2020版新一线高考生物（苏教版）一轮复习教学案：选修3第1讲　基因工程



第1讲　基因工程
[考纲展示]　1.基因工程的诞生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)　3.基因工程的应用(Ⅱ)　4.蛋白质工程(Ⅰ)
考点一| 基因工程的基本工具


1．基因工程的概念
(1)概念：是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
(2)遗传原理：基因重组。
(3)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
种类
E·coli_DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
[思考回答]
1．原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA?
提示：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。
2．图甲表示EcoR Ⅰ限制酶及DNA连接酶的作用示意图，图乙表示Sma Ⅰ限制酶的作用示意图。请据图回答问题：

(1)请写出EcoR Ⅰ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列以及切割位点。
提示：EcoR Ⅰ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
(2)限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？DNA连接酶起作用时，是否需要模板？
提示：相同，都是磷酸二酯键。不需要模板。

1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题
(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。
(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
2．限制酶和DNA连接酶的关系

(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)条件与目的
条件
目的
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

◎考法1　考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用
[解题指导] 确定选择限制酶种类的方法

1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

图(a)

图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。

图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有___________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
解析：(1)由题图可知，BamH Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH Ⅰ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：(1)Sau3A Ⅰ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶
2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：


图1　　　　　　　　　图2
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
解析：(1)选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为BclⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和Sau3AⅠ，但由于BamHⅠ和Sau3AⅠ可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用BclⅠ、HindⅢ两种限制酶切割。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。(2)根据质粒上抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为
，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。(4)根据BclⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA连接　感受
(2)四环素　引物甲和引物丙
(3)　都不能　(4)7
◎考法2　考查载体的作用及特点等
3．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________；并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是_________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。
解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点(答出两点即可)
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　(3)受体细胞
考点二| 基因工程的基本操作及其应用


1．基因工程的基本程序
(1)目的基因的获取
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成

(3)将目的基因导入受体细胞
①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
(4)目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
个体水平
2.PCR技术
(1)原理：DNA双链复制。
(2)条件

(3)过程
(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
3．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较
(1)含义
①乳腺生物反应器是指使外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
②工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
(2)两者区别
比较项目
乳腺生物反应器
工程菌
基因结构
动物基因的结构与人类基因的结构基本相同
细菌和酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性
受体细胞
动物的受精卵
微生物细胞
导入目的基因的方式
显微注射法
感受态细胞法
生产条件
不需严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞中提取
[思考回答]
1．将目的基因导入受体细胞整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，能否稳定遗传？说明理由。
提示：一般不能。因为仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，细胞分裂可能导致目的基因丢失，因此无法稳定遗传。
2．用箭头及必要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
提示：(1)基因组文库的构建过程为：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。
(2)部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群。

1．基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的T­DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
2．基因表达载体的构建方法

3．目的基因的检测与鉴定


◎考法1　考查基因工程的基本操作程序
1．(2018·湖北武汉2月调研)如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。请回答：

(1)A→B利用的技术称为________，其中②过程需要热稳定的________酶才能完成。
(2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过C过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。
(3)上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是______________法，该方法一般________(填“适宜”或“不适宜”)用于将目的基因导入单子叶植物。
(4)从F→G的过程利用的主要技术为____________，欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做________实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占________。
解析：(1)A→B是PCR技术中的操作，②过程是PCR技术中的延伸过程，需要耐热的DNA聚合酶参与。(2)过程C是构建基因表达载体。(3)图中显示，将目的基因导入棉花细胞的方法是农杆菌转化法，该方法不适于将目的基因导入单子叶植物，这是因为农杆菌对大多数单子叶植物没有感染力。(4)F→G过程是将棉花体细胞培育形成新的个体，需要采用植物组织培养技术；检测抗虫基因在转基因植株体内是否表达，在个体水平上需要做抗虫接种实验；假设抗虫基因为A，则该杂合子基因型可以表示为A0，A0自交，后代中抗虫植株A_和非抗虫植株00分别占3/4、1/4。
答案：(1)PCR　Taq DNA聚合　(2)基因表达载体
(3)农杆菌转化　不适宜　(4)植物组织培养　抗虫接种　3/4
◎考法2　考查基因工程技术的应用
2．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。
(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。
(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。
(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。
答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子　(4)磷酸二酯键　(5)目的基因的转录或翻译异常
3．(2019·福建高三质检)苜蓿是目前我国种植最广的豆科牧草，但是病菌往往威胁着苜蓿的生长。为提高产量，研究人员将溶菌酶基因(LYZ基因)和绿色荧光蛋白基因(GFP基因)连接为LYZ­GFP基因，利用农杆菌转化法将其导入苜蓿细胞中，并通过组织培养成功获得了抗病植株。 图1表示Ti质粒，其中Vir区的基因产物是T­DNA转移的必备条件；图2表示含有LYZ­GFP基因的DNA片段。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。回答下列问题：

(1)构建含有LYZ­GFP基因的重组质粒时，应选用限制酶________进行切割，原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(2)据图分析，在培育转基因苜蓿植株过程中，应选择LYZ­GFP基因中的GFP基因为标记基因，而不选择质粒中原有的卡那霉素抗性基因为标记基因，这种做法的优点是________________________。
(3)在组织培养过程中，对愈伤组织进行显微检测，若________，则表明细胞中GFP基因存在并表达。
(4)选择含有GFP基因的愈伤组织为材料，用PCR技术扩增并检测LYZ基因，需选用一段____________________合成引物，该过程所用到的酶必须具有________的特性。
(5)对该苜蓿植株进行病菌接种实验，通过观察其抗病程度可以进行个体生物学水平的鉴定，原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)据图2可知，构建含有LYZ­GFP基因的重组质粒时，含有LYZ­GFP基因的片段有三个酶切位点，基因两侧没有相同限制酶，应该使用双酶切法，限制酶Ⅲ为必选。根据图1结合农杆菌转化法的原理，所用限制酶切割位点必须在T­DNA片段上，限制酶Ⅰ会切断Ti质粒本身的四环素抗性基因，但GFP基因、卡那霉素抗性基因都可以作为标记基因。所以应选择限制酶Ⅰ和Ⅲ。限制酶Ⅱ会破坏质粒中的Vir区的基因，不可选用。
(2)据图1可知，若LYZ­GFP基因在T­DNA片段上，就能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况，这是选用GFP基因为标记基因的优点。而卡那霉素抗性基因不在T­DNA片段上，不能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，所以相对不宜选用。
(3)GFP基因的表达产物是绿色荧光蛋白，对愈伤组织进行显微检测时，若观察到绿色荧光，则表明细胞中的GFP基因存在并表达。
(4)进行PCR技术扩增并检测LYZ基因的前提，要有一段已知的LYZ基因的核苷酸序列以便合成引物。PCR扩增过程使用的DNA聚合酶具有耐高温或热稳定的特性。
(5)LYZ基因能够表达出溶菌酶，根据免疫学知识得知：溶菌酶是免疫活性物质，能够杀灭病菌。因此转基因成功的苜蓿植株会表现出抗病特性。
答案：(1)Ⅰ和Ⅲ(对Ti质粒和含有LYZ­GFP基因的片段)　选择限制酶Ⅰ和限制酶Ⅲ能获取LYZ­GFP基因，不会破坏质粒中的Vir区的基因，使目的基因的插入位点位于T­DNA片段上　(2)LYZ­GFP基因在T­DNA片段上，能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况　(3)观察到绿色荧光　(4)LYZ基因的核苷酸序列　耐高温(或“热稳定”) 　(5)LYZ基因能够表达出溶菌酶，溶菌酶能够杀灭病菌，表现出抗病特性
考点三| 蛋白质工程及应用

蛋白质工程
(1)缘由：基因工程原则上只能产生自然界已存在的蛋白质。
(2)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
(3)手段：基因修饰或基因合成。
(4)目的：合成满足人类生产和生活需求的蛋白质。
(5)流程图

写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(6)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(7)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
[思考回答]
1．对天然蛋白质进行改造，应该通过对基因的操作来实现，为什么不能直接对蛋白质分子进行操作？
提示：如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功了，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传。
2．绝大多数酶都是蛋白质，简要表述酶工程与蛋白质工程有何区别和联系？
提示：酶工程的重点在于对已存在的酶的合成充分利用，而蛋白质工程则是对已存在的蛋白质进行修饰改造或制造出自然界不存在的蛋白质。酶工程是蛋白质工程的一部分。

蛋白质工程与基因工程的比较
1．区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
2.联系
(1)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。

◎考法　考查蛋白质工程的原理及应用
(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：
_________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。
(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。
中心法则的内容如图所示：

由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。
(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能
真题体验| 感悟高考　淬炼考能
1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解析：(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是：首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌
(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
2．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析：(1)据图示信息分析：将L1­GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1­GFP融合基因的完整，又能保证L1­GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
答案：(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　(2)转录　翻译　(3)细胞核　去核卵母细胞　(4)核DNA
3．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。
(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。
(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。
(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原—抗体杂交法。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。
答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕　(3)繁殖快、容易培养　(4)蛋白A的抗体　(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体