高考生物一轮总复习学案：第12单元 生物技术实践 第1讲 微生物的分离与培养

第1讲　微生物的分离与培养

考纲考情

某种微生物数量的测定,C,15年—单选—T13考查血细胞计数板的使用

微生物的应用,B,

14年—非选—T30结合β－胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验考查微生物的分离和培养的操作过程及注意事项

13年—单选—T18 结合废水处理问题考查微生物的分离和培养的操作过程及注意事项

13年—多选—T24探究微生物对秸秆的分解作用

知识整合

一、微生物的培养

1．培养基

(1)概念：人们按照微生物对________的不同需求，配制出供其________的营养基质。

(2)营养组成：一般都含有________________和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对________、氧气以及________________的要求。

(3)种类

①按照物理状态可分为：________培养基、半固体培养基和________培养基。

②按化学成分可分为：________、合成培养基和________培养基。

③按功能可分为：基础培养基、________、鉴别培养基等。

2．微生物培养的基本技术

(1)无菌操作技术

含义：指在培养微生物的操作中，所有防止________________的方法。

关键：防止________________的入侵。

具体措施

①消毒

a．特点：使用较为________的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体________(不包括芽孢和________)。

b．常用方法：煮沸消毒法、________、化学药剂消毒法。

②灭菌

a．特点：指使用强烈的理化因素杀死物体内外________________________，包括芽孢和孢子。

b．常用方法：________灭菌、干热灭菌、________灭菌、紫外线消毒。

(2)接种技术

①平板划线法：是通过________在琼脂固体培养基表面________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

②________法：是将菌液进行一系列的________，然后将________的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

二、微生物的分离与计数

1．微生物的分离

(1)原理：根据微生物对________________________等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入____________________使非目的微生物不能生长，从而达到____________________的目的。

(2)鉴定依据：________的特征。

(3)方法：________________和________________。

2．微生物的数量测定

准备实验器材：无菌条件

↓

采集土壤，制备悬液：配成____________的系列悬液

↓

选择适于分离特定微生物的培养基：平板培养基的制备

↓

接种：无菌操作

↓

培养与观察：____________________________

↓

计数菌落：选取______________的一组为代表，进行统计

每克土壤样品的细菌数＝

3．分解纤维素的微生物的分离——纤维素分解菌的筛选

(1)取样：选择富含________的环境。

(2)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

①制备鉴别培养基：主要的碳源是______________________

②刚果红染色法

a．先培养____________________，再加入刚果红进行颜色反应。

b．倒平板时加入______________________________。

考点突破

考点1　无菌操作技术与微生物

  的实验室培养　　1.消毒和灭菌的区别

灭菌,强烈的理化因素,杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子,

灼烧灭菌法,接种工具

干热灭菌法,玻璃器皿、金属用具

高压蒸汽灭菌法,培养基及容器

2．三种常用灭菌方法的比较

　　3.平板划线法与稀释涂布平板法的比较

(1)平板划线法(如图1所示)

几种平板划线方法示意图

图1

(2)稀释涂布平板法

①系列稀释操作(如图2所示)

图2

②涂布平板操作(如图3所示)

图3

(3)两种纯化细菌方法(平板划线与稀释涂布平板)比较

1．平板划线时注意事项

(1)接种环的灼烧

①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物

②每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端

③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者

(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种

(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连

(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破

2．稀释涂布平板注意事项

(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2  cm处

(2)涂布平板时

①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃

②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精

③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体

3．“倒平板”的意义

平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染

例1　(2016·江苏高考)(多选)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是(　　)

  A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品

  B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落

  C．在涂布平板上长出的菌落，通过划线进一步纯化

  D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株

1．空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配置培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了____________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________________(选填“正确”或“不正确”)。

考点2　生物的分离与计数

1．测定微生物数量的方法

(1)直接计数法：常用的是显微镜直接计数法。

(2)间接计数法：常用的是稀释平板计数法。

2．测定微生物数量方法的实际应用

(1)土壤中好氧型细菌的计数：

①制备土壤稀释液：取土壤表层3～5  cm处的土样；制备系列稀释液。

②取样及倒平板：该实验的接种方法是稀释涂布平板法。

③培养。

④观察记录结果：计算每克土壤样品菌数。

(2)检测某种食品中的细菌总数和大肠杆菌菌落数

一般说来，大肠杆菌菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差。

(3)土壤中分解尿素细菌的计数

某些细菌中含有尿素分解酶，能将培养基中的尿素分解成氨，该物质的水溶液会使酚酞指示剂呈现红色。

3．制备系列稀释液的方法

将1 g土样放入99 mL无菌水中，制成102倍的稀释液，用1 mL无菌移液管吸取上述浓度的溶液0.5 mL，移入装有4.5 mL无菌水的试管中，即配制成103倍的稀释液，用同样的方法可以配制成104、105、106倍的稀释液，将待测样品进行稀释的目的是使微生物细胞分散开，使实验结果更接近真实值。

4．分离微生物实例

【分解纤维素的微生物的分离】

(1)纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。

②作用

纤维素纤维二糖葡萄糖

(2)纤维素分解菌的筛选

①原理

②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程

土壤取样：富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓

梯度稀释：制备系列稀释液

↓

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落

(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较

分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。

①选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。

②鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。

(4)结果分析与评价

选择培养基

的筛选作用,牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目,选择培养基具筛选作用

样品的

稀释操作,得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板,操作成功

重复组

的结果,若选取同一种土样，统计结果应接近

1．从混合样品中分离某种微生物的方法通常有两种

(1)利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。

(2)利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。

2．选择培养基及其应用

(1)选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。

(2)选择培养基应用实例

①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③培养基中缺氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

例2　图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成______色。

(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。

该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白质含________个氨基酸。

2．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(选填“尿素”、“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有______________________________________________________________(答出两点即可)。

例3　某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸菌能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：

(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用________________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是________________________________________________________________________________。

(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________________________________和________________________________。分离纯化时应挑选出________________的菌落作为候选菌。

(3)乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________(选填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”)。

3．(2017·东台模拟)下列有关微生物培养的叙述，错误的是(　　)

  A．用平板划线法分离大肠杆菌时，需要多次灼烧接种环

  B．倒置平板可防止培养皿盖上的冷凝水滴落，造成污染

  C．新配置的培养基可以用高压蒸汽灭菌或干热灭菌的方法灭菌

  D．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染

请根据下列关键词的提示，归纳构建本课时知识体系

微生物的分离　培养基配置　纯化　消毒　灭菌　分装　包扎　搁置斜面　平板划线法、稀释涂布平板法

随堂演练

1．下列关于微生物的分离和培养的有关叙述，错误的是(　　)

  A．微生物培养前，需对培养基进行消毒

  B．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度

  C．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法

  D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源

2．(2015·江苏卷)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(　　)

  A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖

  B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上

  C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落

  D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上

3．欲分离筛选出能分泌脂肪酶的细菌，应选择下列固体培养基(仅列出了碳氮源)中的(　　)

  A．蛋白胨、柠檬酸铁铵  B．橄榄油、硫酸铵

  C．乳糖、酵母膏  D．葡萄糖、蛋白胨

4．下列有关微生物的培养或纯化的叙述，错误的是(　　)

  A．微生物在培养前要先对培养基进行灭菌处理再接种

  B．培养液中溶氧量的变化会影响酵母菌的繁殖和代谢途径

  C．分离自养型微生物的方法是用纤维素作为唯一碳源的培养基

  D．分离纯化微生物的常用方法是平板划线法和涂布平板法

5．(多选)不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是(　　)

  A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素

  B．碳源物质也是该微生物的能源物质

  C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质

  D．水不是该微生物的营养要素之一

6．下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是(　　)

  A．分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生氮气

  B．用选择培养基选择出分解尿素的细菌，杀死其他微生物

  C．统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数

  D．用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红

7．(2015·江苏高考)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：

(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(填序号)。

①酒精灯　②培养皿　③显微镜　④无菌水

(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是__________________________________________________________________________。

(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是____________________________________________________。

(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见下图)。图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。

图中降解纤维素能力最强的菌株是________(填图中序号)。

(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是____________________________________________________________________________________________________________________。

第7题图