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高考生物一轮复习生物技术实践1微生物的培养和利用课件新人教版选修1
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这是一份高考生物一轮复习生物技术实践1微生物的培养和利用课件新人教版选修1，共60页。PPT课件主要包含了课前自主预习案，无菌技术，实验流程，鉴别纤维素分解菌，高效课堂，课堂总结，网络建构提升，历届真题等内容，欢迎下载使用。
微生物的培养和利用
课前自主预习案
高效课堂
课堂总结
历届真题
课前自主预习案
[基础梳理——系统化]知识点一 微生物的实验室培养1．培养基
氮源
无机盐
液体培养基
鉴别培养基
pH
氧气
2．无菌技术
化学药剂消毒法
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
外来杂菌
3．大肠杆菌的纯化培养
称量
灭菌
平板划线法
甘油管藏法
知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离
酚红
样品稀释
培养观察
以尿素为唯一氮源
稀释涂布平板法
知识点三 分解纤维素的微生物的分离1．实验原理
纤维二糖
CX
葡萄糖苷
刚果红
红色复合物
透明圈
2．实验流程
纤维素
纤维素为唯一碳源
梯度稀释
鉴别纤维素分解菌
透明圈
[基能过关——问题化]一、判一判1．判断关于微生物培养技术相关叙述的正误(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。( )(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。( )(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。( )(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。( )(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。( )
√
×
√
×
√
2．判断关于微生物分离相关叙述的正误(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。( )(2)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。( )(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。( )(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。( )(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。( )
×
×
√
×
×
二、连一连1．无菌技术的主要方法及适用对象(连线)
2．以下几种选择培养基和鉴别培养基及其应用(连线)
三、议一议【教材易漏拾遗】1．微生物的接种技术只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？
不是，微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，接种的核心是防止杂菌污染，以保证培养物的纯度。
2．细菌数目的测定还有哪些方法？试举例说明。
滤膜法。测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法。
3．如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？ (2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？ (3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？
获得效果A的接种方法为稀释涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
火焰附近存在着无菌区域。
4．研究人员在刚果红培养基平板上筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示，将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图2，请分析：
(1)透明圈是如何形成的？ (2)图中透明圈大小代表了什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？
刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，故可形成透明圈。
透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株①。
J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。
高效课堂
考点一 微生物的实验室培养【任务驱动 探究突破】任务1 据某微生物培养基的配方表回答下列问题(1)此培养基按物理性质划分属于______培养基，因为没有凝固剂(如琼脂)；按功能划分属于______培养基，因为没有碳源，只有______微生物才能生长(利用空气中的CO2)。(2)此培养基含有微生物所需的营养成分包括水、______和______三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括______、______和生长因子。
液体
选择
自养型
无机盐
氮源
碳源
氮源
(3)若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂(琼脂)。(4)若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中______成分(填表中序号)，加入______和不含氮元素的有机物。
①
尿素
任务2 据两种接种方法产生的培养效果图完成下列问题(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是______________、____________。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，其最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
稀释涂布平板法
平板划线法
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。
任务3 大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①操作步骤②倒平板的操作方法及注意事项a．写出上图正确的倒平板操作流程：_____________________。b．甲、乙、丙中的灭菌方法是________。c．丁中的操作需要等待________________后才能进行。
称量
灭菌
倒平板
丙→乙→甲→丁
灼烧灭菌
平板冷却凝固
(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：设法在培养基上得到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。②纯化大肠杆菌的关键步骤是________。③常用的微生物接种方法有两种a．平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
接种
连续划线
b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的________，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。系列稀释操作(如下图所示)：涂布平板操作(如下图所示)：
梯度稀释
(3)菌种的保存方法①对于频繁使用的菌种，可以采用________的方法。②对于需要长期保存的菌种，可以采用________的方法。
临时保藏
甘油管藏
【特别提醒】(1)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项①倒平板的适宜温度是50 ℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(2)平板划线操作的注意事项①第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。②灼烧接种环，应待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。③划线时最后一区不要与第一区相连。④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
【考向分类 对点落实】 考向一培养基及其制备方法分析1．[经典模拟]下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是( ) A.从物理性质看，该培养基属于液体培养基；从用途看，该培养基属于选择培养基B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨C．该培养基缺少提供生长因子的物质D．该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
B
解析：分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C错误；对培养基调节完pH后还要进行灭菌处理等操作才能使用，D错误。
2．[2021·安徽省黄山市高三 “八校联考”]蓝白斑筛选是基因工程中筛选重组目的基因常用的一种方法，表现为培养基上出现蓝白颜色的菌落，可以通过颜色为依据直接筛选重组菌。用于筛选的菌为β－半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌中编码β－半乳糖苷酶的部分缺失，不具有生物活性。用于蓝白斑筛选的质粒载体一般含有抗性基因和将宿主菌β－半乳糖苷酶缺失部分补全的序列，在这段序列中还含有多个限制性酶切位点，便于插入目的基因。β－半乳糖苷酶能够作用于一种无色化合物Xgal，使其变成蓝色物质。回答下列问题：(1)玻璃和金属材质的实验器材利用________方法灭菌。(2)培养基灭菌后，需要冷却到____℃左右时，才能倒平板。倒平板后，平板冷凝要将平板倒扣，其原因是________________________________________。
干热灭菌
50
防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
(3)为防止杂菌污染，培养基中要添加________。蓝白斑筛选能成功，是因为培养基中添加了________。(4)最终培养基出现的白色的菌落是( )A．目的基因和载体结合 B．只含目的基因C．只含载体(5)若需要长期保存该菌种，可采用的方法是________。
抗生素
Xgal
A
甘油管藏法
解析：(1)玻璃和金属材质的实验器材可用干热灭菌的方法进行灭菌。(2)培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时才能倒平板。倒平板后，平板冷凝要将平板倒扣，这样做可防止皿盖上的冷凝水落入培养基而造成污染。(3)为防止杂菌污染，培养基中要添加抗生素。β－半乳糖苷酶能够作用于一种无色化合物Xgal，使其变成蓝色物质，蓝白斑筛选能成功，是因为培养基中添加了Xgal。(4)由于用于蓝白斑筛选的质粒载体一般含有抗性基因和将宿主菌β－半乳糖苷酶缺失部分补全的序列，因此最终培养基中出现的白色的菌落是目的基因和载体结合的菌落，故选A。(5)若需要长期保存该菌种，可采用的方法是甘油管藏法。
考向二无菌技术的操作3．[经典模拟]微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，以防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是( )①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒 ④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 ⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌A．①③ B．②④ C．③⑤ D．④⑥
D
解析：无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌的污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常用高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。
4．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )A．接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环C．培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅
解析：灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手和衣着需要消毒处理。高压蒸汽通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
C
考向三大肠杆菌的纯化方法及过程分析5．[2021·甘肃兰州一中高三试题]平板冷却凝固后要将平板倒置，其目的是( )A．利于大肠杆菌的生长B．防止空气进入C．利于培养基的冷却D．防止皿盖冷却水滴入培养基造成污染
解析：平板冷却凝固后将平板倒置是为了防止皿盖冷却后水滴入培养基后造成污染，D正确；此操作的原因不是利于大肠杆菌的生长，A错误；空气仍然可以进入到平板中，B错误；倒置对于培养基冷却没有太大影响，C错误。
D
6．[2021·河南省安阳市高三第一次调研]一个由英国伦敦帝国学院和芬兰图尔库大学的科学家组成的研究小组日前开发出一种通过大肠杆菌制造丙烷的新技术。科研人员欲对大肠杆菌进行研究和利用，首先要纯化大肠杆菌，请结合所学知识，回答下列问题：(1)纯化大肠杆菌首先需要制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，其步骤是计算、称量、溶化、灭菌、________。对培养基进行灭菌的方法是_____________，检验培养基是否有杂菌污染的最有效的方法是________________________________。(2)可以估算出样品中大肠杆菌数量的接种方法是___________，用该方法得到的结果一般比实际值____ (填“偏大”或“偏小”)。
倒平板
高压蒸汽灭菌法
将未接种的培养基放在恒温箱中培养
稀释涂布平板法
偏小
(3)某实验小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是振荡培养能提高培养液中________的含量和营养物质的利用率。使用过的培养基及培养物必须经过________后才能丢弃，以防止培养物扩散。(4)如果要检测食品中是否含有大肠杆菌，需要在培养基中加入________(填物质)，以观察是否出现________(填颜色)的菌落。
氧气
灭菌处理
伊红美蓝
黑色
解析：(1)纯化大肠杆菌首先需要制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，其步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，对培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法。检验培养基有没有被杂菌污染，可选取未接种的培养基与接种样品的培养基同时在恒温箱中培养。如果在培养过程中未接种的培养基没有菌落生长，则说明培养基没有被杂菌污染；若未接种的培养基有菌落生长，则说明培养基被杂菌污染。(2)接种大肠杆菌的最常用方法是平板划线法和稀释涂布平板法，其中可以估算出样品中大肠杆菌数量的是稀释涂布平板法。由于两个或多个细胞连在一起，在平板上观察到的是一个菌落，因而该方法得到的结果一般比实际值偏小。(3)大肠杆菌的培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、溶氧量、酸碱度和渗透压等条件；由于大肠杆菌对人和动物有一定的不利影响，所以对培养基和培养物要灭菌处理后才能丢弃。(4)鉴定大肠杆菌要用伊红美蓝培养基，若出现黑色菌落，则说明食品中有大肠杆菌。
考向四微生物培养与分离的考查7．(多选)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是( )A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
BC
解析：漆酶属于木质素降解酶类，生活污水中含木质素类的物质少，则能降解木质素的产漆酶的微生物较少，故生活污水不是分离产漆酶菌株的首选样品，A错误；产漆酶菌株可降解木质素，筛选培养基中应加入木质素来筛选产漆酶的菌株，可依据漆酶菌株的菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；在涂布平板上挑取的菌落可能含有其他杂菌，可再通过平板划线法进一步分离纯化，C正确；对于需要长期保存的菌株，不适宜在常温下保存，应低温冷冻保存，D错误。
8．(多选)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述不正确的是( )A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
解析：高压蒸汽灭菌加热结束后，应让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物，A错误；倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖，B错误；灼烧接种环之后，要待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种，C错误；皿底的标记不会因为盖子混淆而混淆，D正确。
ABC
解析：高压蒸汽灭菌加热结束后，应让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物，A错误；倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖，B错误；灼烧接种环之后，要待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种，C错误；皿底的标记不会因为盖子混淆而混淆，D正确。
9．(多选)下列关于细菌的叙述，不正确的是( )A．不同种类细菌的生长均需要相同碳源B．常用液体培养基分离获得细菌单菌落C．细菌大量培养过程中，芽孢形成于细菌生长的调整期D．培养基中含有高浓度NaCl有利于金黄色葡萄球菌的筛选
解析：自养型细菌(如硝化细菌)可直接利用空气中的CO2作碳源，异养型细菌(如大肠杆菌)只能利用培养基中现成的有机碳源(如葡萄糖)，A错误；常利用固体培养基分离获得细菌的单菌落，B错误；细菌的生长曲线包括调整期、对数期、稳定期、衰亡期四个阶段，芽孢形成于细菌生长的稳定期，C错误；金黄色葡萄球菌能在含有高浓度NaCl的培养基中正常生长、繁殖，其他微生物则不能，故可用含高浓度NaCl的选择培养基来筛选金黄色葡萄球菌，D正确。
ABC
[题后拓展]1．培养基的配制原则(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等来确定配制的培养基种类。(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH要适宜：真菌为5.0～6.0，细菌所需pH为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，故培养不同微生物所需pH 不同。
2．培养基的营养构成(1)各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。(2)不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
3．微生物和动植物营养要素的比较
考向五微生物实验室培养的拓展应用10．[2018·全国卷Ⅱ，37]在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_____ (填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是___________________。
可以
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
破坏DNA结构
消毒液
氯气
未将锅内冷空气排尽
解析：(1)能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)煮沸消毒法，即在100 ℃时煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢；巴氏消毒法却是在70～75 ℃时煮30 min或在80 ℃时煮15 min，以杀死微生物，并且保证营养物质不被破坏，因此，与煮沸消毒法相比，牛奶消毒常采用巴氏消毒法。巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点是达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。 (3)因紫外线能破坏DNA分子的结构，所以密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。(4)通常乙醇消毒用的是75%的酒精，由于酒精有气味，影响水质，不适宜消毒自来水；高锰酸钾本身有颜色，消毒后溶液呈紫红色，也无法使用；因此水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的。(5)采用高压蒸汽灭菌时，锅内的水加热煮沸，应将其中原有的冷空气彻底排除后才能将锅密闭。如果未将锅内冷空气排尽，则会出现压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度的现象。
11．[经典高考]临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用_______法或__________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。(2)取该单菌落适当稀释，用___________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。
平板划线
稀释涂布(平板)
稀释涂布(平板)
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_____；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明__________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的__________。(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素____。
敏感
不敏感
该致病菌对C的敏感性比对A的弱
耐药菌
A
解析：(1)微生物纯化的方法主要为平板划线法和稀释涂布平板法。(2)根据微生物的特点对菌落进行一系列浓度的稀释，然后用涂布法接种于固体培养基表面，最后置于适宜条件下培养。(3)抗生素是由真菌产生的，可以抑制生长、繁殖或杀死细菌等致病菌的一类物质，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明有抗生素A的地方该致病菌受到抑制；B的周围没有透明圈，说明致病菌对抗生素B不敏感，C的透明圈要比A的透明圈小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；D出现了透明圈，说明该致病菌对D敏感，但是在透明圈上出现一个菌落，又可排除杂菌污染，因此可判断此菌落的微生物对抗生素D产生了耐药性。(4)根据以上分析，为达到抗菌的目的，最好选择抗生素A。
【师说拓展】1.消毒与灭菌比较
2.纯化微生物的接种方法比较
12.[经典高考]有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染，某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以______为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于________培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即______________和______________。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和___________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯______附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
原油
选择
平板划线法
稀释涂布平板法
强
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
火焰
解析：(1)该同学欲筛选能降解原油的菌株，可以将样品稀释液置于以原油为唯一碳源的固体培养基中培养，该培养基在功能上属于选择培养基。(2)菌株的接种方法，常用的有两种：平板划线法和稀释涂布平板法。(3)菌株分解周围的营养物质，出现分解圈，分解圈大说明该菌株的降解能力强。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌；微生物的培养要求进行严格的无菌技术，操作时应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围其他细菌的污染。
考点二 微生物的分离、计数与筛选【任务驱动 探究突破】任务1 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)实验原理①分解尿素的原理土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成________，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到________作用。②筛选菌株的原理微生物的选择培养：在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
脲酶
催化
(2)统计菌落数目的方法①显微镜直接计数法a．原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。b．方法：用血球计数板计数。c．缺点：不能区分死菌与活菌。
②间接计数法(活菌计数法)a．原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。b．操作：(ⅰ)设置重复组，以增强实验的说服力与准确性。(ⅱ)为了保证结果的准确，一般应选择菌落数在30～300的平板进行计数。c．计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。(3)实验流程土壤取样→________→微生物的培养与观察→细菌的________。
样品的稀释
计数
[注意事项](1)在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目，如果某个平板的菌落数与其他组差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。(2)统计的菌落往往比活菌的实际数目低，这是由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
任务2 分解纤维素的微生物的分离(1)实验原理①纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，该复合酶具有催化分解纤维素的作用，其作用过程如下：②筛选原理a．培养基：以________为唯一碳源的选择培养基。b．方法：刚果红染色法。 ，出现________，即可根据是否产生________来筛选纤维素分解菌。
纤维素
红色
透明圈
透明圈
(2)筛选流程土壤取样→________→梯度稀释→将样品涂布到_____________的培养基上→挑选产生________的菌落。①土壤取样：选择富含________的环境。②将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。a．制备鉴别培养基：主要碳源是________。b．刚果红染色法。(ⅰ)先培养________，再加入刚果红进行颜色反应；(ⅱ)________时加入刚果红。③进一步鉴定a．为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还需进行__________的实验。b．测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量测定。
选择培养
鉴别纤维素分解菌
透明圈
纤维素
CMC-Na
微生物
倒平板
发酵纤维素酶
葡萄糖
(3)分离纤维素分解菌的几个关键步骤①分离纤维素分解菌的实验中应先用_________，再用_________。选择培养基为________培养基，以纤维素作为__________的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。②鉴别培养基含琼脂，为________培养基，因为要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落，刚果红染色法应用的就是此种培养基。
选择培养基
鉴别培养基
液体
碳源和能源
固体
任务3 选择培养基的应用实例(1)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长，其目的是培养、分离出特定微生物。
(2)选择培养基的应用实例①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。③培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果，如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，以达到分离能消除石油污染的微生物的目的。⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
【考向分类 对点落实】 考向一微生物分离与计数的考查1．[2021·河北衡水中学高三调考]下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是( )A．分解尿素的细菌能产生脲酶，可将尿素分解产生氮气B．用选择培养基选择出分解尿素的细菌，并杀死其他微生物C．统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数D．用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红
D
解析：分解尿素的细菌能产生脲酶，可将尿素分解为氨和CO2，A错误；用含尿素的选择培养基选择出分解尿素的细菌，其目的是淘汰不能分解利用尿素的其他微生物，B错误；统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在30～300之间的平板进行计数，求其平均值，C错误；用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红，D正确。
2.[2021·四川乐山四校联考]某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，实验过程包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中，正确的是( )A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉B．利用平板划线法对细菌进行分离、纯化并计数C．观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验D．培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为细菌培养提供氮源和碳源
解析：实验用过的带菌培养基要高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境，A错误；应利用稀释涂布平板法对细菌进行分离、纯化并计数，B错误；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，C错误；培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了氮源和碳源，D正确。
D
3．[全国卷Ⅰ，39]已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用__________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用__________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以______为碳源的固体培养基进行培养。(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用___________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用_____________法进行计数。(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，_____℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕____℃设计后续实验。
苏丹Ⅲ
萃取法
油脂
血细胞计数板
稀释涂布平板
45
40
解析：(1)生物组织中的油脂能被苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)染成橘黄色(或红色)。(2)为了筛选出能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，我们应选用只能让该菌落生长的选择性培养基，因此培养基中只能选用油脂作为唯一碳源的固体培养基。(3)血细胞计数板可用于直接计数培养液中的菌体数，但是不分死活，因此要计数活菌数量要通过稀释涂布平板法来计数。(4)温度影响酶的活性，在三个温度中，45 ℃时需酶量最高，说明酶活性最低；在三个温度实验中40 ℃时所需酶量最少，低于35 ℃和45 ℃所用酶量，说明酶的最适温度介于35 ℃和45 ℃之间，因此应围绕40 ℃设计不同温度梯度，以进行后续实验。
4．[全国卷Ⅱ]为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为___________。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过_____灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_______________________________。
检测培养基平板灭菌是否合格
3.8×107
灼烧
将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)示意图A和B中，__________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
B
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中__________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高__________的利用率。
溶解氧
营养物质
解析：(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，应通过随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生长，再进行相互对照。三个培养基上平均菌落数为38，所以每升水样中活菌数为38×10×100×1000＝3.8×107。(2)接种环应用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是：随着划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。(3)A表示平板划线法接种培养后得到的结果，B表示稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)振荡培养可以增加液体培养基中的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，以提高营养物质的利用率。
考向二菌种筛选的拓展应用5．[全国卷Ⅰ]植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
纤维二糖
葡萄糖
红
透明圈
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：注：“＋”表示有，“－”表示无。 据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是__________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________________________________
不能
液体培养基不能用于分离单菌落
不能
培养基中没有纤维素，不会形成CR－纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
【师说拓展】1.筛选微生物的两个实例比较
2.选择培养基与鉴别培养基的比较
6.[2018·江苏卷，31]酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的___，及时对培养基进行分装，并进行_________灭菌。(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
pH
高压蒸汽
50 ℃
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有__________________________。a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
a、b、d
氧气
无
30
解析：(1)配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调节pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)在步骤③中，待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板。 (3)在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a正确；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b正确；分离纯化获得单一菌落，挑取菌落时，应挑取单个菌落，c错误；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d正确。(4)酵母菌通过有氧呼吸可大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本(菌体)总数＝80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于(3×109)÷(1 000×2×104×400÷80)＝30个。
考向三 土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌7．[2021·安徽六安高三月考]分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐A．①③⑤⑧ B．②④⑥⑧C．①③⑤⑦ D．①④⑥⑦
解析：要分离分解尿素的细菌应以尿素为唯一氮源，①正确、②错误；分离土壤中分解尿素的细菌用固体培养基需加入琼脂，③正确，④错误；培养基中需要加碳源即葡萄糖，⑤正确，⑥错误；不需要氮源，故不加硝酸盐，⑦错误，⑧正确；故符合题意的有①③⑤⑧，A正确。
A
8．[2021·广东省广州市执信中学第二次月考]分离筛选降解纤维素能力强的微生物，对于解决秸秆等废弃物资源的再利用和环境污染问题具有重要意义。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、KCl、酵母膏以及水解酪素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。请回答下列问题：(1)培养基中加入的化合物A是________。本实验将样品稀释涂布到鉴别培养基之前要进行选择培养，目的是______________________________。(2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培养基中加入________溶液，等培养基上长出菌落后，能产生纤维素酶的菌落周围会出现________。
纤维素
增加能产纤维素酶的微生物的浓度
刚果红
透明圈
(3)为在培养基表面形成单个菌落，若将平板分为5个区域进行划线，理论上需要灼烧接种环________次。若用稀释涂布平板法进行接种，在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌液量不宜过多的原因是__________________________________________________。
6
培养基表面的菌液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果
(4)用三种菌株对秸秆进行处理，并在第5天和第10天对秸秆和秸秆中含有的纤维素、半纤维素以及木质素等组分的降解情况进行了测定(结果如图)。据图分析可知，三种菌株对____________的降解作用最强。与第5天结果相比，第10天秸秆各组分中________的降解率变化最大。
半纤维素
纤维素
解析：(1)为筛选能够降解纤维素的微生物，培养中应添加纤维素作为唯一碳源的选择培养基，因此培养基中加入的化合物 A 是纤维素。选择培养的目的是为了扩增纤维素分解菌，增加纤维素分解菌的浓度。(2)纤维素分解菌的鉴定需用刚果红，等培养基上长出菌落后，能产生纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。(3)平板划线法进行划线时需要灼烧接种环，第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；之后每一次划线前：杀死残留菌种，保证每一次划线菌种来自上次划线末端；划线结束后，杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。因此将平板分为5个区域进行划线，理论上需要灼烧接种环6次。涂布时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多，防止培养基表面的菌液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。(4)据图可知，三种菌株对半纤维素的降解率最高，与第 5 天结果相比，第10 天秸秆各组分中半纤维素和木质素降解率变化不大，纤维素的降解率变化较大。
课堂总结
[网络建构提升]
平板划线
稀释涂布平板
分离
计数
纤维素分解菌
[长句应答必备]1．无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。2．培养基的制备过程包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基以造成污染。3．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求将菌液充分稀释。4．微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
历届真题
1．[2020·浙江7月]下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
解析：利用尿素固体培养基筛选尿素分解菌时，尿素固体培养基并不直接杀死其他微生物，而是其他微生物不能以尿素为氮源，无法在尿素固体培养基中存活，A错误；不同的微生物生长所需的最适pH不同，如细菌适宜生活在中性偏碱环境，霉菌适宜生活在中性偏酸环境，因此配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；利用糯米酿酒需要先进行糖化，酵母菌不能直接利用淀粉进行发酵，C正确；醋化醋杆菌的发酵底物为一定浓度的酒—水混合物，适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化，D正确。
A
2．[2020·江苏卷]产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL 无菌水中，制备成菌悬液，经________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌________个。
④
梯度稀释
4.6×105
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行____育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是__________________________________________。
诱变
脂肪
较大
B
该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析：(1)涂布器一般用干热灭菌法或灼烧灭菌法进行灭菌。(2)99 mL无菌水中加入1.0 g土壤制成的菌悬液为100 mL，取稀释10倍后的菌悬液0.1 mL涂布平板，平板上的平均菌落数为46，则每克土壤约含酵母菌46÷0.1×10×100 ＝4.6×105(个)。(3)辐射可以提高基因突变的频率，利用射线辐照进行的育种为诱变育种。本实验的目的是筛选产脂肪酶的菌株，所用的培养基应该以脂肪(或油脂)为唯一碳源；最终形成的菌落直径越大，形成该菌落的菌株分解脂肪(或油脂)的能力越强，生产脂肪酶的能力也越大。(4)由图可知，相对于菌株A，菌株B的增殖速度更快，降解脂肪的能力更强；根据题干信息“在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白”可进一步推知菌株B处理含油废水时可得到更多的单细胞蛋白，故菌株B更适合作为后续研究的材料。
3．[2017·江苏卷，31]苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。(3)下图为连续划线法示意图，在图中________(填图中序号)区域更易获得单菌落。
蛋白胨、苯酚
增加
稀释涂布
凝固剂
③
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为_______________________。如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5 ②10 ③20)倍后，再进行比色。
0、0.2、0.4、0.6、0.8
③
解析：(1)分析富集培养基的成分可知，培养基中蛋白胨、苯酚中含C，可作为碳源。(2)在接种培养时，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚(碳源)的含量，以达到富集酚降解菌的目的。若接种培养后平板中菌落过于密集，应继续稀释涂布，以降低平板上菌落的密度，便于菌落计数与分离。稀释涂布时所用的培养基为固体培养基，制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等物质作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，越在最后划线区域，菌落的密度越稀，越容易获得单菌落，所以，图中③区域更易获得单菌落。(4)根据表中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L可以推知，浓度梯度应该为0.2，即 1～5 号比色管的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。根据题意，废水为 50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L之间，需将残留液稀释20倍左右，再进行比色。
[等级选考研考向]1．[2020·全国卷Ⅰ，37]某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用_____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL 稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是____________________________(答出1点即可)。
高压蒸汽灭菌
琼脂
选择
104
S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：__________________________________。(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即______________________________________。
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
水、碳源、氮源和无机盐
解析：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。题图中摇瓶M内装有液体培养基甲，培养皿中的培养基乙为固体培养基，相比甲需添加凝固剂Y(琼脂)。依据题干信息，甲、乙培养基均为以S(一种含有C、H、N的有机物)为唯一氮源和碳源的培养基，可抑制或阻止其他微生物繁殖，仅使能够降解和利用S的菌株生长和繁殖，故属于选择培养基。(2)若使平板上长出的菌落数不超过200个，则接种液中的菌体浓度至多为200个/0.1 mL＝2×103个/mL，已知摇瓶M中的细菌细胞数为2×107个/mL，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。
解析：(3)S作为一种营养物质，在培养基中浓度过高，可导致培养液渗透压升高，细菌细胞渗透失水，使其代谢速率下降；另一方面S作为污染物，其浓度过高可能抑制菌体生长、代谢和繁殖。(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，需进行的实验步骤如下：称取一定质量(10 g)的淤泥溶于一定体积的(90 mL)无菌水中，制备土壤浸出液，经梯度稀释(对于细菌，一般选用104、105、106倍的稀释液)后，采用稀释涂布平板法接种于以S为唯一碳源和氮源的固体培养基(即乙培养基)中，每个稀释倍数下设置三组重复实验；在适宜条件下培养，待长出菌落且菌落数目达到稳定后，选取菌落数在30～300的平板进行计数，统计并计算平均值。(5)在甲、乙两种培养基中，S既作为碳源，又作为氮源，同时培养基中还含有水、无机盐等营养物质。
2．[2019·全国卷Ⅰ，37]已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是_______。(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是________________________________________________。(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________。(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供_________和________________。
牛肉膏、蛋白胨
X
下降
不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
稀释涂布平板法
能量
合成其他物质的原料
解析：(1)在Ⅰ号培养基中，牛肉膏、蛋白胨可以为微生物提供氮源，Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的是有机物X。(2)Ⅱ号培养基中碳源只有X，不能降解X的细菌会因缺乏碳源而不能增殖，使该类细菌的比例降低。(3)利用固体培养基对菌落进行计数时，需采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸可被分解为CO2和H2O，且释放能量，为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
3．[2019·全国卷Ⅱ，37]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是___。(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择__菌落进一步纯化，选择的依据是________________________________。
W
乙
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________________________________________________。(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加______，三处滴加量相同。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明____________________________________。
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
缓冲液
缓冲液不能降解W
酶E与天然酶降解W的能力相近
解析：(1)要从土壤中分离能降解W的细菌，培养基中应以W为唯一氮源。(2)乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W。(3)要判断甲、乙能否利用空气中的氮气作为氮源，应将甲、乙菌分别接种在无氮源的培养基上，观察细菌能否生长，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源，否则不能。(4)①实验设计应遵循单一变量原则，C处应滴加等量不含酶的缓冲液。②C处只滴加等量缓冲液，若C处没有出现透明圈，则说明缓冲液不能降解W，若A、B处形成的透明圈直径大小相近，则说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
4．[2019·全国卷Ⅲ，37]回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是__________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上_____ (填“能够”或“不能”)生长，原因是_________________________________________。(2)用平板培养细菌时一般需要将平板______(填“倒置”或“正置”)。(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是________________________________________________。(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过_____处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同
能够
硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
倒置
在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
灭菌
解析：(1)细菌培养时需要碳源、氮源、水和无机盐等，蛋白胨能同时提供碳源、氮源，葡萄糖可提供碳源，NaNO3不能提供碳源，可提供无机氮源。不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同，故制备培养基时需要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是自养型细菌，可以利用空气中的CO2作为碳源，故硝化细菌可在没有碳源的培养基上生长。(2)为防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染，用平板培养细菌时一般需将平板倒置。(3)在一定培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，如特定的形状、大小、颜色、隆起程度等，所以依据菌落的特征，可以初步区分不同种的微生物。(4)为防止污染环境，使用后的培养基丢弃前要都经过灭菌处理，以便杀死丢弃物中所有的微生物。
5．[2018·全国卷Ⅰ，37][生物——选修1：生物技术实践]将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_____的生长，加入了链霉素的培养基属于_____培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有____________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有____________(答出两点即可)。
细菌
选择
碳源、无机盐
蛋白质、核酸
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是____，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是________________________________________________。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因？
碘液
淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
解析：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则M培养基能满足真菌的生长，且能抑制其它微生物的生长，因此培养基中应加入链霉素以抑制细菌的生长，加入了链霉素的培养基属于选择培养基。(2)微生物生长需要多种营养物质，除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有蛋白质和核酸。(3)筛选产淀粉酶的微生物时，可依据淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，再根据透明圈来筛选产淀粉酶的微生物。(4)乙同学的结果不合理，因为其中1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差，不能简单的用其平均数作为最终结果。
6．[2017·全国卷Ⅰ，37]某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_____。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_______(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________(答出两点即可)。
脲酶
分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物
提供能量，为其他有机物的合成提供原料
为细胞生物生命活动
尿素
其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
为细菌生长提供无机营养；作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
解析：(1)细菌分解尿素是由于细菌体内能合成脲酶，尿素是有机物，分解尿素的细菌是分解者，而不是生产者，只有生产者才能利用CO2作为碳源合成有机物。葡萄糖通常既作为碳源，也可作为能源。(2)筛选分解尿素的细菌，通常只能用尿素作为唯一氮源，而“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”均含有无机氮源。(3)KH2PO4和Na2HPO4为微生物提供P元素和无机盐离子如钾离子和钠离子，还可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH的稳定。
微生物的培养和利用
课前自主预习案
高效课堂
课堂总结
历届真题
课前自主预习案
[基础梳理——系统化]知识点一 微生物的实验室培养1．培养基
氮源
无机盐
液体培养基
鉴别培养基
pH
氧气
2．无菌技术
化学药剂消毒法
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
外来杂菌
3．大肠杆菌的纯化培养
称量
灭菌
平板划线法
甘油管藏法
知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离
酚红
样品稀释
培养观察
以尿素为唯一氮源
稀释涂布平板法
知识点三 分解纤维素的微生物的分离1．实验原理
纤维二糖
CX
葡萄糖苷
刚果红
红色复合物
透明圈
2．实验流程
纤维素
纤维素为唯一碳源
梯度稀释
鉴别纤维素分解菌
透明圈
[基能过关——问题化]一、判一判1．判断关于微生物培养技术相关叙述的正误(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。( )(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。( )(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。( )(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。( )(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。( )
√
×
√
×
√
2．判断关于微生物分离相关叙述的正误(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。( )(2)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。( )(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。( )(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。( )(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。( )
×
×
√
×
×
二、连一连1．无菌技术的主要方法及适用对象(连线)
2．以下几种选择培养基和鉴别培养基及其应用(连线)
三、议一议【教材易漏拾遗】1．微生物的接种技术只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？
不是，微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，接种的核心是防止杂菌污染，以保证培养物的纯度。
2．细菌数目的测定还有哪些方法？试举例说明。
滤膜法。测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法。
3．如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？ (2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？ (3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？
获得效果A的接种方法为稀释涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
火焰附近存在着无菌区域。
4．研究人员在刚果红培养基平板上筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示，将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图2，请分析：
(1)透明圈是如何形成的？ (2)图中透明圈大小代表了什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？
刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，故可形成透明圈。
透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株①。
J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。
高效课堂
考点一 微生物的实验室培养【任务驱动 探究突破】任务1 据某微生物培养基的配方表回答下列问题(1)此培养基按物理性质划分属于______培养基，因为没有凝固剂(如琼脂)；按功能划分属于______培养基，因为没有碳源，只有______微生物才能生长(利用空气中的CO2)。(2)此培养基含有微生物所需的营养成分包括水、______和______三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括______、______和生长因子。
液体
选择
自养型
无机盐
氮源
碳源
氮源
(3)若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂(琼脂)。(4)若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中______成分(填表中序号)，加入______和不含氮元素的有机物。
①
尿素
任务2 据两种接种方法产生的培养效果图完成下列问题(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是______________、____________。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，其最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
稀释涂布平板法
平板划线法
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。
任务3 大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基①操作步骤②倒平板的操作方法及注意事项a．写出上图正确的倒平板操作流程：_____________________。b．甲、乙、丙中的灭菌方法是________。c．丁中的操作需要等待________________后才能进行。
称量
灭菌
倒平板
丙→乙→甲→丁
灼烧灭菌
平板冷却凝固
(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：设法在培养基上得到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。②纯化大肠杆菌的关键步骤是________。③常用的微生物接种方法有两种a．平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
接种
连续划线
b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的________，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。系列稀释操作(如下图所示)：涂布平板操作(如下图所示)：
梯度稀释
(3)菌种的保存方法①对于频繁使用的菌种，可以采用________的方法。②对于需要长期保存的菌种，可以采用________的方法。
临时保藏
甘油管藏
【特别提醒】(1)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项①倒平板的适宜温度是50 ℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(2)平板划线操作的注意事项①第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。②灼烧接种环，应待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。③划线时最后一区不要与第一区相连。④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
【考向分类 对点落实】 考向一培养基及其制备方法分析1．[经典模拟]下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是( ) A.从物理性质看，该培养基属于液体培养基；从用途看，该培养基属于选择培养基B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨C．该培养基缺少提供生长因子的物质D．该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
B
解析：分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C错误；对培养基调节完pH后还要进行灭菌处理等操作才能使用，D错误。
2．[2021·安徽省黄山市高三 “八校联考”]蓝白斑筛选是基因工程中筛选重组目的基因常用的一种方法，表现为培养基上出现蓝白颜色的菌落，可以通过颜色为依据直接筛选重组菌。用于筛选的菌为β－半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌中编码β－半乳糖苷酶的部分缺失，不具有生物活性。用于蓝白斑筛选的质粒载体一般含有抗性基因和将宿主菌β－半乳糖苷酶缺失部分补全的序列，在这段序列中还含有多个限制性酶切位点，便于插入目的基因。β－半乳糖苷酶能够作用于一种无色化合物Xgal，使其变成蓝色物质。回答下列问题：(1)玻璃和金属材质的实验器材利用________方法灭菌。(2)培养基灭菌后，需要冷却到____℃左右时，才能倒平板。倒平板后，平板冷凝要将平板倒扣，其原因是________________________________________。
干热灭菌
50
防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
(3)为防止杂菌污染，培养基中要添加________。蓝白斑筛选能成功，是因为培养基中添加了________。(4)最终培养基出现的白色的菌落是( )A．目的基因和载体结合 B．只含目的基因C．只含载体(5)若需要长期保存该菌种，可采用的方法是________。
抗生素
Xgal
A
甘油管藏法
解析：(1)玻璃和金属材质的实验器材可用干热灭菌的方法进行灭菌。(2)培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时才能倒平板。倒平板后，平板冷凝要将平板倒扣，这样做可防止皿盖上的冷凝水落入培养基而造成污染。(3)为防止杂菌污染，培养基中要添加抗生素。β－半乳糖苷酶能够作用于一种无色化合物Xgal，使其变成蓝色物质，蓝白斑筛选能成功，是因为培养基中添加了Xgal。(4)由于用于蓝白斑筛选的质粒载体一般含有抗性基因和将宿主菌β－半乳糖苷酶缺失部分补全的序列，因此最终培养基中出现的白色的菌落是目的基因和载体结合的菌落，故选A。(5)若需要长期保存该菌种，可采用的方法是甘油管藏法。
考向二无菌技术的操作3．[经典模拟]微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，以防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是( )①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒 ④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 ⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌A．①③ B．②④ C．③⑤ D．④⑥
D
解析：无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌的污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常用高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。
4．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )A．接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环C．培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅
解析：灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手和衣着需要消毒处理。高压蒸汽通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
C
考向三大肠杆菌的纯化方法及过程分析5．[2021·甘肃兰州一中高三试题]平板冷却凝固后要将平板倒置，其目的是( )A．利于大肠杆菌的生长B．防止空气进入C．利于培养基的冷却D．防止皿盖冷却水滴入培养基造成污染
解析：平板冷却凝固后将平板倒置是为了防止皿盖冷却后水滴入培养基后造成污染，D正确；此操作的原因不是利于大肠杆菌的生长，A错误；空气仍然可以进入到平板中，B错误；倒置对于培养基冷却没有太大影响，C错误。
D
6．[2021·河南省安阳市高三第一次调研]一个由英国伦敦帝国学院和芬兰图尔库大学的科学家组成的研究小组日前开发出一种通过大肠杆菌制造丙烷的新技术。科研人员欲对大肠杆菌进行研究和利用，首先要纯化大肠杆菌，请结合所学知识，回答下列问题：(1)纯化大肠杆菌首先需要制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，其步骤是计算、称量、溶化、灭菌、________。对培养基进行灭菌的方法是_____________，检验培养基是否有杂菌污染的最有效的方法是________________________________。(2)可以估算出样品中大肠杆菌数量的接种方法是___________，用该方法得到的结果一般比实际值____ (填“偏大”或“偏小”)。
倒平板
高压蒸汽灭菌法
将未接种的培养基放在恒温箱中培养
稀释涂布平板法
偏小
(3)某实验小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是振荡培养能提高培养液中________的含量和营养物质的利用率。使用过的培养基及培养物必须经过________后才能丢弃，以防止培养物扩散。(4)如果要检测食品中是否含有大肠杆菌，需要在培养基中加入________(填物质)，以观察是否出现________(填颜色)的菌落。
氧气
灭菌处理
伊红美蓝
黑色
解析：(1)纯化大肠杆菌首先需要制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，其步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，对培养基进行灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法。检验培养基有没有被杂菌污染，可选取未接种的培养基与接种样品的培养基同时在恒温箱中培养。如果在培养过程中未接种的培养基没有菌落生长，则说明培养基没有被杂菌污染；若未接种的培养基有菌落生长，则说明培养基被杂菌污染。(2)接种大肠杆菌的最常用方法是平板划线法和稀释涂布平板法，其中可以估算出样品中大肠杆菌数量的是稀释涂布平板法。由于两个或多个细胞连在一起，在平板上观察到的是一个菌落，因而该方法得到的结果一般比实际值偏小。(3)大肠杆菌的培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、溶氧量、酸碱度和渗透压等条件；由于大肠杆菌对人和动物有一定的不利影响，所以对培养基和培养物要灭菌处理后才能丢弃。(4)鉴定大肠杆菌要用伊红美蓝培养基，若出现黑色菌落，则说明食品中有大肠杆菌。
考向四微生物培养与分离的考查7．(多选)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是( )A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
BC
解析：漆酶属于木质素降解酶类，生活污水中含木质素类的物质少，则能降解木质素的产漆酶的微生物较少，故生活污水不是分离产漆酶菌株的首选样品，A错误；产漆酶菌株可降解木质素，筛选培养基中应加入木质素来筛选产漆酶的菌株，可依据漆酶菌株的菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；在涂布平板上挑取的菌落可能含有其他杂菌，可再通过平板划线法进一步分离纯化，C正确；对于需要长期保存的菌株，不适宜在常温下保存，应低温冷冻保存，D错误。
8．(多选)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述不正确的是( )A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
解析：高压蒸汽灭菌加热结束后，应让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物，A错误；倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖，B错误；灼烧接种环之后，要待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种，C错误；皿底的标记不会因为盖子混淆而混淆，D正确。
ABC
解析：高压蒸汽灭菌加热结束后，应让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物，A错误；倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖，B错误；灼烧接种环之后，要待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种，C错误；皿底的标记不会因为盖子混淆而混淆，D正确。
9．(多选)下列关于细菌的叙述，不正确的是( )A．不同种类细菌的生长均需要相同碳源B．常用液体培养基分离获得细菌单菌落C．细菌大量培养过程中，芽孢形成于细菌生长的调整期D．培养基中含有高浓度NaCl有利于金黄色葡萄球菌的筛选
解析：自养型细菌(如硝化细菌)可直接利用空气中的CO2作碳源，异养型细菌(如大肠杆菌)只能利用培养基中现成的有机碳源(如葡萄糖)，A错误；常利用固体培养基分离获得细菌的单菌落，B错误；细菌的生长曲线包括调整期、对数期、稳定期、衰亡期四个阶段，芽孢形成于细菌生长的稳定期，C错误；金黄色葡萄球菌能在含有高浓度NaCl的培养基中正常生长、繁殖，其他微生物则不能，故可用含高浓度NaCl的选择培养基来筛选金黄色葡萄球菌，D正确。
ABC
[题后拓展]1．培养基的配制原则(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等来确定配制的培养基种类。(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH要适宜：真菌为5.0～6.0，细菌所需pH为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，故培养不同微生物所需pH 不同。
2．培养基的营养构成(1)各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。(2)不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
3．微生物和动植物营养要素的比较
考向五微生物实验室培养的拓展应用10．[2018·全国卷Ⅱ，37]在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_____ (填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是___________________。
可以
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
破坏DNA结构
消毒液
氯气
未将锅内冷空气排尽
解析：(1)能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)煮沸消毒法，即在100 ℃时煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢；巴氏消毒法却是在70～75 ℃时煮30 min或在80 ℃时煮15 min，以杀死微生物，并且保证营养物质不被破坏，因此，与煮沸消毒法相比，牛奶消毒常采用巴氏消毒法。巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点是达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。 (3)因紫外线能破坏DNA分子的结构，所以密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。(4)通常乙醇消毒用的是75%的酒精，由于酒精有气味，影响水质，不适宜消毒自来水；高锰酸钾本身有颜色，消毒后溶液呈紫红色，也无法使用；因此水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的。(5)采用高压蒸汽灭菌时，锅内的水加热煮沸，应将其中原有的冷空气彻底排除后才能将锅密闭。如果未将锅内冷空气排尽，则会出现压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度的现象。
11．[经典高考]临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用_______法或__________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。(2)取该单菌落适当稀释，用___________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。
平板划线
稀释涂布(平板)
稀释涂布(平板)
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_____；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明__________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的__________。(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素____。
敏感
不敏感
该致病菌对C的敏感性比对A的弱
耐药菌
A
解析：(1)微生物纯化的方法主要为平板划线法和稀释涂布平板法。(2)根据微生物的特点对菌落进行一系列浓度的稀释，然后用涂布法接种于固体培养基表面，最后置于适宜条件下培养。(3)抗生素是由真菌产生的，可以抑制生长、繁殖或杀死细菌等致病菌的一类物质，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明有抗生素A的地方该致病菌受到抑制；B的周围没有透明圈，说明致病菌对抗生素B不敏感，C的透明圈要比A的透明圈小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；D出现了透明圈，说明该致病菌对D敏感，但是在透明圈上出现一个菌落，又可排除杂菌污染，因此可判断此菌落的微生物对抗生素D产生了耐药性。(4)根据以上分析，为达到抗菌的目的，最好选择抗生素A。
【师说拓展】1.消毒与灭菌比较
2.纯化微生物的接种方法比较
12.[经典高考]有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染，某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以______为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于________培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即______________和______________。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和___________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯______附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
原油
选择
平板划线法
稀释涂布平板法
强
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
火焰
解析：(1)该同学欲筛选能降解原油的菌株，可以将样品稀释液置于以原油为唯一碳源的固体培养基中培养，该培养基在功能上属于选择培养基。(2)菌株的接种方法，常用的有两种：平板划线法和稀释涂布平板法。(3)菌株分解周围的营养物质，出现分解圈，分解圈大说明该菌株的降解能力强。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌；微生物的培养要求进行严格的无菌技术，操作时应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围其他细菌的污染。
考点二 微生物的分离、计数与筛选【任务驱动 探究突破】任务1 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)实验原理①分解尿素的原理土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成________，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到________作用。②筛选菌株的原理微生物的选择培养：在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
脲酶
催化
(2)统计菌落数目的方法①显微镜直接计数法a．原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。b．方法：用血球计数板计数。c．缺点：不能区分死菌与活菌。
②间接计数法(活菌计数法)a．原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。b．操作：(ⅰ)设置重复组，以增强实验的说服力与准确性。(ⅱ)为了保证结果的准确，一般应选择菌落数在30～300的平板进行计数。c．计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。(3)实验流程土壤取样→________→微生物的培养与观察→细菌的________。
样品的稀释
计数
[注意事项](1)在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目，如果某个平板的菌落数与其他组差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。(2)统计的菌落往往比活菌的实际数目低，这是由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
任务2 分解纤维素的微生物的分离(1)实验原理①纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，该复合酶具有催化分解纤维素的作用，其作用过程如下：②筛选原理a．培养基：以________为唯一碳源的选择培养基。b．方法：刚果红染色法。 ，出现________，即可根据是否产生________来筛选纤维素分解菌。
纤维素
红色
透明圈
透明圈
(2)筛选流程土壤取样→________→梯度稀释→将样品涂布到_____________的培养基上→挑选产生________的菌落。①土壤取样：选择富含________的环境。②将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。a．制备鉴别培养基：主要碳源是________。b．刚果红染色法。(ⅰ)先培养________，再加入刚果红进行颜色反应；(ⅱ)________时加入刚果红。③进一步鉴定a．为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还需进行__________的实验。b．测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量测定。
选择培养
鉴别纤维素分解菌
透明圈
纤维素
CMC-Na
微生物
倒平板
发酵纤维素酶
葡萄糖
(3)分离纤维素分解菌的几个关键步骤①分离纤维素分解菌的实验中应先用_________，再用_________。选择培养基为________培养基，以纤维素作为__________的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。②鉴别培养基含琼脂，为________培养基，因为要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落，刚果红染色法应用的就是此种培养基。
选择培养基
鉴别培养基
液体
碳源和能源
固体
任务3 选择培养基的应用实例(1)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长，其目的是培养、分离出特定微生物。
(2)选择培养基的应用实例①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。③培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果，如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，以达到分离能消除石油污染的微生物的目的。⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
【考向分类 对点落实】 考向一微生物分离与计数的考查1．[2021·河北衡水中学高三调考]下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是( )A．分解尿素的细菌能产生脲酶，可将尿素分解产生氮气B．用选择培养基选择出分解尿素的细菌，并杀死其他微生物C．统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数D．用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红
D
解析：分解尿素的细菌能产生脲酶，可将尿素分解为氨和CO2，A错误；用含尿素的选择培养基选择出分解尿素的细菌，其目的是淘汰不能分解利用尿素的其他微生物，B错误；统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在30～300之间的平板进行计数，求其平均值，C错误；用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红，D正确。
2.[2021·四川乐山四校联考]某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，实验过程包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中，正确的是( )A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉B．利用平板划线法对细菌进行分离、纯化并计数C．观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验D．培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为细菌培养提供氮源和碳源
解析：实验用过的带菌培养基要高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境，A错误；应利用稀释涂布平板法对细菌进行分离、纯化并计数，B错误；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，C错误；培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了氮源和碳源，D正确。
D
3．[全国卷Ⅰ，39]已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用__________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用__________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以______为碳源的固体培养基进行培养。(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用___________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用_____________法进行计数。(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，_____℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕____℃设计后续实验。
苏丹Ⅲ
萃取法
油脂
血细胞计数板
稀释涂布平板
45
40
解析：(1)生物组织中的油脂能被苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)染成橘黄色(或红色)。(2)为了筛选出能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，我们应选用只能让该菌落生长的选择性培养基，因此培养基中只能选用油脂作为唯一碳源的固体培养基。(3)血细胞计数板可用于直接计数培养液中的菌体数，但是不分死活，因此要计数活菌数量要通过稀释涂布平板法来计数。(4)温度影响酶的活性，在三个温度中，45 ℃时需酶量最高，说明酶活性最低；在三个温度实验中40 ℃时所需酶量最少，低于35 ℃和45 ℃所用酶量，说明酶的最适温度介于35 ℃和45 ℃之间，因此应围绕40 ℃设计不同温度梯度，以进行后续实验。
4．[全国卷Ⅱ]为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为___________。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过_____灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_______________________________。
检测培养基平板灭菌是否合格
3.8×107
灼烧
将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)示意图A和B中，__________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
B
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中__________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高__________的利用率。
溶解氧
营养物质
解析：(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，应通过随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生长，再进行相互对照。三个培养基上平均菌落数为38，所以每升水样中活菌数为38×10×100×1000＝3.8×107。(2)接种环应用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是：随着划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。(3)A表示平板划线法接种培养后得到的结果，B表示稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)振荡培养可以增加液体培养基中的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，以提高营养物质的利用率。
考向二菌种筛选的拓展应用5．[全国卷Ⅰ]植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
纤维二糖
葡萄糖
红
透明圈
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：注：“＋”表示有，“－”表示无。 据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是__________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________________________________
不能
液体培养基不能用于分离单菌落
不能
培养基中没有纤维素，不会形成CR－纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
【师说拓展】1.筛选微生物的两个实例比较
2.选择培养基与鉴别培养基的比较
6.[2018·江苏卷，31]酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的___，及时对培养基进行分装，并进行_________灭菌。(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
pH
高压蒸汽
50 ℃
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有__________________________。a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
a、b、d
氧气
无
30
解析：(1)配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调节pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)在步骤③中，待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板。 (3)在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a正确；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b正确；分离纯化获得单一菌落，挑取菌落时，应挑取单个菌落，c错误；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d正确。(4)酵母菌通过有氧呼吸可大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本(菌体)总数＝80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于(3×109)÷(1 000×2×104×400÷80)＝30个。
考向三 土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌7．[2021·安徽六安高三月考]分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐A．①③⑤⑧ B．②④⑥⑧C．①③⑤⑦ D．①④⑥⑦
解析：要分离分解尿素的细菌应以尿素为唯一氮源，①正确、②错误；分离土壤中分解尿素的细菌用固体培养基需加入琼脂，③正确，④错误；培养基中需要加碳源即葡萄糖，⑤正确，⑥错误；不需要氮源，故不加硝酸盐，⑦错误，⑧正确；故符合题意的有①③⑤⑧，A正确。
A
8．[2021·广东省广州市执信中学第二次月考]分离筛选降解纤维素能力强的微生物，对于解决秸秆等废弃物资源的再利用和环境污染问题具有重要意义。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、KCl、酵母膏以及水解酪素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。请回答下列问题：(1)培养基中加入的化合物A是________。本实验将样品稀释涂布到鉴别培养基之前要进行选择培养，目的是______________________________。(2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培养基中加入________溶液，等培养基上长出菌落后，能产生纤维素酶的菌落周围会出现________。
纤维素
增加能产纤维素酶的微生物的浓度
刚果红
透明圈
(3)为在培养基表面形成单个菌落，若将平板分为5个区域进行划线，理论上需要灼烧接种环________次。若用稀释涂布平板法进行接种，在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌液量不宜过多的原因是__________________________________________________。
6
培养基表面的菌液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果
(4)用三种菌株对秸秆进行处理，并在第5天和第10天对秸秆和秸秆中含有的纤维素、半纤维素以及木质素等组分的降解情况进行了测定(结果如图)。据图分析可知，三种菌株对____________的降解作用最强。与第5天结果相比，第10天秸秆各组分中________的降解率变化最大。
半纤维素
纤维素
解析：(1)为筛选能够降解纤维素的微生物，培养中应添加纤维素作为唯一碳源的选择培养基，因此培养基中加入的化合物 A 是纤维素。选择培养的目的是为了扩增纤维素分解菌，增加纤维素分解菌的浓度。(2)纤维素分解菌的鉴定需用刚果红，等培养基上长出菌落后，能产生纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。(3)平板划线法进行划线时需要灼烧接种环，第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；之后每一次划线前：杀死残留菌种，保证每一次划线菌种来自上次划线末端；划线结束后，杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。因此将平板分为5个区域进行划线，理论上需要灼烧接种环6次。涂布时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多，防止培养基表面的菌液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。(4)据图可知，三种菌株对半纤维素的降解率最高，与第 5 天结果相比，第10 天秸秆各组分中半纤维素和木质素降解率变化不大，纤维素的降解率变化较大。
课堂总结
[网络建构提升]
平板划线
稀释涂布平板
分离
计数
纤维素分解菌
[长句应答必备]1．无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。2．培养基的制备过程包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基以造成污染。3．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求将菌液充分稀释。4．微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
历届真题
1．[2020·浙江7月]下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
解析：利用尿素固体培养基筛选尿素分解菌时，尿素固体培养基并不直接杀死其他微生物，而是其他微生物不能以尿素为氮源，无法在尿素固体培养基中存活，A错误；不同的微生物生长所需的最适pH不同，如细菌适宜生活在中性偏碱环境，霉菌适宜生活在中性偏酸环境，因此配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH，B正确；利用糯米酿酒需要先进行糖化，酵母菌不能直接利用淀粉进行发酵，C正确；醋化醋杆菌的发酵底物为一定浓度的酒—水混合物，适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化，D正确。
A
2．[2020·江苏卷]产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL 无菌水中，制备成菌悬液，经________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌________个。
④
梯度稀释
4.6×105
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行____育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是__________________________________________。
诱变
脂肪
较大
B
该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析：(1)涂布器一般用干热灭菌法或灼烧灭菌法进行灭菌。(2)99 mL无菌水中加入1.0 g土壤制成的菌悬液为100 mL，取稀释10倍后的菌悬液0.1 mL涂布平板，平板上的平均菌落数为46，则每克土壤约含酵母菌46÷0.1×10×100 ＝4.6×105(个)。(3)辐射可以提高基因突变的频率，利用射线辐照进行的育种为诱变育种。本实验的目的是筛选产脂肪酶的菌株，所用的培养基应该以脂肪(或油脂)为唯一碳源；最终形成的菌落直径越大，形成该菌落的菌株分解脂肪(或油脂)的能力越强，生产脂肪酶的能力也越大。(4)由图可知，相对于菌株A，菌株B的增殖速度更快，降解脂肪的能力更强；根据题干信息“在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白”可进一步推知菌株B处理含油废水时可得到更多的单细胞蛋白，故菌株B更适合作为后续研究的材料。
3．[2017·江苏卷，31]苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。(3)下图为连续划线法示意图，在图中________(填图中序号)区域更易获得单菌落。
蛋白胨、苯酚
增加
稀释涂布
凝固剂
③
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为_______________________。如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5 ②10 ③20)倍后，再进行比色。
0、0.2、0.4、0.6、0.8
③
解析：(1)分析富集培养基的成分可知，培养基中蛋白胨、苯酚中含C，可作为碳源。(2)在接种培养时，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚(碳源)的含量，以达到富集酚降解菌的目的。若接种培养后平板中菌落过于密集，应继续稀释涂布，以降低平板上菌落的密度，便于菌落计数与分离。稀释涂布时所用的培养基为固体培养基，制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等物质作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，越在最后划线区域，菌落的密度越稀，越容易获得单菌落，所以，图中③区域更易获得单菌落。(4)根据表中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L可以推知，浓度梯度应该为0.2，即 1～5 号比色管的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。根据题意，废水为 50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L之间，需将残留液稀释20倍左右，再进行比色。
[等级选考研考向]1．[2020·全国卷Ⅰ，37]某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用_____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL 稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是____________________________(答出1点即可)。
高压蒸汽灭菌
琼脂
选择
104
S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：__________________________________。(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即______________________________________。
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
水、碳源、氮源和无机盐
解析：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。题图中摇瓶M内装有液体培养基甲，培养皿中的培养基乙为固体培养基，相比甲需添加凝固剂Y(琼脂)。依据题干信息，甲、乙培养基均为以S(一种含有C、H、N的有机物)为唯一氮源和碳源的培养基，可抑制或阻止其他微生物繁殖，仅使能够降解和利用S的菌株生长和繁殖，故属于选择培养基。(2)若使平板上长出的菌落数不超过200个，则接种液中的菌体浓度至多为200个/0.1 mL＝2×103个/mL，已知摇瓶M中的细菌细胞数为2×107个/mL，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。
解析：(3)S作为一种营养物质，在培养基中浓度过高，可导致培养液渗透压升高，细菌细胞渗透失水，使其代谢速率下降；另一方面S作为污染物，其浓度过高可能抑制菌体生长、代谢和繁殖。(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，需进行的实验步骤如下：称取一定质量(10 g)的淤泥溶于一定体积的(90 mL)无菌水中，制备土壤浸出液，经梯度稀释(对于细菌，一般选用104、105、106倍的稀释液)后，采用稀释涂布平板法接种于以S为唯一碳源和氮源的固体培养基(即乙培养基)中，每个稀释倍数下设置三组重复实验；在适宜条件下培养，待长出菌落且菌落数目达到稳定后，选取菌落数在30～300的平板进行计数，统计并计算平均值。(5)在甲、乙两种培养基中，S既作为碳源，又作为氮源，同时培养基中还含有水、无机盐等营养物质。
2．[2019·全国卷Ⅰ，37]已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是_______。(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是________________________________________________。(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________。(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供_________和________________。
牛肉膏、蛋白胨
X
下降
不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
稀释涂布平板法
能量
合成其他物质的原料
解析：(1)在Ⅰ号培养基中，牛肉膏、蛋白胨可以为微生物提供氮源，Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的是有机物X。(2)Ⅱ号培养基中碳源只有X，不能降解X的细菌会因缺乏碳源而不能增殖，使该类细菌的比例降低。(3)利用固体培养基对菌落进行计数时，需采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸可被分解为CO2和H2O，且释放能量，为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
3．[2019·全国卷Ⅱ，37]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是___。(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择__菌落进一步纯化，选择的依据是________________________________。
W
乙
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________________________________________________。(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加______，三处滴加量相同。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明____________________________________。
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
缓冲液
缓冲液不能降解W
酶E与天然酶降解W的能力相近
解析：(1)要从土壤中分离能降解W的细菌，培养基中应以W为唯一氮源。(2)乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W。(3)要判断甲、乙能否利用空气中的氮气作为氮源，应将甲、乙菌分别接种在无氮源的培养基上，观察细菌能否生长，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源，否则不能。(4)①实验设计应遵循单一变量原则，C处应滴加等量不含酶的缓冲液。②C处只滴加等量缓冲液，若C处没有出现透明圈，则说明缓冲液不能降解W，若A、B处形成的透明圈直径大小相近，则说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
4．[2019·全国卷Ⅲ，37]回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是__________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上_____ (填“能够”或“不能”)生长，原因是_________________________________________。(2)用平板培养细菌时一般需要将平板______(填“倒置”或“正置”)。(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是________________________________________________。(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过_____处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同
能够
硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
倒置
在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
灭菌
解析：(1)细菌培养时需要碳源、氮源、水和无机盐等，蛋白胨能同时提供碳源、氮源，葡萄糖可提供碳源，NaNO3不能提供碳源，可提供无机氮源。不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同，故制备培养基时需要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是自养型细菌，可以利用空气中的CO2作为碳源，故硝化细菌可在没有碳源的培养基上生长。(2)为防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染，用平板培养细菌时一般需将平板倒置。(3)在一定培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，如特定的形状、大小、颜色、隆起程度等，所以依据菌落的特征，可以初步区分不同种的微生物。(4)为防止污染环境，使用后的培养基丢弃前要都经过灭菌处理，以便杀死丢弃物中所有的微生物。
5．[2018·全国卷Ⅰ，37][生物——选修1：生物技术实践]将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_____的生长，加入了链霉素的培养基属于_____培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有____________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有____________(答出两点即可)。
细菌
选择
碳源、无机盐
蛋白质、核酸
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是____，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是________________________________________________。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因？
碘液
淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
解析：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则M培养基能满足真菌的生长，且能抑制其它微生物的生长，因此培养基中应加入链霉素以抑制细菌的生长，加入了链霉素的培养基属于选择培养基。(2)微生物生长需要多种营养物质，除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有蛋白质和核酸。(3)筛选产淀粉酶的微生物时，可依据淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，再根据透明圈来筛选产淀粉酶的微生物。(4)乙同学的结果不合理，因为其中1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差，不能简单的用其平均数作为最终结果。
6．[2017·全国卷Ⅰ，37]某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_____。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_______(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________(答出两点即可)。
脲酶
分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物
提供能量，为其他有机物的合成提供原料
为细胞生物生命活动
尿素
其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
为细菌生长提供无机营养；作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
解析：(1)细菌分解尿素是由于细菌体内能合成脲酶，尿素是有机物，分解尿素的细菌是分解者，而不是生产者，只有生产者才能利用CO2作为碳源合成有机物。葡萄糖通常既作为碳源，也可作为能源。(2)筛选分解尿素的细菌，通常只能用尿素作为唯一氮源，而“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”均含有无机氮源。(3)KH2PO4和Na2HPO4为微生物提供P元素和无机盐离子如钾离子和钠离子，还可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH的稳定。
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