，B错误。

4．鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。

请回答相关问题：

(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在_________________________________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为________培养基。

(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是__________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。

(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

解析：(1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养生物，所以培养硫细菌的培养基中碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基为选择培养基。(2)在制备固体培养基过程中，倒平板操作后将平板倒置的目的是防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染，同时防止培养基中的水分过快发挥。(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，是通过稀释涂布平板法接种得到的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种得到的。(4)图甲对应的平板划线操作示意图是图丙。图甲中③经过多次划线，每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更易获得单菌落。

答案：(1)含碳有机物(或脂肪)　碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物　选择　(2)防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防止培养基中的水分过快挥发　(3)稀释涂布平板法　D　(4)丙　每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落

系统学习(二)　微生物的选择培养和计数(释疑点)

　　　　　　基础知识·全面掌握

(一)微生物的选择培养

1．选择培养基

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2．稀释涂布平板法

将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。

(1)系列稀释操作。

系列稀释：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应离酒精灯火焰1～2 cm。操作过程如下：

(2)涂布平板操作。

(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。

(二)微生物的数量测定

1．稀释涂布平板法

2.显微镜直接计数法

3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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1．(选择性必修3 P18“相关信息”挖掘)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是什么？

提示：前者常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；后者可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

2．(选择性必修3 P19“探究·实践”思考)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时，经培养后发现培养基上出现多种菌落，可能的原因有哪些？

提示：出现杂菌污染的可能原因：培养基制备过程中被杂菌污染；接种过程中，无菌操作不符合要求；系列稀释时，无菌操作不符合要求等。

　　　　　　重难盲点·讲练疏通

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微生物选择培养的原理和方法

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1．选择培养的原理：根据不同微生物的特殊营养需求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

2．三种选择培养方法的比较

[对点练习]

1．精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶，不能在缺少精氨酸的培养基上生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌并进行筛选的过程示意图，过程②将紫外线照射处理的菌液接种在某培养基上。培养至菌落不再增加时，平板上的菌落如图甲所示。过程③向培养基中添加某种物质继续培养得到如图乙所示平板。下列叙述正确的是(　 )

A．紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生基因突变或染色体变异

B．图乙中菌落B为精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌

C．过程③向培养基中添加的某种物质是谷氨酸

D．过程②所用培养基是一种鉴别培养基

解析：选B　谷氨酸棒状杆菌为原核生物，其细胞中不含染色体，因此不会发生染色体变异，A错误；与图甲平板相比，图乙平板上菌落多，说明过程③向培养基中添加的某种物质是精氨酸，新出现的菌落为精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌，B正确，C错误；过程②所用培养基缺少精氨酸，只有能产生精氨酸的微生物才能生存，因此该培养基是一种选择培养基，D错误。

2．下表为某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方：

请结合所学知识分析，下列相关叙述不正确的是(　 )

A．根据用途划分，该培养基属于鉴别培养基

B．若要分离能分解尿素的细菌，需将蛋白胨换成尿素

C．若还需鉴定分解尿素的细菌，需将伊红亚甲蓝换成酚红

D．该培养基中蛋白胨只是提供了氮源

解析：选D　伊红亚甲蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，根据用途划分，该培养基属于鉴别培养基，A正确；若要分离能分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，需要将蛋白胨换成尿素，B正确；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。若培养基中存在分解尿素的细菌，其菌落周围会出现红色环带，这是由于尿素被分解产生的氨使pH升高，指示剂产生颜色变化，从而证明这一菌株以尿素为氮源，C正确；该培养基中蛋白胨主要提供了碳源、氮源、维生素，D错误。

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微生物计数的原理和方法

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1．平板划线法和稀释涂布平板法的比较

2．两种微生物计数方法的比较

[对点练习]

3．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，对该实验有关叙述错误的是(　 )

A．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233

B．涂布了一个平板，统计的菌落数是230

C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，取其平均值作为该样品菌落数估计值

解析：选B　该实验中，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，求平均值，A、D正确；实验应设置对照实验和重复实验，排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，B错误，C正确。

4．(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

回答下列问题：

(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。

(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。

(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是______________________(答出1点即可)。

(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：________________________________________________________________________。

(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即__________________________。

解析：(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意可知，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液涂布的平板上长出的菌落数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌生长提供水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。

答案：(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐