2023届高考生物二轮复习微生物工程学案 （不定项）

考点1　微生物工程

利用乳酸菌发酵制作酸奶或泡菜，利用酵母菌、醋酸菌分别制作果酒和果醋等传统发酵技术，都离不开微生物的发酵，微生物的培养与分离是微生物工程的重要组成，工业化大规模生产发酵产品需要通过发酵工程来实现。

(对照课本回顾主干知识)

重要概念1　获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础

[例1]　幽门螺杆菌(能分解对热不稳定的尿素)是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病菌。为从带菌者胃黏膜样本中分离出该细菌，相关实验步骤和方法不合理的是(　　)

A.配制培养基并灭菌后，需要加入无菌尿素

B.应设置未接种的培养基，作为实验的对照

C.统计样本中活菌数量时，可用划线法接种

D.可利用酚红指示剂对培养的菌落进行鉴定

答案　C

解析　因为幽门螺杆菌能以尿素(对热不稳定)作为氮源，因此，配制培养基并灭菌后，需要加入无菌尿素，A正确；在培养过程中，可设置一个未接种的培养基作为对照组，证明培养过程中没有杂菌污染，B正确；样品中活菌数量统计时，接种方法应采用稀释涂布平板法，C错误；酚红指示剂可用于鉴定尿素分解菌，D正确。

[例2]　黑茶是利用微生物的酶促进茶多酚氧化的发酵茶。研究人员对黑茶中的微生物进行了分离和鉴定，过程如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　)

A.向样品中加入蒸馏水制成样品悬液

B.可根据菌落特征对菌种进行初步鉴定

C.对菌落进行计数时要选菌落数为30～300的平板进行计数

D.该过程中用于涂布、划线的平板中应包含碳源、氮源、水、无机盐及琼脂等成分

答案　A

解析　向样品中加入无菌水制成样品悬液，A错误。

[例3]　(不定项)(2022·北京东城高三期末改编)在土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验中，某培养基上没有生长菌落，某同学分析了出现上述现象的原因，其中合理的是(　　)

A.培养基中含葡萄糖

B.土壤样品稀释倍数过大

C.培养时间过短

D.涂布器灼烧后立刻接种

答案　BCD

[例4]　(2021·辽宁适应性测试改编)微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。回答下列问题：

(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是________________________________________________________________________________________________________________。

(2)若要使菌落能在A平板上生长，下列培养基组分中最合理的是________(填“甲”“乙”或“丙”)，原因是___________________________________________________________。

培养基组分

(3)培养基配制完成后需要立即进行灭菌，常用的灭菌方法为____________。

(4)根据D的染色结果，可判断B平板中的________(填图中数字)是产油脂芽孢杆菌的菌落。

答案　(1)土壤微生物数量较多，菌液浓度较大，如直接接种，菌落密集，在固体培养基表面无法形成单菌落，对土壤菌液进行系列梯度稀释是为了在固体培养基表面形成单菌落

(2)甲　培养基甲含有碳源、氮源、水、无机盐这几类营养物质，且加入了琼脂作为凝固剂，可以达到实验效果

(3)高压蒸汽灭菌法

(4)3

解析　(2)培养基甲含有碳源、氮源、水、无机盐这几类营养物质，且加入了琼脂作为凝固剂，可以达到实验效果；培养基乙不含牛肉膏、蛋白胨(氮源)，不合理；培养基丙不含凝固剂(琼脂)，无法形成固体培养基，无法在培养基表面形成菌落。

(4)苏丹黑B可将脂类物质染成黑色，而C又是B平板上菌落的原位影印，对照实验结果可知，平板B中的3是产油脂芽孢杆菌的菌落。

[例5]　某湖泊中存在有环境污染物M(一种含有C、H、O、N的有机物)难以降解。生物兴趣小组查阅资料发现有一些细菌能够降解M。因此，他们准备从该湖泊的淤泥中分离出能高效降解M的细菌菌种。请你参与他们的科学实践活动。

(1)为了从该淤泥中分离获得能降解M的细菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：

注：“＋”表示有，“－”表示无。

据表判断，________培养基不能用于分离和鉴别能降解M的细菌，原因是______________________________________________________。

(2)纯化降解M的细菌菌种时，发现划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落的操作失误可能是____________________________________________。

(3)采用稀释涂布平板法接种在适宜的选择培养基培养后，若细菌能分解M，培养平板会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。应选择的菌种是________。简述理由：___________________________________。

答案　(1)甲　培养基甲不含琼脂，是液体培养基，不能用于分离单菌落

(2)接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始

(3)细菌Ⅰ　细菌Ⅰ的H/C值大，说明细菌Ⅰ分解M的能力更强

解析　(2)平板划线法操作时要求将灼热的接种环冷却后再划线，否则会灼伤菌株甚至导致菌株死亡，划线时要从上一次划线的末端开始，这样接种环上才有菌株，根据题意可知，第一划线区域的划线上都长满了菌落，而第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，可能的原因有：①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始。

(3)H/C值越大，降解M的能力越强，根据表中数据可知，细菌Ⅰ降解M的能力比细菌Ⅱ高，因此应选择的菌种是细菌Ⅰ。

[练]　写出“微生物的基本培养技术”的3～4个专业术语。

答案　制备培养基、固体培养基、菌落、消毒、灭菌、接种、平板划线法等。

重要概念2　发酵工程为人类提供多样的生物产品

[例6]　(2022·山东青岛一模)某同学尝试自己制作酸菜，制作时向酸菜坛中加入了一些“陈酸菜水”，用质量分数为5%的食盐水进行腌制，并在不同的腌制时间测定了酸菜中亚硝酸盐的含量。下列说法错误的是(　　)

A．加入“陈泡菜水”的目的是提供乳酸菌

B．酸菜“咸而酸”的原因是食盐和乳酸所致

C．制作酸菜时，乳酸菌繁殖会导致坛内长出一层菌膜

D．不同的腌制时间，酸菜中亚硝酸盐的含量可能相同

答案　C

解析　泡菜坛里的菌膜通常是酵母菌繁殖导致的，不是乳酸菌繁殖导致的，C错误；酸菜腌制过程中，亚硝酸盐的含量是先增加后降低，因此在不同的腌制时间，酸菜中亚硝酸盐的含量可能相同，D正确。

[例7]　下列关于传统发酵技术的叙述正确的是(　　)

A．乳酸菌无氧呼吸不产生气体，故制作泡菜时无需频繁放气

B．酵母菌无氧呼吸产生酒精，故制作果酒过程中应始终密闭

C．醋酸菌无线粒体不能进行有氧呼吸，故制作果醋时应密闭

D．制作腐乳时在豆腐上接种了毛霉，故豆腐上不含其他微生物

答案　A

解析　制作泡菜时要用到乳酸菌，乳酸菌是厌氧菌，发酵产生乳酸，故制作泡菜时无需频繁放气，A正确；酒精发酵时应该先通气后密封，先通气的目的是让酵母菌进行有氧呼吸而大量繁殖，而密封的目的是让酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，且发酵过程中需间歇性进行放气，B错误；果醋发酵所用醋酸菌是原核生物，无线粒体，但能进行有氧呼吸，制作果醋时应通气，C错误；腐乳的制作过程中多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉，而且传统发酵中制作腐乳时的微生物是自然环境中的，不是人为接种的，D错误。

[例8]　(2022·北京海淀一模)啤酒发酵依赖于发酵工程，产品质检可应用“电子舌”，电子舌可根据不同滋味信号传感器呈现的响应值对啤酒风味进行评价，结果如图。下列相关叙述不正确的是(　　)

A．啤酒主要经酵母菌和乳酸菌发酵制成

B．发酵原料应含有糖类作为发酵菌种的碳源

C．发酵液L1和L2口味相似，而L3涩味较强

D．菌种选育可依赖于突变筛选或转基因技术等

答案　A

解析　啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌无氧呼吸将糖类分解为酒精而制成的，A错误。

[例9]　(不定项)苹果醋是以苹果为原料经甲、乙两个阶段发酵而成的，如图所示。下列说法正确的是(　　)

A．甲阶段的发酵温度低于乙阶段的发酵温度

B.根据醋酸菌的呼吸作用类型，乙过程需要在有氧条件下完成

C．过程①在酵母菌细胞的细胞质基质进行，②③在线粒体进行

D．醋酸菌可直接将葡萄糖分解产生乙醛，再将乙醛变为乙酸

答案　AB

解析　甲为果酒发酵，乙为果醋发酵，甲阶段的发酵温度(18～30 ℃)低于乙阶段的发酵温度(30～35 ℃)，A正确；醋酸菌为好氧菌，故根据醋酸菌的呼吸作用类型，乙过程需要在有氧条件下完成，B正确；过程①是细胞呼吸第一阶段，过程②是酵母菌无氧呼吸第二阶段，在酵母菌细胞的细胞质基质进行，③是有氧呼吸第二、三阶段在线粒体进行，C错误；醋酸菌如果在糖源充足的情况下，可以直接将葡萄糖变成乙酸，在缺少糖源的情况下，先将乙醇变成乙醛，再将乙醛变成乙酸，D错误。

[例10]　(不定项)(2022·山东实验中学高三第三次诊断)下列关于利用大麦工厂化生产啤酒中糖化环节的叙述，正确的是(　　)

A．糖化前应将干燥的麦芽碾磨，以使淀粉酶与淀粉接触更充分

B．糖化罐中的温度应控制在淀粉酶的最适温度左右

C．糖化的本质就是淀粉酶水解淀粉形成糖浆的过程

D．糖化后应进行蒸煮，以终止淀粉酶的作用并对糖浆消毒

答案　ABCD

解析　大麦种子发芽会释放淀粉酶，为了使淀粉酶与淀粉接触更充分，应将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉，A正确；酶在最适温度下催化效率最高，故糖化罐中的温度应控制在淀粉酶的最适温度左右，B正确；糖化的本质就是酶促反应，即淀粉酶水解淀粉形成糖浆的过程，C正确；蒸煮的目的是终止淀粉酶的进一步作用，并对糖浆进行消毒(或灭菌)，D正确。

[例11]　(2021·全国乙卷)工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品的过程。利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。

回答下列问题：

(1)米曲霉发酵过程中，加入大豆、小麦和麦麸可以为米曲霉的生长提供营养物质，大豆中的________可为米曲霉的生长提供氮源，小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供________。

(2)米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的________、________能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和________。米曲霉发酵过程需要提供营养物质、通入空气并搅拌，由此可以判断米曲霉属于________(填“自养厌氧”“异养厌氧”或“异养好氧”)微生物。

(3)在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于________(填“真核生物”或“原核生物”)；添加的酵母菌在无氧条件下分解葡萄糖的产物是______________。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，据图分析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是____________________(答出1个即可)。

答案　(1)蛋白质　碳源

(2)蛋白酶　脂肪酶　氨基酸　异养好氧

(3)原核生物　酒精和二氧化碳　酒精、乳酸、食盐(答1个即可)

解析　(1)大豆中含有丰富的蛋白质，可为微生物的生长繁殖提供氮源。小麦中的淀粉可以为微生物的生长繁殖提供碳源。

(2)米曲霉在发酵过程中产生的蛋白酶能将蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，产生的脂肪酶能将脂肪分解为甘油和脂肪酸，使发酵的产物具有独特的风味。米曲霉发酵时需要利用现有的有机物和氧气，说明其代谢类型是异养好氧型。

(3)乳酸菌没有核膜包被的细胞核，属于原核生物。酵母菌属于兼性厌氧型微生物，既可以进行有氧呼吸，也可以进行无氧呼吸，无氧呼吸的产物是酒精和二氧化碳。在发酵池中酵母菌产生的酒精能抑制杂菌的生长，乳酸菌产生的乳酸使发酵液呈酸性也能抑制杂菌的生长，同时往发酵池中添加的食盐也能抑制杂菌的生长。

[例12]　(2021·广东选择性考试)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖)为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。

回答下列问题：

(1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为__________，并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用________________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有____________________等(答出两种方法即可)。

(2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是_____________________________。(答出两点即可)

(3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中________可能是高密度培养的限制因素。

(4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌____________________________。

答案　(1)唯一碳源　稀释涂布平板　诱变育种、基因工程育种

(2)盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制

(3)氧气(O2或溶解氧)

(4)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等

解析　(1)根据题意分析，该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源，并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用稀释涂布平板的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。

(3)分析题意，扩大培养时，营养物浓度、温度、pH等条件适宜，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中氧气不足，使菌种进行无氧呼吸产生乙醇，即氧气(O2或溶解氧)是限制高密度培养的重要因素。

(4)根据酶的专一性可知，菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。

[练]　谈谈以大豆为原料，利用黑曲霉可制备酱油的基本环节。

答案　选育黑曲霉菌种、扩大培养、培养基配制、灭菌、接种、发酵、产品分离、提纯(获得酱油)。

长句应答

例1　(2021·湖南适应性考试改编)研究人员欲从土壤中筛选高淀粉酶活性的细菌(目标菌)，并对其进行研究。回答下列问题：

(1)在细菌筛选过程中，将土壤样品稀释液接种至以________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，除碳源外，该培养基还含有氮源、水、无机盐和____________。

(2)进行微生物菌种纯化时，为得到单菌落，最常用的两种接种方法是________________。

(3)从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上出现了A、B和C三种菌落(如图1所示)。如果要得到淀粉酶活力最高的菌株，应该选择________(填“A”“B”或“C”)菌落进一步纯化。A菌落经检测其为硝化细菌，据此说明A菌落能在此培养基上生长且没有形成透明圈的原因是____________________________________________。

(4)在研究过程中获得了三种淀粉酶，其酶活性与反应温度和pH值有关(如图2和图3所示)，假如要选择一种耐酸耐高温的淀粉酶进行后续研究，应该选择淀粉酶________(填“甲”“乙”或“丙”)，理由是______________________。

答案　(1)淀粉　琼脂(凝固剂)

(2)稀释涂布平板法和平板划线法

(3)B　硝化细菌为自养菌，不能产生淀粉酶利用淀粉，能够利用空气中的二氧化碳合成有机物

(4)丙　淀粉酶丙的最适温度最高，最适pH最低，且为酸性

解析　(3)分析题图可知，从土壤中筛选目标菌时，加碘液染色后，平板上B菌落的透明圈最大说明B菌产生的淀粉酶活力最高，故应该选择B菌落进一步纯化。

(4)分析题中曲线可知，三种淀粉酶中，丙的最适温度为72 ℃，比甲、乙的最适温度高，最适pH是3，比甲、乙的最适pH低，故要选择一种耐酸耐高温的淀粉酶进行后续研究，应该选择淀粉酶丙。

[练1－1]　研究人员以猕猴桃鲜果为原料，在发酵前期通过带皮和去皮两种方法酿制果醋，并对其品质进行分析对比，以探究果醋酿造的新思路，实验流程如下图所示：

(1)为提高果汁的出汁率和澄清度，在步骤②后应加入________________处理材料。

(2)果醋酿制一般是在酒精发酵的基础上再进行乙酸发酵，其中的原理是__________________________________________________________________。

(3)进行酒精发酵的微生物主要是________，代谢类型为________________。当发酵罐液面平静无气泡产生时，酒精发酵停止，再向发酵液中接种醋酸菌并在________条件下继续发酵，此阶段发酵液pH的变化趋势为________________________。

(4)猕猴桃含有的多酚、黄酮具有减肥降脂、降血糖的功效，发酵后其含量直接关系果醋的品质。研究人员测定了带皮发酵和去皮发酵前后总酚和总黄酮的含量，结果如下图所示：

上述实验结果说明________(填“带皮”或“去皮”)发酵可作为果醋发酵的新思路，请综合上述实验结果及你对发酵成本的考虑阐述理由：________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(至少写出两点)。

答案　(1)纤维素酶和果胶酶

(2)醋酸菌在缺少糖源但氧气充足的条件下可将乙醇逐步氧化为乙酸(合理即可)

(3)酵母菌　异养兼性厌氧型　有氧　先下降最后保持稳定(或逐渐降低)

(4)带皮　带皮发酵的果醋总酚和总黄酮等有效成分的含量明显高于去皮发酵，品质更胜一筹；带皮发酵对原料利用更加充分，提高经济效益；带皮发酵不丢弃果皮，产生垃圾少，减少垃圾处理的成本等(合理即可)

[练1－2]　(2022·北京西城高三期末)随着膳食营养的丰富，血清总胆固醇含量高的人数逐年增加。研究人员拟从酸笋发酵液中筛选能降解胆固醇的乳酸菌，为开发降胆固醇功能产品提供益生菌。

(1)胆固醇属于________类有机物。

(2)传统酸笋发酵中水封腌制的目的是________________________。将酸笋发酵液稀释后用________法接种到含有CaCO3的固体培养基上，以________(填选项前字母)为最佳指标，初步分离出目标菌株。

A．菌落直径大小

B．溶钙圈大小

C．溶钙圈直径与菌落直径的比值

(3)通过观察菌落的________，初步鉴定为乳酸菌。为进一步鉴定类群，扩增其16S rDNA序列并测序，从________水平确定其为植物乳杆菌。再从中筛选出降解胆固醇能力最强的菌株L。

(4)科研人员研究不同碳源和温度对菌株L降解胆固醇的影响，结果如下图。

根据上述结果，有人认为可确定菌株L适合开发为人体降胆固醇的功能性菌剂，有人认为不能确定，请评价这两种观点。

答案　(1)脂质(固醇)

(2)为乳酸菌发酵提供无氧条件　涂布　C

(3)形态特征　分子

(4)均有道理但不全面。结果显示菌株L降解胆固醇的最优碳源是人体内含量多的葡萄糖，最适温度是人体体温，但缺乏安全性评估等结果。

实验探究

例2　(2022·全国乙卷，37)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。

回答下列问题。

(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有__________________________(答出2点即可)。

(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要______________________________(答出2点即可)等营养物质。

(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是____________。

(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是____________________________________(答出1点即可)。

第(4)题为写实验思路类题，为高考常考题型。解答此类题目时，应先分析题目中的实验目的，以确定实验的变量，设置出对照组和实验组。

1．实验目的：以制糖废液作为碳源，进一步确定生产S的最适碳源浓度。

2．确定实验变量

3．设置对照组和实验组

由于该实验为对比实验，设置一系列不同浓度制糖废液接种等量菌株C即可。

4．语言描述：包括实验中自变量、无关变量如何处理，因变量是如何检测的。

答案　(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌

(2)葡萄糖　制糖废液　氮源、无机盐、生长因子

(3)菌株C中缺少淀粉酶

(4)分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度

(5)减少污染、节省原料、降低生产成本

解析　(2)由实验结果可知，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量最高，说明最适于菌株C生产S的碳源是制糖废液。

(4)要确定生产S的最适制糖废液的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，因变量是S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。

[练2－1]　(2021·河北选择性考试改编)葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣(皮渣)。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。

回答下列问题：

(1)为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为________个。

(2)皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至____________性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是________________________________________________________________。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为________。

(3)皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(简要写出实验步骤和预期结果)

答案　(1)8.8×107

(2)中性或弱碱　使培养基不透明，从而使醋酸菌菌落周围出现透明圈　碳源

(3)实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小。

预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落

解析　(1)为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则三个平板中平均菌落数为(78＋91＋95)÷3＝88，每克皮渣中微生物数量为88÷0.1×104×100÷10＝8.8×107个。

(2)醋酸菌属于细菌，制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至中性或弱碱性，灭菌后在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙可使培养基不透明，醋酸菌产生的醋酸可分解碳酸钙，产生透明圈，根据这一特点可筛选出醋酸菌，在缺少糖源的液体培养基中醋酸菌以乙醇为碳源，先把乙醇氧化为乙醛，再把乙醛氧化为乙酸。

(3)醋酸菌为好氧菌，与兼性厌氧型的乳酸菌菌落形态相似，且二者产生的代谢产物均可使碳酸钙分解，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌，可将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小。若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。

[练2－2]　(2017·全国卷Ⅱ)豆豉是大豆经过发酵制成的一种食品。为了研究影响豆豉发酵效果的因素，某小组将等量的甲、乙两菌种分别接入等量的A、B两桶煮熟大豆中并混匀，再将两者置于适宜条件下进行发酵，并在32 h内定期取样观测发酵效果。回答下列问题：

(1)该实验的自变量是________、________。

(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是________。

(3)如果在实验后，发现32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系，则无法确定发酵的最佳时间；若要确定最佳发酵时间，还需要做的事情是___________________________________________________。

(4)从大豆到豆豉，大豆中的成分会发生一定的变化，其中，蛋白质转变为____________，脂肪转变为__________________。

答案　(1)菌种　发酵时间

(2)好氧菌

(3)延长发酵时间，观测发酵效果，最好的发酵效果所对应的时间即为最佳发酵时间

(4)氨基酸和肽　脂肪酸和甘油

解析　(1)由“甲、乙两菌种”和“32 h内定期取样观测”可知，该实验的自变量是菌种和发酵时间。

(2)由“发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好”可知，该发酵菌是好氧菌。

(3)因“32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系”，说明发酵的最佳时间可能超过32 h，故可延长发酵时间，定期取样观测发酵效果，以确定最好的发酵效果所对应的时间，此时间即为最佳发酵时间。

(4)发酵菌种能产生蛋白酶和脂肪酶，蛋白酶能催化蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸，脂肪酶能催化脂肪分解为甘油和脂肪酸。

[练2－3]　(2019·全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。

(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。

(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是___________________________________________________。

(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即___________________________________________________。

(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。

①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。

②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明__________________________________________。

答案　(1)W

(2)乙　乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W

(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源

(4)①缓冲液　②缓冲液不能降解W　酶E与天然酶降解W的能力相近

解析　(1)物质W是一种含氮有机物，要分离能够降解物质W的细菌，需用以物质W为唯一氮源的选择培养基进行筛选。

(2)由题图可知，甲菌落周围没有透明圈，说明甲菌不能降解物质W，乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解物质W，故要得到目标菌，应选择乙菌落进一步纯化。

(3)要鉴定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，则培养基中不能添加氮源，所以将甲、乙菌分别接种在无氮源的培养基上(其他条件相同且适宜)，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。

(4)实验目的是比较天然酶和酶E降解物质W的能力，做实验时要设计空白对照实验，所以C处应滴加缓冲液。C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解物质W，A、B处透明圈的出现说明物质W被降解，若两个透明圈直径大小相近，则说明酶E与天然酶降解物质W的能力相近。

[练2－4]　(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。

实验所用的培养基成分如下。

培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。

培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。

操作步骤：

①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；

②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。

回答下列问题。

(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成______________________(答出2种即可)等生物大分子。

(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。

(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是____________________________________。

答案　(1)石油　DNA、RNA、蛋白质

(2)N0·2n

(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力

(4)A　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长

解析　(1)培养基一般都含有碳源、氮源、无机盐和水等营养物质，从组成培养基的物质所含化学元素可知，只有石油含有碳元素。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。

(3)由表格分析可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路即可。

(4)由表格分析可知，在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力大于B菌株，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解石油，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株。