高考生物一轮复习考点一遍过考点80 PCR技术(含解析)

考点80  PCR技术

高考频度：★★☆☆☆     难易程度：★★★☆☆

1．PCR原理

（1）细胞内DNA复制条件

（2）细胞内DNA复制过程

①DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸。

②在DNA的复制过程中，复制的前提是双链解开。在体外可通过控制温度来实现。在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来耐高温的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。

③PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

2．PCR的反应过程

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。

3．实验操作

（1）PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定的DNA聚合酶、两种RNA引物、水。

（2）实验操作步骤

①按照PCR反应体系配方配制反应液；

②将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5 mL）中；

③将微量离心管放到PCR仪中；

④设置PCR仪的工作参数；

⑤DNA在PCR仪中大量扩增。

考向  PCR的反应过程

1． PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成

C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸

D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高

【参考答案】C

【试题解析】PCR技术变性过程中是通过高温破坏DNA分子内碱基对之间的氢键，进而使DNA分子解链，该过程在细胞内是通过解旋酶实现的，A项正确；复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，B项正确；PCR反应的产物是DNA，所需原料应为四种脱氧核苷酸，所以，延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种脱氧核苷酸，C项错误；PCR过程所需的酶是耐高温的DNA聚合酶，比细胞内DNA复制过程所需的DNA聚合酶的最适温度高，D项正确。

2．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是

A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物

D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16

【答案】D

【解析】用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物（两种），但不必知道基因的全部序列，A正确；设计引物时，需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，B正确；退火的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此退火温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。

1．有关PCR技术的说法，不正确的是

A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术

B．PCR技术的原理是DNA双链转录

C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列

D．PCR扩增中不需要解旋酶解开双链DNA

2．下列有关PCR技术的说法，不正确的是

A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术

B．PCR技术的原理是DNA双链复制

C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列

D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA

3．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是

A．94 ℃、55 ℃、72 ℃ 

B．72 ℃、50 ℃、92 ℃

C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ 

D．80 ℃、50 ℃、72 ℃

4．用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，x为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的

A． B． C． D．

5．下列有关PCR技术中引物的叙述，正确的是

A．引物是一小段DNA分子或双链RNA分子

B．扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目

C．两种引物之间能够发生碱基互补配对

D．DNA聚合酶只能从引物的5＇端连接脱氧核苷酸

6．用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，x为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的

        A．          B．

C．       D．

7．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中：1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水，PCR过程中加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析不合理的是

A．PCR产物的分子大小在250~500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株

D．10号可确定反应体系等对结果没有干扰

8．根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物（单链DNA)。引物与该基因变性DNA(单链DNA)结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度）测定结果，下列叙述错误的是

A．通常引物1和引物2不能有碱基互补配对关系
B．两引物分别是子链延伸的起点，并可以反复利用
C．若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的GC含量较高

D．复性所需温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度等因素

9．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是

A．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
B．催化①过程的酶是DNA聚合酶
C．催化①②⑤过程的酶都必须能耐高温

D．过程③需要解旋酶

10．在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。

（1）在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。__________________。

（2）在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。________。

（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：________，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。

（4）PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利用了DNA的________原理解决了这个问题。

（5）在对样品DNA分析过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是___________________。

11．（2019全国卷Ⅰ·38）

基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。

（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。

（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。

12．（2018·江苏卷）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的＿＿＿＿端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中＿＿＿＿＿＿＿的设定与引物有关，＿＿＿＿＿＿＿＿的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）

①变性温度  ②退火温度  ③延伸温度   ④变性时间  ⑤退火时间  ⑥延伸时间

（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含＿＿＿个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有＿＿种。

（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：

根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为＿＿＿＿＿＿。

13． (2016·天津卷)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。

（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。

（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。

A．人血细胞启动子  B．水稻胚乳细胞启动子  C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子

（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_____________________。

（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。

（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。

1．【答案】B

【解析】AB项、PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链复制，故A项正确，B项错误；C、利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C项正确；D、PCR扩增中首先要使目的基因DNA受热变性后解链为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，故D项正确。

2．【答案】D

【解析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，A正确；PCR技术以解开的双链作为模版，利用的原理是DNA双链复制，B正确；前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物，C正确；双链DNA模板在高温作用下，氢键断裂，形成单链DNA，可见该过程不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。

3．【答案】A

【解析】标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，其中变性需要高温使DNA解螺旋，温度为90～96℃；复性是在较低温度下，两种引物和DNA单链想结合，温度为50℃左右；延伸为在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链，温度为70～75℃。综上所述，A正确，B、C、D错误。

4．【答案】D

【解析】利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5′端到3′端，据此依题意和图示分析可知，A、B、C均错误，D正确。

5．【答案】B

【解析】引物是一小段单链DNA或RNA，可与DNA母链通过碱基互补配对进行结合，A错误；扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目，B正确；引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合，两种引物之间不能发生碱基互补配对，C错误；DNA聚合酶只能从引物的3＇端连接脱氧核苷酸，D错误。

6．【答案】D

【解析】利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5′端到3′端，据此依题意和图示分析可知，A、B、C均错误，D正确。

7．【答案】B

【解析】PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。

8．【答案】B

【解析】通常引物1和引物2不能有碱基互补配对关系，以免二者结合，A项正确；两引物参与构成子链，不能反复利用，B项错误；若两引物的脱氧核苷酸数相同，引物2的熔解温度较高，推测其GC含量较高，C项正确；结合以上分析可知，复性所需温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度等因素，D项正确。

9．【答案】A

【解析】分析题图：图示为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图，其中①是由RNA形成单链DNA的过程，为逆转录过程；②是由单链DNA合成双链DNA的过程，是DNA分子复制过程；③④⑤是多聚酶链式反应扩增DNA片段，其中③是变性、④是复性、⑤是延伸阶段。④为复性过程，发生的变化是引物与互补DNA链结合，A正确；①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，B错误；图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶不耐高温，C错误；过程③为高温解链，该过程不需要解旋酶，D错误。

10．【答案】（1）5′—G—A—OH(或HO—A—G—5′)   

（2）

（3）每个DNA分子各有一条链含32P    1/2n

（4）DNA解旋   热变性

（5）蛋白酶

【解析】（1）由图可知，引物Ⅱ为5’-G-A-OH。（2）循环一次后生成的DNA分子如下：。（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，根据DNA半保留复制特点可知，循环一次后，每个DNA分子各有一条链含32P，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为2/2n+1=1/2n。（4）PCR反应过程的前提条件是DNA解旋，PCR技术利用DNA的热变性原理解决了这个问题。（5）在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，根据酶的专一性原理，要去除这些组蛋白可加入蛋白酶。

11．【答案】（1）基因组文库    cDNA文库

（2）解旋酶    加热至90~95 ℃    氢键

（3）Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活

【解析】

【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取（基因文库获取、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平—DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平—抗虫、抗病接种实验等）。

【详解】（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库（CDNA文库），前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。

（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。

（3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。

12．【答案】（1）基因组DNA

（2）5’　　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连

（3）②　　⑥

（4）8　　13

（5）pH为8.5，缓冲液为50mmol/LTris-HCl

【解析】（1）α-淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。（2）目的基因与运载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3’端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5’端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。（3）进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。（4）根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含24÷3=8个密码子；构成mRNA的碱基有4种，若虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有4×4-3=13种。（5）根据表格数据分析可知，在pH为8．5，缓冲液为50mmol/LTris-HCl的条件下，α-淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。

13．【答案】（1）总RNA（或mRNA）

（2）B

（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化

（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工

（5）HSA

【解析】（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过反转录过程进行合成。采用PCR技术扩增HSA基因时，两条引物分别与模板链的5’端结合，扩增方向相反。（2）根据启动子通常具有物种及组织特异性可知，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是水稻胚乳细胞启动子。（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，酚类物质可以吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有生物膜系统。（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与天然的HSA生物学功能一致。