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    浙科版高中生物选择性必修第三册·第四章- 第一节 课时2 基因工程赋予生物新的遗传特性(课件PPT)
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    生物选择性必修3 生物技术与工程第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性优秀课件ppt

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    这是一份生物选择性必修3 生物技术与工程第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性优秀课件ppt,共26页。PPT课件主要包含了抗虫棉的培育过程,基因的结构,真核生物基因,非编码区,①启动子,②终止子,编码区,具有调控作用,mRNA前体,原核生物基因等内容,欢迎下载使用。

    1997年,我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年,我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个,减少农药用量40万吨,增收节支社会经济效益450亿元。
    你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?
    2.基因表达载体的构建
    1.目的基因的筛选与获取
    3.将目的基因导入受体细胞
    4.目的基因的 检测与鉴定
    将目的基因插入染色体DNA中
    基因工程的基本操作程序:
    编码蛋白质的核苷酸序列是不连续的,编码蛋白质的序列称为外显子,外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子。
    位于基因的“上游”,有RNA聚合酶结合的位点,控制转录的开始
    位于基因末端,当RNA聚合酶到达时,释放出RNA产物,转录结束
    不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子
    编码蛋白质的核苷酸序列是连续的。
      科学工作者分离得到了某原核生物基因,并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对,结果如图所示。
    将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来,需要已知目的基因的全部序列,成本较高,适于合成序列较短的基因。
    单链DNA (cDNA)
    双链DNA(即目的基因)
    根据已知的氨基酸序列合成DNA
    二、借助载体建立基因文库:
    利用限制酶把某种生物的基因组 DNA切成适当大小,分别与载体组合,导入微生物细胞,形成克隆。
    基因组中所有DNA序列克隆的总汇
    2、构建部分基因文库(cDNA文库)
    由于基因的选择性表达,不同组织细胞的cDNA文库是不同的,同一组织细胞在不同的发育阶段,cDNA文库也有差异。
    从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA
    合成互补的DNA (cDNA)
    导入受体菌中储存,构建cDNA文库
    PCR是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,在DNA聚合酶作用下,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
    三、聚合酶链式反应(PCR技术)体外扩增
    PCR由穆里斯等人于1985年发明,为此,穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖
    如果说,沃森和克里克发现DNA双螺旋结构,标志着分子生物学时代的开启,那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现,彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
    历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。钱嘉韵(中国台湾省,1976年)成功分离出嗜热DNA聚合酶。
    耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
    稳定的缓冲溶液(一般添加Mg2+)
    PCR扩增仪(PCR仪)
    第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板,经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
    第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板,经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
    以指数方式扩增,即2n(n为扩增循环的次数)
    用PCR可以扩增mRNA吗?
    mRNA不可以直接扩增,需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
    ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链,形成RNA-DNA杂交分子;②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链,使之变成单链DNA;③以单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链,形成双链DNA分子,即cDNA
    如何鉴定PCR的产物?
    完成后,常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。
    带电粒子在电场作用下,向与其携带电荷相反的电极迁移的过程电泳。
    3、凝胶中的DNA分子可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记,或使用亚甲基蓝将 DNA染成蓝色,在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
    1、核酸是带有负电的生物大分子,其迁移速率主要受核酸片段长度影响。核酸分子越大,迁移速率越慢。
    2、电泳时常使用凝胶作为介质,凝胶的孔隙可起到分子筛的作用。
    1.试剂①无菌水、琼脂糖 ②电泳缓冲液(TAE或TBE) ③凝胶载样缓冲液(内含指示剂——溴酚蓝) ④核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)⑤PCR反应体系的配方
    PCR扩增DN A片段及凝胶电泳鉴定
    2.用具①PCR仪(自动控温,实现DNA的扩增)②微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)③微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)④一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头)⑤电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)
    3.DNA片段的扩增方法步骤
    用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书,在微量离心管中依次加入各组分
    待所有组分都加入后,盖严离心管的盖子,将微量离心管放入离心机里,离心约30s,使反应液集中在离心管的底部(提高反应速率)
    参照下表的参数,设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
    *可根据目的片段长度适当调整延伸时间
    *复性时不一定均为引物与DNA模板结合,也存在DNA解开的两条单链的结合,因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量(但不能随意加大浓度);
    思考: 预变性的目的?
    使DNA充分变性,以利于引物更好地和模板结合
    4.DNA片段的电泳鉴定方法步骤
    根据待分离DNA片段的大小,用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液,一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后,加入适量的核酸染料混匀
    将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,插入合适大小的梳子,以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固,小心拔出梳子,取出凝胶放入电泳槽。将电泳缓冲液加入电泳槽中,电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
    将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker)
    接通电源,根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。
    取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
    倒入0.1% 亚甲基蓝溶液,没过凝胶约5 mm,染色8 min。凝胶下表面与培养皿之间,不要留有气泡。
    75%乙醇脱色1min,不断晃动培养皿。
    *替换染色方法:向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002% 亚甲基蓝溶液,并没过凝胶。盖上培养皿盖,4℃冷藏过夜。
    冷蒸馏水脱色。可更换被染蓝的蒸馏水。
    6、注意1.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时,一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。6.若电泳缓冲液使DNA带负电荷,加样孔侧应连电极的负极。
    7、结果分析与评价1.成功扩增出DNA片段的判断依据是什么?2.进行电泳鉴定的结果应该是几条条带?3.如图所示,该片段大小约为____bp
    可以在紫外灯下直接观察到DNA条带(根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果)
    4.如果未出现条带,可能原因是什么?5.如果出现不止一条条带,可能原因是什么?
    漏加了PCR反应成分,各反应成分的用量不当,PCR程序设置不当等
    ①引物设计不合理,它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体;②复性温度过低;③DNA聚合酶质量不好等;
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