2021版新高考生物培优大一轮复习讲义：原选修1、选修3部分内容第2讲微生物的培养和应用

第2讲　微生物的培养和应用

微生物的实验室培养

1．培养基

(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(2)种类：液体培养基和固体培养基，二者的区别是是否添加凝固剂。

(3)营养成分：

①主要营养物质：碳源、氮源、水和无机盐。

②其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。

2．无菌技术

(1)关键：防止外来杂菌的入侵。

(2)不同对象的无菌操作方法(连线)：

[答案]　①—b—Ⅰ　②—b—Ⅱ　③④—a　⑤—a—Ⅲ、Ⅳ　⑥—b

3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

(1)计算：依据配方比例，计算配制100 mL的培养基时，各种成分的用量。

(2)称量：准确地称取各种成分。

(3)溶化

(4)灭菌

(5)倒平板：待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰旁倒平板。

4．纯化大肠杆菌

(1)菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。

(2)纯化大肠杆菌的方法

①纯化培养原理：在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。

②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。

③常用的微生物接种方法有两种。

a．平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

b．稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

5．菌种的保存方法

(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

1．选择无菌技术的原则

(1)考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒的要好。

(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。

2．平板划线法与稀释涂布平板法的比较

1．大肠杆菌纯化方法的比较

2．某同学在利用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？并说明理由。

[提示]　最可能的原因是菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但能杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。

无菌技术

1．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。

回答下列问题：

(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是______________________________________________。

(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________________，在照射前，适量喷洒______________________，可强化消毒效果。

(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。

(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________。

[解析]　(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。

(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。

(4)自来水通常采用氯气消毒。

(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。

[答案]　(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽

　消毒和灭菌

微生物的纯化技术

2．(2019·四川省资阳市高三诊断)土壤有“微生物的天然培养基”之称。如图是某同学分离和培养土壤中微生物的部分操作步骤和实验结果示意图。回答下列问题：

(1)利用固体培养基培养土壤中的微生物时，除考虑各种营养条件外，还需要控制的培养条件有____________________________________(至少写两点)等。接种前应该先检测固体培养基是否被污染，检测的具体方法是_______________

___________________________________________________。

(2)图示中用平板划线法接种的操作顺序是A→B→__________；以上操作步骤中存在明显错误的是________(用字母表示)，该操作的正确方法是__________ _______________________________________________________。

(3)实验室利用平板划线法来分离样品中的目的菌时，每次划线之前都要对接种环进行灭菌，目的是______________________________。在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是_______________。

[解析]　(1)若用该培养基培养土壤中的微生物，除考虑各种营养条件外，还要考虑温度、pH、氧气、无菌和渗透压等条件。检测固体培养基是否被污染的方法是将未接种的培养基在适宜的环境中放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。

(2)图示是平板划线法接种操作示意图，由以上分析可知，其操作顺序是A→B→E→D→C→F；为了防止杂菌污染，接种应该在酒精灯的火焰旁进行，因此以上操作中存在错误的步骤是C。

(3)平板划线法操作时，每次划线之前都要对接种环进行灭菌，目的是杀灭上次划线接种环上残留的菌种。在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，能够使菌种的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能够得到单菌落。

[答案]　(1)温度、pH、氧气、无菌　将未接种的培养基在适宜的环境中放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生　(2)E→D→C→F　C　在酒精灯的火焰旁划线　(3)杀灭上次划线接种环上残留的菌种　使菌种的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能够得到单菌落

3．(2019·宜宾市高三月考)土壤中的苯酚(C6H5OH)对环境有极大的污染，实验室希望能从土壤中分离出能专一性降解苯酚的微生物，如图是部分实验过程。回答下列问题：

(1)为了分离纯化目的菌种，①～④步骤的培养基中都加入了一定浓度的苯酚，该物质能为微生物提供________，除此而外，培养基中一般还需要水、______________________等营养物质。

(2)制备步骤④所需要的固体培养基的操作顺序：计算→称量→________→________→倒平板。为了在步骤⑤的平板上形成单个的菌落，涂布平板前，需要对培养液进行多次稀释，原因是____________________________。

(3)研究人员想通过比较试管甲和乙中微生物的生长情况，来证明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源，若甲试管中的液体培养基中的唯一碳源是苯酚，那么，乙试管中培养基成分与甲相比，区别是___________________________。研究人员对甲、乙两支试管进行接种时，所选菌种都来自步骤⑤平板上的同一个单菌落，这样做的目的是________________________________________。

[解析]　(1)为了分离能专一性降解苯酚的微生物，①～④步骤的培养基中需要加入苯酚作为唯一碳源，另外培养基中一般还需要水、氮源、无机盐等营养物质。

(2)制备培养基的操作顺序是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物易于分散成单个细胞，故涂布平板前，需要对培养液进行多次稀释。

(3)研究人员想通过比较试管甲和乙中微生物的生长情况，来证明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源，若甲试管中的液体培养基中的唯一碳源是苯酚，那么，乙试管中应该加入其他碳源，比较甲、乙试管中微生物的生长情况，若甲试管中微生物可以生长，乙试管中微生物不能生长，说明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源。为了保证甲、乙两支试管中的微生物种类是相同的，对甲、乙两支试管进行接种时，所选菌种都来自步骤⑤平板上的同一个单菌落。

[答案]　(1)碳源　氮源和无机盐　(2)溶化　灭菌　在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物易于分散成单个细胞　(3)用其他碳源替代苯酚　保证甲、乙两支试管中的微生物种类是相同的

微生物的分离和计数

1．筛选菌株

(1)寻找目的菌株的方法：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

(2)实验室中微生物的筛选：

①方法：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。

②实例：筛选尿素分解菌时使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养。

(3)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2．统计菌落数目的方法

(1)显微镜直接计数法

①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。

③缺点：不能区分死菌与活菌。

(2)间接计数法(活菌计数法)

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组和对照组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

(1)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。

(2)原理

　　　　　     分 解尿素的细菌

　　　　　　 　     ↓

CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3

　　　　　　　　　　　　    　↓

　　　　　　　    　酚红指示剂―→变红色

(3)实验现象及结论

①培养基变红：该种细菌能分解尿素。

②培养基不变红：该种细菌不能分解尿素。

(4)统计菌落数目

统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

(5)实验流程

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

4．分解纤维素的微生物的分离

(1)纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用：

纤维素纤维二糖葡萄糖

(2)纤维素分解菌的筛选

①原理

　　　　      　   纤维素分解菌

　　　　　　　        　↓

―→红色复合物红色消失，出现透明圈。

②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

1．选择培养基的作用原理

(1)在培养基中加入某种化学物质，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的“加入”是在满足基本所需培养成分的基础上加入。

(2)改变培养基中的营养成分，如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；以石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。

(3)改变微生物的培养条件，如将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物，在高盐环境中培养可分离得到耐盐菌。

2．目的微生物选择的三种方法

(1)利用平板划线法或稀释涂布平板法接种在固体平板培养基上，根据目的微生物特定的菌落特征挑选目的微生物。

(2)利用选择培养基直接筛选目的微生物。

(3)利用鉴别培养基鉴别筛选目的微生物。

1．测定活菌的数量时不用平板划线法，请说出其中的原因。

[提示]　用平板划线法接种时，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个活菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个或多个活菌繁殖而成，还有一些不能形成菌落，而在计数时一个菌落对应着一个活菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌的数量。

2．研究人员用含有刚果红的培养基培养纤维素分解菌时，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图所示。据图回答以下问题：

(1)简述透明圈的形成过程。

[提示]　刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，形成透明圈。

(2)推测与图中透明圈大小有关的因素主要是什么？降解纤维素能力最强的菌种是哪种？

[提示]　纤维素酶的产量和活性。  菌落①所代表的菌种。

3．甲、乙同学测定泡菜滤液中微生物的浓度。在对应稀释倍数为105的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了平板，统计的菌落数为49；乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为43、54、287，然后取其平均值128作为统计结果。 请评价这两位同学的实验结果的有效性，并说明理由。

[提示]　(1)甲同学的实验结果是无效的，因为没有设置重复实验，结果不具有说服力。(2)乙同学的实验结果是无效的，因为一个平板上的菌落计数结果与另外两个相差太大。

微生物的选择培养

1．(多选)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，得到如图所示的两个菌落，培养平板经稀碘液处理，出现了以菌落为中心的透明圈。相关叙述正确的是(　　)

A．培养基中的淀粉也可为微生物提供氮源

B．两个菌落中的微生物为同一种微生物

C．两个菌落中的微生物均能将淀粉酶分泌至细胞外

D．透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明该微生物分解淀粉的能力越大

CD　[A.淀粉只含有C、H、O三种元素，因此培养基中的淀粉不能为微生物提供氮源，A错误；B.两个菌落的周围均有透明圈，说明两个菌落中的微生物都能分解淀粉，但不一定为同一种微生物，B错误；C.两个菌落的周围均有透明圈，说明两个菌落中的微生物均能产生淀粉酶并将淀粉酶分泌至细胞外，C正确；D.透明圈是由于培养基中的淀粉被微生物产生的淀粉酶分解后而产生的，因此透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明该微生物分解淀粉的能力越大，D正确。故选CD。]

2．(2019·河南省天一大联考)某科研小组欲从兔粪中分离、筛选出分解纤维素能力强的菌种，为此开展了相关实验。请回答下列问题：

(1)纤维素是由_____________组成的大分子多糖，是构成植物____________ 的主要成分。

(2)制备培养基：分别称量羧甲基纤维素钠(CMC­Na)5 g、(NH4)SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KH2PO40.5 g，放入锥形瓶中，溶解后，加蒸馏水定容到500 mL。用锥形瓶塞塞紧，用报纸和橡皮筋包扎好，灭菌，然后倒平板。根据用途划分，该培养基属于_____________培养基，若要利用此培养基分离并获得纤维素分解菌的菌落，还应在培养基中加入的物质是______________；培养皿灭菌常采用的两种方法是_____________________；将新鲜的兔粪样品溶解于无菌水中，然后接种到培养基上，常用的接种方法是__________________________。

(3)培养72小时后，采用________染色法进一步筛选分解纤维素能力强的菌株。染色后，用游标卡尺测定____________直径(D)和菌落直径(d)，选择D/d值较大的菌落进行后续研究。

(4)纤维素酶活性的测定方法一般是_______________________________。

[解析]　(1)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，其基本组成单位是葡萄糖。

(2)分离和纯化分解纤维素的菌株的培养基是选择培养基，分离并得到菌落要用固体培养基，需在培养基中加入琼脂；培养皿灭菌可采用的方法有高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法。

(3)筛选纤维素分解菌可用刚果红染色法，D/d值较大的菌落，产纤维素酶的能力强。

(4)纤维素酶活性的测定方法一般是对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

[答案]　(1)葡萄糖　细胞壁　(2)选择　琼脂　高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法　平板划线法或稀释涂布平板法　(3)刚果红　透明圈　(4)对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定

3．(2019·河北省衡水中学高三联考)某种产脂肪酶菌常被用作饲料添加剂。下表是从土壤中初筛该菌的培养基配方，请回答下列问题：

(1)在上述培养基中，橄榄油能为产脂肪酶菌提供________。为增大产脂肪酶菌的浓度，需用该培养基进行富集培养，富集培养基宜选用液体培养基的原因是______________________________________。

(2)用涂布平板法分离产脂肪酶菌时，在上述培养基的基础上，还应加入________和溴甲酚紫(在碱性条件下呈紫色，在酸性条件下呈黄色)。在平板上产脂肪酶菌落的周围会出现黄色圈，原理是________________________________。筛选时常选择菌落大、黄色圈直径大的菌落，二者分别说明__________________

_________________________________________。

(3)菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。在平板上，有的菌落较小，呈乳白色，表面光滑，无丝状物，这些菌落可能为________(填“细菌”或“霉菌”)。有的菌落连成一片，形成原因最可能是____________。

(4)研究发现，在饲料中添加产脂肪酶菌剂后，动物的体重明显增加，这说明____________________________________________________。

[解析]　(1)橄榄油是本培养基中的唯一碳源，能为产脂肪酶菌提供碳源。由于液体培养基能增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间，所以进行富集培养时宜选用液体培养基。

(2)用涂布平板法分离产脂肪酶菌时所用的培养基为固体培养基，所以在上述培养基的基础上，还应加入琼脂等凝固剂。脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸呈酸性，能使溴甲酚紫变为黄色，因此在平板上产脂肪酶菌落的周围会出现黄色圈。菌落大，说明菌体繁殖能力强；黄色圈直径大，说明所产脂肪酶的活性高或产脂肪酶能力强。

(3)菌落无丝状物，说明此菌落不是霉菌。若接种菌液的浓度过高，则会导致菌落在平板上连成一片。

(4)在饲料中添加产脂肪酶菌剂后，因脂肪酶能催化脂肪水解，有利于脂肪的吸收，即脂肪酶菌剂能提高饲料转化率(利用率)，导致动物的体重明显增加。

[答案]　(1)碳源　液体培养基能增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间　(2)琼脂　脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸使溴甲酚紫变为黄色　菌体繁殖能力强、脂肪酶活性高(产脂肪酶能力强)　(3)细菌　接种菌液的浓度过高

(4)脂肪酶菌剂能提高饲料转化率(利用率)

微生物的分离与计数

4．(多选)下列有关微生物培养的叙述，错误的是(　　)

A．涂布接种时，需将涂布器沾酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用

B．纯化培养时，培养皿应倒置放在恒温培养箱内的摇床上培养

C．分离计数时，可用稀释涂布平板法对需计数的微生物进行分离

D．观察菌落时，应将培养皿盖拿掉以利于看清菌落的形态特征

BD　[涂布接种时，将涂布器末端浸在盛有酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，A正确；纯化培养时，不能用摇床培养，B错误；可以用稀释涂布平板法对微生物进行分离计数，C正确；观察菌落时，不能拿掉培养皿盖，D错误。故选BD。]

5．(2019·成都市高三诊断)将葡萄球菌在含卵黄的固体培养基上培养时，葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，形成的菌落周围会出现特有的乳白色乳浊环。某兴趣小组欲通过实验室培养和计数来检测某果汁中的葡萄球菌密度。回答下列问题：

 (1)配制分离葡萄球菌的培养基时，在培养基中加入一定量的卵黄液，卵黄液除了能给微生物提供________、水和无机盐等营养物质外，还具有的作用是______________________________。在配制培养基时若加入高浓度的NaCl溶液，就更容易筛选出葡萄球菌，最可能的原因是________________________。

(2)检测果汁中的葡萄球菌密度时，需先将果汁稀释。若要制成101倍的稀释样液，可取待检测果汁2.5 mL加入________mL无菌水中。稀释后的样液需用________法接种在固体培养基上，利用这一方法进行活菌计数的原理是_______ _______________________________________。

(3)将103倍的稀释样液接种在固体培养基上培养一段时间后，统计三个平板上葡萄球菌菌落数分别是200、180、220。如果需要据此计算出果汁中葡萄球菌的密度，还需要知道的一个重要数据是_________________________________。

[解析]　(1)卵黄液含有蛋白质和脂质等，能够为微生物提供碳源和氮源。此外，葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，形成的菌落周围会出现特有的乳白色乳浊环，具有鉴别葡萄球菌的作用。由于葡萄球菌更耐受高浓度NaCl溶液，在配制培养基时加入高浓度的NaCl溶液，更容易筛选出葡萄球菌。

(2)取待检测果汁2.5 mL加入22.5 mL(2.5 mL×10－2.5 mL)无菌水中，可制成101倍的稀释样液。稀释后的样液需用涂布平板法接种在固体培养基上，利用这一方法进行活菌计数的原理是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

(3)果汁中葡萄球菌的密度为[(200＋180＋220)/3]×103/接种时所用样液的体积，因此，还需要知道接种时所用样液的体积。

[答案]　(1)碳源和氮源　鉴别葡萄球菌　葡萄球菌更耐受高浓度NaCl溶液　(2)22.5　稀释涂布平板

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌　(3)接种时所用样液的体积

　统计菌落时所用两种计数方法的比较

真题体验| 感悟高考　淬炼考能

1．(2019·江苏高考)下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是(　　)

A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养

B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌

C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力

D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值

A　[应该用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌，只有纤维素分解菌能够存活，A错误；木材、秸秆中富含纤维素，故可以从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌，B正确；用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌后，为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，C正确；用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，可以把纤维素分解成葡萄糖，提高其饲用价值，D正确。故选A。]

2．(2019·江苏高考)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　　)

A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌

B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧

C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染

D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基

A　[接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A错误；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B正确；接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C正确；分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D正确。故选A。]

3．(多选)(2020·山东等级考模拟)生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法正确的是(　　)

A．倒成平板后直接培养可判断有无污染

B．倒成平板后需要进行灭菌处理

C．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙

D．生长图形法还可用于某些菌种的筛选

AD　[平板上不含任何生长因子，若倒成平板后直接培养，出现菌落说明已被杂菌感染，因为该嗜热菌不能在缺乏生长因子的培养基中生长，A正确；制备平板时，先灭菌再倒平板，B错误；图中菌落生活在乙丙区域之间，说明同时需要乙和丙，C错误；不同菌种所需生长因子不同，可利用生长图形法筛选菌种，D正确。]

4．(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。

(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是____________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上__________(填“能够”或“不能”)生长，原因是____________。

(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。

(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_____________________。

(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。

[解析]　(1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。

[答案]　(1)蛋白胨　不同细菌生长、繁殖所需的最适pH不同　能够　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源　(2)倒置　(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征　(4)灭菌

5．(2019·全国卷Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。

Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。

Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。

Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。

回答下列问题。

(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。

(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会__________，其原因是___________________________________。

(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________。

(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________和________。

[解析]　(1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供了氮源，而Ⅱ号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，相当于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。

[答案]　(1)牛肉膏、蛋白胨　X　(2)下降　不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖　(3)稀释涂布平板法　(4)能量　合成其他物质的原料

6．(2019·全国卷Ⅱ)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。

(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。

(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是__________________________。

(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________________________________________________

____________________________________________________________________。

(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异。该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。

①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。

②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明______ ______________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_____________ _____________________________________________________________。

[解析]　(1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)图示信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。

[答案]　(1)W　(2)乙　乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W　(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源　(4)①缓冲液　②缓冲液不能降解W　酶E与天然酶降解W的能力相近

7．(2018·江苏高考)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：

①称量土样　②梯度稀释　③平板浇注分离　④划线纯化　⑤扩大培养

(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的________，及时对培养基进行分装，并进行________灭菌。

(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(填“25 ℃”、“50 ℃”或“80 ℃”)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。

(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④进行划线。下列叙述合理的有________。(多选)

a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌

b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落

c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量

d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株

(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。

[解析]　(1)配制培养基的操作步骤为称量→溶解→定容→调pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)在步骤③中，待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板。(3)在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a正确；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b正确；该实验的目的是获得利用工业废甲醇作为碳源的酵母菌，不需要测定酵母菌中的甲醇含量，c错误；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d正确。(4)酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本(菌体)总数＝80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于(3×109)÷(1 000×2×104×400÷80)＝30(个)。

[答案]　　(1)pH　高压蒸汽　(2)50 ℃　(3)abd

(4)氧气　无　30