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2023届高考生物二轮复习生物工程学案
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这是一份2023届高考生物二轮复习生物工程学案，共21页。
(1)植物组织培养和植物体细胞杂交技术。(8)DNA的粗提取和鉴定。
(2)动物细胞培养及干细胞的应用。(9)DNA片段的扩增及电泳鉴定。
(3)动物细胞融合技术和单克隆抗体的制备。(10)基因工程的应用。
(4)动物体细胞核移植技术。(11)蛋白质工程。
(5)胚胎工程的理论基础及应用。(12)转基因产品的安全性。
(6)重组DNA技术的基本工具。(13)关注生殖性克隆与治疗性克隆。
(7)基因工程的基本操作程序。(14)生物武器及其对人类的危害。
eq \x(选择性必修3 P45“思考·讨论”)
1.动物细胞培养过程中，常用幼龄的动物细胞，因为幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，更易于培养。同样，细胞的分化程度越低，其分裂能力就越强，就越容易培养。
eq \x(选择性必修3 P48～49“图2－16”)
2.单克隆抗体制备过程中涉及两次筛选，第一次是利用选择培养基，筛选出杂交瘤细胞；第二次是克隆化培养和抗体检测，目的是筛选出足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
eq \x(选择性必修3 P48～49“图2－16”)
3.在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
eq \x(选择性必修3 P50“思考·讨论”)
4.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC的抗体具有特异性识别肿瘤细胞的作用，药物有杀伤肿瘤细胞的作用。
eq \x(选择性必修3 P54“相关信息”)
5.目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也可采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。
eq \x(选择性必修3 P68“小字内容”)
6.艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
eq \x(选择性必修3 P77“相关信息”)
7.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
eq \x(选择性必修3 P81“资料卡”)
8.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
eq \x(选择性必修3 P90“正文”)
9.构建乳腺生物反应器时需要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
1.判断有关细胞工程和胚胎工程说法的正误
(1)在脱分化过程中，增大细胞分裂素与生长素含量的比值，可利于根的分化生长。(×)
(2)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(×)
(3)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。(√)
(4)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。(×)
(5)杂交瘤细胞制备过程中，可用灭活的病毒诱导细胞融合。(√)
(6)植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。(×)
(7)重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。(√)
(8)使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎产生免疫排斥反应。(×)
(9)牛胚胎移植时可用囊胚期滋养层细胞进行性别鉴定。(√)
(10)胚胎移植中，供体和受体相当于双亲中的父本和母本。(×)
2.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误
(1)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)
(2)E.cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(√)
(4)将胰岛素基因表达载体导入受体细胞借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来。(√)
(5)转基因抗虫棉植株的抗虫效果必须通过分子检测进行鉴定。(×)
(6)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(√)
(7)蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。(√)
(8)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
1.体外进行动物细胞培养时，培养液要定期更换，其目的是___________________
_____________________________________________________________________。
提示 以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
2.胚胎细胞的核移植获得克隆动物的难度小于体细胞核移植，其原因是_________
_____________________________________________________________________。
提示 胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易
3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是___________________________________________________
_______________________________________________________ (答出两点即可)。
提示 对靶细胞具有较高的转化效率；在宿主细胞中不会引起免疫排斥
4.[2021·全国甲卷，38(2)(4)](2)PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是_____________________________________________。
(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_______________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
提示 (2)延伸 两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合 (4)一种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术
5.[2019·全国卷Ⅰ，38(3)]目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶，而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是____________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示 耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
6.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物，引物的作用是_____________________________________________________________________。
提示 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
7.PMI基因存在于下图的基因组中，若使用PCR技术扩增时需要 酶催化，可选择图中四种引物A、B、C、D中的引物_________，原因是_________
_____________________________________________________________________。
提示 耐高温的DNA聚合 B、C PMI基因位于此片段的中间部位，耐高温的DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链
8.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示 抗盐基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
9.用膀胱生物反应器也能生产干扰素，与乳腺生物反应器相比，其优势是________
______________________________________________________________________
(答出2点即可)。
提示 不受年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效
1.(2022·全国甲卷，38)某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题：
(1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是____________________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是______________________________________________；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是________________________(答出1点即可)。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到__________时才具备与精子受精的能力。
(2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有________________(答出3点即可)等。将培养好的良种囊胚保存备用。
(3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案 (1)放入－196 ℃的液氮中保存(或冷冻保存) 刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能受精 肝素或Ca2＋载体 MⅡ期 (2)维生素、氨基酸、核苷酸 (3)对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代
解析 (1)精液可以放入－196 ℃的液氮中保存(或冷冻保存)，使用前再将精液解冻离心分离。刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能受精，故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；将精子培养在人工配制的获能液中使其获能(化学诱导法)，化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或Ca2＋载体溶液中，用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期(MⅡ期)才能具备与精子受精的能力。(2)进行早期胚胎培养的培养液中，除了无机盐、激素、血清外，还含有维生素、氨基酸、核苷酸等。(3)要利用保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料，获得具有该公羊优良性状的后代，主要是利用胚胎移植技术，即对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代。
2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明__________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_________________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________
_____________________________________________________________________。
答案 (1)逆转录酶(或反转录酶) (2)特异性核苷酸序列 复性 (3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)筛选与获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶(或反转录酶)。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为确保PCR扩增获得的是特异性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性(90 ℃以上)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中温度最低的一步是复性(或退火)。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但可能曾感染新冠病毒，已经康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：筛选与获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
微专题1 细胞工程与胚胎工程
1.植物组织培养的过程 原理：植物细胞的全能性
①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
②脱分化阶段不需光，再分化阶段需光。
③生长素/细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
④体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，基因的表达具有选择性。
2.植物体细胞杂交技术
原理：细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
①与再生细胞壁密切相关的细胞器是高尔基体。
②原生质体融合后有多种结果需要筛选。
③从变异角度看，植物体细胞杂交技术属于染色体数目变异，杂种植株的基因型、染色体和染色体组数目均为原两植物直接相加。
3.动物细胞培养 原理：细胞增殖
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理组织，使其分散成单个细胞。
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
4.单克隆抗体的制备 原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5.动物体细胞核移植技术(克隆技术)
原理：动物细胞核的全能性
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起表型改变。
(2)克隆动物的产生属于无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
6.胚胎移植的操作流程
7.胚胎分割 无性繁殖或克隆
1.下列有关细胞工程的叙述正确的有④⑥。
①将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(2021·江苏卷，11D)
②单克隆抗体制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合。(2021·山东卷，15B)
③植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。(2021·江苏卷，5D)
④经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防。(2021·辽宁卷，3D)
⑤动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。(2021·浙江1月，18B)
⑥胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养。(2020·江苏卷，23D)
2.下列有关胚胎工程的叙述正确的有①②。
①早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体。(2021·江苏卷，11B)
②体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理。(2020·山东卷，14B)
③胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。(2020·山东卷，14C)
④胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。(2018·江苏卷，10C)
⑤利用胚胎分割技术，同卵多胎较同卵双胎成功率更高。(2018·江苏卷，10D)
1.(2021·福建卷，11)科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术流程示意图如下。
下列叙述正确的是( )
A.愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的
B.获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状
C.可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生
D.用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体
答案 D
解析 愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞脱分化形成的，A错误；由于基因的选择性表达和基因间的互作效应，获得的杂种植株不一定能够表现双亲的优良性状，B错误；可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合，但不能诱导细胞壁的再生，C错误。
2.(2022·河北衡水金卷)紫杉醇是一种高效抗癌药物。某团队研究了光照条件对红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响，实验结果如表：
下列叙述正确的是( )
A.愈伤组织生长的原理是植物细胞具有全能性
B.愈伤组织的培养要在无菌条件下进行
C.光照能促进愈伤组织的生长并提高紫杉醇含量
D.培养基中的有机物仅能为愈伤组织提供能量
答案 B
解析 愈伤组织生长时主要进行的是细胞分裂，不能体现植物细胞的全能性，A错误；由表可知，两组接种干重相似，光照条件下收获干重和紫杉醇含量均低于黑暗条件下的，C错误；培养基中的有机物可以为植物细胞提供营养物质和能量，还可以调节渗透压等，D错误。
3.(2022·河南九师联盟)S蛋白是新冠病毒表面的一种抗原蛋白，能引起机体的特异性免疫反应。下图是国产腺病毒载体疫苗的生产流程，该疫苗可以有效预防新冠病毒感染。回答下列问题：
(1)构建重组腺病毒载体基因组需要用到的酶是________________。培养扩增细胞时，细胞常出现贴壁生长现象，分瓶前应____________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)腺病毒疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S蛋白的合成，其过程是_____________________________________________________
(用文字和箭头表示)。
(3)新冠抗体是人体产生的能直接攻击新冠病毒的蛋白质，直接给患者注射抗体能起到很好的治疗效果。一般可以通过________、细胞培养和蛋白质提取技术制备单克隆抗体。若要制备针对新冠病毒的单克隆抗体，需要用________多次注射小鼠，之后再从小鼠脾脏中分离出________，与小鼠骨髓瘤细胞共同制备杂交瘤细胞。要得到满足生产需要的杂交瘤细胞至少需要筛选________次。
答案 (1)限制酶和DNA连接酶 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散细胞，并加入新培养液配成细胞悬液
(2)S蛋白基因的cDNAeq \(――→,\s\up7(转录))mRNAeq \(――→,\s\up7(翻译))S蛋白
(3)(动物)细胞融合 S蛋白 已免疫的B淋巴细胞 2
4.(2022·河北衡水金卷)胚胎干细胞在揭示人与动物的发育机制、药学研究、细胞替代治疗及基因治疗中有着广阔的应用前景。不同物种、不同胚胎之间存在较大的差异，不同物种胚胎干细胞的建系方法和培养条件也各不相同，研究人员对阿尔巴斯白绒绵羊胚胎干细胞的培养条件开展了相关研究。回答下列问题：
(1)通过体内受精获得胚胎干细胞的过程中，应对处于发情期的阿尔巴斯白绒母绵羊注射促性腺激素，目的是_____________________________________________。
选用优质公羊与其交配，48～80 h后，从母绵羊的________(部位)冲卵回收得到早期胚胎。
(2)培养羊早期胚胎前先取小鼠的成纤维细胞制备饲养层细胞，在小鼠的成纤维细胞培养液中加入________可将其从培养瓶的瓶壁上分离下来形成单细胞悬液。
(3)研究人员配制A、B两种胚胎干细胞的培养液时，均添加了100 IU/mL青霉素和0.05 mg/mL链霉素，加入青霉素和链霉素的目的是________________________
_____________________________________________________________________。
(4)若探究机械法(用口吸管将内细胞团切割成小块)、酶消化法、培养液A、培养液B对胚胎干细胞传代培养的影响，请补充完整实验组的处理：实验组1：机械法获取胚胎干细胞＋培养液A；实验组2：___________________________________
_____________________________________________________________________；
实验组3：机械法获取胚胎干细胞＋培养液B；实验组4：______________________
_____________________________________________________________________。
答案 (1)促进母绵羊排出更多卵细胞(超数排卵)，以便获得多枚胚胎 输卵管
(2)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)
(3)抑制微生物的生长繁殖，避免培养过程中出现杂菌污染
(4)酶消化法获取胚胎干细胞＋培养液A 酶消化法获取胚胎干细胞＋培养液B
微专题2 基因工程(含PCR技术)
1.基因工程的基本工具
①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。
2.基因工程的四个操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
①目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
②在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。
③当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
①启动子、终止子
a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。
b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组到一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。
(3)将目的基因导入受体细胞
辨析农杆菌转化法中的“两个两次”
①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的TDNA导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定
3.PCR技术及应用
(1)PCR技术原理与条件
(2)PCR技术的过程
可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
4.蛋白质工程
1.(2021·辽宁卷，4)下列有关细胞内的DNA及其复制过程的叙述，正确的是( )
A.子链延伸时游离的脱氧核苷酸添加到3′端
B.子链的合成过程不需要引物参与
C.DNA每条链的5′端是羟基末端
D.DNA聚合酶的作用是打开DNA双链
答案 A
解析 细胞内DNA复制时，子链延伸方向为5′→3′，故游离的脱氧核苷酸添加到3′端，A正确；子链的合成过程需要引物参与，B错误；DNA每条链的5′端是磷酸基团末端，3′端是羟基末端，C错误；解旋酶的作用是打开DNA双链，D错误。
2.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
答案 D
解析 PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
3.(2022·广东中山市调研)枯草杆菌分泌能力与其信号肽序列有关，位于信号肽序列下游的基因片段表达的蛋白质可分泌至细胞外。人为设计一段中间区域互补的序列，通过“搭桥”PCR可将信号肽基因与纤维素酶基因片段相连接，获得重组DNA片段。过程如图所示。下列相关叙述，正确的是( )
“搭桥”PCR过程图解
A.引物B的3′端和引物C的3′端具有互补序列
B.PCR1产物可以作为图示延伸过程的“长引物”
C.重组PCR产物碱基数量与PCR1过程得到的两种片段碱基数量之和相等
D.重组PCR产物在枯草杆菌表达后，经过内质网和高尔基体的加工，大量分泌到细胞外
答案 B
解析 引物与模板的3′端互补配对，作为子链的5′端，观察图示，引物B的3′端和引物C的5′端应具有互补序列，A错误；观察图示，PCR1过程产生的两种基因片段中引物A和引物D所在的两条单链在3′端有部分互补后，以不互补片段为模板进行子链的延伸，所以两条模板链又可作为彼此延伸过程“长引物”，B正确；重组PCR过程的产物不是两种基因片段直接拼接，而是通过部分互补的引物来进行拼接，重组PCR产物碱基数量少于PCR1过程得到的两种片段碱基数量之和，C错误；枯草杆菌属于细菌，是原核生物，胞内没有内质网和高尔基体，D错误。
4.(2022·重庆一中调研)某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt毒蛋白基因，并将其导入大豆叶肉细胞，培育出抗虫的转基因大豆，主要过程如下。请回答下列问题：
(1)质粒上存在潮霉素抗性基因的目的是_________________________________。
(2)利用PCR技术获取Bt毒蛋白基因的前提是_____________________________，在Bt毒蛋白基因两侧分别添加Hind Ⅲ和BamHⅠ限制酶识别序列，其目的是_____________________________________________________________________。
(3)利用PCR技术扩增Bt毒蛋白基因时，连续扩增5次，形成________个两条链等长的子代DNA，需要________个引物。
(4)构建重组质粒时，要将Bt毒蛋白基因插入启动子和终止子之间的原因是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)将重组质粒导入农杆菌时，需要用________处理农杆菌，使其转化为感受态细胞。过程③筛选具有抗虫能力的大豆，从分子水平上检测Bt毒蛋白基因是否翻译的方法是_____________________________________________________________。
答案 (1)便于重组DNA分子的筛选 (2)根据Bt毒蛋白基因两端的核苷酸序列设计引物 使Bt毒蛋白基因与质粒定向拼接 (3)22 62 (4)保证Bt毒蛋白基因能够在大豆细胞中准确表达 (5)Ca2＋ 抗原—抗体杂交
解析 (1)潮霉素抗性基因属于标记基因，其目的是便于重组DNA分子的筛选。(2)PCR获取目的基因的前提是根据Bt毒蛋白基因两端的核苷酸序列设计引物，在Bt毒蛋白基因两侧分别添加Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制酶识别序列，可确保Bt毒蛋白基因与质粒定向拼接。(3)PCR连续扩增5次，经过5次扩增后，得到的DNA总数是25＝32(个)，其中只含有一种引物的DNA分子有两个，含有两种引物且不等长的DNA分子共有2×5－2＝8(个)，则共有2＋8＝10(个)DNA分子两条链不等长，故两条链等长的DNA分子数是32－10＝22(个)。扩增5次后可获得64条DNA单链，除最初的模板链外均含有引物，该过程中至少需要引物的数为64－2＝62(个)。(4)由于Bt毒蛋白基因无启动子和终止子，所以将Bt毒蛋白基因插入到启动子和终止子之间的目的是保证Bt毒蛋白基因能够在大豆细胞中准确表达。(5)将重组质粒导入农杆菌利用的方法是Ca2＋处理法。从分子水平上检测Bt毒蛋白基因是否翻译，其方法是抗原—抗体杂交。
5.(2022·四川绵阳市诊断)研究人员利用一种从鱼体内分离出的抗冻基因，培育出抗冻番茄植株，使得其幼苗的致死低温下降了2 ℃。具体研发过程如下图(其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。回答下列问题：
(1)不用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因的原因是_____________________________，
选择Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割鱼抗冻基因和质粒，而不是只选择Pst Ⅰ一种酶切割抗冻基因和质粒的优点是_______________________________________。
(2)研究人员用Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割抗冻基因和质粒，获得含抗冻基因的重组质粒后，又用不同的限制酶对原质粒和重组质粒进行酶切，获得片段大小如下表：(1 kb＝1 000 bp，1 bp为一个碱基对，注意：DNA片段大小与图中所画比例一致)
由表中数据可知，鱼抗冻基因的长度为________，若不考虑终止密码子，抗冻基因合成的抗冻蛋白最多由________个氨基酸组成。
(3)图中的步骤②为____________，步骤③表示植物组织培养的________________过程。
(4)若鱼抗冻基因整合进二倍体番茄细胞的某一条染色体上(基因型记为Aa)，则通过________________________(答出1种)的方法对抗冻番茄进行处理后获得的后代一定保留有抗冻基因。
答案 (1)Alu Ⅰ酶会破坏鱼抗冻基因 可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化
(2)2.4 kb 800
(3)重组质粒(重组DNA)导入受体(或番茄)细胞 脱分化和再分化
(4)营养繁殖或植物组织培养或无性繁殖
解析 (1)分析图可知，鱼的抗冻基因中包含了Alu Ⅰ的识别位点，若用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因会破坏鱼抗冻基因，所以不能用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因。选择Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割鱼抗冻基因和质粒，而不是只选择Pst Ⅰ一种酶切割抗冻基因和质粒的优点是可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化。(2)根据表格数据分析，原质粒长7.7 kb，两种限制酶切割后得到的片段为2.3 kb、5.4 kb，重组质粒长＝3.0 kb＋4.8 kb＝7.8 kb，结合质粒上的限制酶切割位点分析可得目的基因(抗冻基因)的长度＝7.8 kb－5.4 kb＝2.4 kb。若不考虑终止密码子，结合基因、mRNA和蛋白质的基本单位的数量关系可得组成抗冻蛋白的氨基酸数＝2.4×1 000÷3＝800。(3)图中步骤②表示将重组质粒(重组DNA)导入受体细胞的过程，步骤③表示植物组织培养的脱分化和再分化过程。(4)营养繁殖属于无性繁殖，可以保持亲本的优良性状，亲子代基因型不变，因此后代一定保留有抗冻基因，所以利用营养繁殖方法，或者利用植物组织培养技术可以使后代一定保留有抗冻基因。
专题强化练光照条件
接种干重/(g·L－1)
收获干重/(g·L－1)
紫杉醇含量/%
光照
4.33
9.13
0.007 0
黑暗
4.38
12.10
0.016 4
细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
使用最广泛的是大肠杆菌
限制酶
Alu Ⅰ
Sma Ⅰ和Pst Ⅰ
原质粒
7.7 kb
2.3 kb、5.4 kb
重组质粒
3.0 kb、4.8 kb
(1)植物组织培养和植物体细胞杂交技术。(8)DNA的粗提取和鉴定。
(2)动物细胞培养及干细胞的应用。(9)DNA片段的扩增及电泳鉴定。
(3)动物细胞融合技术和单克隆抗体的制备。(10)基因工程的应用。
(4)动物体细胞核移植技术。(11)蛋白质工程。
(5)胚胎工程的理论基础及应用。(12)转基因产品的安全性。
(6)重组DNA技术的基本工具。(13)关注生殖性克隆与治疗性克隆。
(7)基因工程的基本操作程序。(14)生物武器及其对人类的危害。
eq \x(选择性必修3 P45“思考·讨论”)
1.动物细胞培养过程中，常用幼龄的动物细胞，因为幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，更易于培养。同样，细胞的分化程度越低，其分裂能力就越强，就越容易培养。
eq \x(选择性必修3 P48～49“图2－16”)
2.单克隆抗体制备过程中涉及两次筛选，第一次是利用选择培养基，筛选出杂交瘤细胞；第二次是克隆化培养和抗体检测，目的是筛选出足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
eq \x(选择性必修3 P48～49“图2－16”)
3.在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
eq \x(选择性必修3 P50“思考·讨论”)
4.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC的抗体具有特异性识别肿瘤细胞的作用，药物有杀伤肿瘤细胞的作用。
eq \x(选择性必修3 P54“相关信息”)
5.目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也可采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。
eq \x(选择性必修3 P68“小字内容”)
6.艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
eq \x(选择性必修3 P77“相关信息”)
7.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
eq \x(选择性必修3 P81“资料卡”)
8.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
eq \x(选择性必修3 P90“正文”)
9.构建乳腺生物反应器时需要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
1.判断有关细胞工程和胚胎工程说法的正误
(1)在脱分化过程中，增大细胞分裂素与生长素含量的比值，可利于根的分化生长。(×)
(2)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(×)
(3)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。(√)
(4)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。(×)
(5)杂交瘤细胞制备过程中，可用灭活的病毒诱导细胞融合。(√)
(6)植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。(×)
(7)重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。(√)
(8)使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎产生免疫排斥反应。(×)
(9)牛胚胎移植时可用囊胚期滋养层细胞进行性别鉴定。(√)
(10)胚胎移植中，供体和受体相当于双亲中的父本和母本。(×)
2.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误
(1)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)
(2)E.cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(√)
(4)将胰岛素基因表达载体导入受体细胞借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来。(√)
(5)转基因抗虫棉植株的抗虫效果必须通过分子检测进行鉴定。(×)
(6)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(√)
(7)蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶。(√)
(8)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)
1.体外进行动物细胞培养时，培养液要定期更换，其目的是___________________
_____________________________________________________________________。
提示 以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
2.胚胎细胞的核移植获得克隆动物的难度小于体细胞核移植，其原因是_________
_____________________________________________________________________。
提示 胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易
3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是___________________________________________________
_______________________________________________________ (答出两点即可)。
提示 对靶细胞具有较高的转化效率；在宿主细胞中不会引起免疫排斥
4.[2021·全国甲卷，38(2)(4)](2)PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，其中复性的结果是_____________________________________________。
(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_______________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
提示 (2)延伸 两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合 (4)一种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术
5.[2019·全国卷Ⅰ，38(3)]目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶，而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是____________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示 耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
6.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物，引物的作用是_____________________________________________________________________。
提示 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
7.PMI基因存在于下图的基因组中，若使用PCR技术扩增时需要 酶催化，可选择图中四种引物A、B、C、D中的引物_________，原因是_________
_____________________________________________________________________。
提示 耐高温的DNA聚合 B、C PMI基因位于此片段的中间部位，耐高温的DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链
8.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示 抗盐基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
9.用膀胱生物反应器也能生产干扰素，与乳腺生物反应器相比，其优势是________
______________________________________________________________________
(答出2点即可)。
提示 不受年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效
1.(2022·全国甲卷，38)某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊，为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代，该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题：
(1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是____________________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是______________________________________________；精子体外获能可采用化学诱导法，诱导精子获能的药物是________________________(答出1点即可)。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞，因为卵母细胞达到__________时才具备与精子受精的能力。
(2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行，该培养液的成分除无机盐、激素、血清外，还含的营养成分有________________(答出3点即可)等。将培养好的良种囊胚保存备用。
(3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案 (1)放入－196 ℃的液氮中保存(或冷冻保存) 刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能受精 肝素或Ca2＋载体 MⅡ期 (2)维生素、氨基酸、核苷酸 (3)对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代
解析 (1)精液可以放入－196 ℃的液氮中保存(或冷冻保存)，使用前再将精液解冻离心分离。刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能受精，故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；将精子培养在人工配制的获能液中使其获能(化学诱导法)，化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或Ca2＋载体溶液中，用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到减数第二次分裂中期(MⅡ期)才能具备与精子受精的能力。(2)进行早期胚胎培养的培养液中，除了无机盐、激素、血清外，还含有维生素、氨基酸、核苷酸等。(3)要利用保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料，获得具有该公羊优良性状的后代，主要是利用胚胎移植技术，即对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植，对受体母羊进行是否妊娠的检查，一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代。
2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明__________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_________________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________
_____________________________________________________________________。
答案 (1)逆转录酶(或反转录酶) (2)特异性核苷酸序列 复性 (3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)筛选与获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶(或反转录酶)。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为确保PCR扩增获得的是特异性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性(90 ℃以上)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中温度最低的一步是复性(或退火)。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但可能曾感染新冠病毒，已经康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：筛选与获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
微专题1 细胞工程与胚胎工程
1.植物组织培养的过程 原理：植物细胞的全能性
①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
②脱分化阶段不需光，再分化阶段需光。
③生长素/细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
④体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，基因的表达具有选择性。
2.植物体细胞杂交技术
原理：细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
①与再生细胞壁密切相关的细胞器是高尔基体。
②原生质体融合后有多种结果需要筛选。
③从变异角度看，植物体细胞杂交技术属于染色体数目变异，杂种植株的基因型、染色体和染色体组数目均为原两植物直接相加。
3.动物细胞培养 原理：细胞增殖
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理组织，使其分散成单个细胞。
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
4.单克隆抗体的制备 原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5.动物体细胞核移植技术(克隆技术)
原理：动物细胞核的全能性
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起表型改变。
(2)克隆动物的产生属于无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
6.胚胎移植的操作流程
7.胚胎分割 无性繁殖或克隆
1.下列有关细胞工程的叙述正确的有④⑥。
①将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(2021·江苏卷，11D)
②单克隆抗体制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合。(2021·山东卷，15B)
③植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。(2021·江苏卷，5D)
④经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防。(2021·辽宁卷，3D)
⑤动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。(2021·浙江1月，18B)
⑥胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养。(2020·江苏卷，23D)
2.下列有关胚胎工程的叙述正确的有①②。
①早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体。(2021·江苏卷，11B)
②体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理。(2020·山东卷，14B)
③胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。(2020·山东卷，14C)
④胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。(2018·江苏卷，10C)
⑤利用胚胎分割技术，同卵多胎较同卵双胎成功率更高。(2018·江苏卷，10D)
1.(2021·福建卷，11)科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术流程示意图如下。
下列叙述正确的是( )
A.愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的
B.获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状
C.可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生
D.用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体
答案 D
解析 愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞脱分化形成的，A错误；由于基因的选择性表达和基因间的互作效应，获得的杂种植株不一定能够表现双亲的优良性状，B错误；可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合，但不能诱导细胞壁的再生，C错误。
2.(2022·河北衡水金卷)紫杉醇是一种高效抗癌药物。某团队研究了光照条件对红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响，实验结果如表：
下列叙述正确的是( )
A.愈伤组织生长的原理是植物细胞具有全能性
B.愈伤组织的培养要在无菌条件下进行
C.光照能促进愈伤组织的生长并提高紫杉醇含量
D.培养基中的有机物仅能为愈伤组织提供能量
答案 B
解析 愈伤组织生长时主要进行的是细胞分裂，不能体现植物细胞的全能性，A错误；由表可知，两组接种干重相似，光照条件下收获干重和紫杉醇含量均低于黑暗条件下的，C错误；培养基中的有机物可以为植物细胞提供营养物质和能量，还可以调节渗透压等，D错误。
3.(2022·河南九师联盟)S蛋白是新冠病毒表面的一种抗原蛋白，能引起机体的特异性免疫反应。下图是国产腺病毒载体疫苗的生产流程，该疫苗可以有效预防新冠病毒感染。回答下列问题：
(1)构建重组腺病毒载体基因组需要用到的酶是________________。培养扩增细胞时，细胞常出现贴壁生长现象，分瓶前应____________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)腺病毒疫苗进入人体后，S蛋白基因利用人体细胞的蛋白质表达系统指导S蛋白的合成，其过程是_____________________________________________________
(用文字和箭头表示)。
(3)新冠抗体是人体产生的能直接攻击新冠病毒的蛋白质，直接给患者注射抗体能起到很好的治疗效果。一般可以通过________、细胞培养和蛋白质提取技术制备单克隆抗体。若要制备针对新冠病毒的单克隆抗体，需要用________多次注射小鼠，之后再从小鼠脾脏中分离出________，与小鼠骨髓瘤细胞共同制备杂交瘤细胞。要得到满足生产需要的杂交瘤细胞至少需要筛选________次。
答案 (1)限制酶和DNA连接酶 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散细胞，并加入新培养液配成细胞悬液
(2)S蛋白基因的cDNAeq \(――→,\s\up7(转录))mRNAeq \(――→,\s\up7(翻译))S蛋白
(3)(动物)细胞融合 S蛋白 已免疫的B淋巴细胞 2
4.(2022·河北衡水金卷)胚胎干细胞在揭示人与动物的发育机制、药学研究、细胞替代治疗及基因治疗中有着广阔的应用前景。不同物种、不同胚胎之间存在较大的差异，不同物种胚胎干细胞的建系方法和培养条件也各不相同，研究人员对阿尔巴斯白绒绵羊胚胎干细胞的培养条件开展了相关研究。回答下列问题：
(1)通过体内受精获得胚胎干细胞的过程中，应对处于发情期的阿尔巴斯白绒母绵羊注射促性腺激素，目的是_____________________________________________。
选用优质公羊与其交配，48～80 h后，从母绵羊的________(部位)冲卵回收得到早期胚胎。
(2)培养羊早期胚胎前先取小鼠的成纤维细胞制备饲养层细胞，在小鼠的成纤维细胞培养液中加入________可将其从培养瓶的瓶壁上分离下来形成单细胞悬液。
(3)研究人员配制A、B两种胚胎干细胞的培养液时，均添加了100 IU/mL青霉素和0.05 mg/mL链霉素，加入青霉素和链霉素的目的是________________________
_____________________________________________________________________。
(4)若探究机械法(用口吸管将内细胞团切割成小块)、酶消化法、培养液A、培养液B对胚胎干细胞传代培养的影响，请补充完整实验组的处理：实验组1：机械法获取胚胎干细胞＋培养液A；实验组2：___________________________________
_____________________________________________________________________；
实验组3：机械法获取胚胎干细胞＋培养液B；实验组4：______________________
_____________________________________________________________________。
答案 (1)促进母绵羊排出更多卵细胞(超数排卵)，以便获得多枚胚胎 输卵管
(2)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)
(3)抑制微生物的生长繁殖，避免培养过程中出现杂菌污染
(4)酶消化法获取胚胎干细胞＋培养液A 酶消化法获取胚胎干细胞＋培养液B
微专题2 基因工程(含PCR技术)
1.基因工程的基本工具
①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。
2.基因工程的四个操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
①目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
②在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。
③当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
①启动子、终止子
a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。
b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组到一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。
(3)将目的基因导入受体细胞
辨析农杆菌转化法中的“两个两次”
①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的TDNA导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定
3.PCR技术及应用
(1)PCR技术原理与条件
(2)PCR技术的过程
可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
4.蛋白质工程
1.(2021·辽宁卷，4)下列有关细胞内的DNA及其复制过程的叙述，正确的是( )
A.子链延伸时游离的脱氧核苷酸添加到3′端
B.子链的合成过程不需要引物参与
C.DNA每条链的5′端是羟基末端
D.DNA聚合酶的作用是打开DNA双链
答案 A
解析 细胞内DNA复制时，子链延伸方向为5′→3′，故游离的脱氧核苷酸添加到3′端，A正确；子链的合成过程需要引物参与，B错误；DNA每条链的5′端是磷酸基团末端，3′端是羟基末端，C错误；解旋酶的作用是打开DNA双链，D错误。
2.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
答案 D
解析 PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
3.(2022·广东中山市调研)枯草杆菌分泌能力与其信号肽序列有关，位于信号肽序列下游的基因片段表达的蛋白质可分泌至细胞外。人为设计一段中间区域互补的序列，通过“搭桥”PCR可将信号肽基因与纤维素酶基因片段相连接，获得重组DNA片段。过程如图所示。下列相关叙述，正确的是( )
“搭桥”PCR过程图解
A.引物B的3′端和引物C的3′端具有互补序列
B.PCR1产物可以作为图示延伸过程的“长引物”
C.重组PCR产物碱基数量与PCR1过程得到的两种片段碱基数量之和相等
D.重组PCR产物在枯草杆菌表达后，经过内质网和高尔基体的加工，大量分泌到细胞外
答案 B
解析 引物与模板的3′端互补配对，作为子链的5′端，观察图示，引物B的3′端和引物C的5′端应具有互补序列，A错误；观察图示，PCR1过程产生的两种基因片段中引物A和引物D所在的两条单链在3′端有部分互补后，以不互补片段为模板进行子链的延伸，所以两条模板链又可作为彼此延伸过程“长引物”，B正确；重组PCR过程的产物不是两种基因片段直接拼接，而是通过部分互补的引物来进行拼接，重组PCR产物碱基数量少于PCR1过程得到的两种片段碱基数量之和，C错误；枯草杆菌属于细菌，是原核生物，胞内没有内质网和高尔基体，D错误。
4.(2022·重庆一中调研)某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt毒蛋白基因，并将其导入大豆叶肉细胞，培育出抗虫的转基因大豆，主要过程如下。请回答下列问题：
(1)质粒上存在潮霉素抗性基因的目的是_________________________________。
(2)利用PCR技术获取Bt毒蛋白基因的前提是_____________________________，在Bt毒蛋白基因两侧分别添加Hind Ⅲ和BamHⅠ限制酶识别序列，其目的是_____________________________________________________________________。
(3)利用PCR技术扩增Bt毒蛋白基因时，连续扩增5次，形成________个两条链等长的子代DNA，需要________个引物。
(4)构建重组质粒时，要将Bt毒蛋白基因插入启动子和终止子之间的原因是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)将重组质粒导入农杆菌时，需要用________处理农杆菌，使其转化为感受态细胞。过程③筛选具有抗虫能力的大豆，从分子水平上检测Bt毒蛋白基因是否翻译的方法是_____________________________________________________________。
答案 (1)便于重组DNA分子的筛选 (2)根据Bt毒蛋白基因两端的核苷酸序列设计引物 使Bt毒蛋白基因与质粒定向拼接 (3)22 62 (4)保证Bt毒蛋白基因能够在大豆细胞中准确表达 (5)Ca2＋ 抗原—抗体杂交
解析 (1)潮霉素抗性基因属于标记基因，其目的是便于重组DNA分子的筛选。(2)PCR获取目的基因的前提是根据Bt毒蛋白基因两端的核苷酸序列设计引物，在Bt毒蛋白基因两侧分别添加Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制酶识别序列，可确保Bt毒蛋白基因与质粒定向拼接。(3)PCR连续扩增5次，经过5次扩增后，得到的DNA总数是25＝32(个)，其中只含有一种引物的DNA分子有两个，含有两种引物且不等长的DNA分子共有2×5－2＝8(个)，则共有2＋8＝10(个)DNA分子两条链不等长，故两条链等长的DNA分子数是32－10＝22(个)。扩增5次后可获得64条DNA单链，除最初的模板链外均含有引物，该过程中至少需要引物的数为64－2＝62(个)。(4)由于Bt毒蛋白基因无启动子和终止子，所以将Bt毒蛋白基因插入到启动子和终止子之间的目的是保证Bt毒蛋白基因能够在大豆细胞中准确表达。(5)将重组质粒导入农杆菌利用的方法是Ca2＋处理法。从分子水平上检测Bt毒蛋白基因是否翻译，其方法是抗原—抗体杂交。
5.(2022·四川绵阳市诊断)研究人员利用一种从鱼体内分离出的抗冻基因，培育出抗冻番茄植株，使得其幼苗的致死低温下降了2 ℃。具体研发过程如下图(其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。回答下列问题：
(1)不用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因的原因是_____________________________，
选择Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割鱼抗冻基因和质粒，而不是只选择Pst Ⅰ一种酶切割抗冻基因和质粒的优点是_______________________________________。
(2)研究人员用Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割抗冻基因和质粒，获得含抗冻基因的重组质粒后，又用不同的限制酶对原质粒和重组质粒进行酶切，获得片段大小如下表：(1 kb＝1 000 bp，1 bp为一个碱基对，注意：DNA片段大小与图中所画比例一致)
由表中数据可知，鱼抗冻基因的长度为________，若不考虑终止密码子，抗冻基因合成的抗冻蛋白最多由________个氨基酸组成。
(3)图中的步骤②为____________，步骤③表示植物组织培养的________________过程。
(4)若鱼抗冻基因整合进二倍体番茄细胞的某一条染色体上(基因型记为Aa)，则通过________________________(答出1种)的方法对抗冻番茄进行处理后获得的后代一定保留有抗冻基因。
答案 (1)Alu Ⅰ酶会破坏鱼抗冻基因 可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化
(2)2.4 kb 800
(3)重组质粒(重组DNA)导入受体(或番茄)细胞 脱分化和再分化
(4)营养繁殖或植物组织培养或无性繁殖
解析 (1)分析图可知，鱼的抗冻基因中包含了Alu Ⅰ的识别位点，若用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因会破坏鱼抗冻基因，所以不能用限制酶Alu Ⅰ切割鱼抗冻基因。选择Sma Ⅰ和Pst Ⅰ两种限制酶切割鱼抗冻基因和质粒，而不是只选择Pst Ⅰ一种酶切割抗冻基因和质粒的优点是可防止目的基因和质粒反向连接，防止目的基因、质粒自身环化。(2)根据表格数据分析，原质粒长7.7 kb，两种限制酶切割后得到的片段为2.3 kb、5.4 kb，重组质粒长＝3.0 kb＋4.8 kb＝7.8 kb，结合质粒上的限制酶切割位点分析可得目的基因(抗冻基因)的长度＝7.8 kb－5.4 kb＝2.4 kb。若不考虑终止密码子，结合基因、mRNA和蛋白质的基本单位的数量关系可得组成抗冻蛋白的氨基酸数＝2.4×1 000÷3＝800。(3)图中步骤②表示将重组质粒(重组DNA)导入受体细胞的过程，步骤③表示植物组织培养的脱分化和再分化过程。(4)营养繁殖属于无性繁殖，可以保持亲本的优良性状，亲子代基因型不变，因此后代一定保留有抗冻基因，所以利用营养繁殖方法，或者利用植物组织培养技术可以使后代一定保留有抗冻基因。
专题强化练光照条件
接种干重/(g·L－1)
收获干重/(g·L－1)
紫杉醇含量/%
光照
4.33
9.13
0.007 0
黑暗
4.38
12.10
0.016 4
细胞类型
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射技术
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
使用最广泛的是大肠杆菌
限制酶
Alu Ⅰ
Sma Ⅰ和Pst Ⅰ
原质粒
7.7 kb
2.3 kb、5.4 kb
重组质粒
3.0 kb、4.8 kb
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